JP3843136B2

JP3843136B2 - トロポニンｉの生物学的適用における標準尺度として有用な合成ビエピトープ化合物

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Publication number: JP3843136B2
Application number: JP52529398A
Authority: JP
Inventors: ババン，ファビエンヌ・ノエル; カルゾラリ，シャルル・ディディエ; フレシュー，オディール・スザンヌ・エレーヌ; グラニエ，クロード; ラリュ，カトリーヌ・クリスティアンヌ・マリー; ポー，ベルナール・クリスティアン; リウニエ，フランソワ・イヴ; トランキエ，シルヴィー・マリー−フランス
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1996-12-05
Filing date: 1997-12-04
Publication date: 2006-11-08
Anticipated expiration: 2017-12-04
Also published as: DE69737329T2; JP2001505571A; CA2274303C; ATE353338T1; FR2756827A1; WO1998024816A1; EP0964871B1; AU735873B2; JP2006036782A; FR2756827B1; CA2274303A1; US6867011B1; AU5326198A; ZA9710964B; ES2283031T3; EP0964871A1; DE69737329D1

Description

本発明は、トロポニンＩのアッセイ用のイムノアッセイにおける標準として用いることができる合成ビエピトープ化合物、それらの製造方法、かかる化合物を含有する組成物およびキット、ならびに、かかる化合物を用いるイムノアッセイ方法に関する。
トロポニンは、３種類の蛋白質、すなわち、トロポニンＩ、ＴおよびＣからなる筋原線維蛋白質複合体であることが知られている。この蛋白質複合体は、ミオシンおよびアクチンと相互作用することによりＣa²⁺イオンによる筋肉収縮の調節に寄与することができる。より正確には、神経インパルスが筋肉の運動終板のレベルに達すると、筋小胞体に伝達される活動電位が発生することが知られている。次いで、Ｃa²⁺がサイトゾル中に放出され、トロポニンＣに結合し、これは、トロポニンＩおよびトロポニンＣ間の相互作用を補強し、したがって、トロポニンＩ、Ｔ、Ｃ複合体のコンフォメーションを変化させる。次いで、アクチン−ミオシン相互作用部位が遊離し、筋肉収縮運動を可能にする。
筋肉が損傷を受けると、それが心筋梗塞後の心筋壊死の間に心筋であろうと、持続性の肉体的作業の間の骨格筋であろうと、トロポニンが血流中に多かれ少なかれ迅速に放出される。
かくして、トロポニンのアッセイは、Circulation (1991), 83 pp. 902-912におけるトロポニンＴのアッセイであろうと、Am. Heart J. (1987), 110, pp. 1333-1344およびMolecular Immunology (1992), 29(2), pp. 271-278におけるトロポニンＩのアッセイであろうと、最近、心筋梗塞の初期診断ために推奨されている。同様に、心筋梗塞後の血栓崩壊治療の成功を測定するための心臓トロポニンＴのアッセイは、Br. Heart J., (1994), 71,pp. 242-248に提案されており、骨格筋に対する損傷の測定用の骨格トロポニンＩのアッセイも提案されている(abstract No.35 of the American Association for Clinical Chemistry, 46th National Meeting, New Orleans, July 17-21, 1994)。現在、種々の心臓トロポニンおよび骨格トロポニンのアッセイがヒトおよび動物病理学の診断用の非常に有用な手段であることに注目すべきである。
生物学的分析研究所において行われるイムノアッセイが、該アッセイに必要な試薬（すなわち、標識または非標識抗体、顕示薬（revealing agent）および希釈液）に加えて、研究すべき試料の条件と同様の条件下で用いる場合、結果を算出するための参照としておよび／または正の対照としての役割を果たす測定すべき化合物用の標準の製造業者による供給を必要とすることは、よく知られている。
測定すべき化合物用の標準および／または対照を得るために、凍結乾燥形態（使用前に使用者が該化合物を溶解する溶媒を添えた）またはすぐに使用できる精製した化合物を用いることが可能である。
生物学的試薬は不安定であるために、凍結乾燥生成物から調製した標準または対照溶液は、単位用量で冷凍し、−８０℃で保存する。さらにまた、これらの溶液は、プロテアーゼ阻害剤または抗菌剤をそれらに添加した場合でさえ、＋４℃で２、３時間以上安定ではないことが観察された。したがって、これは、使用者が使用直前にそれらの標準溶液を調製することを必要とする。
フランス特許公開番号第2,701,954号の下に公開された特許出願には、トロポニンＩまたはＴの当量あたり１〜１０モル当量のトロポニンＣの割合でトロポニンＣと混合したトロポニンＩまたはトロポニンＴおよび塩化カルシウムを含有する水溶液からなることを特徴とするイムノアッセイ用のトロポニンＩまたはＴの安定化溶液が記載されている。この技術では、多少希釈したトロポニンＩまたはＴの標準溶液を＋４℃で数日間保存できる。
フランス特許公開番号第2,734,267号の下に公開された特許出願には、トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣにより形成された三成分複合体からなるトロポニンの標準溶液が記載されている。
これらの標準を得るために用いられる原料は、ヒトまたは動物起源のものであり、かくして得られた標準または対照は、＋４℃で約１ヶ月間安定である。
ＰＣＴ出願公開WO 94/15217には、トロポニンＩのＮ末端ペプチドを認識する抗体の調製用の免疫原として有用ないくつかの合成ペプチドが記載されている。これらのペプチドのいくつかは、ＰＣＴ出願公開WO 94/15217により包含される発明の主題である抗体を用いるトロポニンＩのイムノアッセイにおいて標準として用いることができる。
同様に、ＰＣＴ出願公開WO 94/27156は、心臓トロポニンＩに対して特異的な抗体を用いる心臓トロポニンＩのアッセイ方法に関する。これらの抗体は、骨格筋トロポニンＩにはなく、したがって、心臓トロポニンＩに対して特異的な配列を有するペプチドフラグメントから調製することができる。しかしながら、この出願には、トロポニンＩのイムノアッセイにおいて標準としてある種のペプチドフラグメントを用いる可能性について記載も示唆もしていない。
ＰＣＴ出願公開WO 96/27661には、蛋白質およびペプチドを安定化するための水溶液が記載されていることも知られている。これらの溶液は、特に、蛋白質またはペプチドについての診断試験における適用が見出される。
ＰＣＴ出願公開WO 96/27661によると、これらの水溶液は、トロポニンＩ全体ほど安定ではないことが知られているトロポニンＩのフラグメントの安定性を増加させることができる。
1997年1月8日に公開されたヨーロッパ特許出願公開第752426号には、また、高分子量蛋白質（＞１００ＫＤ）またはポリマーなどの担体分子に結合した１種類以上のペプチドを含有するトロポニンＩ標準が記載されている。
ヨーロッパ特許出願公開第650053号には、樹脂状構造をもってお互いに結合し合っている１種類以上の受容体に対する活性部位を含有する合成標準が記載されている。この出願には、さらに詳しくは、３週間だけ溶液中で安定なトロポニンＴについての合成標準が記載されている。
今、数ヶ月間安定な、トロポニンＩの評価のために用いることができる合成標準を得ることができることが見出された。
確かに、本発明化合物の特異的構造は、それらに優れた安定性を与える。
したがって、本発明化合物は、数ヶ月間溶液中で安定な非常に標準化された標準を得ることができ、動物の臓器からトロポニンＩ標準を調製するのに必要な精製工程および複雑な抽出工程を回避することができる。
本発明化合物は、リンカーによりお互いに結合されたトロポニンＩの２種類のエピトープを含有し、一般式Ｉ：
Ξ−Ｅ₁−Ｚ−Ｅ₂−Ψ (Ｉ)
［式中、
Ｅ₁およびＥ₂は、同一または異なって、トロポニンＩの最小エピトープまたは伸長エピトープのいずれかを含有するペプチド配列を表し、
Ｚは、
・アミノ酸（ａａ）１〜４０個のペプチド配列（ただし、−Ｅ₁−Ｚ−Ｅ₂−は、一緒になってトロポニンＩ配列の一部を形成しない）、
・線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖、または、
・アミノ酸１〜１０個の少なくとも１種類のペプチド配列および少なくとも１種類の線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖からなる混合構築物
を表し、
Ξは、
・水素原子、アセチル基、アミノ酸１〜１０個のペプチド配列、アミノ酸１〜１０個のＮ−α−アセチル化ペプチド配列、システイニル、ビオチニルもしくはビオシチニル基、または、システイニル、ビオチニルもしくはビオシチニル残基を有するアミノ酸１〜１０個のペプチド配列、
・線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖、
・Ｎ−α−アセチル化線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖、
・アミノ酸１〜１０個の少なくとも１種類のペプチド配列および少なくとも１種類の線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖からなる混合構築物、
・アミノ酸１〜１０個の少なくとも１種類のペプチド配列およびビオチニル、ビオシチニルもしくはシステイニル残基を有する少なくとも１種類の線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖からなる混合構築物
を表し、
Ψは、
・ヒドロキシル基、アミノ基、アミノ酸１〜１０個のペプチド配列、アミノ末端基を有するアミノ酸１〜１０個のペプチド配列、
・線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖、
・ヒドロキシル基またはアミノ基を有する線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖、
・アミノ酸１〜１０個の少なくとも１種類のペプチド配列および少なくとも１種類の線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖からなる混合構築物、
・アミノ酸１〜１０個の少なくとも１種類のペプチド配列およびヒドロキシル基またはアミノ基を有する少なくとも１種類の線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖からなる混合構築物
を表す]
で示される。
−Ｅ₁−Ｚ−Ｅ₂−が、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは、２個のアミノ酸、特に、５個のアミノ酸の非保存性置換、欠失または挿入によりトロポニンＩ配列の所定のフラグメントとは異なる場合、−Ｅ₁−Ｚ−Ｅ₂−は、トロポニンＩ配列の一部ではないと考えられる。
Ｚは、特に、
・式II：
−ＮＨ−(ＣＨ₂)_m−ＣＯ− (II)
[式中、ｍは、１〜１０の整数を表す]
で示される鎖、または、
・式III〜Ｖ：
−[ｐｅｐ₁−ＮＨ−(ＣＨ₂)_m−ＣＯ]_p− (III)
−[ｐｅｐ₁−ＮＨ−(ＣＨ₂)_m−ＣＯ−ｐｅｐ₂]_p− (IV)
−[ＮＨ−(ＣＨ₂)_m−ＣＯ−ｐｅｐ₂]_p− (Ｖ)
[式中、
ｍは、１〜１０の整数を表し、
ｐは、１〜５の整数を表し、
ｐｅｐ₁およびｐｅｐ₂は、同一または異なっており、アミノ酸２〜１０個を含有するペプチド鎖を表す]
で示される混合構築物を表し；
Ξは、特に、
・式IIａ：
−ＮＨ−(ＣＨ₂)_q−ＣＯ− (IIａ)
[式中、ｑは、１〜１０の整数を表す]
で示される鎖、または、
・式IIIａ〜Ｖａ：
−[ｐｅｐ₃−ＮＨ−(ＣＨ₂)_q−ＣＯ]_r− (IIIａ)
−[ｐｅｐ₃−ＮＨ−(ＣＨ₂)_q−ＣＯ−ｐｅｐ₄]_r− (IVａ)
−[ＮＨ−(ＣＨ₂)_q−ＣＯ−ｐｅｐ₄]_r− (Ｖａ)
[式中、
ｑは１〜１０の整数を表し、
ｒは、１〜５の整数を表し、
ｐｅｐ₃およびｐｅｐ₄は、同一または異なっており、アミノ酸２〜１０個を含有するペプチド鎖を表す]
で示される混合構築物；
・Ｎ−α−アセチル化された式IIａ〜Ｖａで示される鎖、または、ビオチニル、ビオシチニルまたはシステイニル残基を有する式IIａ〜Ｖａで示される鎖を表し；
Ψは、特に、
・式IIｂ：
−ＮＨ−(ＣＨ₂)_s−ＣＯ− (IIｂ)
[式中、ｓは、１〜１０の整数を表す]
で示される鎖、または、
・式IIIｂからＶｂ：
−[ｐｅｐ₅−ＮＨ−(ＣＨ₂)_s−ＣＯ]_t− (IIIｂ)
−[ｐｅｐ₅−ＮＨ−(ＣＨ₂)_s−ＣＯ−ｐｅｐ₆]_t− (IVｂ)
−[ＮＨ−(ＣＨ₂)_s−ＣＯ−ｐｅｐ₆]_t− (Ｖｂ)
[式中、
ｓは、１〜１０の整数を表し、
ｔは、１〜５の整数を表し、
ｐｅｐ₅およびｐｅｐ₆は、同一または異なっており、アミノ酸２〜１０個を含有するペプチド鎖を表す]
で示される混合構築物；
・ヒドロキシル基またはアミノ酸を有する式IIｂ〜Ｖｂで示される鎖
を表す。
本発明の化合物のうち、好ましいものは、Ξが式IIａで示される鎖、または、式IIIａ〜Ｖａで示される混合構築物、または、Ｎ−α−アセチル化された式IIａ〜Ｖａで示される鎖、または、ビオチニル、ビオシチニルもしくはシステイニル残基を有する式IIａ〜Ｖａで示される鎖を表す化合物である。
本発明の化合物のうち、好ましいものは、また、Ψが式IIｂで示される鎖、または、式IIIｂ〜Ｖｂで示される混合構築物、または、ヒドロキシル基もしくはアミノ基を有する式IIｂ〜Ｖｂで示される鎖を表す化合物である。
Ｚが式IIで示される鎖または式III〜Ｖで示される混合構築物のいずれかを表す本発明化合物が、特に好ましい。
トロポニンＩの最小エピトープを含有するペプチド配列は、抗トロポニンＩモノクローナル抗体によって決定した。かかる抗体は、Larue et al. (Molec. Immunology, (1992), vol.20 No.29, pp.271-278)、Bodor et al. (Clin. Chem. (1992), vol.38 No.11, pp.2203-2214)、Granier et al. (Protein Science, (1997), vol.6 suppl.1, p.61)により、および、ＰＣＴ出願公開WO 94/15217に記載されている。これらの抗体の大部分は、市販されている（フィンランド国トゥルクのハイテスト・リミテッド（Ｈytest ＬＴＤ））。
トロポニンＩの最小エピトープを含有するペプチド配列を決定するために、アミノ酸７個の上記ペプチド配列と重複するアミノ酸１０個のペプチドの同時合成は、以下のスキームにより行った：
−ペプチド１＝アミノ酸１−１０
−ペプチド２＝アミノ酸４−１３
−ペプチド３＝アミノ酸７−１６
−その他。
一般に、合成され試験されたペプチドは、蛋白質の完全配列を記載している(Vallins et al., FEBS Letters (1990), vol.270 No.1-2, pp.57-61)。
次いで、用いたモノクローナル抗体の各々と反応するペプチドを各ペプチドの各抗体との結合についての免疫酵素試験により同定した。
例えば、抗トロポニンＩモノクローナル抗体について、FEBS Letters (1990), vol.270 No.1-2, pp.57-61に記載されているように、各抗体に対して免疫学的に反応性を有する最小エピトープを含有するペプチド配列およびトロポニンＩ配列におけるこのペプチド配列の位置を以下に示す。

アミノ酸の置換、欠失または挿入によりペプチド配列から誘導されたペプチド配列は、また、それらが抗体への結合に対して等価な結合性を示すので、本発明の範囲内に属する。
以下の線状配列Ｅ₁および／またはＥ₂ Ｎo. １〜５が好ましい。

上記配列は、非限定的な例として挙げられる。
リンカーＺがペプチド配列を含有する場合、後者は、配列Ｅ₁および／またはＥ₂と一緒にトロポニンＩの伸長エピトープを形成する。この伸長エピトープは、特に、配列−ＴＥＰＨＡＫＫ−または−ＧＡＬＬＧＡＲ−または−ＰＴＬＲＲＶＲＩＳＡ−または−ＧＫＦＫＲＰＴＬＲＲＶＲ−または−ＬＧＦＡＥＬＱＤ−または−ＮＹＲＡＹＡＴＥＰＨ−または−ＡＹＡＴＥＰＨ−または−ＬＧＦＡＥＬＱ−などを有する。
抗体に対する免疫学的応答を増幅するこれらの伸長エピトープは、上記のとおり決定された最小エピトープを含有するペプチド配列にアミノ酸を付加することにより決定された。
上記のとおり、リンカーＺのペプチド配列は、１〜４０アミノ酸からなる。Ｚのペプチド配列を形成するアミノ酸の数は、３０未満、特に、２０未満であるのが好ましい。
Ｚの特に好ましいペプチド配列としては、以下のアミノ酸配列：

から選択される配列が挙げられる。
Ｚのこの特に好ましいペプチド配列は、アミノ酸ストレッチの繰り返しを含有してもよく、３０個未満のアミノ酸を有する。
例として、以下の式（式中、ｎは、１〜５の整数を表す）で示されるＺペプチド配列が挙げられる：

Ｚは、式III〜Ｖ（式中、ｍは、１〜１０の整数である）で示される混合構築物を表してもよい。
非限定的な例としては、Ｚは、以下の配列を表してもよい：

本発明の好ましい化合物は、式Ｉ（式中、Ｚとして、上記で定義した配列Ｎｏ．６〜２６から選択される配列が挙げられる）で示されるビエピトープ化合物である。
Ξおよび／またはΨがペプチド配列を含有する場合、この配列は、結合されるＥ₁および／またはＥ₂と一緒に伸長エピトープを形成してもよい。
有利には、Ξの化学構造は、本発明のビエピトープ化合物を、天然担体蛋白質、ペプチド構築物または固相に結合させるような構造である。
式ＩａおよびＩｂ：

で示される合成ビエピトープペプチドは、式Ｉで示されるペプチドの一部を形成し、好ましいペプチドである。
式ＩａおよびＩａにおいて、
Ｚは、以下の配列：

（ここで、ｎは１〜５の整数を表し、ｍは、１〜１０の整数を表す）
から選択される配列を含むかまたは表し；
Ξは、所望により、以下の配列：

から選択される配列を含有するペプチド配列の残基と結合していてもよいアセチル基、システイニル基、ビオチニルまたはビオシチニル基を表し；
Ψは、アミノ残基または以下の配列：

の１つを含有するペプチド配列を表す。
以下に記載する配列２７〜３３の１つを含むペプチドが好ましい：

以下の式ＩａおよびＩｂで示される合成ビエピトープペプチドは、特に好ましいペプチドである。以下の２つの表において、ペプチド配列は、一文字表記を用いて示される。

式ＩａおよびＩｂにおいて、Ｅ₁およびＥ₂に相当する下線を付したアミノ酸配列は、トロポニンＩの最小エピトープを表す。Ｚの下線を付したアミノ酸は、それらが結合するＥ₁またはＥ₂と一緒になってトロポニンＩの伸長エピトープを形成する。
上記化合物のうち、化合物５、６、１０、１１、１２、１３、１４および１５は、特に好ましい化合物である。
これらのペプチドは、以下の配列を有する：

本発明の主題である式Ｉで示される合成エピトープ化合物は、慣用的な方法に従って固相合成法により得られる：R. B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, pp.2149-2154;R. C. Sheppard, in “Peptides 1971”, Nesvadba H(ed.)North Holland, Amsterdam, pp.111;E. Atherton and R. L. Sheppard, in“Solid phase peptide synthesis, a practical approach”, IRL PRESS, (1989), Oxford University Press, pp.25-34。自動合成器として、ミリポア９０５０プラス・ペプ・シンセサイザー（Ｍillipore ９０５０Ｐlus Ｐep Ｓynthesizer）または同等のシンセサイザーを用いることができる。
合成用の固体支持体は、用いられる技術および化学に適合すべきである。例えば、９０５０プラス・ペプ・シンセサイザーでの合成のためには、いわゆる「コンティニアス・フロー（continuous flow）」法に適した樹脂を用いることが推奨される；ＰＥＧＰＳ樹脂は、これらの基準を満たしている。これらの支持体は、ビーズのポリスチレンの官能基と最初のアミノ酸の結合部位との間にあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースとするスペーサーからなる。固定部のこの部位の性質は、選択されたＣ末端官能基により変化してもよい。例えば、アミドの形態のペプチドについては、ＰＡＬＰＥＧＰＳ型樹脂が用いられる。
原料として用いられる出発樹脂およびアミノ酸は、市販品である（パーセプティデ−バイオシステム（ＰerＳeptive-Ｂiosystem））。
以下の側鎖保護基を用いた：

９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆmoc）基により第一アミン官能基をアミノ酸のα位で一時的に保護した。脱保護は、ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジン溶液を用いて行われる。
カップリングについては、好ましくは、過剰のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）が用いられる。
合成後、該樹脂を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、次いで、ジクロロメタン）で洗浄し、真空乾燥させ、次いで、０℃に冷却した適当なスキャベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸をベースとした溶液で処理した。例えば、トリフルオロ酢酸８２％、フェノール５％、水５％、チオアニソール５％およびエタンジチオール３％を含有するＫ試薬を用いることができる。
次いで、かくして単離した合成ビエピトープペプチドを沈殿させ、エーテルで洗浄する。
次いで、該合成ビエピトープ化合物を逆相液体クロマトグラフィーに付すことにより精製し、それらの純度を質量分析法により測定する。例えば、相として、ボンダパック（Ｂondapak）Ｃ₁₈相を用いることができる。２つの緩衝液間で線形勾配液を形成することにより（最初は、実質的に水性（例えば、水−ＴＦＡ０．１％）であり、次は、有機性（例えば、アセトニトリル６０％、水４０％およびＴＦＡ０．０８％を含有する混合物）である）、該ペプチドを溶離する。回収した純粋なフラクションを合わせ、真空濃縮し、凍結乾燥させた。
トロポニンＩアッセイキットを用いて、式Ｉで示される化合物のビエピトープ特徴を測定した。例えば、サンドイッチ型イムノアッセイを用い、ペプチド配列Ｅ₁およびＥ₂と反応するモノクローナル抗体を含有するキットを用いることができる。
ビエピトープ特徴を測定するために、式Ｉで示される化合物を、例えば、正常ヒト血清または緩衝液であってもよいキットの希釈剤中で希釈し、それらを患者の試料と同様にアッセイする。
トロポニンＩの免疫学的アッセイ用の標準としての式Ｉで示される化合物の使用もまた、本発明の一部である。
本発明は、また、式Ｉで示される化合物を含有する組成物に関する。それらは、好ましくは、緩衝液中の式Ｉで示される化合物からなる水溶液または組成物である。緩衝液としては、例えば、カソン（Ｋathon）およびＢＳＡまたはカソン、レジレイト

およびＥＤＴＡ、またはカソン、プラスミオン（Ｐlasmion）および所望によりＥＤＴＡ、またはカソン、カゼインおよびＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄ｐＨ＝６．５−７．５）を用いることができる。
また、カソンおよびＢＳＡまたはカソン、レジレイトおよびＥＤＴＡまたはカソン、プラスミオンおよび所望によりＥＤＴＡ、またはカソン、カゼインおよびＥＤＴＡを含有するコハク酸緩衝液（ｐＨ＝５−６）またはトリス−ＨＣl緩衝液（ｐＨ＝７．５−８．５）を用いることができる。
グリシン、カソン、レジレイトおよびＥＤＴＡを含有する緩衝液を用いることもできる。
カソン、レジレイトおよびＥＤＴＡを含有するコハク酸またはリン酸緩衝液が好ましい。
ローム・アンド・ハース（Ｒhom and Ｈaas）社により市販されている抗菌剤であるカソン（登録商標）（Ｋathon▲Ｒ▼）は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（１．５％）からなる。
レジレイト（登録商標）

は、レジレイト

社により市販されている。
プラスミオン（登録商標）（Ｐlasmion▲Ｒ▼）は、ベロン・ラボラトリーズ（Ｂellon Ｌaboratories）により市販されており、水中の加工液体ゼラチン（３０g／l）、ＮaＣl（５．３８２g／l）、ＭgＣl（１４３mg／l）、ＫＣl（３７３mg／l）、乳酸ナトリウム（３．３６０g／l）からなる。
以下の緩衝液が特に好ましい：
−カソン（０．２％）、レジレイト（０．０５−２％）および２mＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ＝６）、
−カソン（０．２％）、カゼイン（０．０１−０．５％）および２mＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ＝６）、
−カソン（０．２％）、レジレイト（０．０５−０．５％）および２mＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄）（ｐＨ＝７．５）、
−カソン（０．２％）、カゼイン（０．０１−０．１％）および２mＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＰＯ₄）（ｐＨ＝７．５）。
血漿および式Ｉで示される化合物を含有する組成物は、また、本発明の一部である。
標準または対照として式Ｉで示される化合物を用いるイムノアッセイ法はまた、本発明の一部である。
本発明は、また、式Ｉで示される化合物または式Ｉで示されるビエピトープペプチドを含有する組成物を含有するイムノアッセイ用キットに関する。
以下の実施例により本発明を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
実施例１：
本発明化合物（ペプチド１０）の製造

固相上でこのペプチドを合成した。Merrifieldにより１９６３年に開発されたこの技術（J. Am. Chem. Soc. (1963)85, pp. 2149-2154）は、酸官能基により高分子固体支持体（樹脂）上に最初のアミノ酸を結合させ、この最初のアミノ酸からペプチド配列を伸長させることからなり、該ペプチドは、該樹脂上に固定されたまま合成される。
化合物１０の合成のために、合成器として９０５０プラス・ペプ・シンセサイザーを用い、樹脂として上記ＰＥＧＰＳ樹脂を用いた。
合成の種々の工程を表１に示す：

合成の最後に、樹脂を、ジメチルホルムアミド、次いで、ジクロロメタンで洗浄し、真空乾燥させた。
次いで、樹脂をＫ試薬（トリフルオロ酢酸８２％；フェノール５％；水５％；チオアニソール５％；エタンジオール３％）で処理した。次いで、沈殿により単離された化合物１０をジエチルエーテルで洗浄し、化合物１００．５２９gを得た。
同様の方法で、適当なアミノ酸を用いて、本発明の他の化合物を合成した。
質量分析により測定された式ＩａおよびＩｂで示されるいくつかの化合物の分子量を以下に示す。

実施例２：
本発明のペプチドの免疫反応性の評価
トロポニンＩアッセイキットを用いて、上記化合物のビエピトープ特徴を測定した。それは、キットＥＲＩＡトロポニンＩパスツール・コード７９６９１（ＥＲＩＡＴroponin ＩＰasteur Ｃode ７９６９１）である。
その原理は、ヒト血清において心臓トロポニンＩを定量的にアッセイするサンドイッチ型免疫酵素法に基づいている。
固相は、抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体（８Ｅ１）で被覆されたポリスチレンチューブからなる。
ペルオキシダーゼに結合した第２の抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体（１１Ｅ１２）により視覚化される。
該試験は、以下の工程からなる：
固相に固定された抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体の存在下、試料および標準（動物起源のトロポニンＩ標準）ならびにペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体をインキュベートする。
一連の洗浄後、テトラメチルベンジジン色素原を添加することにより、酵素的視覚化を行う。
視覚化を停止した後、λ＝４５０nmで化学濃度を測定する。得られた吸光度は、チューブ中に存在する心臓トロポニンＩの濃度と直接関連がある。
化合物１、２、５、６、１０、１１および１２を水に溶解した（場合に応じて、Ｃ＝１mg／または２mg／ml）。これらの溶液を、レジレイト０．０５％およびカソン０．２％および２mＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍコハク酸緩衝液ｐＨ＝６を用いて再希釈した。次いで、核「最終溶液」を、上記プロトコールの「試料」としてアッセイした。
さらにまた、化合物１、２、１０および１１をヒト血清中で希釈した後に試験した。この場合、濃度２mg／mlの化合物１、２、１０および１１を含有する水性「保存」溶液を正常ヒト血清中で希釈することにより「最終溶液」を得た。
全ての化合物は、トロポニンＩのアッセイにおいて反応性を示す。
実施例３：
安定性の試験
本発明化合物（化合物１０）を水に希釈した（Ｃ＝２mg／ml）。この「保存」溶液から、４つの「実験」溶液Ｓ₁、Ｓ₂、Ｓ₃およびＳ₄を得る。
種々の希釈を行うために、溶液Ｓ₁（Ｃ＝０．５ng／ml）およびＳ₂（Ｃ＝１ng／ml）については、カソン（０．２％）、レジレイト（０．０５％）および２mＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）を用いた。
「保存」溶液を、カソン（０．２％）、レジレイト（０．０５％）および２mＭＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄ｐＨ＝７．５）で希釈することにより、溶液Ｓ₃（Ｃ＝０．５ng／ml）およびＳ₄（Ｃ＝１ng／ml）を得た。
Ｄ０（溶液調製日）に、実施例２に記載したプロトコールに従って、溶液Ｓ₁、Ｓ₂、Ｓ₃およびＳ₄をアッセイした。得られた値は、安定性のモニターリング用の参照として供された。
次いで、溶液Ｓ₁、Ｓ₂、Ｓ₃およびＳ₄を＋４℃で保存し、定期的にアッセイした。アッセイの各シリーズの間、３つの「対照溶液」を用いた。それらは、アッセイ測定範囲に分布された乾燥トロポニンＩ対照血清である。これらの血清について、凍結乾燥対照血清の貯蔵寿命は、１８ヶ月を超えることが予め示された。各安定性試験の間、試験された対照の各々がその目標濃度で得られたことをチェックした。したがって、これにより、種々の試験の間にペプチドに対して得られた濃度を比較することができた。特に、Ｄ０（溶液調製日）の本発明化合物の溶液の濃度を、安定性試験の間の本発明化合物の濃度と比較することができた。対照について、安定性試験の間、一定の値が常に見出されるということは、行われた試験を実証することができる。
安定性試験の間に得られた結果を表２および３に示す。

表１および２に示された結果は、本発明の化合物１０の溶液の優れた安定性を示す。
式Ｉで示される他の化合物を用いて行われた試験は、それらの安定性が化合物１０のものに匹敵することを示した。例えば、化合物６を用いて行った試験は、カソン（０．２％）、レジレイト（０．２％）および２mＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ＝６）中溶液中で＋４℃で保存した場合、この化合物が少なくとも９ヶ月間優れた安定性を有することを確認した。化合物６は、０．２５、４．８および１８ng／mlの濃度を得るために、上記緩衝液に溶解させた。
この安定性試験は、−２０℃で保存され参照として用いられる化合物６により実証された。
−２０℃で少なくとも１８ヶ月間保存した場合、化合物６が安定であることは、予めチェックされた。この試験の結果を表４に示す。

Claims

式Ｉ：
Ξ−Ｅ₁−Ｚ−Ｅ₂−Ψ (Ｉ)
［式中、
Ｅ₁およびＥ₂は、同一または異なって、トロポニンＩの最小エピトープからなるペプチド配列を表し、ここで、最小エピトープは以下の配列：

からなる群から選択され、
Ｚは、
式IV：
−[ｐｅｐ₁−ＮＨ−(ＣＨ₂)_m−ＣＯ−ｐｅｐ₂]_p− (IV)
[式中、
ｍは、５であり、
ｐは、１であり、
ｐｅｐ₁およびｐｅｐ₂は、同一または異なっており、各々、Ｅ₁エピトープのＣ端末およびＥ₂エピトープのＮ末端に隣接するトロポニンＩ配列からのアミノ酸２〜１０個からなるペプチド鎖を表す]
で示される混合構築物
を表し、
Ξは、
・水素原子、アセチル基、アミノ酸１〜１０個のペプチド配列、アミノ酸１〜１０個のＮ−α−アセチル化ペプチド配列、システイニル、ビオチニルもしくはビオシチニル基、または、システイニル、ビオチニルもしくはビオシチニル残基を有するアミノ酸１〜１０個のペプチド配列、
・線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖、または
・Ｎ−α−アセチル化線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖
を表し、
Ψは、
・ヒドロキシル基、アミノ基、アミノ酸１〜１０個のペプチド配列、Ｃ末端にアミノ末端基を有するアミノ酸１〜１０個のペプチド配列、ここで、該アミノ末端基は、Ｃ末端アミノ酸残基のカルボン酸基とアミド基を形成するアミノ基である、または
・ヒドロキシル基またはアミノ基を有する線状または分枝アミノ(Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル)カルボニル鎖
を表す]
で示されるビエピトープ化合物。
式ＩａまたはＩｂ：

[式中、
Ｚは、配列Ｎo.２６：−Ａla Ｌys Ｌys−ＮＨ−(ＣＨ₂)_m−ＣＯ−Ａla Ｍet Ｍet Ｇln Ａla−（ここで、ｍは、５である）を表し；
Ξは、以下の配列；

から選択される配列を含有するペプチド配列の残基と結合していてもよいアセチル基、システイニル基、ビオチニルまたはビオシチニル基を表し；
Ψは、アミノ基または以下の配列：

から選択される配列を含有するペプチド配列を表す]
で示される請求項１記載のビエピトープ化合物。
以下の化合物：
化合物６

および
化合物１４

から選択される請求項１記載のビエピトープ化合物。
トロポニンＩのイムノアッセイにおける標準としての請求項１記載のビエピトープ化合物の使用。
水、血漿または緩衝液中溶液中の請求項１記載の式Ｉで示される化合物を含有する、トロポニンＩのイムノアッセイ用組成物。
緩衝液がリン酸緩衝液、コハク酸緩衝液またはトリス−ＨＣl緩衝液から選択される請求項５記載の組成物。
緩衝液が以下の溶液：
−カソン（登録商標）、レジレイト（登録商標）およびＥＤＴＡを含有するコハク酸緩衝液（０．１ＭｐＨ＝５−６）、
−カソン、カゼインおよびＥＤＴＡを含有するコハク酸緩衝液（０．１ＭｐＨ＝５−６）、
−カソン、レジレイトおよびＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１ＭｐＨ＝６．５−７．５）、
−カソン、カゼインおよびＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１ＭｐＨ＝６．５−７．５）
のいずれか１種類である請求項５記載の組成物。
標準または対照として請求項１記載の式Ｉで示されるビエピトープ化合物を用いるトロポニンＩのイムノアッセイ方法。
イムノアッセイがサンドイッチ型のものである請求項８記載の方法。
請求項１記載の式Ｉで示されるビエピトープペプチドまたは請求項５記載の式Ｉで示されるビエピトープ化合物を含有する組成物を含有するトロポニンＩのイムノアッセイ用キット。