JPH07248297A - β−グルカンの測定法 - Google Patents

β−グルカンの測定法

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JPH07248297A
JPH07248297A JP6065423A JP6542394A JPH07248297A JP H07248297 A JPH07248297 A JP H07248297A JP 6065423 A JP6065423 A JP 6065423A JP 6542394 A JP6542394 A JP 6542394A JP H07248297 A JPH07248297 A JP H07248297A
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glucan
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Masayuki Izawa
正行 井沢
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Sapporo Breweries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【構成】 Calcofluorを用いるフローインジ
ェクションシステムによるβ−(1,3)(1,4)−
D−グルカンの測定法において、サンプル注入量が、反
応部分の空寸体積量が0.4ml未満の場合は、0.03×
空寸体積量(ml)+0.0018≦サンプル注入量(m
l)≦0.066×空寸体積量(ml)+0.0018を、
反応部分の空寸体積量が0.4ml以上の場合は、 0.01×空寸体積量(ml)+0.0098≦サンプル注
入量(ml)≦0.026×空寸体積量(ml)+0.00
178 を満足し、かつ0.002〜0.1mlの範囲内であること
を特徴とするβ−(1,3)(1,4)−D−グルカン
の測定法。 【効果】 試料中のβ−グルカン含有量を高い精度で、
かつ再現性よく測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、β−(1,3)(1,
4)−D−グルカン(以下、β−グルカンと略記するこ
とがある。)の測定法に関し、詳しくは各種の大麦をは
じめとする穀類や麦芽,麦汁,ビールなどに含まれるβ
−グルカンを測定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】下記の構造式で表されるCalcofl
uorは、β−グルカンと特異的に結合し、その結合に
より蛍光強度が増加する蛍光剤であり、この化合物を用
いたフローインジェクション法はデンマークのカールズ
ベルグ社のヨルゲンセンらによって報告されている(C
arlsberg Res.Commun.Vol.53,
p.277−285,1988;Analytica−E
BC,3.11. 2.)。
【0003】
【化1】
【0004】また、同様の原理によるCalcoflu
orを用いたフローインジェクション法が数名の研究者
によって報告されており(Journal of th
eInstitute of Brewing,Vol.9
5,p.327,1989:Journal of th
e Institute of Brewing,Vol.
93,p.396,1987)、 近年スウェーデンのT
ecator社やアメリカのFiatron社(Jou
rnal of the AmericanSocie
ty of Brewing Chemists,Vol.
93,p.396,1987)によってCalcoflu
orを用いたフローインジェクションシステムが市販さ
れている。
【0005】これらはいずれも図1もしくは図2に見ら
れる様なシステムを応用したものであり、pH10から
pH8の範囲のトリスもしくはグリシン緩衝液にCal
cofluorを8〜35mg/リットルとなるように
溶解させた反応液の流液に試料を注入もしくは試料を注
入した溶液の流液を混合し、適当なチューブを用いβ−
グルカンと結合させ、蛍光検出器にてその蛍光強度の増
加を測定するものである。これらの方法により麦汁,ビ
ール等の試料中のβ−グルカン含量を決定するにあた
り、大麦より抽出した精製β−グルカンを溶解させた濃
度既知の溶液を標準試料として用いている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これまで報告
されているCalcofluorを用いたフローインジ
ェクション法は、サンプル注入量,混合チューブの長さ
や空寸体積量,流速,反応液pH,Calcofluo
r濃度等がそれぞれ測定条件が異なっており、それらの
違いにより同一の試料のβ−グルカン含量の測定値が異
なることが経験されている。特に従来の報告では、測定
温度は特定されておらず、任意の室温にて通常測定がな
されていたが、測定温度によって麦汁,ビール等の試料
の測定値が変化することが認識されている。また、Ca
lcofluorとβ−グルカンの結合により生じる蛍
光強度の増加量は温度により変化するが、その変化の割
合が標準サンプルの分子量10万以上の高分子β−グル
カンとビールや麦汁等の中にいくらか含まれる分子量1
0万以下の低分子β−グルカンとでは違っており、温度
が低い程、低分子β−グルカンのCalcofluor
との反応による蛍光増加量が高分子β−グルカンに比べ
て高くなることが認められている。
【0007】よって、測定温度が低温である程、ビー
ル,麦汁等の低分子β−グルカンを含む試料の測定値が
高くなる。ところで、通常麦汁には、様々な糖成分が含
まれており、ビールには糖の他にエタノールが含まれて
いるが、この様な成分が従来のCalcofluorを
用いたフローインジェクション法の測定値に影響を与え
ることも認められた。これらの事象は大麦抽出液,麦
汁,ビール等の中に含まれるβ−グルカンを測定する上
において誤差を生む原因となることは明かである。その
ため、測定時の室温や糖類,エタノール等の影響を受け
ないシステム、測定条件を設定することが精度の向上に
有効であり、その開発が待たれている。
【0008】
【課題を解決するための手段および作用】本発明の目的
は、Calcofluorを用いるフローインジェクシ
ョン法によるβ−グルカンの測定精度と再現性の向上を
図ることにあり、そのための第1の手段として従来任意
の室温にて行われていた測定をシステムの一部、最適な
条件としてはシステム全てを同一の温度にて保持するこ
とにより行い、温度変化による測定値の変動を防ぐこと
である。第2の手段として、試料中の糖やエタノール等
の目的とするβ−グルカン以外の成分による影響を低減
し、種々の試料において客観的な測定値が得られる様な
測定条件を設定することである。
【0009】本発明は、Calcofluorを用いる
フローインジェクションシステムによるβ−グルカンの
測定法において、該システムのCalcofluor反
応液と試料を混合する箇所より検出器までの間にある反
応部分を0〜40℃の温度範囲で一定温度に保つことを
特徴とするβ−グルカンの測定法並びにCalcofl
uorを用いるフローインジェクションシステムによる
β−(1,3)(1,4)−D−グルカンの測定法にお
いて、サンプル注入量が、反応部分の空寸体積量が0.4
ml未満の場合は、
【0010】
【数5】0.03×空寸体積量(ml)+0.0018≦サ
ンプル注入量(ml)≦0.066×空寸体積量(ml)
+0.0018
【0011】を、反応部分の空寸体積量が0.4ml以上
の場合は、
【0012】
【数6】0.01×空寸体積量(ml)+0.0098≦サ
ンプル注入量(ml)≦0.026×空寸体積量(ml)
+0.00178
【0013】を満足し、かつ0.002〜0.1mlの範囲
内であることを特徴とするβ−(1,3)(1,4)−
D−グルカンの測定法を提供するものである。
【0014】本発明の方法は、図1および図2に示され
た従来用いられていたシステムをそのまま応用すること
が可能である。測定温度の一定化において最も重要な部
分は試料注入後より検出器に至るまでの反応および混合
部分である。この部分によりCalcofluorとβ
−グルカンの結合が実質的に行われるため、この部分を
一定温度に保つことにより室温の相違による測定値の変
化をかなり低減することができる。
【0015】さらに、Calcofluor反応液およ
び該反応液の容器を反応部分と同様の温度で一定に保つ
ことがより効果的である。反応部分が短い場合には、試
料が検出器に至るまでの間に目的の温度に達しない可能
性があるため、その様な場合には、予め反応液の温度を
反応部分の温度と同一にしておくことが必要であると考
えられる。また、検出器も反応部分と同一の温度に保つ
ことがより望ましい。その理由は、検出器の内部におい
て、実際の測定セル部分に至るまでに試料の温度変化の
可能性が考えられるからである。最も効果的に温度変化
の影響を無くすことができるのは、上記の部分だけでは
なくポンプ,サンプルインジェクターを含めたシステム
全体を一定の温度に保持することである。
【0016】しかし、余りに高い測定温度はCalco
fluorとβ−グルカンの結合を妨げるので、望まし
くない。通常、実用的には0℃から40℃程度の温度が
適当であり、システムそのものを一定温度に保つ場合に
は、15〜30℃程度が望ましい。Calcofluo
rを用いたフローインジェクション法によるβ−グルカ
ンの測定法の種々の条件の中で、サンプル注入量と反応
部分空寸体積量が、試料中に含まれる糖類やエタノール
による測定値への影響の程度に最も関係する。サンプル
注入量が多くなればなるほど、糖類やエタノールを含ん
でいる試料の測定値は、これらを含んでいない試料に比
べて低くなるが、逆にある注入量より少なくなればなる
ほど、糖類やエタノールを含んでいる試料の測定値は、
これらを含んでいない試料に比べて高くなる。
【0017】糖類やエタノールによる測定値への影響
が、これらを含んでいない試料に対して測定値を高くす
る作用から低くする作用に変わる特定のサンプル注入量
が存在することが確認された。しかし、そのサンプル注
入量は、反応部分の空寸体積量に応じて変化するもので
ある。よって、特定の反応部分の空寸体積量に対して糖
類やエタノールの影響を余り受けない特定のサンプル注
入量が存在するわけである。しかしながら、これらはそ
の他の測定条件によって若干の影響を受けるとともに、
糖類とエタノールの種類や含有量等によっても若干異な
ることから、次のような条件を設定することが適切であ
る。
【0018】サンプル注入量が、反応部分の空寸体積量
が0.4ml未満の場合は、
【0019】
【数7】0.03×空寸体積量(ml)+0.0018≦サ
ンプル注入量(ml)≦0.066×空寸体積量(ml)
+0.0018
【0020】を、また反応部分の空寸体積量が0.4ml
以上の場合は、
【0021】
【数8】0.01×空寸体積量(ml)+0.0098≦サ
ンプル注入量(ml)≦0.026×空寸体積量(ml)
+0.00178
【0022】を満足し、かつ0.002〜0.1mlの範囲
内とすること。この条件を詳しく説明すると、反応部分
の空寸体積量が0.1〜0.2mlのときは、サンプル注入
量を0.006〜0.014mlとし、空寸体積量が0.2〜
0.25mlのときは、サンプル注入量を0.008〜0.0
17mlとし、空寸体積量が0.25〜0.3mlのとき
は、サンプル注入量を0.011〜0.019mlとし、空
寸体積量が0.3〜0.4mlのときは、サンプル注入量を
0.012〜0.025mlとし、空寸体積量が0.4〜0.6
mlのときは、サンプル注入量を0.013〜0.03ml
とし、空寸体積量が0.6〜0.8mlのときは、サンプル
注入量を0.015〜0.035mlとし、空寸体積量が0.
8〜1.0mlのときは、サンプル注入量を0.02〜0.0
4mlとし、空寸体積量が1.0〜1.5mlのときは、サ
ンプル注入量を0.025〜0.05mlとし、空寸体積量
が1.5〜2.0mlのときは、サンプル注入量を0.03〜
0.06mlとすればよい。この様な条件下で測定を行え
ば、従来のCalcofluorを用いたフローインジ
ェクション法によるβ−グルカンの測定法に比べて、糖
類やエタノール等の影響を受けない、より客観的なβ−
グルカンそのものだけを測定することが可能である。
【0023】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例1 図1に示したシステムを使用し、室温を所定温度に設定
して行った。反応液としてCalcofluor 15
mg/リットル,TritonX100 10mg/リ
ットル(0.1M Glycine−NaOH緩衝液,p
H9中)を使用し、流速3ml/minの条件で実施し
た。なお、蛍光検出器の励起波長は360nm、蛍光波
長は420nmで測定した。反応部分として内径0.5m
m, 長さ4mのテフロンチューブを使用した。サンプル
注入量は0.02mlとし、反応部分の温度を恒温槽にて
制御し20℃とした。
【0024】標準溶液として大麦より抽出した精製β−
グルカン(Sigma社製)を30mg/リットル、5
0mg/リットル、75mg/リットル、100mg/
リットル、150mg/リットル、200mg/リット
ル、250mg/リットル、300mg/リットルとな
るように蒸留水中に溶解させたものを使用し、各標準溶
液により得られる測定ピークの高さより検量線を作製し
た。一方、麦汁AまたはビールAを試料として用い、試
料のピークの高さを測定し、上記検量線より試料中のβ
−グルカン含量を決定した。結果を第1表に示す。
【0025】実施例2 反応液およびその容器の温度を恒温槽にて20℃に制御
したこと以外は実施例1と同一システム・同一条件にて
試料の麦汁AまたはビールAについてピークの高さを測
定し、実施例1と同様の標準溶液を用いて作成した検量
線より試料中のβ−グルカン含量を決定した。その結果
を第1表に示す。
【0026】実施例3 システム全体を恒温槽にて20℃に制御したこと以外は
実施例1と同一システム・同一条件にて試料の麦汁Aま
たはビールAについてピークの高さを測定し、実施例1
と同様の標準溶液を用いて作成した検量線より試料中の
β−グルカン含量を決定した。結果を第1表に示す。
【0027】実施例4 システム全体を恒温槽にて25℃に制御したこと以外は
実施例1と同一システム・同一条件にて試料の麦汁Aま
たはビールAについてピークの高さを測定し、実施例1
と同様の標準溶液を用いて作成した検量線より試料中の
β−グルカン含量を決定した。結果を第1表に示す。
【0028】
【表1】
【0029】実施例5 実施例3と同じシステムを用いたが、反応部分に内径0.
5mm、長さ1mのテフロンチューブを用い、サンプル
注入量を0.01mlとしたこと以外は実施例3と同様に
して所定の試料(1:大麦精製βグルカンを0.1N硫酸
中に溶解させ、煮沸湯浴中で1時間加水分解後、水酸化
ナトリウムで中和して得た低分子量のβ−グルカン(以
下、低分子量のβ−グルカンと称する。)を含む水溶
液、2:低分子量のβ−グルカンと5%エタノールを含
む水溶液、3:低分子量のβ−グルカンと10%マルト
ースを含む水溶液)についてピークの高さを測定し、実
施例1と同様の標準溶液を用いて作成した検量線より試
料中のβ−グルカン含量を決定した。その結果を実施例
3の結果と共に第2表に示す。
【0030】比較例1 実施例1と同じシステムをしたが、反応部分も含めてシ
ステム全体の温度を制御することなく実施したこと以外
は実施例1と同様にして試料の麦汁AまたはビールAに
ついてピークの高さを測定し、実施例1と同様の標準溶
液を用いて作成した検量線より試料中のβ−グルカン含
量を決定した。結果を第1表に示す。
【0031】比較例2 実施例3と同じシステムを用いたが、サンプル注入量を
0.01mlとしたこと以外は実施例3と同様にして試料
(1:低分子量のβ−グルカンを含む水溶液、2:低分
子量のβ−グルカンと5%エタノールを含む水溶液、
3:低分子量のβ−グルカンと10%マルトースを含む
水溶液)についてピークの高さを測定し、実施例1と同
様の標準溶液を用いて作成した検量線より試料中のβ−
グルカン含量を決定した。結果を第2表に示す。
【0032】比較例3 実施例5と同様のシステムを用いたが、サンプル注入量
を0.025mlとしたこと以外は実施例3と同様にして
試料(1:低分子量のβ−グルカンを含む水溶液、2:
低分子量のβ−グルカンと5%エタノールを含む水溶
液、3:低分子量のβ−グルカンと10%マルトースを
含む水溶液)についてピークの高さを測定し、実施例1
と同様の標準溶液を用いて作成した検量線より試料中の
β−グルカン含量を決定した。結果を第2表に示す。
【0033】
【表2】
【0034】第1表の結果から明らかなように、比較例
1の場合は、室温の変化に伴いβ−グルカンの測定値が
変化するのに対し、実施例1〜4のようにシステムの一
部もしくは全部を温度制御することにより、β−グルカ
ンの測定値が変動しなくなることが確認された。また、
低分子量のβ−グルカンの測定に際し、糖類やエタノー
ルの存在による影響について調べた結果、第2表に示し
たように、反応部分の空寸体積量に対して適切なサンプ
ル注入量を用いた実施例の場合は、糖類やエタノールの
存在による影響を殆ど受けないのに対し、注入量が本発
明の条件と合致しないサンプル注入量を用いた比較例の
場合はこれらの影響を強く受けることが確認された。
【0035】
【発明の効果】本発明の方法によれば、試料に含まれる
糖類やエタノールなどの成分による影響を受けないで、
試料中のβ−グルカン含有量を高い精度で、かつ再現性
よく測定することができる。したがって、種々の穀類,
麦芽抽出液,麦汁,ビールなどの試料中のβ−グルカン
含有量を客観的に比較、評価することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】 Calcofluorを用いたフローインジ
ェクション法によるβ−グルカン含有量の測定システム
の1例を示す。
【図2】 Calcofluorを用いたフローインジ
ェクション法によるβ−グルカン含有量の測定システム
の他の例を示す。
【符号の説明】
1 Calcofluor反応液 2 ポンプ 3 サンプル注入器 4 反応部分 5 積分器 6 蛍光検出器 7 廃液 8 緩衝液

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 Calcofluorを用いるフローイ
    ンジェクションシステムによるβ−(1,3)(1,
    4)−D−グルカンの測定法において、該システムのC
    alcofluor反応液と試料を混合する箇所より検
    出器までの間にある反応部分を0〜40℃の温度範囲で
    一定温度に保つことを特徴とするβ−(1,3)(1,
    4)−D−グルカンの測定法。
  2. 【請求項2】 Calcofluor反応液および該反
    応液を収容した容器を0〜40℃の温度範囲で一定温度
    に保つ請求項1記載のβ−(1,3)(1,4)−D−
    グルカンの測定法。
  3. 【請求項3】 検出器を0〜40℃の温度範囲で一定温
    度に保つ請求項1記載のβ−(1,3)(1,4)−D
    −グルカンの測定法。
  4. 【請求項4】 ポンプ・サンプルインジェクターを含め
    たシステム全体を0〜40℃の温度範囲で一定温度に保
    つ請求項1記載のβ−(1,3)(1,4)−D−グル
    カンの測定法。
  5. 【請求項5】 サンプル注入量が、反応部分の空寸体積
    量が0.4ml未満の場合は、 【数1】0.03×空寸体積量(ml)+0.0018≦サ
    ンプル注入量(ml)≦0.066×空寸体積量(ml)
    +0.0018 を、反応部分の空寸体積量が0.4ml以上の場合は、 【数2】0.01×空寸体積量(ml)+0.0098≦サ
    ンプル注入量(ml)≦0.026×空寸体積量(ml)
    +0.00178 を満足し、かつ0.002〜0.1mlの範囲内である請求
    項1〜4のいずれかに記載のβ−(1,3)(1,4)
    −D−グルカンの測定法。
  6. 【請求項6】 反応部分の空寸体積量が0.7〜0.9ml
    の場合に、サンプル注入量が0.017〜0.03mlの範
    囲内である請求項1〜4のいずれかに記載のβ−(1,
    3)(1,4)−D−グルカンの測定法。
  7. 【請求項7】 反応部分の空寸体積量が0.4〜0.7ml
    の場合に、サンプル注入量が0.015〜0.025mlの
    範囲内である請求項1〜4のいずれかに記載のβ−
    (1,3)(1,4)−D−グルカンの測定法。
  8. 【請求項8】 Calcofluorを用いるフローイ
    ンジェクションシステムによるβ−(1,3)(1,
    4)−D−グルカンの測定法において、サンプル注入量
    が、反応部分の空寸体積量が0.4ml未満の場合は、 【数3】0.03×空寸体積量(ml)+0.0018≦サ
    ンプル注入量(ml)≦0.066×空寸体積量(ml)
    +0.0018 を、反応部分の空寸体積量が0.4ml以上の場合は、 【数4】0.01×空寸体積量(ml)+0.0098≦サ
    ンプル注入量(ml)≦0.026×空寸体積量(ml)
    +0.00178 を満足し、かつ0.002〜0.1mlの範囲内であること
    を特徴とするβ−(1,3)(1,4)−D−グルカン
    の測定法。
  9. 【請求項9】 Calcofluorを用いるフローイ
    ンジェクションシステムによるβ−(1,3)(1,
    4)−D−グルカンの測定法において、反応部分の空寸
    体積量が0.7〜0.9mlで、サンプル注入量が0.017
    〜0.03mlの範囲内であることを特徴とするβ−
    (1,3)(1,4)−D−グルカンの測定法。
  10. 【請求項10】 Calcofluorを用いるフロー
    インジェクションシステムによるβ−(1,3)(1,
    4)−D−グルカンの測定法において、反応部分の空寸
    体積量が0.4〜0.7mlで、サンプル注入量が0.015
    〜0.025mlの範囲内であることを特徴とするβ−
    (1,3)(1,4)−D−グルカンの測定法。
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