JP3834332B2 - β−グルカンの測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−(1,3)(1,4)−D−グルカン(以下、β−グルカンと略記することがある。)の測定方法に関し、さらに詳しくは各種の大麦をはじめとする穀類や麦芽,麦汁,ビールなどに含まれるβ−グルカンを測定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
下記の構造式で表されるCalcofluorは、β−グルカンと特異的に結合し、その結合により蛍光強度が増加する蛍光剤であり、この化合物を用いてβ−グルカンを定量するフローインジェクション法がデンマークのカールズベルグ社のヨルゲンセンらによって報告されている(Carlsberg Res.Commun.Vol.53,p.277−285,1988;Analytica−EBC,3.11.2.)。
【0003】
【化1】
【0004】
また、同様の原理によるCalcofluorを用いたフローインジェクション法が数名の研究者によって報告されており(Journal of the Institute of Brewing,Vol.95,p.327,1989:Journal of the Institute of Brewing,Vol.93,p.396,1987)、
近年スウェーデンのTecator社やアメリカのFiatron社(Journal of the American Society of Brewing Chemists,Vol.93,p.396,1987)によってCalcofluorを用いたフローインジェクションシステムが市販されている。
【0005】
これらはいずれも図1もしくは図2に見られる様なシステムを応用したものであり、pH10からpH8の範囲のトリス緩衝液もしくはグリシン緩衝液にCalcofluorを8〜35mg/リットルとなるように溶解させた反応液の流液に試料を注入もしくは試料を注入した溶液の流液を混合し、適当なチューブを用いβ−グルカンと結合させ、蛍光検出器にてその蛍光強度の増加を測定するものである。
【0006】
これらの方法により麦汁,ビール等のサンプル中のβ−グルカン含量を決定するにあたり、大麦より抽出した精製β−グルカンを溶解させた濃度既知の溶液を標準試料として用いている。
【0007】
しかし、これまで報告されているCalcofluorを用いたフローインジェクション法においてはサンプルである麦汁中の糖やビール中エタノールの影響により測定値が変化すること、また、それらの影響がサンプル注入量,混合部分の空寸体積量等の測定条件により異なり、同一のサンプルにおいてβ−グルカン含量の測定値が異なることが報告されている。
【0008】
さらに、最近に至って麦汁やビール中にCalcofluorの蛍光反応を阻害する低分子成分(糖類,エタノール等)が存在することや、それらの麦汁,ビール中における含量が使用する麦芽の種類,量等によって異なることが明らかとなった。
【0009】
これらの糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質といったものが、麦汁,ビール中のβ−グルカン含量を従来のCalcofluorを用いたフローインジェクション法によって測定する上で誤差を生む要因となることは明らかである。
【0010】
そのため、測定するサンプル中の糖やエタノール含量、Calcofluorの蛍光反応阻害物質等の影響を受けないシステムを構築することが精度の向上に有効であり、その開発が待たれている。
本発明の目的は、Calcofluorを用いるフローインジェクション法によるβ−グルカンの測定において、その精度と再現性の向上を図ることにあり、そのための手段として短いゲル濾過カラムを用いて分子量1万以上の高分子のβ−グルカンはカラム担体に保持させることなく素通りさせ、低分子の糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質等はカラム担体であるゲル粒子に数秒から数十秒保持させることにより、β−グルカンと分離溶出させるシステム並びに測定条件を設定することである。
【0011】
また、使用するカラムの容量を最適化して、カラムを使用しない場合と同等の分析時間(数分(好ましくは3分)以内)で分析できるようにすることである。
【0012】
本発明は、Calcofluorを用いるフローインジェクションシステムによるβ−グルカンの測定法において、サンプルを流液に注入後、検出対象である分子量1万以上の高分子β−グルカンを所定時間以内(数分(好ましくは3分)以内)に溶出させ、かつマルトース,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質といった低分子成分の溶出を高分子のβ−グルカンよりも遅らせることが可能なゲル濾過カラムにサンプル流液を通し、目的とするβ−グルカンと測定値変動の要因となる成分を分離させ、そのカラム通過後に蛍光検出器にて測定するシステムである。
【0013】
以上に述べたように、本発明は検出対象である高分子β−グルカンがゲル粒子の網目構造の内部に入り込むことなく、ゲル粒子間の空隙を経てゲル粒子間の空隙の全体積に等しい液量(ゲル粒子外部容積量あるいはボイド容量という)の溶媒を流した時に速やかにカラムから溶出するようゲル粒子外部容積量が所定時間内(数分以内(好ましくは3分以内))にカラムから溶出する液量以下の範囲であり、かつゲル粒子の網目構造の内部に入り込む低分子物質がカラムから溶出するまでの液量に対応するカラム内部容積量(ゲル粒子外部容積量とゲル粒子内溶媒容積とを合わせた量)がサンプル注入量の10倍以上であるゲル濾過カラムを、システムのサンプルを注入する箇所より検出器までの間に配置することを特徴とするβ−グルカンの測定法である。
【0014】
なお、サンプル注入量に対して上記カラム内部容積量が小さいと、分子量1万以上の高分子のβ−グルカンと低分子の糖、エタノール、Calcofluorの蛍光反応阻害物質との十分な分離が行えないことになる。
【0015】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、Calcofluorを用いるフローインジェクションシステムによるβ−グルカンの測定方法において、ゲル濾過カラムを、サンプルを流液に注入する箇所より検出器までの間に配置してなるフローインジェクションシステムに、β−(1,3)(1,4)−D−グルカンと低分子成分とを含むサンプルを注入し、β−グルカンを該カラムのゲル粒子に保持させることなく素通りさせて1分以内に溶出させ、低分子成分の溶出をβ−グルカンよりも遅らせること、および、該カラムが、
(a)ゲル粒子として、限界排除分子量30万以下4千以上のものを使用し、
(b)ゲル粒子外部容積量が1分以内のカラム溶出液量以下の範囲にあり、かつ
(c)カラム内部容積量がサンプル注入量の10倍以上である
ことを特徴とするβ−グルカンの測定方法に関する。
【0016】
【図面の簡単な説明】
図1は、Calcofluorを用いたフローインジェクション法によるβ−グルカン含有量の従来型測定システムの1例を示す。
図2は、Calcofluorを用いたフローインジェクション
法によるβ−グルカン含有量の従来型測定システムの他の例を示す。
図3は、Calcofluorを用いたフローインジェクション法によるβ−グルカン含有量のゲル濾過カラム使用測定システムの1例を示す。
図4は、Calcofluorを用いたフローインジェクション法によるβ−グルカン含有量のゲル濾過カラム使用測定システムの他の例を示す。
図5は、本発明の方法における反応部分の空寸体積量の影響を示した図である。
図6は、本発明の方法におけるサンプル注入量の影響を示した図である。
図中、1はCalcofluor反応液、2はポンプ、3はサンプル注入器、4は反応部分、5はインテグレータ(検出データの定量計算等のデータ処理を行う)、6は蛍光検出器、7は廃液、8は緩衝液もしくは蒸留水、9はゲル濾過カラムを示す。
【0017】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、図3および図4に示される様なシステムからなり、図1および図2に示される様な従来用いられていたシステムをそのまま応用することが可能である。
【0018】
本発明の測定方法における重要な点として、使用する担体粒子の種類,カラムの容積がある。通常、用いられている分析用のゲル濾過カラムを用いた場合、サンプルの溶出に時間がかかりすぎ(分析時間は30分以上要する)、短時間での測定を特徴とするフローインジェクション法には不適切となる。しかし、逆に分析時間を短縮するためカラムの容積を大幅に減少させると、高分子β−グルカンとマルトース,エタノール、Calcofluorの蛍光反応阻害物質の低分子成分との分離が不十分になる恐れがある。
【0019】
また、目的とするβ−グルカンが担体の粒子に保持され、分子量ごとに分離溶出した場合(分子ふるいがかかると言う)、麦汁,ビール等の試料中のβ−グルカンの分子量分布の違いによってピーク高さが変化し、測定値が分子量分布の影響を受けることになり、高分子β−グルカンの総量を測定するという本発明の目的に適合しなくなる。
【0020】
したがって、短時間で高分子のβ−グルカンと糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質の低分子物質を分離することが可能で、かつ高分子β−グルカンを分子ふるいにかけることなく溶出できるゲル濾過カラムの要件が必要となる。
【0021】
具体的にはフローインジェクション法として、高分子β−グルカンを早く溶出する必要があるため、使用するカラムのゲル粒子外部容積量は小さい方が望ましく、高分子β−グルカンを短時間で通過させるためには、所定時間にカラムより溶出される液量以下であることが必要である。
【0022】
また、低分子の糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質を分離するためには、少なくともサンプル注入量の10倍量以上のゲル粒子充填後のカラム内部容積量が必要と考えられる。
【0023】
なお、後述する実施例では、高分子β−グルカンを1分以内で溶出させるようにするため、上記のゲル粒子外部容積量は1分当たりのカラム溶出液量以下としてある。すなわち、1分以内にHPLCで分析することができる。
【0024】
次に、目的とする高分子β−グルカンを分子ふるいにかけることなく、高分子β−グルカンと低分子の糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質を分離するためには、限界排除分子量4千以上30万以下の担体粒子を用いる必要があると考えられる。
【0025】
限界排除分子量が30万を超えるものを用いた場合、麦汁,ビール中の高分子β−グルカンが分子ふるい作用を受けるとともに、溶出が遅れるため、低分子の糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質との分離が不十分なものとなる。また、限界排除分子量が4千未満のものを用いた場合、逆に低分子の糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質の溶出が早くなるため、β−グルカンとの分離が不十分なものとなる。
【0026】
以上の理由から、本発明では通常、限界排除分子量4千以上30万以下の担体粒子を用いるが、特に限界排除分子量10万前後のものが望ましい。このような条件を満たす担体粒子としては、例えばShodex OHpak SB−803 HQ(商品名、昭和電工株式会社製),Asahipak GS320 HQ(商品名、昭和電工株式会社製)等が挙げられる。
【0027】
また、本発明を実施するには、理論段数(カラムの分離能を表す指標)の高いカラムが適しており、1万以上の理論段数を有するゲル濾過担体を用いることが望ましい。
【0028】
本発明の方法を実施する場合、図3に示した様なポンプ1つを用いたシステムにおいても上記カラムを使用することできるが、CalcofluorおよびCalcofluorの蛍光反応に合わせた緩衝液をカラムに通すことによる分離能の低下やカラムの劣化が早い等の問題がある。それ故、図4に示すように、サンプルを注入しカラムに通す流液とCalcofluorを含む流液は別にし、カラム通過後、試料中のβ−グルカンとCalcofluorを反応、結合させるシステムとした方がより望ましいと考えられる。
【0029】
また、該システム中にゲル濾過カラムを設置する位置は、サンプルを流液に注入する部位から検出器までであり、好ましくは該サンプル注入部位からCalcofluor反応部位に至るまでの間に存在し、サンプル中の低分子の糖,エタノール,Calcofluorの蛍光反応阻害物質とβ−グルカンとが分離され、先に溶出してくる高分子β−グルカン含有流液とCalcofluor反応液とが反応部分で混合され、高分子β−グルカンが検出される。
【0030】
なお、本発明の方法では、β−グルカン検出後、前記阻害物質,糖,エタノールも同様にCalcofluorと混合され、検出器を通り、前記阻害物質が多い場合には、β−グルカンのピークの後にマイナスピークが見受けられるが、通常はβ−グルカンのピークのテーリングに埋もれているため、特別なピークは見受けられない。
【0031】
なお、前記阻害物質が負のピークを示すのに対し、マルトース,エタノールは正のピークを生じるため、両者が打ち消し合ってピークが表れないものと考えられる。
【0032】
ゲル濾過カラムにサンプルを運ぶ流液(溶媒)としては、カラムを劣化させず次のCalcofluorとβ−グルカンとの反応に影響を与えないものが望ましく、具体的には蒸留水等が考えられる。
【0033】
Calcofluorを用いるフローインジェクション法による測定装置にゲル濾過カラムを組み入れて使用する場合、測定時の環境温度(測定を行う室の温度)を常に一定にしておく必要がある。しかも、その環境温度値を10〜40℃の範囲、より好ましくは15〜30℃の環境温度範囲に設定することが望ましい。
【0034】
これは、後述の実施例においても説明するが、測定時の環境温度が変化すると、β−グルカンの測定値が変化するもので、カラムの分離能やサンプル中に含まれる低分子のβ−グルカンとCalcofluorとの反応性が周囲温度に応じて変化するからである。
【0035】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
【0036】
実施例1
図4に示したシステムを使用して実施した。カラム側の溶媒としては蒸留水、カラム通過後の混合液として、Calcofluor 20,TritonX100を含む0.1M Glycine−NaOH緩衝液(pH9.2)を使用し、流速は両液とも2ml/minの条件で実施した。なお、蛍光検出器の励起波長は360nm、蛍光波長は420nmで測定した。0.1M Glycine−NaOH緩衝液の代わりに、0.1M Tris−HCl緩衝液(pH8.2)を用いてもよい。
【0037】
反応部分として内径0.5mm,空寸体積量0.5mlのテフロンチューブを使用した。また、カラムは担体粒子として昭和電工株式会社製の「Shodex OHpak SB−803 HQ」(限界排除分子量10万)を内径6.0mm,長さ50mmのカラムに充填したもの(ゲル粒子外部容積量0.5ml,カラム内部容積量0.9ml)を使用し、サンプル注入量は0.02mlとした。
標準溶液として大麦より抽出した精製β−グルカン(Sigma社製)を30mg/リットル、50mg/リットル、75mg/リットル、100mg/リットル、150mg/リットル、200mg/リットル、250mg/リットルとなるように蒸留水中に溶解させたものを使用し、各標準溶液により得られる測定ピークの高さより検量線を作成した。
【0038】
一方、ビールにβ−グルカナーゼを添加したビール中のβ−グルカンを分解後、加熱処理によりβ−グルカナーゼを失活させて調製したβ−グルカンを含まないビールに大麦β−グルカンを100mg/リットルとなるように溶解したものをサンプルA、同様に調製したβ−グルカンを含まない麦汁に大麦β−グルカンを100mg/リットルとなるように溶解したものをサンプルB、10%(w/v)のマルトース水溶液に大麦β−グルカンを100mg/リットルとなるように溶解したものをサンプルCとし、さらに5%(v/v)のエタノール水溶液に大麦β−グルカンを100mg/リットルとなるように溶解したものをサンプルDとし、各サンプルのピークの高さを測定し、上記検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第1表に示す。なお、環境温度(測定装置周辺の温度)は20℃である。
【0039】
【表1】
【0040】
実施例2
実施例1と同様にしてサンプルの麦汁EおよびビールF中のβ−グルカン含量を所定の環境温度(測定装置周辺の温度は18,22,25℃)にて同様に測定し、実施例1と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第2表に示す。
【0041】
【表2】
【0042】
実施例3
サンプルとして実施例2と同様に麦汁E,ビールFを用い、かつ20℃の恒温槽にシステム全体を入れて測定を行ったこと以外は実施例1と同様にしてピークの高さを測定し、実施例1と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第2表に示す。
【0043】
比較例1
図2に示したシステムを使用し、ゲル濾過カラムが取り付けられていないこと以外は実施例1と同一条件で試料のサンプルA〜Dについてピークの高さを測定し、実施例1と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第1表に示す。
【0044】
比較例2
サンプル注入量を0.1mlにしたこと以外は実施例1と同一システム、同一条件でサンプルA〜Dについてピークの高さを測定し、実施例1と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第1表に示す。
この場合、カラム内部容積量は0.9mlであるから、サンプル注入量の9倍の容量を有することとなる。
【0045】
比較例3
ゲル濾過粒子として昭和電工株式会社製の「Shodex OHpak SB−804 HQ」(限界排除分子量200万)を使用したこと以外は実施例1と同一システム、同一条件にてサンプルA〜Dについてピークの高さを測定し、実施例1と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中のβ−グルカン含量を決定した。結果を第1表に示す。
【0046】
第1表の結果から明らかなように、実施例1の測定値が理論値通り100mg/リットルもしくはこれに非常に近い値を示すのに対し、比較例ではいずれもβ−グルカンとマルトース,エタノール,Calcofluor蛍光反応阻害物質との分離ができない、もしくは不十分なため、理論値よりも低い値や高い値を示している。
【0047】
したがって、適切な要件を備えたゲル濾過カラムを使用することにより、ビールや麦汁中に含まれる測定値の変動要因となる低分子物質をβ−グルカンと分離することが可能であり、より正確な測定ができることが示された。
【0048】
また、実施例1の測定装置,条件を見れば明らかなように、1サンプルの測定時間は1分以内で可能であり、サンプル注入操作を考慮すれば、実質的にカラムを用いない従来の測定装置の場合と測定時間は変わらないことが認められた。
【0049】
なお、第2表が示すように、測定装置全体を一定温度に保つことにより、室温によらず一定の測定値が得られ、さらに精度が向上することが認められた。
すなわち、測定時の周囲温度は常に一定の温度で行う必要がある。
また、同一測定を繰り返す場合にも環境温度は同一値、かつ一定である必要がある。
【0050】
実施例4
実施例1において、カラム側の流液として蒸留水を1ml/minの流速で、カラム通過後の混合液としてCalcofluorを2ml/minの流速で実施し、さらに反応部分として内径0.5mm、空寸体積量を所定値に変化させたテフロンチューブを使用し、さらにサンプル注入量を0.005mlとしたこと以外は実施例1と同様にして行った。
上記の条件で反応部分の空寸体積量を変化させて測定した。得られた結果を図5に示す。
【0051】
図の縦軸は反応部分の空寸体積が300μlのときの測定値を1とした場合の相対値を示している。この図から明らかなように、空寸体積量500μl以下では測定値の変動が認められない。このことは、ミキシングチューブが長いほど分離された高分子β−グルカンと低分子β−グルカンとが再度混合されてしまうためと考えられる。
【0052】
実施例5
実施例4と同一条件で、空寸体積量を0.5mlとし、サンプル注入量を5μlから80μlまで変化させて測定を行った。その結果を図6に示す。なお、図6の縦軸はサンプル注入量を5μlとした時の測定値を1とした場合の相対値を示している。この図から明らかなように、サンプル注入量を80μl程度に増やしても、測定誤差はほとんど生じていない。すなわち、カラム内部容積量900μlに対してサンプル注入量を1/11以下にすること(カラム内部容積量がサンプル注入量の11倍量以上となること)により、測定値の変動はほとんど認められない。
【0053】
【産業上の利用可能性】
本発明の方法によれば、サンプルに含まれるマルトース等の低分子糖類やエタノール,Calcofluor蛍光反応阻害物質などの成分による影響を受けないで、サンプル中のβ−グルカン含有量を高い精度で、かつ再現性よく測定することができる。したがって、種々の穀類,麦芽抽出液,麦汁,ビールなどのサンプル中のβ−グルカン含有量を客観的に比較、評価することが可能である。
Claims (3)
- Calcofluorを用いるフローインジェクションシステムによるβ−グルカンの測定方法において、ゲル濾過カラムを、サンプルを流液に注入する箇所より検出器までの間に配置してなるフローインジェクションシステムに、β−(1,3)(1,4)−D−グルカンと低分子成分とを含むサンプルを注入し、β−グルカンを該カラムのゲル粒子に保持させることなく素通りさせて1分以内に溶出させ、低分子成分の溶出をβ−グルカンよりも遅らせること、および、該カラムが、
(a)ゲル粒子として、限界排除分子量30万以下4千以上のものを使用し、
(b)ゲル粒子外部容積量が1分以内のカラム溶出液量以下の範囲にあり、かつ
(c)カラム内部容積量がサンプル注入量の10倍以上である
ことを特徴とするβ−(1,3)(1,4)−D−グルカンの測定方法。 - 試料を注入した蒸留水をカラムに通過させた後、Calcofluorを含み、Calcofluorの蛍光反応に適した組成の流液と混合させる請求項1記載のβ−(1,3)(1,4)−D−グルカンの測定方法。
- 測定時における測定装置周辺の温度を10〜40℃の範囲内の一定温度に保つ請求項1または2のいずれかに記載のβ−(1,3)(1,4)−D−グルカンの測定方法。
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