JP3848347B2

JP3848347B2 - プローブ固定基体の変化を判別する方法、プローブ固定基体および検出装置

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Description

本発明は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを固定した基体におけるプローブの劣化の程度および／またはプローブ等を保護する保護体の変化の程度を判定する方法、プローブ劣化および／またはプローブ等を保護する保護体の変化の判定に有用な素子を有するプローブ固定基体、あるいはプローブ劣化および／またはプローブ等を保護する保護体の変化の判定のためのシステム等に関する。

プローブ固定基体の一例としてＤＮＡチップが挙げられる。ＤＮＡチップとは、プローブとして遺伝子の発現、変異、多型などの同時解析に非常に有効である多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高密度アレイである。例えば、フォトリソグラフィーを用いて作製された固相オリゴヌクレオチドアレイが示され(例えば、特許文献１参照)、また、インクジェット法を用いた固相ＤＮＡプローブアレイの作製方法が示されている(例えば、特許文献１および２参照)。

また、標的物質の検出処理工程は、一般に、蛍光物質などで標識化した標的物質を固相プローブアレイのプローブと結合させるためにハイブリダイゼーションを行う。このハイブリダイゼーションは通常標的物質を溶解させた溶液に固相プローブアレイを接触または浸漬させ、熱を加える処理により行われる反応であり、その濃度や温度などはプローブと標的物質の組み合わせによって異なる。さらにプローブと標的物質が結合したかを蛍光検出機などの装置を用いて観察する。
米国特許第５６８８６４２号明細書国際公開第９５／２５１１６号公報

一般にＤＮＡなどは紫外線や温度によって分解する性質を持っており、長時間の日光などによる紫外線照射や高温下に保管するとプローブが劣化して標的核酸とハイブリダイズするという機能を失ってしまう。さらには、このようにして作られたプローブアレイに固定されているプローブ量はごく微量であるため、非破壊的にプローブの量や活性を測ることは困難な場合がある。そこで紫外線や高温などの様々な環境によるプローブ機能の消失を容易に判断できる方法を提供する。

さらには、これらプローブ等を保護する目的で保護体を基体に設ける場合もある。しかし、この保護体が上記の要因で変化してしまう可能性もあり、この変化を容易に判断する方法も提供する。

上記課題を解決するため本発明は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基体上に固定したプローブ固定基体であって、前記プローブ固定基体の変化の要因となる環境変化を検知する素子を更に設けたことを特徴とするプローブ固定基体に関する。

また、上記課題を解決するため本発明は、プローブ固定基体の有する素子の変化を読み取ることで、プローブ固定基体の変化の有無あるいは変化の度合いを判別する方法にも関する。

さらには、本発明にかかるシステムは、プローブ固定基体の有する素子の変化を読み取るための読み取り手段と、該読み取り手段で読み取られた素子の変化からプローブ固定基体の変化の有無を判断する判断手段と、を有することを特徴とするシステムである。

本発明によれば、プローブを基体上に固定したプローブ固定基体の変化を生じさせる環境変化に応じて変化を生じる素子を基体上に設置したことで、プローブ固定基体の変化、すなわちプローブの劣化、プローブおよび／または基体を保護する保護体などの変化の有無、あるいはそれらの変化の程度または可能性を簡便な方法で判別することができ、製造時における品質管理や、保存後のプローブ機能の確認が容易となる。

本発明には、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを固定したプローブ固定基体の性能に関わる何らかの変化の有無あるいはその度合いを判別する方法およびこのような判断方法を行えるようにしたプローブ固定基体、さらにはこれらの方法を用いてプローブ固定基体の変化具合を計算するシステム等が含まれる。プローブ固定基体の変化とは、例えばプローブの劣化あるいは、プローブなどを保護する保護体の変化などが含まれる。

プローブを固定するための基体は、プローブを固定し、得られたプローブ固定基体を用いて標的物質を検出あるいは分離するための操作に支障のないものであれば特に限定されず、例えばガラス、樹脂、金属、中空糸などを挙げることができるが、マイクロアレイを例に挙げるのであれば、標的物質の検出や汎用性を考慮すると、ガラス基板やプラスティック基板が好ましく、さらにはアルカリ成分などが含まれない無アルカリガラス基板や石英基板が特に好ましい。

プローブを基体上に固定する方法にはさまざまな方法が知られている。詳細としては、基体上においてプローブの合成を行うことにより基体上に固定する方法と、予め用意されたプローブをピンまたはスタンプなどにより基体上に付与することにより固定する方法とがある。

基体上にてプローブの合成を行う固定方法としては、例えば、米国特許第５１４３８５４５号公報に記載されているように、基体の選択された領域からアクチベーターによって保護基を除去し、除去可能な保護基を有するモノマーを前記領域に結合させることを繰返すことにより、基体上で種々の配列を有するポリマーを合成する方法が知られている。

また、予め用意されたプローブを基体上に付与することにより固定する方法としては、例えば、特開平８−２３９７５号公報に記載されているように、基体及び該基体上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を接触させることにより固定する方法が知られている。また、特開平８−３３４５０９号公報に記載のように、生物学的に活性な物質の検出において、カルボジイミドを有する化合物上にカルボジイミド基を介して固定化することを用いて検出する方法が知られている。

更に、特開２００１−１７８４４２号公報には、末端部にチオール基を有するＤＮＡ断片と、チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基を有する鎖状分子が一方の末端で表面に固定された固相担体とを液相にて接触させることにより、ＤＮＡ断片と鎖状分子との間で共有結合を形成させることによるＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法が記載されており、チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基としては、具体的にはマレイミジル基、α、β−不飽和カルボニル基、α−ハロカルボニル基、ハロゲン化アルキル基、アジリジン基、およびジスルフィド基からなる群より選ばれる基を含む置換基が挙げられている。

プローブの固定化方法は、上述のようにＤＮＡ断片の固定方法だけでも多くの方法が知られているが、本発明ではプローブの種類やその固定方法は特に限定されるものではない。

プローブ固定基体のプローブは、その種類にもよるが、一般に温度や紫外線、酸素などによってプローブとしての機能が失われてしまう。以下、この現象を劣化という。そして、この劣化の度合いを判別あるいは計測する簡便な方法はこれまでなかった。そこで本発明は、これら劣化の要因を検知する素子を基体に搭載することで、これらプローブ固定基体を使用する前にその劣化の要因となる因子がどの程度加えられたかを判断し、プローブの劣化の度合いを測るというものである。プローブ劣化の因子としては、例えば紫外線の受光や結露、温度変化、酸化ならびにｐＨ変化などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

劣化の要因を検知する素子とは、例えば要因が紫外線の場合は、特開２００１−２８１０５２号公報で公開されているように、加熱により色変化を伴って酸化型に復元し得る２量化キノン化合物を、紫外線の照射により還元の基に脱色する紫外線検出材としてポリオレフィン系樹脂に配合したものや、特公平３−１９５３６号で公開されているように、低重合度のポリ塩化ビニルと有色染料もしくは、無色染料とを必須成分とする溶液状組成物であって、近紫外線照射により前記有色染料もしくは無色染料が明瞭な色彩変化及び色濃度変化を起こしうることを特徴とする紫外線検知材、市販の紫外線検知材(例えば、商品名「ＵＶラベル」、日油技研工業株式会社製)などがある。

なお、プローブの種類によっては紫外線の影響の度合いも異なるため、素子形成材料の感度を調整し、使用するプローブに最適なものを選ぶことが好ましく、本発明はこれら感度や紫外線検知材の種類を限定するものではない。

温度変化の場合は、非結晶−結晶または相分離−非相分離によるリタイラブル系の電子供与性呈色性化合物(例えばロイコオーラミン類、ジアリールフタリド類ポリアリールカルビノール類、アシルオーラミン類、ローダミンＢラクタム類、インドリン類、スピロピラン類、フルオラン類、シアニン色素類、クリスタルバイオレット等、の電子供与性有機物等)、電子受容性化合物(例えばフェノール類、フェノール金属塩類、カルボン酸金属塩類、スルホン酸、スルホン酸塩、リン酸塩、リン酸金属塩類、酸性リン酸エステル、酸性リン酸エステル金属塩類、亜リン酸塩、亜リン酸類、亜リン酸金属塩類等の酸化物等)のような材料がある。この系は、サーマルヘッドにより融点以上に加熱され、急冷されたときに無色に固定され、そのインク系のガラス転移点以上で徐々に発色する。温度と発色する時間は、可逆剤等の濃度によりコントロールする事ができる。

具体的には特開平１１−１４０３３９号公報で公開されているような、支持体上に、無色ないしは淡色の塩基性染料と呈色剤および熱可融性物質を含有する層を設けた不可逆型示温材料において、塩基性染料として３−(１−ｎ−オクチル−２−メチルインドール−３−イル)−３−(４−ジエチルアミノ−２−エトキシフェニル)−４−アザフタリドまたは３，３’−ビス(１−ｎ−オクチル−２−メチルインドール−３−イル）フタリドを用い、かつ熱可融性物質として１，２−ジフェノキシエタンおよび／またはシュウ酸ジベンジルエステルを含有せしめたことを特徴とする不可逆型示温材料や、市販の示温材(例えば商品名「サーモペイント」、「サーモラベル」、「サーモシート」、「サーモテープ」、いずれも日油技研工業株式会社製)などがある。

なお、プローブの種類によっては温度の影響の度合いも異なるため、感度を調整し、使用するプローブに最適な検知材を選ぶことが好ましく、本発明はこれら感度や示温材の種類を限定するものではない。

プローブによっては大気中の酸素と反応し酸化されてしまうプローブもある。このようなプローブに関しては酸素検知材が有効である。例を挙げると、メチレンブルー等の特定の色素と該色素を還元するための還元剤としてグルコース等との組み合わせにより酸素の存在を検知する酸素検知材(特開昭５３−１２０４９３号公報及び特開昭５６−６０３４９号公報参照)などが知られている。

また、グルコースは熱や光に対して不安定であるなどの欠点を補うため、特開２０００−３９４２９号公報で公開されているように、システイン、その塩、エステル及びＮ−アシル誘導体から選ばれる少なくとも１種と、チアンジン系及び／又はインジゴ系色素とを含むことを特徴とする酸素検知材が開示されている。

さらには、特開昭５６−２１０５６４号公報には、ビス(サリチルアルデヒド)アルキレンジイミンコバルト(II)もしくはその誘導体を用いた酸素インジケーターが開示されており、特開昭６４−１０１７２号公報には、高分子アミンコバルト錯体の塗膜と熱可塑性プラスティック皮膜層からなる酸素インジケーターシートが開示されている。

なお、ここであげた酸素検知材は、プローブの種類等により感度を調整して用いることが好ましく、またその種類を限定するものではない。

パッケージを開封した瞬間あるいはプローブ固定基体を作製した瞬間から劣化をするプローブには、タイムインジケーターが有効である。例を挙げるのであれば、特開平１１−１４６１６号公報で開示されている、基体の片面または両面に、酸素との反応により速やかに変色する化合物を含む変色層を積層し、該変色層の上に、酸素ガス透過率０．１〜３０００ｍｌ／ｍ²・２４ｈｒ・ａｔｍ・２５℃・１００％ＲＨの酸素ガス透過制御層を積層してなることを特徴とするタイムインジケーターがあげられる。

また、特開平６−１８６７６号公報には、熱可塑性樹脂と揮散性を有する電子受容性有機化合物と難揮散性の電子供与性発色性有機化合物とを溶融混練してなる組成物を、比表面積が、連続的または非連続的に異なる形状に成形してなるタイムインジケーターが掲示されている。

さらには、特開平１０−２９３１８３号公報には、容器内の空間部分に充填され、大気に接触することにより遅延された形状回復性を有する発泡体又は積層体から形成されていることを特徴とするタイムインジケーターが開示されている。

なお、ここであげたタイムインジケーターは、プローブの種類等により感度を調整して用いることが好ましく、またその種類を限定するものではない。

ｐＨによって劣化するプローブの場合、湿らせたｐＨ試験紙を添付する方法や、またプローブ固定基体が液中に保存される場合には、フェノールスルホンフタレインなどのｐＨ指示薬を溶解させておく等の方法がある。

プローブの劣化を防ぐ目的で保護体を設ける場合もある。ＤＮＡチップを例に挙げるならば、ポリビニルアルコール(以下、ＰＶＡと略す。)膜をプローブ固定面に設けることでプローブの劣化を抑制できることが知られている。このＰＶＡはハイブリダイゼーションを行う際の標的物質を含む溶液により溶解され、ＰＶＡ膜を意識することなく使用することができる。しかし、ＰＶＡ膜を有するＤＮＡチップを高温下に置くと、ＰＶＡが硬化し溶解しにくくなる。ＰＶＡ膜が溶解しなければその後のハイブリダイゼーション反応が正常に行われなくなるため、検査の妨げになる。

また、保護体が紫外線吸収体など、プローブの劣化要因から保護する物である場合、過度の劣化要因にさらされた場合、保護体が劣化し保護能が低下する。このような場合にはプローブも劣化するおそれがあるため、保護体の変化を検知することが必要となる。

そこで本発明のもう一つの目的は、これら保護体の変化の要因を検知する素子を基体に搭載することで、これらプローブ固定基体を使用する前にその保護体の変化の要因となる因子がどの程度加えられたかを判断し、その基体が正常に使用できるかどうかを判断する物である。保護体の変化の因子としては、例えば紫外線の受光や結露、温度変化、酸化ならびにｐＨ変化などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

これらプローブの劣化の要因あるいは保護体の変化の要因を検知する素子は、その履歴を検知できるよう不可逆性であることが望ましく、そのようにすることで、プローブ固定基体が使用される直前までその固定基体の状態を判断することができる。

また、これら素子の形状は、シール状、テープ状、シート状、インク状、ペースト状、板状、棒状、あるいは粒状など形状は制限されない。また、熱などの要因によって形状が変化する物でも良い。汎用性を考えるならば、インク状の素子を基体にペイントする方法、またはシール状の素子を基体に貼る方法が好ましい。さらに、あとで搭載する手間を省くため、予め高分子の基体にこれら素子を混練しておいた基体に対してプローブを固定しても良い。

劣化の要因を検知する素子を搭載する場所に関しては、プローブとしての機能を阻害しないのであれば、特に限定されないが、プローブの劣化具合を判断するという目的からすると、プローブの近くに搭載することが好ましく、プローブ固定基体のプローブが固定されている部分を避けて基体に直接搭載することが好ましい。また、プローブ固定基体に直接搭載せずとも、パッケージなどに搭載しても良い。またペースト状またはインク状の素子をプローブと混ぜ合わせて固定化する方法や、保護体と混ぜ合わせて設ける方法などもある。

このように搭載したプローブ固定基体の変化の要因を検知する素子の変化(例えば色変化や形状変化)を目視あるいは読み取り装置などで検査し、変化があった場合はプローブの劣化や、保護体としての機能喪失などの可能性があることを簡便に判断できる。

さらには、予めこれらのプローブの劣化の要因を検知する素子の変化量とプローブの劣化の度合いを実測し検量線を作成しておき、実際に劣化の要因を検知する素子の変化量をこの検量線と比較することで、プローブの劣化の度合いを定量的に求めることも可能である。同様に、プローブの保護体の変化の度合いを定量的に求めることも可能である。

本発明にかかるプローブ劣化判断システムは、プローブ固定基体の有する素子の変化を読み取るための読み取り手段と、該読み取り手段で読み取られた素子の変化からプローブの劣化の有無を判断する判断手段と、から構成することができる。あるいは、本発明にかかるプローブ劣化判断システムは、プローブ固定基体の有する素子の変化を読み取るための読み取り手段と、該読み取り手段で読み取られた素子の変化からプローブの劣化の度合いを計算する計算手段とから構成することもできる。例えば、後述の実施例に示すように、素子として、変化を色で示すことのできるものを用い、素子の色を読み取り手段としてのスキャナ等で読み取り、色成分をＲＧＢに各２５６階調に分解し、Ｒ成分やＧ成分などの所定の色成分の強度として表し、この得られた色成分の強度と予め設けた基準値とを比較してプローブの劣化の有無を判断する、あるいは、所定の色成分の強度とプローブの劣化の度合いとの関係を予め設定し、実際に得られた色成分の強度からプローブの劣化の度合いを計算できるようにシステムを構成することができる。この予め設けた基準値との比較やプローブの劣化の度合いの計算はコンピュータに設定したプログラムよって行うことができる。

さらに本発明にかかる保護体変化判断システムは、プローブ固定基体の有する素子の変化を読み取るための読み取り手段と、該読み取り手段で読み取られた素子の変化から保護体の変化の有無を判断する判断手段と、から構成することができる。あるいは、本発明にかかる保護体変化判断システムは、プローブ固定基体の有する素子の変化を読み取るための読み取り手段と、該読み取り手段で読み取られた素子の変化から保護体の変化の度合いを計算する計算手段とから構成することもできる。例えば、上述したプローブ劣化判断システムと同様の方法を用いることができる。

以下、実施例をもって本発明をさらに詳細に説明する。

［実施例１］紫外線によるプローブ劣化の判別
（１）基体の作製
スライドガラスを予め６０℃に加温した１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液にガラス基板を１０分間浸した。引き続き純水流水中で十分にすすぎ、スライドガラスに付着した水酸化ナトリウムを水洗、除去した。十分にすすいだ後、純水中にスライドガラスを浸漬し、超音波洗浄を１０分間行った。超音波洗浄後、純水流水中で十分にすすぎ、スライドガラスに付着したパーティクルを水洗、除去した。その後、このスライドガラスをスピンドライで乾燥させた。

アミノシランカップリング剤(商品名：ＫＢＭ−６０３；信越化学工業(株)社製)を１重量％になるように溶解して３０分間撹拌し、この水溶液にスライドガラスを３０分間浸漬させた後取り出して水で洗浄し、オーブン中に入れ１２０℃で１時間乾燥させた。

（２）プローブの合成
本実施例においてプローブは、検出しようとする標的核酸の全部に対して相補的な塩基配列を有し、標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ(交雑反応)することで標的核酸を検出する一本鎖核酸を用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１の配列からなる一本鎖核酸を合成した。なお、この一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア(Thiol−Modifier)(グレンリサーチ(Glen Research)社製)を用いることによってチオール基を導入した。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた；
５’ＨＳ−（ＣＨ₂）₆−Ｏ−ＰＯ₂−Ｏ−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ３’(配列番号：１)。

（３）プローブの固定
上記(２)で合成したＤＮＡ断片(配列番号１)をグリセリン７．５重量％、尿素７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、アセチレンアルコール(商品名：アセチレノールＥ１００；川研ファインケミカル(株)社製)１重量％を含む水溶液に、０．６ＯＤになるよう溶解させた。なお、オリゴヌクレオチドを１ｍｌに溶解し、１ｃｍの光路長のセルにおいて２６０ｎｍの吸光度が１となる量が１ＯＤである。

このＤＮＡ断片を含む水溶液をバブルジェットプリンター(商品名：ＢＪ−Ｆ８５０；キヤノン(株)社製を平板への印刷が可能なように改造を施したもので、ＢＪヘッドとスライドガラスの間隔は約１ｍｍ、吐出量は約４ｐｌである。)を用い、上記(１)の方法によって作製したスライドガラスに別々にスポッティングし、ＤＮＡチップを作製した。この際、１５倍のルーペによる観測ではサテライトスポット(液体が固相表面に着弾したときの飛沫に由来するスポット)は観測されなかった。

プローブを含む溶液をスポッティングしたスライドガラスを室温で１０分間放置し、１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．０)、次いで純水で洗浄し、スピンドライを行った。

（４）紫外線検知材の搭載
上記(３)で作製したＤＮＡチップのプローブが固定されていない部分にＵＶラベルＳタイプ(日油技研工業株式会社製)を貼付した。なお、このＵＶラベルＳタイプは白色であるが紫外線を受光すると不可逆的に赤(ピンク)に変色するもので、約２５０ｍＪ／ｃｍ²で変色度合いが飽和する物である。

（５）紫外線の照射
上記(４)で紫外線検知材を搭載したＤＮＡチップに約５ｍＪ／ｃｍ²になるように紫外線を照射した。

（６）ブロッキング・ハイブリダイゼーション反応
１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．０)に１．０重量％になるようウシ血清アルブミンを溶解させ、上記(５)で紫外線を照射したＤＮＡチップと、上記(４)で作製したＤＮＡチップ(紫外線を照射しないＤＮＡチップ)の両者を室温で２時間浸漬させ、ブロッキング反応を行った。

配列番号１のプローブと相補的な核酸配列を有するＤＮＡ断片の５’末端にローダミンを結合させて標識化したＤＮＡ断片を合成し、これを１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．０)に５０ｎＭになるように溶解させた。ブロッキング処理を行ったＤＮＡチップをこの標識化したＤＮＡ断片を含む溶液に浸漬し、４５℃で２時間放置した。その後、１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．０)で未反応のＤＮＡ断片を洗浄し、さらに純水で洗浄を行った。

（７）結果
ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップを蛍光スキャナ(商品名：GenePix4000B；Axon Instruments, Inc.製)で波長５３２ｎｍの蛍光観測を行った。その結果、各々のスポットがほぼ円形であり、その直径は５５μｍであった。そしてＰＭＴ４００Ｖ、レーザーパワー１００％で測定した場合に、ＵＶ照射を行ったＤＮＡチップの配列番号１のプローブに起因するスポット中心付近の蛍光強度は６３３５であり、ＵＶ照射を行わないチップの配列番号１のプローブに起因するスポット中心付近の蛍光強度は２１６７６であった。また、スポット周囲のバックグラウンドの蛍光強度はＵＶを照射した場合は２７０、ＵＶ照射のない場合は３８３であった。上記ではＵＶ照射によるプローブの劣化を蛍光強度から判断する。

また、ハイブリダイゼーション反応を行う前、ＵＶを照射しないＤＮＡチップに貼付したＵＶラベルは白色であり、ＵＶを照射したＤＮＡチップのＵＶラベルは薄いピンクに変色していた。これにより、ＵＶラベルが変色している場合は、ＵＶによるプローブの劣化が起こり、目視でこの劣化を判断することが可能であることが証明された。表１にＵＶ照射の有無による蛍光強度の比較結果をまとめる。

［実施例２］紫外線によるプローブ劣化の判定
（１）ＤＮＡチップの作製
実施例１と同様の方法でＤＮＡチップの必要数を作製した。

（２）紫外線検知材の搭載
作製した各ＤＮＡチップのプローブが固定されていない部分にＵＶラベルＳタイプ(日油技研工業株式会社製)を貼付した。

（３）紫外線の照射
上記(２)で紫外線検知材を搭載した各ＤＮＡチップに１０秒までの異なる時間で約５ｍＪ／ｃｍ²になるように紫外線を照射した。また、照射を行なわないものも用意した。

（４）検量線１の作成
それぞれのＵＶラベルをスキャナ(キヤノン株式会社製、Ｎ−１２４０Ｕ)でスキャンし、ＵＶラベルの色成分をＲＧＢに各２５６階調に分解し、Ｇ成分とＵＶ照射時間をプロットした。その結果を図１に示す。ＵＶ照射時間とＵＶラベルのＧ色成分の輝度との関係は図１に示すとおり、直線的に減少する。

（５）検量線２の作成
各ＤＮＡチップを実施例１と同様の方法でブロッキング反応及びハイブリダイゼーション反応を行い、さらに実施例１と同条件で蛍光強度の測定を行った。その結果を表２に示す。

(４)で作成したＧ成分とＵＶ照射時間の関係のグラフ(検量線１)と(５)で作成した蛍光強度と照射時間の関係とから、Ｇ成分と蛍光強度との関係のグラフを作成した。その結果を図２に示す。

（６）プローブ劣化度合いの計算
上記(２)に示した紫外線検知材搭載のＤＮＡチップに紫外線を３秒間照射し、上記(４)と同様にしてＵＶラベルのＧ成分を測定した結果、１８１であった。図２の検量線からこのＤＮＡチップの蛍光強度の期待値は約１１０００であり、プローブ劣化度は約５０％である。

（７）結果
上記(６)にてＵＶ照射を３秒間行ったＤＮＡチップを実施例１と同様の方法でブロッキング反応及びハイブリダイゼーション反応を行い、さらに実施例１と同条件で蛍光強度の測定を行った。その結果蛍光強度は１１１２１であった。このことから、ＵＶラベルのＧ色成分の輝度(ＵＶ照射量)から、プローブの劣化程度を計算することも可能であることが証明された。

［実施例３］温度によるプローブ劣化の判定
（１）ＤＮＡチップの作製
実施例１と同様の方法でＤＮＡチップの必要数を作製した。

（２）温度検知材の搭載
作製したＤＮＡチップのプローブが固定されていない部分に加熱積算ラベルＫＳ９０−２０(日油技研工業株式会社製)を貼付した。なお、この加熱積算ラベルＫＳ９０−２０は白色であるが、加熱をすると不可逆的に茶色に変色する物であり、約８０℃で３０分、約９０℃で２０分もしくは約１００℃で７分程度で、その変色が飽和する物である。

（３）加熱
上記(２)で温度検知材を搭載した各ＤＮＡチップをそれぞれ５０℃、７０℃、９０℃のクリーンオーブン内で２０分間加熱した。

(２)で添付した加熱積算ラベルをスキャナ(キヤノン株式会社製、Ｎ−１２４０Ｕ)でスキャンし、加熱積算ラベルの色成分をＲＧＢに各２５６階調に分解し、Ｒ成分と加熱温度を表にした。図３に、加熱温度、加熱積算ラベルのＲ成分との関係を示す。この結果２０分の加熱時間では７０℃を超えたところから急激にＲ成分輝度が減少していることがわかる。

（４）ブロッキング・ハイブリダイゼーション反応
加熱処理を行ったＤＮＡチップ及び、加熱処理を行わなかったＤＮＡチップそれぞれを実施例１と同様の方法で、ブロッキング反応およびハイブリダイゼーション反応を行った。

（５）蛍光測定
ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップを蛍光スキャナ(商品名：GenePix4000B；Axon Instruments, Inc.製)で波長５３２ｎｍの蛍光観測を行った。その結果、各々のスポットがほぼ円形であり、その直径は５５μｍであった。そしてＰＭＴ４００Ｖ、レーザーパワー１００％で測定した場合の蛍光強度を表３に示した。

（６）不良基準の作成
２０％以上劣化したチップを不良と定めると、表３からＲ成分が２００未満であるとプローブの劣化が２０％を超えることがわかる。この値を不良基準とする。

（７）試料作製
先の方法で作成したＤＮＡチップに加熱積算ラベルＫＳ９０−２０を貼付し、９０℃／３分で加熱した。この加熱積算ラベルをスキャナでスキャンし、加熱積算ラベルの色成分をＲＧＢに各２５６階調に分解し、Ｒ成分を測定した。その結果、２０４であり先の不良基準よりも高い値であることから、プローブの劣化度合いは２０％以下(良品)であることが推測された。

（８）結果
９０℃／３分で加熱したＤＮＡチップを先と同様の方法でブロッキング、ハイブリダイゼーションを行い、蛍光スキャナで波長５３２ｎｍの蛍光観測を行った。その結果、ＰＭＴ４００Ｖ、レーザーパワー１００％で測定した場合の蛍光強度は１７９８５であり、プローブ劣化度合いは１３％で、良品であることが確認された。

以上のことから、加熱時間が異なっても、加熱積算ラベルを使用することでプローブの劣化度合いを実際にハイブリダイゼーション反応をさせなくても判別できることが確認できた。

［実施例４］温度による保護体変化の判定
（１）ＤＮＡチップの作製
実施例１と同様の方法でＤＮＡチップの必要数を作製した。

（２）ポリビニルアルコールの溶解とプローブ固定担体への付与(保護体の形成)
ＰＶＡ１０３(株式会社クラレ社製のポリビニルアルコールで、けん化度９８．０−９９．０ｍｏｌ％、重合度約３００)を各５ｇ秤量し、純水４９５ｇを含むビーカーに攪拌しながら加えて、純水中に分散させた。次いで、１時間温浴により８０〜９０℃に加熱して溶解し、濃度１．０重量％のＰＶＡ水溶液を調製した。放冷後、不溶解物が無いことを確認し、濾過を行い、ＰＶＡ水溶液を調製した。濾過には０．２２μｍのメンブレンフィルターを用いた。

作製したＤＮＡチップをＰＶＡ水溶液に３０秒間浸漬し、引き上げ、自然乾燥した。しかしながら、このようなコート法に限らずスピンコート法、ロールコート法なども適用可能であり、またインクジェット法、ピン法などでプローブ固定担体のプローブ固定した部分だけにＰＶＡを付与させてもよい。

（３）温度検知材の搭載
作製したＤＮＡチップのプローブが固定されていない部分に加熱積算ラベルＫＳ９０−２０(日油技研工業株式会社製)を貼付した。なお、この加熱積算ラベルＫＳ９０−２０は白色であるが、加熱をすると不可逆的に茶色に変色する物であり、約８０℃で３０分、約９０℃で２０分もしくは約１００℃で７分程度で、その変色が飽和する物である。

（４）保護膜の膜厚測定
作製したＤＮＡチップをエリプソメーター(堀場ジョバンイボン社製ＵＶＩＳＥＬ)にて膜厚を測定した。その結果２０．３ｎｍであった。

（５）加熱
保護層を形成したＤＮＡチップを８０℃で５時間放置し、その後室温に戻した。なお、温度検知材は完全に茶色に変色していた。

（６）保護膜の溶解
１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液(ｐＨ７．０)に加熱処理を施したＤＮＡチップおよび、加熱処理を施さなかったＤＮＡチップそれぞれを１０分間浸漬させ、その後純水で洗浄し、スピンドライにて乾燥させた。

（７）保護膜の膜厚測定
加熱処理を施したＤＮＡチップをエリプソメーターにて膜厚を測定した。その結果１５．３ｎｍであり、加熱処理を行わなかったＤＮＡチップは膜を検出できなかった。このことから加熱によって保護体が硬化して保護膜が溶解しなかったことがわかり、ハイブリダイゼーション反応を行えないことが予想された。

（８）ブロッキング・ハイブリダイゼーション反応
加熱処理を行ったＤＮＡチップおよび加熱処理を行わなかったＤＮＡチップそれぞれを実施例１と同様の方法で、ブロッキング反応およびハイブリダイゼーション反応を行った。

（９）蛍光測定
ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップを蛍光スキャナ(商品名：GenePix4000B；Axon Instruments, Inc.製)で波長５３２ｎｍの蛍光観測を行った。加熱処理を行ったＤＮＡチップは蛍光は観測されなかった。なお、加熱処理を行わなかったＤＮＡチップは、各々のスポットがほぼ円形であり、その直径は５５μｍであった。そしてＰＭＴ４００Ｖ、レーザーパワー１００％で測定した場合の蛍光強度は２０１３９であった。

以上のことから、保護体の変化の劣化の有無を判別する素子から、保護体の変化を実際にハイブリダイゼーション反応をさせなくても判別できることが確認できた。

なお、本発明の効果を紫外線、温度による外的因子を用いた実施例で説明したが、本発明の主旨に基づき明細書中で記載したとおり、他の外的因子についても同様の手法を用いることにより、プローブの劣化程度を簡便に判断することが可能である。

ＵＶ照射時間とＵＶラベルのＧ色輝度を示す図である。ＵＶラベルのＧ色輝度と蛍光強度の関係を示す図である。温度と加熱積算ラベルのＲ色輝度の関係を示す図である。

Claims

標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基体上に固定したプローブ固定基体の変化の有無または量を判定する方法であって、前記プローブ固定基体の変化の要因となる環境変化を検知する素子を前記プローブ固定基体に設け、前記プローブ固定基体の変化の要因となる環境変化を検知する素子の変化の度合いから、プローブ固定基体の変化の有無または量を判別することを特徴とする判定方法。
前記プローブ固定基体の変化が、プローブの劣化または保護体の変化であることを特徴とする請求項１記載の方法。
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基体上に固定したプローブ固定基体であって、前記プローブ固定基体の変化の要因となる環境変化を検知する素子が設けられており、該素子から該プローブ固定基体の環境変化に関する情報を取得する手段と、該取得手段で取得した情報に基づいてプローブ固定基体の変化の有無または量を判定する手段と、を有することを特徴とするシステム。
前記プローブ固定基体の変化が、プローブの劣化または保護体の変化であることを特徴とする請求項３記載のシステム。
前記プローブと標的物質とを反応させるための反応装置であって、請求項３記載のシステムを備えることを特徴とする反応装置。
前記プローブと反応した標的物質の有無あるいは量を検出するための検出装置であって、請求項３記載のシステムを備えることを特徴とする検出装置。
プローブの劣化具合から、予め作成しておいた検量線を使用して、前記プローブ固定担体と反応した標的物質の量または有無を計測した結果を補正することを特徴とする請求項６記載の検出装置。
プローブの劣化の要因を検知する素子の変化量とプローブの劣化の度合いとを実測して検量線を作成し、該検量線を用いて前記素子の変化量からプローブの劣化度合いを定量することを特徴とする、プローブ劣化定量方法。