JP3802677B2 - 悪性ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質の発現のためのベクター、その利用、発現方法 - Google Patents
悪性ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質の発現のためのベクター、その利用、発現方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3802677B2 JP3802677B2 JP12679498A JP12679498A JP3802677B2 JP 3802677 B2 JP3802677 B2 JP 3802677B2 JP 12679498 A JP12679498 A JP 12679498A JP 12679498 A JP12679498 A JP 12679498A JP 3802677 B2 JP3802677 B2 JP 3802677B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- vector
- malignant
- immunoglobulin
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、悪性Ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質発現のためのベクターと、悪性Ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質の発現方法と、前記ベクターと前記ベクターを含む悪性Ｂ−細胞の利用とに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ−細胞性リンパ腫に発現される免疫グロブリンのイディオタイプ(idiotype)は、腫瘍特異抗原であるが、腫瘍を有する宿主において低い免疫原性を示す。イディオタイプＩ．ａ．に対する免疫反応を誘発するための幾つかの方法が評価されており、イディオタイプは、マウスにワクチン接種するための可溶性蛋白質として使用するために、ＧＭ−ＣＳＦに結合されている（Nature 362, 755-758, 1993)。ＧＭ−ＣＳＦは、専用の抗原提示細胞を補充することが可能で、イディオタイプの有効な提示と、従ってＴ細胞の活性化を引き起こす。この方法には、リンパ腫の免疫グロブリンＶ遺伝子をクローニングし、融合蛋白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで生産し、精製しなくてはならないという欠点がある。従って、この方法では、臨床場面で患者毎に個別にワクチンを調製しなくてはならない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ワクチンを個別に調製する必要がなく、患者に普遍的に使用できる新しいベクターを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この目的は、作用可能(operably)なように互いに結合された、
（ａ）μイントロンまたはκイントロンの領域と相同で、非機能性ＣμまたはＣκエンハンサーを任意で含むか、あるいは欠失しているか、あるいは含む、少なくとも１．５ｋｂの領域と、
（ｂ）免疫グロブリンまたはその一部のドメインをエンコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列と、
（ｃ）サイトカインをエンコードするＤＮＡ配列と、
（ｄ）エンハンサーを任意で含むか、あるいは機能性エンハンサー領域を欠失しており、組み込み(integration) に続いて、マーカーの発現が細胞のＣμまたはＣκエンハンサーにより調節される、真核Ｂ−細胞において選択可能なマーカーとを少なくとも含む、悪性Ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質の発現のためのベクターにより、本発明に従って解決された。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の好ましい態様は、従属形式の請求項、以下の説明および実施例から明らかとなる。
従来の技術、すなわち上記で引用された Nature 362, 755-758, 1993の文献に示されている従来の技術に従って得られる融合蛋白質は、細胞培養細胞のトランスフェクション後にｉｎ ｖｉｔｒｏで発現され、精製され、可溶形態で投与されるが、一方本発明に従って提供されるベクターは、相同的組み換えによりサイトカイン遺伝子を免疫グロブリン遺伝子の重鎖の遺伝子座に部位特異的に挿入することが可能であり、その際、Ｖ遺伝子を分離したり、その遺伝子をベクターに挿入する必要は全くない。予め精製された可溶性蛋白質を投与しなくてはならない従来の方法に対し、本発明のベクターは、悪性Ｂ−細胞に直接組み込まれ、この細胞内で発現が誘発され、その結果、遺伝子工学により改変された腫瘍細胞を直接患者に投与する事ができる。これは時間、労力、費用を節約するだけでなく、遥かに優れた腫瘍防御効果も引き起こす。
【０００６】
本発明のベクター作製のための開始物質は、ＤＥ ４４ ０６ ５１２に記載されている組み換え抗体の作製用の組み込みベクターであった。これらのベクターは、マウス／ヒトキメラ抗体を高率で生産するのに有用である。ＤＥ ４４
０６ ５１２に記載されている組み込みベクターは、組み換え抗体の調製にのみ役立ち、従って、抗体産生ハイブリドーマ細胞においてのみ発現された。悪性Ｂ−細胞において直接相同的組み換えによってサイトカインを有する融合細胞の形態で免疫グロブリンを発現し、悪性Ｂ−細胞性腫瘍を有する患者のワクチン接種のためにこの方法で修飾された悪性Ｂ−細胞を使用するという本発明の解決方法は、ＤＥ ４４ ０６ ５１２から明らかではない。
【０００７】
本発明により、サイトカイン遺伝子は、相同的組み換えにより、例えばＢ−細胞性リンパ腫細胞の様な悪性Ｂ−細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に導入される。この目的のために、請求項１の特徴を有する組み込みベクターが作製された。重鎖遺伝子座への部位特異的組み込み後に、免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質が、内因性ＶH プロモーターの調節下に発現される。
【０００８】
記載されている組み換えベクターは、全てのリンパ腫に使用できる可能性がある。相同的組み換えにより悪性Ｂ−細胞の重鎖遺伝子座にサイトカイン遺伝子を導入することにより、イディオタイプの分離を回避できる。これによって、治療開始までの時間が大幅に短縮される。更に、融合蛋白質を精製せずに、ワクチン接種のために、放射線照射後の相同的組み換えにより修飾された腫瘍細胞を使用することも可能である。以下の実施例は、可溶性蛋白質の代わりに本発明に従って提供された修飾された細胞を使用して、ワクチン接種を実施すれば、腫瘍防御効果が極めて顕著となることを示している。
【０００９】
本発明によるベクターの作製は、ＤＥ ４４ ０６ ５１２に記載されている組み込みベクターに基づいている。本発明を完全に開示するために、このドイツ特許文書の全体は、引用することによって本明細書の一部とされる。しかし、ＤＥ ４４ ０６ ５１２に記載されている組み込みベクターは、組み換え抗体が発現も回収もされず、代わりに悪性Ｂ−細胞において直接発現される免疫グロブリン遺伝子とサイトカインの融合蛋白質が得られるように、本発明に従って修飾されている。
【００１０】
本発明のベクターは、イントロン領域と相同の少なくとも１．５ｋｂの領域を有し、その領域にはＩｇエンハンサーが、天然には存在しないか、あるいはその領域から欠失しているか、あるいはその領域において不活化されており、あるいは更なる態様において、本発明のベクターは、機能性ＣμまたはＣκエンハンサーを有している。
【００１１】
そのＤＮＡは、抗体の機能性ドメインまたはその機能性部分をエンコードする限り、例えば１つ以上のエキソンを含んでよい。ドメインの機能性部分がＶドメインの一部であるならば、これは標的抗原に結合できなくてはならないか、あるいは結合に寄与できなくてはならない。機能性部分がＣドメインの一部であるならば、これはエフェクター機能の少なくとも一部を発揮できなくてはならない。
【００１２】
好ましい態様において、少なくとも１．５ｋｂのμまたはκイントロンの領域は、ＣμまたはＣκエンハンサーが配置される領域を含み、この領域は、機能性ＣμまたはＣκエンハンサーを任意で含むか、あるいは欠失している。
この後者の態様において、エンハンサーは、欠失しているか、あるいは不活化されていてもよい。この様な不活化は、例えば、従来技術から知られる方法による突然変異によって、起こすことができる。
選択可能なマーカーにおいて、エンハンサーは欠失しているか、不活化されている。別の態様において、マーカーは、天然のエンハンサーを欠失している。更なる態様において、選択可能なマーカーは、エンハンサーを含む。
【００１３】
前記ベクターに含まれる相同配列は、相同組み換えを達成するために少なくとも１．５ｋｂの長さを持たなくてはならない。この少なくとも１．５ｋｂのＤＮＡ配列は、ＣμまたはＣκイントロンの異なる領域から選択できる。本発明に従って、エンハンサーそのものは、構築物に存在しなくても、あるいは相同フランキング領域(homologous flanking region)から欠失していても、あるいはその中で不活化されていてもよい。機能的に再配置された抗体遺伝子の相同配列へのベクターの組み込み時には、組み換え遺伝子の発現は、内因性(endogenous)エンハンサーの調節下にある。もし、定常部をエンコードするエキソンが挿入されると、これらは、更に内因性Ｖプロモーターの調節下に置かれる。更に、エンハンサーは、選択可能なマーカーの発現を調節し、これによって、選択マーカーが強力なエンハンサー付近に結合されている場合のみ活性化されることが保証される。使用された相同性部位により、免疫グロブリン座との相同組み換えが促進され、それによって選択可能なマーカーは、内因性ＣμまたはＣκエンハンサーの調節下に置かれる。
【００１４】
免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質をコードする本発明に従って提供される組み換え遺伝子の発現は、悪性Ｂ−細胞の重鎖Ｖ遺伝子の３’の部位特異的組み込み後、内因性ＶH プロモーターにより調節される。
クローニング技術は、従来の技術から本技術に精通する者にとって良く知られている。例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2nd edition 1989, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, USA およびHarlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", 1988, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, USAを参照されたい。
【００１５】
免疫グロブリンを産生するＢ細胞の内因性免疫グロブリンＶ遺伝子断片は変化しないで残り、導入された定常遺伝子断片とサイトカインに結合される相同組み換え後に発現される。この方法において、Ｂ−細胞リンパ腫のイディオタイプは保存されているが、そのサイトカインとの物理的結合によって、抗原提示細胞(antigen-presenting cells)による提示が増強され、これによってイディオタイプの免疫原性が増強される。従って、ＤＥ ４４ ０６ ５１２のベクターと対照的に、本発明のベクターはＶドメインまたはその一部をエンコードしないが、代わりに内因性Ｖ配列をエンコードし、従って、トランスフェクションされたＢ−細胞のイディオタイプは保存される。
【００１６】
別の好ましい態様において、ベクターは、定常部またはその一部をエンコードするＤＮＡ配列を示す。この配列は、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかをエンコードしていると思われる。全てのイディオタイプにおいて、幾つかのエキソンが重鎖をコードしていることは、精通した技術者に知られている。構築物に重鎖のＣH エキソンが１つだけ存在するならば、これは、好ましくはＣH1エキソンである。この種の構築物により、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）2 フラグメントの機能性を有する免疫グロブリン部分を持つ融合蛋白質を調製することが可能である。しかし、本発明のベクターは、好ましくは、完全な重鎖の発現を可能にする１種類の重鎖の全てのエキソンを含む。この態様において、要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、５’−３’の方向にこの順番で配置されている。
【００１７】
本発明の組み込みベクターの別の好ましい態様において、μまたはκイントロンに相同な領域は、１．９ｋｂまたは２．０ｋｂの長さを持つ。
更なる好ましい態様において、本発明のベクターは、細菌に適合する調節ユニットを含む。この様な細菌適合性調節ユニットは、細菌系、例えば、大腸菌におけるベクターのクローニングと増幅を可能にする。細菌適合性調節系は、上記の従来技術（Sambrookら）から精通する技術者にとって知られている。前記細菌適合性調節ユニットの一具体例は、プラスミドｐＢＲ３２２の調節ユニットである。
【００１８】
更なる態様において、融合蛋白質の免疫グロブリン部分は、キメラの性質を持つ。ここで、「キメラ」とは、異なる種のＶおよびＣ領域を組み合わせた免疫グロブリンを意味する。例えば、マウスのＶ遺伝子は、ヒトのイソ型(isotype) のＣエキソンと組み合わせる事ができる。
別の態様において、前記特徴（ｂ）のＤＮＡ配列は、ヒト免疫グロブリン鎖をエンコードする。このドメインは、ＶおよびＣドメイン、あるいはその一部が可能である。
【００１９】
本発明のベクターの更なる好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、マウス、ラット、ヤギ、ウマまたはヒツジ由来のドメインをエンコードする。好ましくは、ＶまたはＣ領域をエンコードする配列のＤＮＡ配列は全て、前記動物種の１種に由来し、この場合、Ｃ領域は異なる動物種から得てもよい。
本発明の有利な態様において、ベクターは、患者にとって異種であり、免疫反応の誘発に有利と思われる定常Ｉｇ領域を有する。
【００２０】
本発明のベクターの別の態様において使用されるヒトのドメインをエンコードするＤＮＡ配列に関して、相同組み換えのためのこれらのドメインをエンコードするＤＮＡ配列を、異なる哺乳動物種の対応する配列と共に使用する事ができる。
本発明のベクターの別の好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、分泌抗体のＣドメインの全てをエンコードする。
【００２１】
本発明のベクターの更なる好ましい態様は、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体のＣドメインをエンコードするＤＮＡ配列を含む。これらのイソ型の幾つかが、全ての哺乳動物に存在しないことは、精通する技術者にとって良く知られている。例えば、ヒトゲノムは、ＩｇＧ４イソ型をエンコードするが、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂイソ型をエンコードしないＣ遺伝子を含む。これに反して、マウスゲノムは、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂイソ型をエンコードするが、ＩｇＧ４イソ型をエンコードしないＣ遺伝子を含む。
【００２２】
本発明の組み込みベクターの更なる好ましい態様において、選択可能なマーカーは、ｇｐｔ、ｎｅｏまたはヒグロマイシン耐性のコードである。これらのマーカーに必要な選択的条件下に細胞を培養する方法は、精通する技術者にとって知られている（Sambrookら、上記参照）。更に、精通する技術者は、本発明のベクターに使用できるその他の選択マーカーを選択できる。
【００２３】
免疫グロブリン産生細胞のトランスフェクションは、現代の免疫学において標準的方法と見なされている。トランスフェクションの条件は、使用される細胞系に関して調節しなくてはならないことは、精通する技術者にとって良く知られている。この様なトランスフェクションの条件を確立する基本的過程は、例えば、Toneguzzo et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986), 703-706 と Biorad "Genepulser"の説明に記載されている。マウス骨髄腫系ＮＳ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １８）の適切なトランスフェクションの条件は、例えば、Mocikat et al., Gene 136 (1993), 349-353に記載されている。安定な形質転換細胞の選択は、適切な選択培地で少なくとも７日間形質転換細胞を培養することにより行われる。適切な形質転換細胞の選択は、プラスミドを取り込まなかった細胞を死滅させるために必要である。選択培地の選択は、もちろん、使用される選択マーカーに依存している。適切な選択培地の調製は、従来の技術から知られており、例えば、上記Sambrook et al. に記載されている。
【００２４】
本発明の方法の好ましい態様において、トランスフェクションは、エレクトロポレーション（electroporation)、カルシウム共同沈降(calcium co-precipitation)、リポフェクション（lipofection)、ＤＥＡＥデキストラン法またはレトロウイルス遺伝子転移により行われる。これらの方法の全ては、従来の技術から良く知られている。従って、本発明の方法において各々のトランスフェクションの手順の諸条件を調節する方法は、精通する技術者にとって知られている。本発明の方法の別の好ましい態様において、選択剤としてミコフェノール酸、Ｇ４１８またはヒグロマイシンを含む培地において、選択が行われる。上記の様に、これらの選択剤は従来の技術から良く知られている。それらの選択は、使用されるマーカーに依存しており、それらの投与量は、分子生物学の標準的教科書から求めることができる。上記Sambrook et al. を参照されたい。
【００２５】
本発明の方法の別の好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、γ1 、γ2a、γ2b、γ3 、γ4 、μ、α、δまたはεイソ型の定常ドメインをエンコードする。
前記特徴（ｃ）のＤＮＡ配列は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、リンホカイン及び成長因子から選択されるサイトカインをエンコードする。この様なＤＮＡ配列の具体例は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターフェロンγである。
【００２６】
本発明のベクターは、例えば、上記により詳細に特徴づけられている手順によって、悪性Ｂ−細胞の中に導入され、そこで、相同組み換えにより組み込まれ、安定して発現される。適切な選択および同定の手順により、安定して融合蛋白質を発現する悪性Ｂ−細胞が同定される。しかし、本発明の一態様において、融合蛋白質を安定して発現する細胞を予め選択せずに、本発明のベクター構築物(vector construct)を含む悪性Ｂ−細胞をワクチン接種に直接使用する事も可能である。ワクチン接種の前に、融合蛋白質の発現に影響を与えずに、放射線照射によって悪性Ｂ−細胞を複製不能とすることは、もちろん、必要である。
【００２７】
従って、患者に注入する前に組み換え細胞の選択を行うことは、必ずしも必要ではない。抗腫瘍免疫感作には、相同組み換えが発生した形質転換細胞の発現で十分なので、異種細胞集団の投与は許容される。このため、本発明のベクターにとって、請求項１の特徴（ｄ）に記載されている真核細胞において選択可能なマーカーを示すことは必ずしも必要ではない。患者に注入する前に、組み換え細胞の選択が行われない場合には、前記マーカーは省略できる。
【００２８】
本発明により提供されるベクターは、生体外分析においても使用できる。この目的のために、培養された樹状細胞を誘発して、腫瘍に特異的なペプチドを提示させ、また任意で、組み換え腫瘍細胞により発現される融合蛋白質によりＴ細胞を活性化させる。抗原提示細胞または活性化されたＴ細胞は、各々、その後、患者に再導入される。
【００２９】
免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質を生産する悪性Ｂ−細胞を注入する大きな利点は、臨床量のこれらの蛋白質を調製するために、長時間を要する生産および精製段階が不要となる点である。
本発明のベクターが組み込まれた悪性Ｂ−細胞は、例えば、Ｂ−細胞性白血病細胞、Ｂ−細胞性リンパ腫細胞またはプラズマ細胞腫細胞である。
【００３０】
以下、動物モデルを使用して実施した実施例によって本発明を説明する。継続的な実験によれば、この方法で得られた結果は、ヒトにも応用できるであろう。本発明は、以下の実施例に限定されず、特許請求の範囲の記載内において変更も可能であることが理解されるべきである。
【００３１】
【実施例】
ベクターの作製
ネズミＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を、ＰｓｔＩによりｐＳＰ７２（図３参照）の中にクローニングする。遺伝子の５’部分をＥｃｏＲＶとＸｍａＩにより切り取り、同じ酵素により切断されて、Ｎ−末端の２９個のアミノ酸が欠失しているＰＣＲ生成物により置換する。この方法で、構築物ｐＳＰ７２（ΔＥＶ）−ＧＭＣＳＦ（ΔＬ）が調製される。ベクターｐＳＶｇｐｔ−ｈｕγ１−Ａ５（Kardinal et al., Eur. J. Immunol. 25, 792-797, 1995)の中で、ＳａｌＩ制限部位は、ヒトＩｇＧ１−ＣH ３エキソンの導入された３’である。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ＳａｌＩによりｐＳＰ７２（ΔＥＶ）−ＧＭＣＳＦ（ΔＬ）から切断され、修飾されたｐＳＶｇｐｔ−ｈｕγ１−Ａ５のＳａｌＩ部位の中に結合される。
【００３２】
遺伝子転移
ＧＭ−ＣＳＦを持つ組み換えベクターは、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩによって直線化され、ネズミＢ細胞リンパ腫細胞系ＭＰＣ１１の中に伝達される。ミコフェノール酸によりｇｐｔ遺伝子の存在に関して、安定してトランスフェクションされた細胞が選択される。構築物が部位特異的方法で組み込まれたクローン（図１参照）がＥＬＩＳＡにより同定される。
【００３３】
動物実験
抗腫瘍免疫感作のための相同組み換えによるリンパ腫イディオタイプの修飾の利点は、ネズミＢ細胞リンパ腫ＭＰＣ１１を用いて具体例として示される。この腫瘍はＢＡＬＢ／ｃマウスから得られ、ＩｇＧ２ｂを発現し、１０3 個の細胞を同系動物に接種後２０日以内までに動物の１００％が死亡する。ベクターをＭＰＣ１１に転移し、相同組み換え体を同定後、これらの組み換え体をＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫感作に使用する。この目的のために、５Ｘ１０6 個の放射線照射された細胞をそれぞれ３週間の間隔で腹腔内投与する。最後の注入後７日目に、致死量の野生型腫瘍細胞の接種材料を腹腔内投与する。腫瘍細胞だけを投与され、予め免疫感作されなかった対照群の動物は腫瘍のため死亡し（図２のＣ群）、免疫感作された動物は生存に関して有意な利点を示す（Ａ群）。相同組み換えにより重鎖遺伝子座の中にＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含まないヒトＩｇＧ１−Ｃ領域だけが導入された、すなわち異種重鎖を発現するＭＰＣ１１細胞によりワクチン接種が実施されると、生存期間は僅かしか延長しない。
【００３４】
既述の方法において、リンパ腫からの腫瘍イディオタイプの単離は、遺伝子レベルでもタンパク質レベルでも不要であり、個体に特異的なワクチンを製造する必要がなく、共通のベクターをすべてのリンパ腫に利用することができ、治療開始までの時間を顕著に短縮することができる。相同組み換えによって修飾された、放射線照射された腫瘍細胞を利用すると、時間と労力を要する融合タンパク質の精製が不要となるという利点があるだけではない。顕著な利点は、組み換えタンパク質を発現する細胞を用いて免疫感作を行うと、精製可溶性タンパク質の投与と比較して、腫瘍防御効果が非常に強力であるということである。
【００３５】
本組み換えベクターによって、治療開始までの時間は、相当、短縮される可能性がある。さらに、融合タンパク質の精製を必要とせずに、ワクチン接種のための放射線照射後に、相同組み換えによって修飾した腫瘍細胞を利用することが可能である。上記の実施例によって、精製された可溶性タンパク質を用いた細胞の免疫感作と比較して、腫瘍防御効果が驚くほど強力であることが、証明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】構築物が部位特異的方法で組み込まれて、クローンが得られることを示す図である。
【図２】腫瘍細胞の投与後の経過時間（日）と、生存率（％）の関係を示す図である。
【図３】ベクターｐＳＰ７２の制限酵素地図（Promega, Medison, U.S.A.) である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、悪性Ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質発現のためのベクターと、悪性Ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質の発現方法と、前記ベクターと前記ベクターを含む悪性Ｂ−細胞の利用とに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ−細胞性リンパ腫に発現される免疫グロブリンのイディオタイプ(idiotype)は、腫瘍特異抗原であるが、腫瘍を有する宿主において低い免疫原性を示す。イディオタイプＩ．ａ．に対する免疫反応を誘発するための幾つかの方法が評価されており、イディオタイプは、マウスにワクチン接種するための可溶性蛋白質として使用するために、ＧＭ−ＣＳＦに結合されている（Nature 362, 755-758, 1993)。ＧＭ−ＣＳＦは、専用の抗原提示細胞を補充することが可能で、イディオタイプの有効な提示と、従ってＴ細胞の活性化を引き起こす。この方法には、リンパ腫の免疫グロブリンＶ遺伝子をクローニングし、融合蛋白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで生産し、精製しなくてはならないという欠点がある。従って、この方法では、臨床場面で患者毎に個別にワクチンを調製しなくてはならない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ワクチンを個別に調製する必要がなく、患者に普遍的に使用できる新しいベクターを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この目的は、作用可能(operably)なように互いに結合された、
（ａ）μイントロンまたはκイントロンの領域と相同で、非機能性ＣμまたはＣκエンハンサーを任意で含むか、あるいは欠失しているか、あるいは含む、少なくとも１．５ｋｂの領域と、
（ｂ）免疫グロブリンまたはその一部のドメインをエンコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列と、
（ｃ）サイトカインをエンコードするＤＮＡ配列と、
（ｄ）エンハンサーを任意で含むか、あるいは機能性エンハンサー領域を欠失しており、組み込み(integration) に続いて、マーカーの発現が細胞のＣμまたはＣκエンハンサーにより調節される、真核Ｂ−細胞において選択可能なマーカーとを少なくとも含む、悪性Ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質の発現のためのベクターにより、本発明に従って解決された。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の好ましい態様は、従属形式の請求項、以下の説明および実施例から明らかとなる。
従来の技術、すなわち上記で引用された Nature 362, 755-758, 1993の文献に示されている従来の技術に従って得られる融合蛋白質は、細胞培養細胞のトランスフェクション後にｉｎ ｖｉｔｒｏで発現され、精製され、可溶形態で投与されるが、一方本発明に従って提供されるベクターは、相同的組み換えによりサイトカイン遺伝子を免疫グロブリン遺伝子の重鎖の遺伝子座に部位特異的に挿入することが可能であり、その際、Ｖ遺伝子を分離したり、その遺伝子をベクターに挿入する必要は全くない。予め精製された可溶性蛋白質を投与しなくてはならない従来の方法に対し、本発明のベクターは、悪性Ｂ−細胞に直接組み込まれ、この細胞内で発現が誘発され、その結果、遺伝子工学により改変された腫瘍細胞を直接患者に投与する事ができる。これは時間、労力、費用を節約するだけでなく、遥かに優れた腫瘍防御効果も引き起こす。
【０００６】
本発明のベクター作製のための開始物質は、ＤＥ ４４ ０６ ５１２に記載されている組み換え抗体の作製用の組み込みベクターであった。これらのベクターは、マウス／ヒトキメラ抗体を高率で生産するのに有用である。ＤＥ ４４
０６ ５１２に記載されている組み込みベクターは、組み換え抗体の調製にのみ役立ち、従って、抗体産生ハイブリドーマ細胞においてのみ発現された。悪性Ｂ−細胞において直接相同的組み換えによってサイトカインを有する融合細胞の形態で免疫グロブリンを発現し、悪性Ｂ−細胞性腫瘍を有する患者のワクチン接種のためにこの方法で修飾された悪性Ｂ−細胞を使用するという本発明の解決方法は、ＤＥ ４４ ０６ ５１２から明らかではない。
【０００７】
本発明により、サイトカイン遺伝子は、相同的組み換えにより、例えばＢ−細胞性リンパ腫細胞の様な悪性Ｂ−細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に導入される。この目的のために、請求項１の特徴を有する組み込みベクターが作製された。重鎖遺伝子座への部位特異的組み込み後に、免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質が、内因性ＶH プロモーターの調節下に発現される。
【０００８】
記載されている組み換えベクターは、全てのリンパ腫に使用できる可能性がある。相同的組み換えにより悪性Ｂ−細胞の重鎖遺伝子座にサイトカイン遺伝子を導入することにより、イディオタイプの分離を回避できる。これによって、治療開始までの時間が大幅に短縮される。更に、融合蛋白質を精製せずに、ワクチン接種のために、放射線照射後の相同的組み換えにより修飾された腫瘍細胞を使用することも可能である。以下の実施例は、可溶性蛋白質の代わりに本発明に従って提供された修飾された細胞を使用して、ワクチン接種を実施すれば、腫瘍防御効果が極めて顕著となることを示している。
【０００９】
本発明によるベクターの作製は、ＤＥ ４４ ０６ ５１２に記載されている組み込みベクターに基づいている。本発明を完全に開示するために、このドイツ特許文書の全体は、引用することによって本明細書の一部とされる。しかし、ＤＥ ４４ ０６ ５１２に記載されている組み込みベクターは、組み換え抗体が発現も回収もされず、代わりに悪性Ｂ−細胞において直接発現される免疫グロブリン遺伝子とサイトカインの融合蛋白質が得られるように、本発明に従って修飾されている。
【００１０】
本発明のベクターは、イントロン領域と相同の少なくとも１．５ｋｂの領域を有し、その領域にはＩｇエンハンサーが、天然には存在しないか、あるいはその領域から欠失しているか、あるいはその領域において不活化されており、あるいは更なる態様において、本発明のベクターは、機能性ＣμまたはＣκエンハンサーを有している。
【００１１】
そのＤＮＡは、抗体の機能性ドメインまたはその機能性部分をエンコードする限り、例えば１つ以上のエキソンを含んでよい。ドメインの機能性部分がＶドメインの一部であるならば、これは標的抗原に結合できなくてはならないか、あるいは結合に寄与できなくてはならない。機能性部分がＣドメインの一部であるならば、これはエフェクター機能の少なくとも一部を発揮できなくてはならない。
【００１２】
好ましい態様において、少なくとも１．５ｋｂのμまたはκイントロンの領域は、ＣμまたはＣκエンハンサーが配置される領域を含み、この領域は、機能性ＣμまたはＣκエンハンサーを任意で含むか、あるいは欠失している。
この後者の態様において、エンハンサーは、欠失しているか、あるいは不活化されていてもよい。この様な不活化は、例えば、従来技術から知られる方法による突然変異によって、起こすことができる。
選択可能なマーカーにおいて、エンハンサーは欠失しているか、不活化されている。別の態様において、マーカーは、天然のエンハンサーを欠失している。更なる態様において、選択可能なマーカーは、エンハンサーを含む。
【００１３】
前記ベクターに含まれる相同配列は、相同組み換えを達成するために少なくとも１．５ｋｂの長さを持たなくてはならない。この少なくとも１．５ｋｂのＤＮＡ配列は、ＣμまたはＣκイントロンの異なる領域から選択できる。本発明に従って、エンハンサーそのものは、構築物に存在しなくても、あるいは相同フランキング領域(homologous flanking region)から欠失していても、あるいはその中で不活化されていてもよい。機能的に再配置された抗体遺伝子の相同配列へのベクターの組み込み時には、組み換え遺伝子の発現は、内因性(endogenous)エンハンサーの調節下にある。もし、定常部をエンコードするエキソンが挿入されると、これらは、更に内因性Ｖプロモーターの調節下に置かれる。更に、エンハンサーは、選択可能なマーカーの発現を調節し、これによって、選択マーカーが強力なエンハンサー付近に結合されている場合のみ活性化されることが保証される。使用された相同性部位により、免疫グロブリン座との相同組み換えが促進され、それによって選択可能なマーカーは、内因性ＣμまたはＣκエンハンサーの調節下に置かれる。
【００１４】
免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質をコードする本発明に従って提供される組み換え遺伝子の発現は、悪性Ｂ−細胞の重鎖Ｖ遺伝子の３’の部位特異的組み込み後、内因性ＶH プロモーターにより調節される。
クローニング技術は、従来の技術から本技術に精通する者にとって良く知られている。例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2nd edition 1989, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, USA およびHarlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", 1988, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, USAを参照されたい。
【００１５】
免疫グロブリンを産生するＢ細胞の内因性免疫グロブリンＶ遺伝子断片は変化しないで残り、導入された定常遺伝子断片とサイトカインに結合される相同組み換え後に発現される。この方法において、Ｂ−細胞リンパ腫のイディオタイプは保存されているが、そのサイトカインとの物理的結合によって、抗原提示細胞(antigen-presenting cells)による提示が増強され、これによってイディオタイプの免疫原性が増強される。従って、ＤＥ ４４ ０６ ５１２のベクターと対照的に、本発明のベクターはＶドメインまたはその一部をエンコードしないが、代わりに内因性Ｖ配列をエンコードし、従って、トランスフェクションされたＢ−細胞のイディオタイプは保存される。
【００１６】
別の好ましい態様において、ベクターは、定常部またはその一部をエンコードするＤＮＡ配列を示す。この配列は、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかをエンコードしていると思われる。全てのイディオタイプにおいて、幾つかのエキソンが重鎖をコードしていることは、精通した技術者に知られている。構築物に重鎖のＣH エキソンが１つだけ存在するならば、これは、好ましくはＣH1エキソンである。この種の構築物により、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）2 フラグメントの機能性を有する免疫グロブリン部分を持つ融合蛋白質を調製することが可能である。しかし、本発明のベクターは、好ましくは、完全な重鎖の発現を可能にする１種類の重鎖の全てのエキソンを含む。この態様において、要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、５’−３’の方向にこの順番で配置されている。
【００１７】
本発明の組み込みベクターの別の好ましい態様において、μまたはκイントロンに相同な領域は、１．９ｋｂまたは２．０ｋｂの長さを持つ。
更なる好ましい態様において、本発明のベクターは、細菌に適合する調節ユニットを含む。この様な細菌適合性調節ユニットは、細菌系、例えば、大腸菌におけるベクターのクローニングと増幅を可能にする。細菌適合性調節系は、上記の従来技術（Sambrookら）から精通する技術者にとって知られている。前記細菌適合性調節ユニットの一具体例は、プラスミドｐＢＲ３２２の調節ユニットである。
【００１８】
更なる態様において、融合蛋白質の免疫グロブリン部分は、キメラの性質を持つ。ここで、「キメラ」とは、異なる種のＶおよびＣ領域を組み合わせた免疫グロブリンを意味する。例えば、マウスのＶ遺伝子は、ヒトのイソ型(isotype) のＣエキソンと組み合わせる事ができる。
別の態様において、前記特徴（ｂ）のＤＮＡ配列は、ヒト免疫グロブリン鎖をエンコードする。このドメインは、ＶおよびＣドメイン、あるいはその一部が可能である。
【００１９】
本発明のベクターの更なる好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、マウス、ラット、ヤギ、ウマまたはヒツジ由来のドメインをエンコードする。好ましくは、ＶまたはＣ領域をエンコードする配列のＤＮＡ配列は全て、前記動物種の１種に由来し、この場合、Ｃ領域は異なる動物種から得てもよい。
本発明の有利な態様において、ベクターは、患者にとって異種であり、免疫反応の誘発に有利と思われる定常Ｉｇ領域を有する。
【００２０】
本発明のベクターの別の態様において使用されるヒトのドメインをエンコードするＤＮＡ配列に関して、相同組み換えのためのこれらのドメインをエンコードするＤＮＡ配列を、異なる哺乳動物種の対応する配列と共に使用する事ができる。
本発明のベクターの別の好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、分泌抗体のＣドメインの全てをエンコードする。
【００２１】
本発明のベクターの更なる好ましい態様は、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体のＣドメインをエンコードするＤＮＡ配列を含む。これらのイソ型の幾つかが、全ての哺乳動物に存在しないことは、精通する技術者にとって良く知られている。例えば、ヒトゲノムは、ＩｇＧ４イソ型をエンコードするが、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂイソ型をエンコードしないＣ遺伝子を含む。これに反して、マウスゲノムは、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂイソ型をエンコードするが、ＩｇＧ４イソ型をエンコードしないＣ遺伝子を含む。
【００２２】
本発明の組み込みベクターの更なる好ましい態様において、選択可能なマーカーは、ｇｐｔ、ｎｅｏまたはヒグロマイシン耐性のコードである。これらのマーカーに必要な選択的条件下に細胞を培養する方法は、精通する技術者にとって知られている（Sambrookら、上記参照）。更に、精通する技術者は、本発明のベクターに使用できるその他の選択マーカーを選択できる。
【００２３】
免疫グロブリン産生細胞のトランスフェクションは、現代の免疫学において標準的方法と見なされている。トランスフェクションの条件は、使用される細胞系に関して調節しなくてはならないことは、精通する技術者にとって良く知られている。この様なトランスフェクションの条件を確立する基本的過程は、例えば、Toneguzzo et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986), 703-706 と Biorad "Genepulser"の説明に記載されている。マウス骨髄腫系ＮＳ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １８）の適切なトランスフェクションの条件は、例えば、Mocikat et al., Gene 136 (1993), 349-353に記載されている。安定な形質転換細胞の選択は、適切な選択培地で少なくとも７日間形質転換細胞を培養することにより行われる。適切な形質転換細胞の選択は、プラスミドを取り込まなかった細胞を死滅させるために必要である。選択培地の選択は、もちろん、使用される選択マーカーに依存している。適切な選択培地の調製は、従来の技術から知られており、例えば、上記Sambrook et al. に記載されている。
【００２４】
本発明の方法の好ましい態様において、トランスフェクションは、エレクトロポレーション（electroporation)、カルシウム共同沈降(calcium co-precipitation)、リポフェクション（lipofection)、ＤＥＡＥデキストラン法またはレトロウイルス遺伝子転移により行われる。これらの方法の全ては、従来の技術から良く知られている。従って、本発明の方法において各々のトランスフェクションの手順の諸条件を調節する方法は、精通する技術者にとって知られている。本発明の方法の別の好ましい態様において、選択剤としてミコフェノール酸、Ｇ４１８またはヒグロマイシンを含む培地において、選択が行われる。上記の様に、これらの選択剤は従来の技術から良く知られている。それらの選択は、使用されるマーカーに依存しており、それらの投与量は、分子生物学の標準的教科書から求めることができる。上記Sambrook et al. を参照されたい。
【００２５】
本発明の方法の別の好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、γ1 、γ2a、γ2b、γ3 、γ4 、μ、α、δまたはεイソ型の定常ドメインをエンコードする。
前記特徴（ｃ）のＤＮＡ配列は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、リンホカイン及び成長因子から選択されるサイトカインをエンコードする。この様なＤＮＡ配列の具体例は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターフェロンγである。
【００２６】
本発明のベクターは、例えば、上記により詳細に特徴づけられている手順によって、悪性Ｂ−細胞の中に導入され、そこで、相同組み換えにより組み込まれ、安定して発現される。適切な選択および同定の手順により、安定して融合蛋白質を発現する悪性Ｂ−細胞が同定される。しかし、本発明の一態様において、融合蛋白質を安定して発現する細胞を予め選択せずに、本発明のベクター構築物(vector construct)を含む悪性Ｂ−細胞をワクチン接種に直接使用する事も可能である。ワクチン接種の前に、融合蛋白質の発現に影響を与えずに、放射線照射によって悪性Ｂ−細胞を複製不能とすることは、もちろん、必要である。
【００２７】
従って、患者に注入する前に組み換え細胞の選択を行うことは、必ずしも必要ではない。抗腫瘍免疫感作には、相同組み換えが発生した形質転換細胞の発現で十分なので、異種細胞集団の投与は許容される。このため、本発明のベクターにとって、請求項１の特徴（ｄ）に記載されている真核細胞において選択可能なマーカーを示すことは必ずしも必要ではない。患者に注入する前に、組み換え細胞の選択が行われない場合には、前記マーカーは省略できる。
【００２８】
本発明により提供されるベクターは、生体外分析においても使用できる。この目的のために、培養された樹状細胞を誘発して、腫瘍に特異的なペプチドを提示させ、また任意で、組み換え腫瘍細胞により発現される融合蛋白質によりＴ細胞を活性化させる。抗原提示細胞または活性化されたＴ細胞は、各々、その後、患者に再導入される。
【００２９】
免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質を生産する悪性Ｂ−細胞を注入する大きな利点は、臨床量のこれらの蛋白質を調製するために、長時間を要する生産および精製段階が不要となる点である。
本発明のベクターが組み込まれた悪性Ｂ−細胞は、例えば、Ｂ−細胞性白血病細胞、Ｂ−細胞性リンパ腫細胞またはプラズマ細胞腫細胞である。
【００３０】
以下、動物モデルを使用して実施した実施例によって本発明を説明する。継続的な実験によれば、この方法で得られた結果は、ヒトにも応用できるであろう。本発明は、以下の実施例に限定されず、特許請求の範囲の記載内において変更も可能であることが理解されるべきである。
【００３１】
【実施例】
ベクターの作製
ネズミＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を、ＰｓｔＩによりｐＳＰ７２（図３参照）の中にクローニングする。遺伝子の５’部分をＥｃｏＲＶとＸｍａＩにより切り取り、同じ酵素により切断されて、Ｎ−末端の２９個のアミノ酸が欠失しているＰＣＲ生成物により置換する。この方法で、構築物ｐＳＰ７２（ΔＥＶ）−ＧＭＣＳＦ（ΔＬ）が調製される。ベクターｐＳＶｇｐｔ−ｈｕγ１−Ａ５（Kardinal et al., Eur. J. Immunol. 25, 792-797, 1995)の中で、ＳａｌＩ制限部位は、ヒトＩｇＧ１−ＣH ３エキソンの導入された３’である。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ＳａｌＩによりｐＳＰ７２（ΔＥＶ）−ＧＭＣＳＦ（ΔＬ）から切断され、修飾されたｐＳＶｇｐｔ−ｈｕγ１−Ａ５のＳａｌＩ部位の中に結合される。
【００３２】
遺伝子転移
ＧＭ−ＣＳＦを持つ組み換えベクターは、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩによって直線化され、ネズミＢ細胞リンパ腫細胞系ＭＰＣ１１の中に伝達される。ミコフェノール酸によりｇｐｔ遺伝子の存在に関して、安定してトランスフェクションされた細胞が選択される。構築物が部位特異的方法で組み込まれたクローン（図１参照）がＥＬＩＳＡにより同定される。
【００３３】
動物実験
抗腫瘍免疫感作のための相同組み換えによるリンパ腫イディオタイプの修飾の利点は、ネズミＢ細胞リンパ腫ＭＰＣ１１を用いて具体例として示される。この腫瘍はＢＡＬＢ／ｃマウスから得られ、ＩｇＧ２ｂを発現し、１０3 個の細胞を同系動物に接種後２０日以内までに動物の１００％が死亡する。ベクターをＭＰＣ１１に転移し、相同組み換え体を同定後、これらの組み換え体をＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫感作に使用する。この目的のために、５Ｘ１０6 個の放射線照射された細胞をそれぞれ３週間の間隔で腹腔内投与する。最後の注入後７日目に、致死量の野生型腫瘍細胞の接種材料を腹腔内投与する。腫瘍細胞だけを投与され、予め免疫感作されなかった対照群の動物は腫瘍のため死亡し（図２のＣ群）、免疫感作された動物は生存に関して有意な利点を示す（Ａ群）。相同組み換えにより重鎖遺伝子座の中にＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含まないヒトＩｇＧ１−Ｃ領域だけが導入された、すなわち異種重鎖を発現するＭＰＣ１１細胞によりワクチン接種が実施されると、生存期間は僅かしか延長しない。
【００３４】
既述の方法において、リンパ腫からの腫瘍イディオタイプの単離は、遺伝子レベルでもタンパク質レベルでも不要であり、個体に特異的なワクチンを製造する必要がなく、共通のベクターをすべてのリンパ腫に利用することができ、治療開始までの時間を顕著に短縮することができる。相同組み換えによって修飾された、放射線照射された腫瘍細胞を利用すると、時間と労力を要する融合タンパク質の精製が不要となるという利点があるだけではない。顕著な利点は、組み換えタンパク質を発現する細胞を用いて免疫感作を行うと、精製可溶性タンパク質の投与と比較して、腫瘍防御効果が非常に強力であるということである。
【００３５】
本組み換えベクターによって、治療開始までの時間は、相当、短縮される可能性がある。さらに、融合タンパク質の精製を必要とせずに、ワクチン接種のための放射線照射後に、相同組み換えによって修飾した腫瘍細胞を利用することが可能である。上記の実施例によって、精製された可溶性タンパク質を用いた細胞の免疫感作と比較して、腫瘍防御効果が驚くほど強力であることが、証明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】構築物が部位特異的方法で組み込まれて、クローンが得られることを示す図である。
【図２】腫瘍細胞の投与後の経過時間（日）と、生存率（％）の関係を示す図である。
【図３】ベクターｐＳＰ７２の制限酵素地図（Promega, Medison, U.S.A.) である。
Claims (10)
- 悪性腫瘍Ｂ細胞において免疫グロブリン−サイトカイン融合タンパク質を発現するためのベクターであって、作動可能なように相互に結合した
（ａ）μイントロンまたはκイントロンの領域に相同な少なくとも１．５ｋｂの領域と、
（ｂ）免疫グロブリンのＣドメインをコードするＤＮＡ配列と、
（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列と、
（ｄ）真核生物Ｂ細胞において選択可能であり、機能的なエンハンサー領域を含むマーカー遺伝子と
を少なくとも含むベクター。 - 少なくとも１．５ｋｂの前記領域が機能的なまたは機能のないＣμまたはＣκエンハンサーを含む請求項１に記載のベクター。
- 真核細胞Ｂ細胞において選択可能な前記マーカー遺伝子が、機能のないエンハンサー領域を含むか、または、エンハンサー領域を欠損する請求項１に記載のベクター。
- μイントロンまたはκイントロンのＣμまたはＣκエンハンサーを含む領域に相同な領域が、少なくとも１．９ｋｂを含む請求項１に記載のベクター。
- 前記（ｂ）のＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン鎖のドメインをコードする請求項１に記載のベクター。
- 悪性Ｂ細胞において免疫グロブリンＣドメイン−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質をin vitroで発現させる方法であって、
（ａ）請求項１に記載のベクターを悪性Ｂ細胞に導入するステップと、
（ｂ）融合タンパク質を安定して発現している細胞を選択して同定するステップと、
（ｃ）細胞を複製不全にするために細胞を処理するステップと
を含む方法。 - 前記ステップ（ｂ）が省略される請求項６に記載の方法。
- 相同組換えによる請求項１に記載のベクターの導入に続いて、悪性Ｂ細胞の重鎖Ｖ遺伝子の前記ベクターの３’への部位特異的組み込みが行われる請求項６に記載の方法。
- 組込まれた形態の請求項１に記載のベクターを含む悪性Ｂ細胞であって、免疫グロブリンＣドメイン−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質が前記悪性Ｂ細胞により発現されることを特徴とする悪性Ｂ細胞。
- 複製不全であり組み込まれた形態の請求項１に記載のベクターを含む悪性Ｂ細胞であって、悪性Ｂ細胞疾患を有する患者の治療のために免疫グロブリンＣドメイン−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を発現できる悪性Ｂ細胞を含んでなる医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19716892.2 | 1997-04-22 | ||
| DE19716892A DE19716892C1 (de) | 1997-04-22 | 1997-04-22 | Expression von Immunglobulin-Zytokin-Fusionsproteinen in malignen B-Zellen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10295379A JPH10295379A (ja) | 1998-11-10 |
| JP3802677B2 true JP3802677B2 (ja) | 2006-07-26 |
Family
ID=7827331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12679498A Expired - Fee Related JP3802677B2 (ja) | 1997-04-22 | 1998-04-21 | 悪性ｂ−細胞における免疫グロブリン−サイトカイン融合蛋白質の発現のためのベクター、その利用、発現方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6673573B2 (ja) |
| EP (1) | EP0874054B1 (ja) |
| JP (1) | JP3802677B2 (ja) |
| AT (1) | ATE247170T1 (ja) |
| DE (2) | DE19716892C1 (ja) |
| DK (1) | DK0874054T3 (ja) |
| ES (1) | ES2205303T3 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6911204B2 (en) | 2000-08-11 | 2005-06-28 | Favrille, Inc. | Method and composition for altering a B cell mediated pathology |
| US20100205679A9 (en) * | 2000-10-17 | 2010-08-12 | The Rockefeller University | Animals, cells and methods for production of detectably-labeled antibodies |
| WO2007149097A1 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | The Rockefeller University | Animals, cells and methods for production of detectably-labeled antibodies |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5202238A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| JPH09506761A (ja) * | 1990-11-09 | 1997-07-08 | ステファン ディー．ギリーズ | サイトカインの免疫複合体 |
| US5650150A (en) * | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| ATE248924T1 (de) * | 1991-05-06 | 2003-09-15 | Us Gov Health & Human Serv | Karcinoembryonale antigen expremierende rekombinante viren und methoden ihrer anwendung |
| JPH08501085A (ja) | 1992-08-26 | 1996-02-06 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 抗腫瘍剤としてのサイトカインｉｐ−１０の利用 |
| US6099846A (en) * | 1992-10-14 | 2000-08-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhancement of B cell lymphoma and tumor resistance using idiotype/cytokine conjugates |
| DE4406512C1 (de) * | 1994-02-28 | 1995-02-16 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Integrationsvektoren zur Herstellung von Genen, die rekombinante Antikörper codieren |
| DE19541450C2 (de) * | 1995-11-07 | 1997-10-02 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Genkonstrukt und dessen Verwendung |
| US5850150A (en) * | 1996-05-01 | 1998-12-15 | Sun Microsystems, Inc. | Final stage clock buffer in a clock distribution network |
-
1997
- 1997-04-22 DE DE19716892A patent/DE19716892C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-04-03 ES ES98106176T patent/ES2205303T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 DE DE59809249T patent/DE59809249D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 EP EP98106176A patent/EP0874054B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 AT AT98106176T patent/ATE247170T1/de active
- 1998-04-03 DK DK98106176T patent/DK0874054T3/da active
- 1998-04-21 US US09/064,026 patent/US6673573B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-21 JP JP12679498A patent/JP3802677B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-11-18 US US10/716,580 patent/US20040072300A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-12-09 US US12/964,333 patent/US20110207211A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040072300A1 (en) | 2004-04-15 |
| DK0874054T3 (da) | 2003-12-08 |
| US6673573B2 (en) | 2004-01-06 |
| US20020155111A1 (en) | 2002-10-24 |
| US20110207211A1 (en) | 2011-08-25 |
| ATE247170T1 (de) | 2003-08-15 |
| DE59809249D1 (de) | 2003-09-18 |
| EP0874054B1 (de) | 2003-08-13 |
| DE19716892C1 (de) | 1998-09-03 |
| ES2205303T3 (es) | 2004-05-01 |
| EP0874054A2 (de) | 1998-10-28 |
| JPH10295379A (ja) | 1998-11-10 |
| EP0874054A3 (de) | 2001-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11230697B2 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| KR100203511B1 (ko) | 이종개체 항체의 제조방법 | |
| CN101263158B (zh) | 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制 | |
| KR100514560B1 (ko) | 지정스위치-매개dna재조합 | |
| KR100379356B1 (ko) | 상동재조합을달성하기위한dna구성물및이것의용도 | |
| US20050137384A1 (en) | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation | |
| KR20020020794A (ko) | 단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Ｆｃ융합 단백질 | |
| EP1539785B1 (en) | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector | |
| US20110207211A1 (en) | Expression of immunoglobulin-cytokine fusion proteins in malignant b cells | |
| JP2004535168A (ja) | 抗体の調製および選択方法 | |
| US10717991B2 (en) | Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof | |
| US20050123511A1 (en) | Dna vaccine | |
| US20230406934A1 (en) | Ungulate-derived polyclonal immunoglobulin specific for pd-li and uses thereof | |
| CN118108860A (zh) | 一种基于FcRn可提高细胞免疫水平的重组疫苗及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050909 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20051209 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20051215 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060308 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060331 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060428 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100512 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110512 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120512 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |