JP3784835B2 - 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド - Google Patents
新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP3784835B2 JP3784835B2 JP50133997A JP50133997A JP3784835B2 JP 3784835 B2 JP3784835 B2 JP 3784835B2 JP 50133997 A JP50133997 A JP 50133997A JP 50133997 A JP50133997 A JP 50133997A JP 3784835 B2 JP3784835 B2 JP 3784835B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- arg
- peptides
- phe
- peptide
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、一般的に、ペプチド化学の分野に関し、そしてより詳細には、オピオイドレセプターへのリガンド結合を阻害し得る新規オピオイドペプチドに関する。
背景情報
オピオイドレセプターの少なくとも3つの公知のサブタイプ、ミュー(μ)、デルタ(δ)、およびカッパ(κ)があり、これらは、モルヒネ、エンケファリン、およびダイノルフィンを結合する。3つのレセプターサブタイプは鎮痛特性を有する。しかし、阻害される疼痛のタイプおよび二次的機能は、各レセプタータイプで異なる。κレセプターは、化学的刺激を含む疼痛に応じて鎮痛に影響を与える点で効力がある。κレセプターはまた、利尿および鎮静を誘導し、そして不快および精神心理学的効果、ならびに薬物または他の身体的依存に関連する。μレセプターは、一般的に、鎮痛、呼吸抑制、腸管運動性、抗利尿、免疫応答、および薬物または他の身体的依存に関連するものとみなされる。一方、δレセプターは、熱鎮痛、およびより小さい程度では、呼吸および嗜癖に関連する。オピオイドレセプター機能におけるこれらの差は、有害な副作用なしに鎮痛を生じる薬物の調査を促進する。
合成ペプチドの使用は、これらのサブタイプの描写(delineation)、およびインビトロおよびインビボの両方の系でのこれらのレセプター系に特異的なリガンドの相互作用を研究するために使用され得るアナログを提供することにおける手段になる。あるオピオイド化合物は(レセプターに結合して効果を生じる)アゴニストであるが、他のオピオイド化合物は(レセプターに結合するが効果を生じない)アンタゴニストである。オピオイドレセプターのほとんどの以前から公知のアゴニストおよびアンタゴニストは、エンケファリンおよび関連ペプチド(ダイノルフィン、デルムエンケファリン(dermenkephalin)、およびカソモルフィン(casomorphin)を含む)のアナログである。本発明の化合物は、これらの公知のオピオイドペプチドのいずれとも配列相同性をほとんどから全く有さない。
多数の個々のペプチドの調製およびスクリーニングのための方法における最近の進歩は、オピエートレセプターへのリガンドの相互作用に関する調査を含む、生物医学的調査のすべての領域に有用な多くのペプチドの同定を導いている。レセプター特異的アゴニストおよびアンタゴニストの両方とも、薬理学的ツールとしておよび治療薬剤として必要とされる。しかし、これらの進歩でさえも、基本的調査および薬物の発見は、特定のオピエートレセプターサブタイプに対するリガンド間の関係を確かめるために必要とされる、必要な多数の異なるオピエートアゴニストおよびアンタゴニストの利用可能性によって限定されている。したがって、オピエートリガンド−レセプター相互作用の研究のための調査を含む、生物医学的調査における使用のための多数の個々のペプチドについての必要性が存在する。さらに、治療価値を有するオピオイドペプチドが必要とされる。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに関連する利点を提供する。
発明の要旨
本発明は、κオピエートレセプターについて選択的である新規オピオイドペプチドを提供する。1つの実施態様では、オピオイドペプチドは、一般構造Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号28)を有し、ここでA1はTyrまたはArgであり、B2はArgまたはPheであり、そしてC3はThr、Phe、またはMetである。さらに他の実施態様では、オピオイドペプチドは、一般構造(D)Phe-D4-E5-F6(配列番号29)または(D)Nle-D4-E5-F6(配列番号30)を有し、ここでこれらの式の両方において、D4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。
発明の詳細な説明
本発明は、κ選択的オピオイドリガンド[3H]-U69,593の結合を阻害し得る新規オピオイドペプチドを提供する。1つの実施態様では、このペプチドは、一般構造Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号28)を有し、ここでA1はTyrまたはArgであり、B2はArgまたはPheであり、そしてC3はThr、Phe、またはMetである。この式に包含されるペプチドの例としては、以下のものが挙げられる:Ac-Tyr-Arg-Thr-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号1);Ac-Tyr-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号2);Ac-Arg-Phe-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号3);Ac-Tyr-Arg-Met-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号4);およびAc-Arg-Arg-Phe-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号5)。
別の実施態様では、新規ペプチドは、式(D)Phe-D4-E5-F6(配列番号29)に包含されるものであり、ここでD4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。この実施態様の範囲内のペプチドの例は以下の配列のいずれか1つを有する:(D)Phe-(D)NapAla-(D)Nle-(D)Arg(配列番号6);(D)Phe-(D)NapAla-(D)Nle-(D)ChAla(配列番号7);(D)Phe-(D)NapAla-Trp-(D)Arg(配列番号8);(D)Phe-(D)NapAla-Trp-(D)ChAla(配列番号9);(D)Phe-(D)NapAla-(D)Ile-(D)Arg(配列番号10);(D)Phe-(D)NapAla-(D)Ile-(D)ChAla(配列番号11);(D)Phe-(D)Phe-(D)Nle-(D)Arg(配列番号12);(D)Phe-(D)Phe-(D)Nle-(D)ChAla(配列番号13);(D)Phe-(D)Phe-Trp-(D)Arg(配列番号14);(D)Phe-(D)Phe-Trp-(D)ChAla(配列番号15);(D)Phe-(D)Phe-(D)Ile-(D)Arg(配列番号16);および(D)Phe-(D)Phe-(D)Ile-(D)ChAla(配列番号17)。
本発明のさらに別の実施態様では、ペプチドは、構造(D)Nle-D4-E5-F6(配列番号30)を有し、ここでD4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。この式の範囲内にあるペプチドの例は、以下の配列を有する:(D)Nle-(D)NapAla-(D)Nle-(D)Arg(配列番号18);(D)Nle-(D)NapAla-(D)Nle-(D)ChAla(配列番号19);(D)Nle-(D)NapAla-Trp-(D)Arg(配列番号20);(D)Nle-(D)NapAla-(D)Ile-(D)Arg(配列番号21);(D)Nle-(D)NapAla-(D)Ile-(D)ChAla(配列番号22);(D)Nle-(D)Phe-(D)Nle-(D)Arg(配列番号23);(D)Nle-(D)Phe-Trp-(D)Arg(配列番号24);(D)Nle-(D)Phe-Trp-(D)ChAla(配列番号25);(D)Nle-(D)Phe-(D)Ile-(D)Arg(配列番号26);および(D)Nle-(D)Phe-(D)Ile-(D)ChAla(配列番号27)。
以下の標準的略語が、本明細書でアミノ酸残基を同定するために使用される。
アミノ酸は、上に提供されるようなこれらの一般に知られているコードによって示され、そして(D)は、天然に存在するL-アミノ酸に対するものとして「D」配置を有するアミノ酸を示す。特定の配置が示されない場合、当業者はアミノ酸が(L)-アミノ酸であると理解する。
例示したペプチド内の1つ以上のアミノ酸が、例えば、例示されたペプチドに示される1つ以上の特定のアミノ酸の保存的アミノ酸置換によって、改変または置換され得ることは、当業者には公知である。保存的アミノ酸置換変化には、例えば、1つの塩基性アミノ酸の他の塩基性アミノ酸への置換、1つの疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸への置換、または、Argに対するオルニチン(0rn)またはホモアルギニン(homoArg)のような天然に存在しないアミノ酸の使用を包含する当該分野で周知の他の保存的置換が挙げられ得る。このような置換には、(L)配置のアミノ酸が記載されている場合の対応する(D)-アミノ酸、およびその反対(visa-versa)が含まれる。
上記のタイプの改変または置換の他に、1つ以上のアミノ酸の模倣物、さもなければペプチド模倣物(peptide mimeticまたはpeptidomimetic)として公知であるものもまた使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「模倣物」とは、同一または同様のアミノ酸の機能的特徴を有するアミノ酸またはアミノ酸アナログを意味する。したがって、例えば、(D)アルギニンアナログは、このアナログが、アルギニンのグアニジニウム側鎖反応性基の特徴である生理学的pHで正の電荷を有する側鎖を含む場合、(D)アルギニンの模倣物であり得る。ペプチド模倣物は、対応するペプチドに存在するような同様のペプチド鎖ファルマコフォア(pharmacophore)基を保持する有機分子である。
アミノ酸の天然に存在しないアミノ酸および上記のようなペプチド模倣物による置換は、側鎖の機能性に対する改変に基づいて、個々のペプチドの全体の活性または他の特性を増強し得る。例えば、例示されたペプチドのこれらのタイプの変更は、酵素的分解に対するペプチドの安定性を増強し得るか、または生物学的活性を増加し得るか、または免疫原性を低下させ得る。
上記の式を使用して、当業者は、本発明のペプチドを容易に合成し得る。合成ペプチドを調製するための標準的手順は当該分野で周知である。新規オピオイドペプチドは、Merrifield(J. Am.Chem. Soc., 85:2149 (1964))の固相ペプチド合成(SPPS)方法、またはSPPSの改変を使用して合成され得、あるいはこのペプチドは、当該分野で周知の標準的溶液方法(例えば、Bodanzsky, M., Principles of Peptide Synthesis, 第2改訂版(Springer-Verlag, 1988および1993)を参照のこと、)を使用して合成され得る。あるいは、当該分野で周知の同時多数ペプチド合成(SMPS)技法が使用され得る。Merrifieldの方法によって調製されるペプチドは、Applied Biosystems 431A-01 Peptide Synthesizer (Mountain View, CA)のような自動化ペプチド合成機を使用して、またはHoughten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:5131 (1985)に記載される手動のペプチド合成技法を使用して、合成され得る。
ペプチドは、アミノ酸またはアミノ酸アナログを使用して合成され得、その活性基は、必要に応じて、例えば、t-ブチルジカルボネート(t-BOC)基またはフルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)基を使用して保護される。アミノ酸およびアミノ酸アナログは、市販用を購入するか(Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtec)または当該分野で公知の方法を使用して合成され得る。固相法を使用して合成されるペプチドは、4-メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)、4-(オキシメチル)-フェニルアセトアミドメチル、および4-(ヒドロキシメチル)フェノキシメチル-コポリ(スチレン-1%ジビニルベンゼン)(Wang樹脂)(これらの全ては市販されている)を含む樹脂に、またはp-ニトロベンゾフェノンオキシムポリマー(オキシム樹脂)(これは、De GradoおよびKaiser, J. Org. Chem. 47:3258(1982)に記載されるように合成され得る)に付着され得る。
例示したペプチドにおいて、「Ac」はアミノ末端でのアセチル基を示し、そして「NH2」はアミド基がカルボキシ末端にあることを意味する。ペプチドは、例えば、まだ樹脂に付着されている間に、アセチル化したペプチドのようなN-末端改変した化合物を得るために操作され得るか、あるいはフッ化水素または等価の切断試薬を使用して樹脂から除去され、次いで改変され得る。C-末端カルボキシ基(Wang樹脂)を含む合成された化合物は、樹脂からの切断後、またはいくつかの場合には液相合成前に改変され得る。N-末端のアセチル化の方法またはC-末端のアミド化の方法のような、N-末端またはC-末端を改変する方法は、当該分野で周知である。
新しく合成されたペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)、等電点クロマトグラフィーのような方法、またはペプチドのサイズもしくは電荷に基づく分離の他の方法を使用して、あるいは免疫精製技法によって、精製され得る。さらに、精製したペプチドは、アミノ酸分析および質量分析のようなこれらのおよび他の周知の方法を使用して特徴づけられ得る。
製造後、ペプチドは、実施例Iに提供されるようなκ放射性レセプターアッセイを使用して、κレセプター結合活性についてアッセイされ得る。ペプチドの特異性のさらなるデータについて、κ放射性レセプターアッセイの結果は、実施例IIで提供されるようなμおよびδ放射性レセプターアッセイの結果と比較され得る。ペプチドのインビトロアゴニストまたはアンタゴニスト活性を試験するために、実施例IIIに記載のモルモット回腸アッセイのような、周知のインビボアッセイが、ルーチンに行われ得る。さらに、いくつかの他の確実なインビボ試験が当該分野で公知であり、これらは本発明のオピオイドペプチドおよび組成物を試験するために有用である。試験の例としては、マウスの尾打(tail-flick)、尾はさみ(tail-pinch)、およびHCl苦悶(writhing)試験、ならびにラット温暖プレートおよびホットプレートアッセイ、およびラット尾浸水(tail-immersion)、尾打、および空気苦悶アッセイが挙げられ、これらはすべて、Vonvoigtlanderら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 224(1):7-12 (1983)に記載されている。。上記のより通常に使用されるアッセイの1つである、マウス尾打インビボ動物モデルはまた、Dixonら、Drug Res., 27:1968 (1977)、Jiangら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 262:526 (1992)、およびDooleyら、Science, 266:2019 (1994)に記載される。
本発明のペプチドはκレセプターに結合するので、これらはオピエートレセプターサブタイプを研究するためにインビトロアッセイで使用され得る。例えば、未知のタイプまたは起源の試料レセプターにおいて、ペプチドは、放射性同位元素のような検出可能なマーカーで標識された後、κサブタイプのような特定のレセプターサブタイプへの結合を特異的に助ける条件下で、レセプター試料と接触され得る。結合していないレセプターおよびペプチドは、例えば、生理的食塩溶液での洗浄によって除去され得、次いで、結合したレセプターは、当業者に周知の方法を使用して検出され得る。したがって、本発明のペプチドは、脳および他の組織試料中の、関連したオピオイドレセプターサブタイプ、特にκタイプの診断に、インビトロで有用である。
インビトロスクリーニング方法での有用性の他に、ペプチドはまたインビボで有用である。例えば、オピオイドペプチドは、オピオイドレセプターサブタイプを局在化するためにインビボで診断的に使用され得る。ペプチドはまた、薬物として、すなわち鎮痛薬として、あるいはオピオイドレセプター系と相互作用する他の化合物と関連する病状を処置するために有用である。したがって、本発明のペプチドは、κレセプターに関連する病状を処置するための医薬品に、および鎮痛薬として使用され得る。例えば、これらのペプチドが、中枢で作用する疼痛抑制剤(killer)の末梢効果をブロックするための治療的目的で使用され得ることが、考えられ得る。例えば、モルヒネは中枢に作用する疼痛抑制剤である。しかし、モルヒネは、所望の鎮痛効果に必要とされない、末梢において多くの有害な効果(例えば、便秘およびそう痒症(そう痒))を有する。多くのペプチドが血液脳関門を容易に横切せず、したがって中枢効果を誘起しないことは公知であるが、本発明のペプチドは、便秘およびそう痒のようなモルヒネの末梢効果をブロックする点で価値を有し得る。
本発明の新規ペプチドは薬学的組成物に組み込まれ得る。薬学的に受容可能なキャリアは当該分野で周知であり、そして、水溶液(例えば、生理学的に緩衝化された生理的食塩水または他の緩衝液)、あるいは溶媒またはビヒクル(例えば、グリコール、グリセロール、油(例えば、オリーブ油)、もしくは注入可能な有機エステル)を含む。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、オピオイドペプチドを安定化するか、またはペプチドの吸収を増加させるように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、炭水化物(例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン)、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。生理学的に受容可能な化合物を含む薬学的に受容可能なキャリアの選択が、例えば、投与経路、および特定のオピオイドペプチドの特定の生理化学的特徴に依存することは、当業者に公知である。
医薬品を投与する方法は、当業者に周知であり、そして経口、静脈内、筋肉内、または腹腔内投与を含むが、これらに限定されない。投与は、連続的にまたは断続的に行われ得、そして被験体で変化し、そして処置のタイプおよび使用されるペプチドの効力に依存する。
以下の実施例は例証を意図するが、本発明を限定するものではない。
実施例I
放射性レセプターアッセイによるカッパ選択的オピオイドペプチドの同定
この実施例は、κ選択的リガンド[3H]-U69,593のインヒビターとしての個々のペプチドの同定を記載する。個々のペプチドを、放射性レセプターアッセイによって、[3H]-U69,593を阻害し得るものとして同定した。
多数の種々のペプチドの10の混合物から作成した合成組合せライブラリー(synthetic combinatorial library)(SCL)は、個々の活性化合物を迅速に同定するために使用され得る。ライブラリーが溶液中にある(すなわち、ビーズ、ピン、ファージ、ガラスなどに付着していない)ので、これらは実質的に任意のアッセイ系でスクリーニングされ得る。すべてのオピオイドペプチドを、最初に調製し、そして位置スキャニング(positional scanning)合成組合せライブラリー(PS-SCL)内に含んだ。ライブラリーを反復選択プロセスとともに使用して、放射性レセプターアッセイにおいて[3H]-U69,593を阻害し得る個々のペプチドを同定した。
以下に詳述するように、ペプチドライブラリーを、ラット脳ホモジネートおよび放射性リガンドとして[3H]-U69,593を使用してスクリーニングし、そして[3H]-U69,593の結合を著しく阻害したペプチドについて、IC50値を決定した。
カッパレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイ
液体窒素で凍結したモルモット脳を、Harlan Bioproducts for Science (Indianapolis, IN)から得た。凍結した脳を解凍し、小脳および皮質を取り出して秤量した。合わせた皮質および小脳を、100μMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、5mM MgCl2、および1mg/mlウシ血清アルブミンを含む40ml Tris-HCl緩衝液(50mM、pH7.4、4℃)中でホモジナイズし、そして4℃にて10分間遠心分離した(39000×g)(Model J2-HC; Beckman Instruments, Fullerton, CA)。ペレットを新鮮なTris-HCl緩衝液に再懸濁し、そして37℃にて40分間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を上記のように遠心分離し、得られたペレットを100容量のTris緩衝液で再懸濁し、そして懸濁液を合わせた。膜懸濁液を調製し、そして同日中に使用した。粗ホモジネートのタンパク質含有量は、Bradford、Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)に記載される方法を使用して決定したように、0.1〜0.3mg/mlの範囲であった。
結合アッセイをポリプロピレンチューブで行った。各チューブは、3nMのκ選択的リガンド[3H]-U69,593(比活性62Ci/mmol)(Amersham; Arlington Heights, IL)、ペプチド混合物(混合物中の個々のペプチドについて3×104〜3×105M濃度の範囲)、ならびに100μM PMSF、5mM MgCl2、および1mg/ml BSA、pH7.4を含むTris緩衝液を使用してモルモット脳(皮質および小脳)から調製された組織ホモジネートを含んだ。アッセイチューブを、25℃にて2.5時間インキュベートした。反応を、GF-Bフィルター(Wallac, Gaithesburg, MD)による濾過によって停止した。続いて、フィルターを6ml Tris-HCl緩衝液で4℃にて洗浄した。結合した放射能をBeta-plate Liquid Scintillation Counter(Life Technologies, Gaithersburg, MD)で計数し、そしてカウント/分(cpm)で表した。標準曲線を、0.05〜6300nMナロキソン(Sigma, St. Louis, MO)を使用して調製した。競合阻害アッセイを、ペプチド混合物の連続希釈を使用して上記のように行った。次いで、IC50値を、ソフトウエアGRAPHPAD(ISI, San Diego, CA)を使用して算出した。IC50値についての平均標準偏差は±20%であった。
1000nMより低いIC50値は、κレセプターに結合する非常に活性なオピオイドペプチドを示し、特に活性な化合物は100nMまたはそれより低いIC50値を有し、そして最も活性な化合物は10nMより低い値を有する。
1つのSCLのアッセイスクリーニングから同定したオピオイドペプチドは、一般構造Ac-A1-B2-C3-Arg-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Arg-Arg-NH2(配列番号28)を有し、ここでA1はTyrまたはArgであり、B2はArgまたはPheであり、そしてC3はThr、Phe、またはMetである。この式の範囲内にあるペプチドのIC50値を、表1に提供する。
また、κ選択的ペプチドとして同定されるものは、一般式(D)Phe-D4-E5-F6(配列番号29)であり、ここでD4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである。表2は、この式の範囲内の各ペプチドについてのそれぞれのIC50値を提供する。
一般式(D)Nle-D4-E5-F6(配列番号30)(ここで、D4は(D)NapAlaまたは(D)Pheであり、E5は(D)Nle、Trp、または(D)Ileであり、そしてF6は(D)Argまたは(D)ChAlaである)のペプチドもまた、[3H]-U69,593のインヒビターとして同定した。この式の範囲内のペプチドのIC50値を、以下の表3に提供する。
上記の表1から3の結果は、κオピオイドレセプターについて全て選択的であるオピオイドペプチドの3つの構造的に独特の系列を提供する。
実施例II
オピオイドペプチドのカッパレセプター特異性
この実施例は、μおよびδオピエートレセプターと比較して、κレセプターに対する新規オピオイドペプチドの特異性についてのさらなるデータを得る方法を示す。
個々のペプチドは、上記のように当該分野で周知の手順によって合成され得る。以下に詳述される、μおよびδレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイにおける、個々の合成されたペプチドの活性は、実施例Iからのκレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイの結果と比較され得る。
μレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイを、上記のようにラット脳ホモジネートを使用して行い得る。試料ポリプロピレンチューブを、全容量0.65ml中に、約0.5mlの膜懸濁液、3nMのμ選択的オピオイドペプチド[3H]-DAMGO(比活性36Ci/mmol)、0.08mg/mlペプチド混合物、およびTris-HCl緩衝液を含むように調製する。アッセイチューブを、一般的に25℃にて60分間インキュベートし、そして反応を、例えば、GF-Bフィルターによる濾過によって停止した。続いて、フィルターを4℃にて6mlのTris-HCl緩衝液で洗浄する。次いで、結合した放射能を、例えば、Beta-plate Liquid Scintillation Counter (Life Technologies, Gaithersburg, MD)で計数し、そしてカウント/分(cpm)で表す。標準曲線を、0.13〜3900nMの標識されていないDAMGOの存在下での[3H]-DAMGOのインキュベーションによって決定し得る。
δレセプターについて選択的な放射性レセプターアッセイを、100μMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、5mM MgCl2、および1mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.4を含むTris緩衝液中で、上記のようにラット脳ホモジネートおよび放射性リガンドとして[3H]-ナルトリンドール(naltrindole)(0.5nM、比活性34.7ci/mmol)を使用して行い得る。試料を、一般的に、2.5時間インキュベートする。標準曲線を、0.10〜3200nM[3H]-D-Pen2、Pen5]-エンケファリン([3H]-DPDPE)を使用して調製する。全ての他の工程は、上記と同様である。
トリチウム標識したリガンド、[3H]-DAMGOおよび[3H]-DPDPEを、Multiple Peptide Systems (San Diego, CA)によって調製されるように、National Institute on Drug Abuse (NIDA)の貯蔵庫から、そして[3H]-ナルトリンドールはDuPont NEN Research Products (Los Angeles, CA)から入手し得る。IC50値の平均標準偏差は±20%であった。
それぞれのκ、μ、およびδ放射性レセプターアッセイにおける比較データは、μおよびδオピエートレセプターよりもκレセプターに対する新規オピオイドペプチドの選択性をさらに示し得る。
実施例III
モルモット回腸アッセイによるカッパレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト活性
この実施例は、ある新規なオピオイドペプチドが、モルモット回腸アッセイによって、κレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして同定され得ることを示す。
モルモット回腸アッセイ
モルモット回腸(GPI)バイオアッセイは、ペプチドがオピオイドアゴニストであるかどうかを決定するために行われ得る。また、このような情報は、上記の放射性レセプター結合アッセイから決定され得ない。
GPIアッセイ(Kosterlitzら、Br. J. Pharam. 39:398-418 (1970))は、インビトロでのオピオイド活性の決定について最も広く使用されるアッセイの1つである。アッセイは、組織における電気的に刺激された収縮を阻害するオピオイドアゴニストの能力に基づく。GPIは、回腸調製物がμおよびκレセプターの両方を含む限りでは、「完全な(clean)」アッセイではない。しかし、GPIにおけるκレセプターが媒介する効果を、アンタゴニストに対するKe値(κ効果:Ke約20〜30nM;μ効果:Ke約1〜3nM)を決定することによって、またはCTAP((D)Tca-Cys-Tyr-(D)Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2、ここでTcaは環状(D)Trpアナログである)のような特異的μアンタゴニストでμレセプターをブロックすることによって、μレセプターが媒介する効果と区別し得る。
モルモットを断頭によって殺し、回腸を取り出し、そして縦走筋−腸層間神経叢調製物をクレブス溶液(NaCl 118mM、KCl 4.75mM、NaH2PO4 1mM、NaHCO3 25mM、MgSO4 1.2mM、グルコース 11mM、およびCaCl2 2.5mM)中に置く。溶液を95%O2および5%CO2でガスを通し、37℃で維持する。組織を10mlの器官浴中で最終張力1g下でつるし、そして1時間安定化する。直線の白金電極による電気的刺激を、0.4msパルスの上部(supra)最大電圧で適用し、0.1Hzの速度で送達する。次いで、等尺性収縮を緊張ゲージ力変換器により測定し、そしてストリップチャート記録計で記録する。
本発明は上記の実施例に関して記載されているが、種々の改変が、本発明から逸脱することなく、当業者によって行われ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は以下の請求の範囲に述べられる。
Claims (4)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/472,219 | 1995-06-07 | ||
US08/472,219 US5610271A (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | Kappa receptor selective opioid peptides |
PCT/US1996/008871 WO1996040206A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-03 | Novel kappa receptor selective opioid peptides |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005365634A Division JP2006104214A (ja) | 1995-06-07 | 2005-12-19 | 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11512075A JPH11512075A (ja) | 1999-10-19 |
JP3784835B2 true JP3784835B2 (ja) | 2006-06-14 |
Family
ID=23874629
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50133997A Expired - Fee Related JP3784835B2 (ja) | 1995-06-07 | 1996-06-03 | 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド |
JP2005365634A Withdrawn JP2006104214A (ja) | 1995-06-07 | 2005-12-19 | 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド |
JP2006297157A Expired - Fee Related JP4081501B2 (ja) | 1995-06-07 | 2006-10-31 | 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005365634A Withdrawn JP2006104214A (ja) | 1995-06-07 | 2005-12-19 | 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド |
JP2006297157A Expired - Fee Related JP4081501B2 (ja) | 1995-06-07 | 2006-10-31 | 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5610271A (ja) |
EP (2) | EP0833652B1 (ja) |
JP (3) | JP3784835B2 (ja) |
AT (1) | ATE386048T1 (ja) |
AU (1) | AU699543B2 (ja) |
CA (3) | CA2223176C (ja) |
DE (1) | DE69637430T2 (ja) |
ES (1) | ES2301168T3 (ja) |
WO (1) | WO1996040206A1 (ja) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5763445A (en) * | 1996-03-08 | 1998-06-09 | Adolor Corporation | Kappa agonist compounds pharmaceutical formulations and method of prevention and treatment of pruritus therewith |
US5965701A (en) * | 1997-12-23 | 1999-10-12 | Ferring Bv | Kappa receptor opioid peptides |
GB9912416D0 (en) * | 1999-05-28 | 1999-07-28 | Pfizer Ltd | Compounds useful in therapy |
GB9912417D0 (en) * | 1999-05-28 | 1999-07-28 | Pfizer Ltd | Compounds useful in therapy |
GB9912415D0 (en) * | 1999-05-28 | 1999-07-28 | Pfizer Ltd | Compounds useful in therapy |
GB9912410D0 (en) * | 1999-05-28 | 1999-07-28 | Pfizer Ltd | Compounds useful in therapy |
US9006175B2 (en) | 1999-06-29 | 2015-04-14 | Mannkind Corporation | Potentiation of glucose elimination |
WO2001036006A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Palatin Technologies, Inc. | Opioid metallopeptide compositions and methods |
AU2002363236A1 (en) * | 2001-10-30 | 2003-05-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compounds, pharmaceutical compositions and methods of use therefor |
DE60318938T2 (de) | 2002-03-20 | 2009-01-22 | Mannkind Corp., Valencia | Inhalationsgerät |
DK1786784T3 (da) | 2004-08-20 | 2011-02-14 | Mannkind Corp | Katalyse af diketopiperazinsyntese |
JP4990142B2 (ja) | 2004-08-23 | 2012-08-01 | マンカインド コーポレイション | 薬物送達のためのジケトピペラジン塩、ジケトモルホリン塩、又はジケトジオキサン塩 |
US20080045610A1 (en) * | 2004-09-23 | 2008-02-21 | Alexander Michalow | Methods for regulating neurotransmitter systems by inducing counteradaptations |
AU2005286733B2 (en) * | 2004-09-23 | 2009-11-05 | Alexander Michalow | Methods for regulating neurotransmitter systems by inducing counteradaptations |
HUE028691T2 (en) | 2005-09-14 | 2016-12-28 | Mannkind Corp | A method for formulating a drug based on increasing the affinity of crystalline microparticle surfaces towards active ingredients |
AU2007216966C1 (en) | 2006-02-22 | 2014-03-20 | Mannkind Corporation | A method for improving the pharmaceutic properties of microparticles comprising diketopiperazine and an active agent |
WO2007139921A2 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Cara Therapeutics, Inc. | N-oxides of kappa opioid receptor peptides |
US7842662B2 (en) * | 2006-11-10 | 2010-11-30 | Cara Therapeutics, Inc. | Synthetic peptide amide dimers |
WO2008077194A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Xenome Ltd | Receptor agonists |
US8485180B2 (en) | 2008-06-13 | 2013-07-16 | Mannkind Corporation | Dry powder drug delivery system |
ES2655921T3 (es) | 2008-06-13 | 2018-02-22 | Mannkind Corporation | Un inhalador de polvo seco y sistema para administración de fármacos |
ES2904623T3 (es) | 2008-06-20 | 2022-04-05 | Mannkind Corp | Aparato interactivo para establecer un perfil en tiempo real de esfuerzos de inhalación |
TWI532497B (zh) | 2008-08-11 | 2016-05-11 | 曼凱公司 | 超快起作用胰島素之用途 |
US8314106B2 (en) | 2008-12-29 | 2012-11-20 | Mannkind Corporation | Substituted diketopiperazine analogs for use as drug delivery agents |
EP2405963B1 (en) | 2009-03-11 | 2013-11-06 | MannKind Corporation | Apparatus, system and method for measuring resistance of an inhaler |
WO2010144789A2 (en) | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Mannkind Corporation | Diketopiperazine microparticles with defined specific surface areas |
WO2011056889A1 (en) | 2009-11-03 | 2011-05-12 | Mannkind Corporation | An apparatus and method for simulating inhalation efforts |
KR20130117755A (ko) | 2010-06-21 | 2013-10-28 | 맨카인드 코포레이션 | 건조 분말 약물 운반 시스템 및 방법 |
CN105667994B (zh) | 2011-04-01 | 2018-04-06 | 曼金德公司 | 用于药物药盒的泡罩包装 |
WO2012174472A1 (en) | 2011-06-17 | 2012-12-20 | Mannkind Corporation | High capacity diketopiperazine microparticles |
WO2013063160A1 (en) * | 2011-10-24 | 2013-05-02 | Mannkind Corporation | Methods and compositions for treating pain |
CN104519898A (zh) * | 2012-06-06 | 2015-04-15 | 国家健康与医学研究院 | 用于治疗癌症的方法和药物组合物 |
CN108057154B (zh) | 2012-07-12 | 2021-04-16 | 曼金德公司 | 干粉药物输送系统和方法 |
US10159644B2 (en) | 2012-10-26 | 2018-12-25 | Mannkind Corporation | Inhalable vaccine compositions and methods |
JP6523247B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-05-29 | マンカインド コーポレイション | 微結晶性ジケトピペラジン粒子の製造方法および乾燥粉末組成物の製造方法 |
EP3021834A1 (en) | 2013-07-18 | 2016-05-25 | MannKind Corporation | Heat-stable dry powder pharmaceutical compositions and methods |
EP3030294B1 (en) | 2013-08-05 | 2020-10-07 | MannKind Corporation | Insufflation apparatus |
US10307464B2 (en) | 2014-03-28 | 2019-06-04 | Mannkind Corporation | Use of ultrarapid acting insulin |
US10561806B2 (en) | 2014-10-02 | 2020-02-18 | Mannkind Corporation | Mouthpiece cover for an inhaler |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4261883A (en) * | 1979-07-09 | 1981-04-14 | The Regents Of The University Of California | Novel N-aralkyl enkephalin amide analogs are provided having analgesic and opioid properties |
US5017689A (en) * | 1989-07-06 | 1991-05-21 | Arizona Technology Development Corporation | Dynorphin analogs specific for kappa opioid receptors |
JP3130080B2 (ja) * | 1990-12-27 | 2001-01-31 | 日清製粉株式会社 | ペプチドおよびその製造方法 |
US5367053A (en) * | 1993-05-19 | 1994-11-22 | Houghten Pharmaceuticals, Inc. | Opioid peptide inhibitors |
-
1995
- 1995-06-07 US US08/472,219 patent/US5610271A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-06-03 WO PCT/US1996/008871 patent/WO1996040206A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-03 ES ES96918080T patent/ES2301168T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-03 AT AT96918080T patent/ATE386048T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-03 DE DE69637430T patent/DE69637430T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-03 EP EP96918080A patent/EP0833652B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-03 JP JP50133997A patent/JP3784835B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-03 AU AU60429/96A patent/AU699543B2/en not_active Ceased
- 1996-06-03 EP EP08002484A patent/EP1978025A1/en not_active Withdrawn
- 1996-06-03 CA CA002223176A patent/CA2223176C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-03 CA CA002551157A patent/CA2551157C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-03 CA CA2551182A patent/CA2551182C/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-12-19 JP JP2005365634A patent/JP2006104214A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-10-31 JP JP2006297157A patent/JP4081501B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2223176C (en) | 2007-08-14 |
WO1996040206A1 (en) | 1996-12-19 |
CA2551182C (en) | 2010-08-24 |
ES2301168T3 (es) | 2008-06-16 |
EP1978025A1 (en) | 2008-10-08 |
DE69637430D1 (de) | 2008-03-27 |
AU6042996A (en) | 1996-12-30 |
JP2007077163A (ja) | 2007-03-29 |
CA2551157C (en) | 2010-01-19 |
JPH11512075A (ja) | 1999-10-19 |
CA2223176A1 (en) | 1996-12-19 |
EP0833652B1 (en) | 2008-02-13 |
US5610271A (en) | 1997-03-11 |
EP0833652A1 (en) | 1998-04-08 |
AU699543B2 (en) | 1998-12-03 |
ATE386048T1 (de) | 2008-03-15 |
CA2551182A1 (en) | 1996-12-19 |
EP0833652A4 (en) | 2001-10-31 |
JP2006104214A (ja) | 2006-04-20 |
JP4081501B2 (ja) | 2008-04-30 |
DE69637430T2 (de) | 2009-02-05 |
CA2551157A1 (en) | 1996-12-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3784835B2 (ja) | 新規カッパレセプター選択的オピオイドペプチド | |
US5641861A (en) | μopioid receptor ligands: agonists and antagonists | |
US5919897A (en) | MU opioid receptor ligands: agonists and antagonists | |
DiMaio et al. | Synthesis and pharmacological characterization in vitro of cyclic enkephalin analogs: effect of conformational constraints on opiate receptor selectivity | |
Janecka et al. | Opioid receptors and their ligands | |
US6350430B1 (en) | Melanocortin receptor ligands and methods of using same | |
US7417027B2 (en) | Linear and cyclic melanocortin receptor-specific peptides | |
Salvadori et al. | Evolution of the Dmt-Tic pharmacophore: N-terminal methylated derivatives with extraordinary δ opioid antagonist activity | |
Schiller | 6 Development of Receptor-Specific Opioid Peptide Analogues | |
JPH10506608A (ja) | 白血球接着のインヒビター | |
WO1998042732A1 (en) | Mu-opiate receptor peptides | |
US5614370A (en) | Assay to identify human C5a antagonists and agonists | |
Naqvi et al. | Structure–activity relationship studies of dynorphin A and related peptides | |
Lazarus et al. | Interaction of deltorphin with opioid receptors: molecular determinants for affinity and selectivity | |
EP0853484B1 (en) | Novel mu opioid receptor ligands: agonists and antagonists | |
Misicka et al. | Topographical requirements for delta opioid ligands: presence of a carboxyl group in position 4 is not critical for deltorphin high delta receptor affinity and analgesic activity | |
AU688040B2 (en) | New opioid peptide analogs with mixed MU agonist/delta antagonist properties | |
US20030032774A1 (en) | Novel opioid peptides for the treatment of pain | |
Peck | Dual labeled TIPP (Tyr-Tic-Phe-Phe, Tic= 1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid) peptides as pharmacological tools to study delta opioid receptors | |
Choi | Synthesis and biological evaluation of dynorphin a analogues as pharmacological probed of opioid receptors | |
Snyder | Synthesis and opioid activity of dynorphin a analogues | |
Maeda | Synthesis and evaluation of affinity labels based on peptide antagonists for delta opioid receptors | |
Arttamangkul | Synthesis and opioid activity of conformationally constrained dynorphin A analogues | |
Rew | Synthesis and biological activities of heteroatom-bridged cyclic enkephalin analogs | |
Wooden | Synthesis of novel biologically active peptide analogues that are agonists at opioid receptors and antagonists at cholecystokinin receptors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050628 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050921 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20051107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051219 |
|
A72 | Notification of change in name of applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A721 Effective date: 20051219 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060221 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060316 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100324 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100324 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110324 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |