ES2205303T3 - Vector para la expresion de proteinas de fusion inmunoglobulina-citoquina en celulas b malignas. - Google Patents
Vector para la expresion de proteinas de fusion inmunoglobulina-citoquina en celulas b malignas.Info
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Abstract
CON ARREGLO A LA INVENCION SE PRESENTA UN VECTOR PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS DE FUSION DE INMUNOGLOBULINA Y CITOQUINA EN CELULAS B MALIGNAS, QUE CONTIENE EN UNION FUNCIONAL AL MENOS A) UNA REGION DE 1,5 KB COMO MINIMO, QUE ES HOMOLOGA A UNA REGION DEL MI - INTRON O KA INTRON, QUE NO CONTIENE NINGUN ENHANCER FUNCIONAL C MI O C KA ; B) AL MENOS UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UN DOMINIO DE UNA INMUNOGLOBULINA O UNA PARTE DE LA MISMA; C) UNA SECUENCIA DE ADN CODIFICADORA PARA UNA CITOQUINA; Y D) UN MARCADOR SELECCIONABLE EN CELULAS B EUCARIONTICAS, QUE NO MUESTRA NINGUNA REGION ENHANCER FUNCIONAL, SIENDO CONTROLADA LA EXPRESION DE DICHO MARCADOR TRAS LA INTEGRACION DEL ENHANCER C MI O C KA CELULAR.
Description
Expresión de proteínas de fusión
inmunoglobulina-citoquina en células B malignas.
La presente invención se refiere a un vector para
la expresión de proteínas de fusión
inmunoglobulina-citoquina en células B malignas, un
procedimiento para la expresión de proteínas de fusión
inmunoglobulina-citoquina en células B malignas, la
utilización del vector así como células B malignas que contienen
dicho vector.
El idiotipo de inmunoglobulina que se expresa en
los linfomas de células B es un antígeno específico de tumor, que
sin embargo presenta una baja inmunogenicidad en un huésped portador
de tumor. Se han evaluado diferentes preparaciones en su capacidad
de inducir una respuesta inmune contra el idiotipo. Entre otros, se
acopló el idiotipo a GM-SCF y se utilizó como
proteína soluble para la vacunación de ratones (Nature 362,
755-758, 1993). El GM-CSF recruta
células presentadoras de antígeno profesionales y conduce a la
presentación efectiva del idiotipo y con ello a la activación de las
células T. Esta preparación tiene la desventaja de que debe clonarse
el gen V de la inmunoglobulina a partir del linfoma y que la
proteína de fusión debe ser producida y purificada in vitro.
Además, en una situación clínica debería prepararse una vacuna
individual para cada paciente.
Es objeto de la presente invención proporcionar
nuevos vectores que puedan utilizarse de forma universal en
pacientes sin que sea necesario preparar vacunas individuales.
Este objeto se resuelve según la invención
mediante un vector para la expresión de proteínas de fusión
inmunoglobulina-citoquina en células B malignas que
contenga como mínimo, en unión funcional,
a) una región de 1,5 kb como mínimo, homóloga a
una región del intrón \mu o intrón \kappa, que contiene
opcionalmente un activador de la transcripción C\mu o C\kappa o
ninguno o ninguno funcional;
b) una secuencia de ADN como mínimo que codifica
un dominio de una inmunoglobulina o un trozo del mismo;
c) una secuencia de ADN que cofidica una
citoquina;
d) un marcador seleccionable en células B
eucariotas, que contiene opcionalmente un activador de la
transcripción o que no muestra ninguna región activadora de la
transcripción funcional, controlándose entonces la expresión de este
marcador tras la integración de un activador de la transcripción
C\mu o C\kappa.
Las realizaciones preferidas de la invención se
manifiestan en las reivindicaciones dependientes, en la siguiente
descripción y en los ejemplos de realización.
En el estado de la técnica, por ejemplo en la
publicación citada más arriba en Nature 362,
755-758, 1993, las proteínas de fusión contenidas se
expresaron in vitro tras la transfección de células en
cultivo celular, se purificaron y se administraron en forma soluble;
por el contrario, el gen de citoquina puede introducirse de forma
específica de sitio en el locus de la cadena pesada de los
genes de la inmunoglobulina mediante los vectores proporcionados por
la invención, por recombinación homóloga, sin que sea necesario
aislar el gen V e introducirlo en el vector. El vector según la
invención se introduce directamente en la célula B maligna y se
expresa en esta célula, de
manera que no es necesario administrar la proteína purificada previamente, a diferencia de las preparaciones existentes hasta el momento, sino que las células tumorales modificadas mediante biotecnología pueden administrarse directamente en los pacientes. Esto, por un lado, conlleva un ahorro de tiempo, trabajo y costes y por otro lado tiene como consecuencia un efecto protector contra tumor claramente mejor.
manera que no es necesario administrar la proteína purificada previamente, a diferencia de las preparaciones existentes hasta el momento, sino que las células tumorales modificadas mediante biotecnología pueden administrarse directamente en los pacientes. Esto, por un lado, conlleva un ahorro de tiempo, trabajo y costes y por otro lado tiene como consecuencia un efecto protector contra tumor claramente mejor.
El punto de partida para la construcción de los
vectores según la invención son los vectores de integración
descritos en la patente DE 44 06 512 para la preparación de
anticuerpos recombinantes. Estos vectores son apropiados para una
producción altamente eficiente de anticuerpos de ratones quiméricos
/ hombres. Los vectores de integración descritos en la patente DE 44
06 512 se utilizaron exclusivamente para la preparación de
anticuerpos recombinantes y por lo tanto se expresaron
exclusivamente en células de hibridoma productoras de anticuerpos.
La preparación-solución según la invención, la
introducción de inmunoglobulinas como proteínas de fusión con
citoquinas por recombinación homóloga directamente en células B
malignas y la utilización de dichas células B malignas modificadas
para la vacunación de pacientes con tumores de células B malignos,
no resulta evidente a partir de la patente DE 44 06 512.
En la presente invención se introduce un gen de
citoquina en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina
de las células B malignas, por ejemplo las células de linfoma de
células B, por recombinación homóloga. Para ello se construyó un
vector de integración con las características de la reivindicación
1. Tras la integración específica de sitio en el locus de la
cadena pesada se expresó una proteína de fusión
inmunoglobulina-citoquina bajo el control del
promotor V_{H} endógeno.
El vector de recombinación descrito se puede
emplear potencialmente para todos los linfomas. Mediante la
introducción del gen de citoquina por recombinación homóloga en el
locus de la cadena pesada de la célula B maligna, puede
evitarse un aislamiento del idiotipo. Por lo tanto, el tiempo
transcurrido hasta el comienzo de una terapia se acorta
considerablemente. Además es posible emplear las células tumorales
modificadas por recombinación homóloga tras la irradiación, sin ser
necesaria la purificación de la proteína de fusión. El siguiente
ejemplo de realización muestra que el efecto protector contra tumor
es claramente más pronunciado cuando se inmuniza con las células
modificadas proporcionadas por la invención en lugar de la proteína
soluble.
La base para la construcción del vector según la
invención son los vectores de integración descritos en la patente DE
44 06 512. Se hace referencia a todo el contenido de esta solicitud
de patente alemana para una completa comprensión. Sin embargo, los
vectores de integración descritos en la solicitud de patente DE 44
06 512 se modifican de tal manera que no se expresa y obtiene ningún
anticuerpo recombinante, sino que se expresan proteínas de fusión de
inmunoglobulinas y citoquinas directamente en células B
malignas.
El vector según la invención puede presentar una
región homóloga a una región de intrón de 1,5 kb como mínimo, en la
cual no se encuentra de forma natural el activador de la
transcripción de Ig o se ha deleccionado del mismo o se ha
inactivado; o en otra forma de realización, el vector según la
invención presenta sin embargo un activador de la
transcripción
C\mu o C\kappa funcional.
C\mu o C\kappa funcional.
El ADN puede englobar un exón o varios, siempre y
cuando se codifique un dominio funcional de un anticuerpo o un trozo
funcional del mismo. En el caso en que el trozo del dominio sea un
trozo de un dominio V, debe ser capaz de unirse al antígeno objetivo
o contribuir a ello. Si se trata de una parte de un dominio C, éste
debe poder desempeñar como mínimo una parte de las funciones
efectoras.
En una forma de realización preferida, la región
del intrón \mu o \kappa, de 1,5 kb como mínimo engloba la región
en la cual se localiza el activador de la transcripción C\mu o
C\kappa, conteniendo opcionalmente esta región un activador de la
transcripción C\mu o C\kappa más o ninguno más. En esta forma de
realización mencionada en último lugar, el activador de la
transcripción puede estar deleccionado o inactivado. Dicha
inactivación puede realizarse mediante mutagénesis según los
procedimientos conocidos en el estado de la
\hbox{técnica.}
En el marcador seleccionable se ha deleccionado o
se ha inactivado el activador de la transcripción. En otra forma de
realización, el marcador no presenta ningún activador de la
transcripción de forma natural. En una forma de realización
adicional, el marcador seleccionable posee un activador de la
transcripción.
La secuencia homóloga contenida en el vector debe
presentar una longitud de 1,5 kb como mínimo, para poder conseguirse
un acontecimiento de recombinación homóloga. Esta secuencia de ADN
de 1,5 kb como mínimo puede seleccionarse a partir de diferentes
regiones del intrón C\mu o C\kappa. El propio activador de la
transcripción puede no estar contenido en la construcción según la
invención o deleccionarse a partir del flanco homólogo o bien
inactivarse. Mediante la integración del vector en la secuencia
homóloga de un gen de anticuerpo reorganizado de forma funcional, la
expresión del gen recombinante se coloca bajo el control del
activador de la transcripción endógeno. En el caso de que se
recombinen exones que codifican las regiones constantes, estos se
encontrarán también bajo el control del promotor V endógeno. El
activador de la transcripción regula además la expresión del
marcador seleccionable. De esta manera se asegura que el marcador de
selección sólo se activa cuando se integra en la proximidad de un
activador de la transcripción potente. Mediante el flanco de
homología utilizado, se favorece una recombinación homóloga con el
locus de inmunoglobulina, de manera que el marcador
seleccionable queda bajo el control del activador de la
transcripción C\mu o C\kappa endógeno.
La expresión del gen recombinante proporcionado
por la invención, que codifica una proteína de fusión
inmunoglobulina-citoquina, quedará bajo el control
del promotor V_{H} endógeno tras la integración 3' específica de
sitio del gen V de la cadena pesada de la célula B maligna.
Las técnicas de clonación son conocidas por el
experto medio en la técnica a partir del estado de la técnica. Por
ejemplo se remite a Sambrook et al, "Molecular Cloning, A
Laboratory Manual" ("Clonaje Molecular, un Manual de
Laboratorio"), 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, USA, así como Harlow y Lane
"Antibodies, A Laboratory Manual" ("Anticuerpos, un Manual
de Laboratorio"), 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, USA.
El segmento del gen V de la inmunoglobulina
endógena de las células B productoras de inmunoglobulina permanece
invariable y se expresará tras la recombinación homóloga en conexión
con el segmento de gen constante introducido y la citoquina. De esta
manera se conserva el idiotipo de un linfoma de célula B, pero su
unión física a la citoquina conduce a una presentación reforzada
mediante las células presentadoras de antígeno y así a una
inmunogenicidad aumentada del isotipo. Por lo tanto, el vector según
la invención no codifica ningún dominio V o trozo del mismo, a
diferencia del vector de la patente DE 44 06 512; en vez de esto se
conserva la secuencia V endógena y el idiotipo de la célula B
transfectada.
En otra forma de realización preferida, el vector
presenta una secuencia de ADN que codifica una región constante o un
trozo de la misma. Esta secuencia puede codificar la cadena pesada o
ligera de un anticuerpo. El experto medio en la técnica sabe que en
todos los isotipos varios exones codifican la cadena pesada. En el
caso de que se presente sólo un exón C_{H} para la cadena pesada
en la construcción, éste es preferentemente el exón C_{H1}. Con
dicha construcción pueden prepararse proteínas de fusión, cuya
porción de inmunoglobulina presenta la funcionalidad de los
fragmentos Fab o F(ab)_{2}. Sin embargo, el vector
según la invención contiene preferentemente todos los exones de un
isotipo de cadena pesada, de manera que se pueda expresar una cadena
pesada completa. En esta forma de realización, los elementos (a),
(b), (c) y (d) se disponen de forma consecutiva en este orden en
dirección 5'-3'.
En otra forma de realización preferida del vector
de integración según la invención, éste presenta en la región
homóloga al intrón \mu o \kappa, una longitud de
1,9 kb o 2,0 kb.
1,9 kb o 2,0 kb.
En una forma de realización adicional, el vector
según la invención contiene una unidad reguladora compatible con
bacterias. Dicha unidad reguladora compatible con bacterias
posibilita la clonación y amplificación del vector en sistemas
bacteriales, por ejemplo en E. coli. Los sistemas de
regulación compatibles con bacterias son conocidos por el experto
medio en la técnica a partir del estado de la técnica; consúltese
Sambrook et al., citado anteriormente. Un ejemplo de una unidad
reguladora compatible con bacterias de este tipo es la unidad
reguladora del
plásmido pBR322.
plásmido pBR322.
En otra forma de realización, la porción de
inmunoglobulina de la proteína de fusión es de naturaleza quimérica.
Por "quimérica" se entiende una inmunoglobulina, que combina
las regiones V y C de diferentes especies. Por ejemplo puede
combinarse un gen V de ratón con exones C de un isotipo humano.
En otra realización, la secuencia de ADN de la
característica (b) codifica una cadena de inmunoglobulina humana.
Estos dominios pueden ser tanto dominios V como dominios C o trozos
de los mismos.
En otra forma de realización preferida del vector
según la invención, la secuencia de ADN codifica dominios que
provienen de ratón, rata, cabra, caballo u oveja. Preferentemente,
todas las secuencias de ADN de las regiones V o las regiones C
provienen de uno de estos tipos de animales, donde las regiones C
también pueden tomarse de diferentes tipos de animales.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el vector presenta una región Ig constante
xenógena para el paciente, lo cual puede resultar ventajoso para la
inducción de una respuesta inmune.
De la misma manera que se han utilizado, en otra
forma de realización del vector según la invención, secuencias de
ADN que codifican dominios humanos, las secuencias de ADN que
codifican estos dominios pueden emplearse para la recombinación
homóloga con la correspondiente secuencia de otro tipo de
mamífero.
mamífero.
En otra forma de realización preferida del vector
según la invención, la secuencia de ADN codifica todos los dominios
C de un anticuerpo secretor.
Una forma de realización preferida adicional del
vector según la invención contiene una secuencia de ADN que codifica
los dominios C de un anticuerpo que es un anticuerpo IgM, IgG1,
IgG2a, IgG2b, IgG4, IgA, IgD o IgE. El experto medio en la técnica
sabe que algunos de estos isotipos no están presentes en todas las
especies de mamíferos. Así, el genoma humano contiene por ejemplo
genes C, que codifican el isotipo IgG4 pero no los isotipos IgG2a o
IgG2b. Por el contrario, el genoma de ratón contiene genes C que
codifican el isotipo IgG2a y el isotipo IgG2b, pero no el isotipo
IgG4.
En otra forma de realización preferida del vector
de integración según la invención, el marcador seleccionable es gpt,
neo o codifica una resistencia a la higromicina. El experto medio en
la técnica está familiarizado con el cultivo de células bajo las
condiciones de selección que requieren estos marcadores (consúltese
Sambrook et al., citado anteriormente). Éste se encuentra además en
condiciones de seleccionar marcadores de selección adicionales que
pueden utilizarse en el vector según la invención.
La transfección de células productoras de
inmunoglobulina se considera un procedimiento estándar de la
inmunología moderna. El experto medio en la técnica sabe que las
condiciones de transfección debe ajustarse a cada línea celular
utilizada. Un manual para conseguir dichas condiciones de
transfección se da por ejemplo en Toneguzzo et al., Mol. Cell Biol.,
6 (1986), 703-706, así como en la descripción
"Genepulser" de Biorad. Por ejemplo, para la línea de mieloma
de ratón NS-1 (ATCC TIB 18) se describen las
condiciones de transfección apropiadas en Mocikat et al., Gene 136
(1993), 349-353. La selección de transformantes
estables se lleva a cabo mediante el cultivo de los transformantes
durante 7 días como mínimo en un medio de selección apropiado. La
selección de transformantes estables es necesaria para matar las
células que no han integrado el plásmido. La selección del medio de
selección se ajusta evidentemente al marcador de selección
utilizado. La preparación de los medios de selección apropiados es
conocida en el estado de la técnica y se puede consultar por ejemplo
en Sambrook et al., citado anteriormente.
En una forma de realización preferida del vector
según la invención, la transfección se lleva a cabo mediante
electroporación, coprecipitación con calcio, lipofección, la técnica
DEAE-dextrano o transferencia génica retrovírica.
Todos estos procedimientos son bien conocidos en el estado de la
técnica. El experto medio en la técnica sabe como tiene que ajustar
las condiciones de cada procedimiento de transfección particular en
el procedimiento según la invención. En otra forma de realización
preferida del procedimiento según la invención, la selección se
lleva a cabo en un medio que contiene como medio de selección ácido
micofenólico, G418 o higromicina. Tal y como se ha mencionado
anteriormente, estos medios de selección son conocidos en el estado
de la técnica. Su elección depende del marcador de selección
utilizado, mientras que su dosificación puede deducirse de los
trabajos estándar de la biología molecular; consúltese por ejemplo
Sambrook et al., citado anteriormente.
En otra forma de realización preferida del
procedimiento según la invención, la secuencia de ADN codifica
dominios constantes del isotipo \gamma_{1}, \gamma_{2a},
\gamma_{2b}, \gamma_{3}, \gamma_{4}, \mu, \alpha,
\beta o \varepsilon.
La secuencia de ADN según la característica (c)
codifica citoquinas que pueden seleccionarse entre interleuquinas,
interferones, factores estimuladores de colonias, linfoquinas y
factores de crecimiento. Algunos ejemplos de secuencias de ADN de
este tipo son: IL-2, IL-4,
IL-7, IL-12, IL-13,
GM-CSF o
\hbox{interferón \gamma .}
Los vectores de la presente invención se
introducen en células B malignas preferentemente mediante los
procedimientos detallados más arriba, y se integran mediante
recombinación homóloga y se expresan de forma estable en las mismas.
Mediante procedimientos de selección e identificación apropiados se
identifican las células B malignas que expresan de forma estable la
proteína de fusión. Sin embargo, en una forma de realización
preferida de la presente invención también es posible emplear
directamente para vacunación las células B malignas que contienen la
construcción vectorial según la invención, sin que haya tenido lugar
una selección previa de dichas células que expresan de forma estable
la proteína de fusión. Evidentemente, antes de una vacunación es
necesario hacer las células B malignas incompetentes para la
replicación mediante irradiación antes de la inyección, sin
perjudicar por ello la expresión de la proteína de fusión.
Por lo tanto, no es estrictamente necesario
proceder a una selección de las células recombinantes antes de la
inyección en los pacientes. Para inmunizar contra el tumor es
suficiente la expresión de los transformantes en los cuales se
presenta un acontecimiento de recombinación homóloga, de manera que
también puede darse una población celular heterogénea. Por lo tanto
no es estrictamente necesario que el vector según la invención
presente el marcador seleccionable en células B eucarióticas
mencionado en la característica (d) de la reivindicación 1. Puede
prescindirse de dicho marcador en los casos en que no tenga lugar
una selección de las células recombinantes antes de la inyección en
los pacientes.
El vector proporcionado por la invención también
puede utilizarse en una preparación ex vivo. Para ello se
utilizan células dendríticas cultivadas para la presentación de
péptidos específicos de tumor y eventualmente también para la
activación de células T por medio de la proteína de fusión expresada
en las células tumorales recombinantes. Las células presentadoras de
antígeno y las células T activadas se retornarían entonces a los
pacientes.
Una gran ventaja en la inyección de dichas
células B malignas que producen la proteína de fusión
inmunoglobulina-citoquina reside en la supresión de
etapas de producción y purificación necesarias para la preparación
de estas proteínas en cantidades relevantes clínicamente.
La célula B maligna en la cual se introduce en
vector según la invención, puede ser por ejemplo una célula de
leucemia de células B, una célula de linfoma de célula B o una
célula de plasmacitoma.
La invención se describe a continuación con
\hbox{ayuda} de un ejemplo realizado en un modelo animal.
Tomando como base las prolongadas experiencias, los resultados
obtenidos también son transferibles a los humanos. Evidentemente, la
invención no se limita al siguiente ejemplo de realización especial,
sino que puede modificarse según el alcance de las reivindicaciones
indicadas posteriormente.
El gen de GM-CSF murino se clona
a través de PstI en el vector pSP72 (véase la figura 3). La porción
5' del gen se escisiona con EcoRV y XmaI y se substituye por un
producto de PCR cortado de la misma manera, al cual le faltan los
últimos 29 aminoácidos N-terminales. De esta manera
se produce la construcción pSP72 (\DeltaEV)-GMCSF
(\DeltaL). Se introduce una diana de restricción para SalI en el
vector pSVgpt-hu\gamma1-A5
(Kardinal et al. Eur. J. Inmunol. 25, 792-797, 1995)
en 3' respecto el exón IgG1-C_{H}3 humano. El gen
GM-CSF se escisiona con SalI a partir de pSP72
(\DeltaEV)-GMCSF (\DeltaL) y se liga en la diana
SalI del vector modificado
pSVgpt-hu\gamma1-A5.
El vector recombinante portador de
GM-CSF se lineariza con EcoRI o BamHI y se
transfiere a la línea celular de linfoma de célula B murina MPC11.
Las células transfectadas de manera estable se seleccionan con la
ayuda de ácido micofenólico en presencia del gen gpt. Los clones en
los cuales se ha integrado la construcción de manera específica de
sitio se identifican mediante ELISA.
Los beneficios que aporta a la inmunización
contra tumor la modificación de un idiotipo de linfoma a través de
la recombinación homóloga, se muestran mediante el ejemplo del
linfoma de célula B murino MPC11. Este tumor procede del ratón
BALB/c, expresa IgG2b y tras la inoculación de 10^{3} células en
animales singénicos conduce a la muerte del 100% de los animales en
un período de hasta 20 días. Tras la transferencia del vector a
MPC11 y la identificación de los recombinantes homólogos, se
utilizan los mismos para la inmunización de ratones BAB/c. Para ello
se inyecta dos veces i.p. 5x10^{6} células irradiadas por ratón,
con un intervalo de tres semanas. / días tras la última inyección se
suministra i.p. un inóculo de células tumorales de tipo salvaje.
Mientras que los animales del grupo control, que contienen sólo
células tumorales, pero ninguna preinmunización, mueren por el tumor
(Grupo C en la Figura 2), los animales inmunizados muestran una
significativa en cuanto a supervivencia (Grupo A). Cuando se vacuna
con las células MPC11, en cuyo locus de cadena se ha
introducido la región IgG1-C sin el gen
GM-CSF por recombinación homóloga, que expresan
también una cadena pesada xenogenizada, de manera que sólo se
produce una prolongación del tiempo de supervivencia marginal.
Dado que el idiotipo del tumor en el
procedimiento descrito no tiene que aislarse del linfoma a nivel
genético ni a nivel de proteína y no tiene que prepararse una vacuna
específica individualmente, sino que puede utilizarse un vector
universal para todos los linfomas, puede reducirse considerablemente
el tiempo necesario hasta el inicio de la terapia. La utilización de
células tumorales irradiadas modificadas por recombinación homóloga,
no comporta sólo la ventaja de renunciar a la purificación de la
proteína de fusión, que comporta un consumo de tiempo y desembolso
de gastos. Una ventaja decisiva consiste en que el efecto protector
contra tumor es claramente más pronunciado cuando se inmuniza con
células que expresan una proteína recombinante que cuando se
proporciona la proteína soluble purificada.
Mediante el presente vector de recombinación
puede reducirse considerablemente el tiempo hasta el inicio de una
terapia. Además es posible utilizar para la vacunación las células
tumorales modificadas por recombinación homóloga tras la
irradiación, sin que sea necesario purificar la proteína de fusión.
Puede demostrarse mediante el ejemplo mencionado más arriba que,
sorprendentemente, el efecto protector contra tumor es claramente
más pronunciado que en la inmunización de células con una proteína
soluble purificada.
Claims (30)
1. Vector para la expresión de proteínas de
fusión inmunoglobulina-citoquina en células B
malignas, que contiene como mínimo, en unión funcional,
a) una región de 1,5 kb como mínimo, homóloga a
una región del intrón \mu o intrón \kappa;
b) una secuencia de ADN como mínimo que codifica
un dominio de una inmunoglobulina o un trozo del mismo;
c) una secuencia de ADN que cofidica una
citoquina; y
d) un marcador seleccionable en células B
eucariotas, que presenta una región activadora de la transcripción
funcional, o una región activadora de la transcripción no funcional,
o ninguna región activadora de la transcripción.
2. Vector según la reivindicación 1, donde la
región de 1,5 kb de tamaño como mínimo contiene un activador de la
transcripción C\mu o C\kappa funcional.
3. Vector según la reivindicación 1, donde la
región de 1,5 kb de tamaño como mínimo contiene un activador de la
transcripción C\mu o C\kappa no funcional.
4. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde el gen de marcador seleccionable
en células B eucariotas presenta una región activadora de la
transcripción no funcional.
5. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde el gen de marcador seleccionable
en células B eucariotas no presenta ninguna región activadora de la
transcripción.
6. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de ADN de (b)
codifica una región constante o un trozo de la misma.
7. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la región que es homóloga a una
región que engloba el intrón \mu o \kappa, engloba 1,9 kb como
mínimo.
8. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la región que es homóloga a una
región que engloba el intrón \mu o \kappa, engloba 2,0 kb como
mínimo.
9. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, que contiene una unidad reguladora
compatible con bacterias.
10. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la inmunoglobulina es una
inmunoglobulina quimérica.
11. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de ADN de (b)
codifica el dominio de una cadena de inmunoglobulina humana.
12. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de ADN de (b)
codifica dominios que provienen de ratón, rata, cabra, de caballo u
oveja.
13. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de ADN de (b)
codifica todos los dominios C de un anticuerpo
\hbox{secretor.} 14. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de ADN de (b)
codifica todos los dominios C de un anticuerpo unido a membrana.
15. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que la secuencia de ADN de (c) codifica interleuquina, interferón,
factores estimuladores de colonias, linfoquina o factores de
crecimiento.
16. Vector según la reivindicación 15,
caracterizado por el hecho de que la secuencia de ADN de (c)
codifica la IL-2, la IL-4, la
IL-7, la IL-12, la
IL-13, el GM-CSF o el interferón
\gamma.
17. Vector según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, donde el marcador seleccionable es un
marcador que codifica gpt, neo, o resistencia a la higromicina.
18. Procedimiento para la expresión de una
proteína de fusión inmunoglobulina-citoquina en
células B malignas in vitro con las siguientes etapas:
(a) Introducción de un vector según una o varias
de las reivindicaciones 1-17 en una célula B
maligna;
(b) Selección e identificación de células que
expresan de forma estable la proteína de fusión;
(c) Manipulación de las células para hacerlas
incompetentes para la replicación.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
donde se suprime la etapa (b).
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó
19, donde la etapa (a) se lleva a cabo mediante transfección.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
donde la transfección se lleva a cabo mediante electroporación,
coprecipitación con calcio, lipofección, la técnica de DEAE dextrano
o transferencia génica retrovírica.
22. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 18 a 21, donde se lleva a cabo la selección en un
medio que contiene como medio de selección ácido micofenólico, G418
o higromicina.
23. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 18 a 22 donde, tras la introducción de un vector
según una o varias de las reivindicaciones 1 a 17 por recombinación
homóloga, tiene lugar una integración específica de sitio del vector
en 3' respecto el gen V de la cadena pesada.
24. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 18 a 23, donde se regula la expresión del promotor
V_{H} endógeno.
25. Utilización de un vector según una o varias
de las reivindicaciones 1 a 17 para la expresión de proteínas de
fusión inmunoglobulina-citoquina en células B
malignas.
26. Utilización según la reivindicación 25, donde
la células B maligna es una célula de leucemia de células B, una
célula de linfoma de célula B o una célula de plasmocitoma.
27. Utilización según la reivindicación 25, donde
se tiene lugar una activación de células T mediante la expresión de
las proteínas de fusión
inmunoglobulina-citoquina.
28. Utilización de un vector según una o varias
de las reivindicaciones 1 a 17 en células B malignas para la
vacunación de pacientes con enfermedades de células B malignas.
29. Célula B maligna que contiene un vector según
una o varias de las reivindicaciones 1 a 17 en forma integrada,
expresándose en la célula una proteína de fusión
inmunoglobulina-citoquina.
30. Utilización de una célula B maligna, que se
hace incompetente para la replicación y contiene un vector según una
o varias de las reivindicaciones 1 a 17 en forma integrada y que es
capaz de expresar una proteína de fusión
inmunoglobulina-citoquina para la producción de una
preparación farmacéutica para el tratamiento de pacientes con
enfermedades de células B malignas.
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