JP3777984B2 - 核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス - Google Patents
核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス Download PDFInfo
- Publication number
- JP3777984B2 JP3777984B2 JP2001002755A JP2001002755A JP3777984B2 JP 3777984 B2 JP3777984 B2 JP 3777984B2 JP 2001002755 A JP2001002755 A JP 2001002755A JP 2001002755 A JP2001002755 A JP 2001002755A JP 3777984 B2 JP3777984 B2 JP 3777984B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- chip device
- nucleic acid
- channel
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、過酸化水素などの化学物質の定量に用いることのできるバイオセンサーと、そのようなバイオセンサーを検出部として備えたチップデバイスに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
過酸化水素などの化学物質を検出するバイオセンサーとしては、酵素を電極に固定したものが使用されている。
分析化学の分野、例えば環境分析、臨床、医薬品などの分野において、極微量成分を正確に、かつ迅速に分析する手法として、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）又はフローインジェクション分析（ＦＩＡ）等が用いられている。それらの検出計として、微量の液体試料中の成分を検出するのに適した検出計セルが求められている。それらの分析計で用いられる検出計セルは、通常、分析対象となる液体試料を導入するための試料導入口、液体試料の流路及びその流路を通過した液体試料を排出する試料排出口を備え、その流路中に液体試料と紫外あるいは可視領域の検出光との相互作用領域となる試料室を有し、上に示したような分析手法に用いられる分析カラムの出口に接続されて使用される。その測定室となる流路部分には検出光が照射され、検出光は試料室に存在する液体試料を透過した後、測定光学系により検出される。
【０００３】
近年、取扱いが煩雑なガラスキャピラリーに代わって、分析の高速化、装置の小型化が期待できる形態として、D. J. Harrison et al./ Science, Vol.261, p.895-897 (1993) に示されているように、２枚の基板を接合して形成されたキャピラリー電気泳動に用いるチップデバイスが提案されている。そのチップデバイスは、ガラス基板を材料とした電気泳動部材上に液体試料を導入するための流路と、液体試料を分離するための流路を半導体製造技術を基盤とするマイクロマシニング技術を用いて形成されたものである。チップデバイスを用いた電気泳動装置は、従来のキャピラリー電気泳動装置と比較して、高速分析が可能、溶媒消費量が極めて少ない、必要とするサンプルが極微量、装置の小型化が可能などの利点を有する。これの特徴は、上に述べた分析化学の分野において、従来の分析装置では実現が困難であった現場（オンサイドやベッドサイド）分析を可能とするものとして、またＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分析などの分野に対しては、高速分析の視点からスクリーニングに有利なものとして有望視されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来のバイオセンサーは酵素で構成されているが、酵素は変成しやすいため、安定性の向上が大きな課題となっている。
また、酵素を用いたバイオセンサーの場合、酵素は分子量が大きいため、電極表面との間で直接的な電子移動が困難な場合が多い。そのため、電子移動のためのメディエーター（中間媒体）を共存させる必要があるため、そのための試薬も必要になる。
その結果、バイオセンサーの製作にあたって、複雑な製造工程が必要となる。
【０００５】
そこで、本発明の第１の目的は、メディエーターを必要とせず、安定性にもすぐれて、しかも製作も容易なバイオセンサーを提供することである。
本発明の第２の目的は、そのようなバイオセンサーを検出部として備えた、微量分析装置の分析計セルやチップデバイスを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明のバイオセンサーは、触媒機能を有する核酸アプタマーの一端に金属との親和性のある官能基が導入されており、その官能基により電極表面に自己集積化されているものである。
核酸アプタマーは、酵素に比べて高い耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性を備えている。また、核酸アプタマーは分子量が低いため、空間的に電極表面に近づくことができるので、メディエーターなしでも高い感度を有する。
核酸アプタマーの一端に金属との親和性のある官能基を導入することにより、電極表面にも容易に固定化が可能になる。
本発明のチップデバイスは、検出部にこのバイオセンサーを備えたものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
核酸アプタマーの一例は、ＤＮＡ・ヘミン錯体であり、官能基はＤＮＡの５’端に導入されたチオール基である。
ＤＮＡ・ヘミン錯体が酸化還元反応に対する触媒活性をもつことは知られている（例えば、Chemistry & Biology, 1998, Vol.5, No.9, 505-517参照）。しかし、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの核酸アプタマーを電極に固定したり、さらにその固定された核酸アプタマーを分析計の検出部に用いることは知られていない。
チオール化した核酸は金属電極表面に容易に固定化できる。
【０００８】
図１に核酸アプタマーの一例としてＤＮＡとヘミンとの錯体を使用した例を示す。この核酸アプタマー２０はＤＮＡオリゴヌクレオチドとヘミンとの錯体から形成されており、ＤＮＡの一端に導入されたチオール基（ＳＨ）が金電極２２に吸着することにより、核酸アプタマーが電極２２に固定されている。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの分子量は低いため、ヘミンは金電極２２に対し空間的に接近した位置に固定されている。
この核酸アプタマー２０はペルオキシダーゼ活性をもっており、Ｈ2Ｏ2に対する酸化還元反応の触媒として作用する。
【０００９】
この核酸アプタマー２０を金電極２２に自己集積化（固定）する工程を図２に示す。
使用するＤＮＡオリゴヌクレオチドの塩基配列は、図４の上部に示されるようなＳＨ−ＰＳ２．Ｍ又はＳＨ−２０ｍｅｒ−１である。
何れかのＤＮＡを１ｍＭの濃度になるように調整して、９５℃で５分間加熱する（ステップＳ１）。
【００１０】
その溶液をバッファ液で１μＭに希釈する（ステップＳ２）。バッファ液としては２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＰＨ８.０）、２０ｍＭのＫＣｌ及び０.０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合溶液である。
その希釈された溶液を室温で３０分間放置する（ステップＳ３）。
その後、そのＤＮＡ溶液に、ヘミンを１０μＭの濃度になるように加え（ステップＳ４）、２０分間インキュベーションを行なう（ステップＳ５）。インキュベーションは３７℃で浸透しながら行なう。
【００１１】
その後、その溶液を金電極の上に１μｌ載せ（ステップＳ６）、１時間放置した後、イオン交換水で洗う（ステップＳ７）。
以上の操作により、図１に示されたように、核酸アプタマー２０が金電極２２に固定化されたバイオセンサーが得られる。
【００１２】
次に、このバイオセンサーを用いて、Ｈ2Ｏ2の酸化還元反応を測定した例を説明する。
試料としてＨ2Ｏ2をリン酸バッファとＫＣｌで希釈して６００μＭとなるように調製する。その試料溶液に、上のように作成したバイオセンサーを浸し、ＣＶ（サイクリックボルタノメトリ）測定を行った。ＣＶ測定では、０Ｖから−１.０Ｖに向かって電圧を低下させ、再び０Ｖへ戻すサイクルで、その走査速度を０.１Ｖ／秒とした。
【００１３】
その結果を図３に示す。▲１▼は上に示した本発明のＤＮＡ・ヘミン錯体によるＣＶ測定結果であり、それに対し、▲２▼は試料溶液にヘミンのみを加えた場合の測定結果である。ヘミンのみの場合はヘミンは電極に固定されていない。
図３の結果から、ヘミンのみの測定結果とＤＮＡ・ヘミン錯体の測定結果とでは、還元ピークの位置がずれている。このことから、ヘミンをＤＮＡと錯体とし、ＤＮＡを金電極上に固定することにより、金電極上での状態が変化し、その影響で還元ピークの位置がずれたものと考えられる。
【００１４】
次に、ＤＮＡ・ヘミン錯体を金電極に固定した実施例におけるＨ2Ｏ2に対する応答性を調べた結果を図４（Ａ）と（Ｂ）に示す。（Ａ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号１に示したＳＨ−ＰＳ２．Ｍの場合、（Ｂ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号２に示したＳＨ−２０ｍｅｒ−１の場合である。上に記載したように金電極へＤＮＡ・ヘミン錯体を固定した後、バッファで希釈した各濃度のＨ2Ｏ2の試料でＣＶ測定を行なった結果を示している。
Ｈ2Ｏ2試料溶液の濃度は６０、６００、６０００μＭであった。図４（Ａ）と（Ｂ）の結果から、ＤＮＡの種類により応答特性が異なることがわかる。
また、１００℃で３０分間加熱した後も図４（Ａ）と（Ｂ）と同じ応答特性を示したことから、核酸アプタマーは高い耐熱性を備えていることがわかる。
【００１５】
【実施例】
図５は本発明をチップデバイスに適用した一実施例を表わしたものであり、（ａ）はその上面図、（ｂ）はそのＡ−Ａ線位置での断面図である。
このチップデバイスは、板状部材の内部に形成された微小断面積の流路８を備え、その流路８の少なくとも一部を検出部としており、その検出部には本発明のバイオセンサーが設けられている。
【００１６】
具体的に示すと、石英にてなるガラス基板１，２が貼り合わされ、その貼り合わされた面のガラス基板１側には数１００μｍ以下の幅と深さをもつ液体試料用流路用の微小な流路溝８が形成されている。流路溝８の一端には試料導入口９ａがガラス基板２を貫通して設けられ、流路溝８の他端には試料排出口９ｂがガラス基板２を貫通して設けられている。
【００１７】
流路溝８の試料排出口側には、金電極１０が形成されており、金電極１０につながるリード部分１２が基板１の側端面まで伸びている。リード部分１２の端部では、基板２の一部が切りかかれて凹部１４が形成され、リード部分１２の端部がその凹部１４に露出して測定回路と接続できるようになっている。金電極１０及びリード部分１２は金をマスク蒸着することにより、５０〜３００ｎｍの厚さに形成されている。その金電極１０には、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの触媒機能を有する核酸アプタマーが、その一端に導入されたチオール基など金属との親和性のある官能基によって固定されてバイオセンサーを構成している。そのバイオセンサーが検出部となっている。
両基板１，２は、接合すべき面を向かい合わせて密着させ、接着剤により、又はフッ酸溶液による接合で、気密に接合することにより流路溝８を形成している。
【００１８】
図６は本発明を電気泳動装置のチップデバイスに適用した実施例を示したものである。（ａ）は一方の基板３１の平面図、（ｂ）は他方の基板の平面図、（ｃ）は両基板３１，３２を組み合わせてチップデバイスとした状態の正面図である。
このチップデバイスは電気泳動により試料を分離し分析する電気泳動チップであり、その板状部材にはその内部に電気泳動による分析流路３５と分析流路３５に交差して分析流路３５に試料を導入するためのサンプル流路３４が形成され、この板状部材の一表面には分析流路３５又はサンプル流路３４に達する穴３３が形成されており、分析流路３５の下流側の一部が検出部となって、その検出部には本発明のバイオセンサーが設けられている。
【００１９】
具体的に示すと、このチップデバイスは一対の透明ガラス基板３１，３２からなり、一方の基板３２の表面に互いに交差するサンプル流路３４と分析流路３５が形成され、分析流路３５の下流側には図５の実施例と同様に、金電極３７が形成されており、金電極３７につながるリード部分３８が基板３２の側端面まで伸びている。金電極３７及びリード部分３８は金をマスク蒸着することにより、５０〜３００ｎｍの厚さに形成されている。その金電極３７にも、図５の実施例と同様に、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの触媒機能を有する核酸アプタマーが、その一端に導入されたチオール基など金属との親和性のある官能基によって固定されてバイオセンサーを構成している。そのバイオセンサーが検出部となっている。
【００２０】
他方の基板３１にはサンプル流路３４及び分析流路３５の両端に対応する位置にリザーバ３３を貫通穴として設けられている。また、リード部分３８の端部に該当する位置では、基板３１の一部が切りかかれて凹部４０が形成され、両基板３１，３２を組み合わせたとき、リード部分３８の端部がその凹部４０から露出して測定回路と接続できるようになる。
【００２１】
両基板３１，３２は、（ｃ）に示すように、流路３４，３５、電極３７及びリード部分３８が内側にくるように重ねて張り合わされて、チップデバイスが形成されている。両基板３１，３２は、接合すべき面を向かい合わせて密着させ、接着剤により、又はフッ酸溶液による接合で、気密に接合されている。
【００２２】
このチップデバイスを使用するときは、いずれかのリザーバ３３から泳動媒体として泳動バッファ又はゲル溶液をサンプル流路３４及び分析流路３５中に注入する。その後、サンプル流路３４の一方の端のリザーバ３３にサンプルを注入した後、各リザーバ３３にそれぞれ電極を差し込むか、又は予め各リザーバ３３に形成された電極を用いて、サンプル流路３４の両端に所定時間だけ所定の高電圧を印加し、これによりサンプルをサンプル流路３４と分析流路３５の交差部６に導く。次に、分析流路３５の両端に泳動のための所定の電圧を印加し、交差部３６に存在するサンプルを分析流路３５内に導き、分離させる。分析流路３５の下流側の位置に形成された検出部としてのバイオセンサーにより、分離成分の検出を行なう。
【００２３】
【発明の効果】
本発明のバイオセンサーは、触媒機能を有する核酸アプタマーの一端に金属との親和性のある官能基を導入し、その官能基により電極表面に自己集積化したものであるので、製作が容易で、酵素に比べて高い耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性を達成することができ、メディエーターなしでも高い感度で検出することができる。
検出部にこのバイオセンサーを備えた本発明のチップデバイスは検出信号を電気信号として直接取り出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸アプタマーの一例としてＤＮＡとヘミンとの錯体を使用して本発明を概略的に示す図である。
【図２】核酸アプタマーを金電極２２に自己集積化する工程を示すフローチャート図である。
【図３】ＤＮＡ・ヘミン錯体によるＣＶ測定結果とヘミンのみによる測定結果を示す図である。
【図４】実施例におけるＨ2Ｏ2に対する応答性を調べた結果を示す図で、（Ａ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号１に示したＳＨ−ＰＳ２．Ｍの場合、（Ｂ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号２に示したＳＨ−２０ｍｅｒ−１の場合である。
【図５】本発明をチップデバイスに適用した一実施例を示す図で、（ａ）はその上面図、（ｂ）はそのＡ−Ａ線位置での断面図である。
【図６】本発明を電気泳動装置のチップデバイスに適用した実施例を示す図で、（ａ）は一方の基板の平面図、（ｂ）は他方の基板の平面図、（ｃ）は両基板を組み合わせてチップデバイスとした状態の正面図である。
【符号の説明】
１，２，３１，３２ ガラス基板
８ 流路溝
９ａ 試料導入口
９ｂ 試料排出口
１０，２２，３７ 金電極
２０ 核酸アプタマー
３４ サンプル流路
３５ 分析流路
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、過酸化水素などの化学物質の定量に用いることのできるバイオセンサーと、そのようなバイオセンサーを検出部として備えたチップデバイスに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
過酸化水素などの化学物質を検出するバイオセンサーとしては、酵素を電極に固定したものが使用されている。
分析化学の分野、例えば環境分析、臨床、医薬品などの分野において、極微量成分を正確に、かつ迅速に分析する手法として、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）又はフローインジェクション分析（ＦＩＡ）等が用いられている。それらの検出計として、微量の液体試料中の成分を検出するのに適した検出計セルが求められている。それらの分析計で用いられる検出計セルは、通常、分析対象となる液体試料を導入するための試料導入口、液体試料の流路及びその流路を通過した液体試料を排出する試料排出口を備え、その流路中に液体試料と紫外あるいは可視領域の検出光との相互作用領域となる試料室を有し、上に示したような分析手法に用いられる分析カラムの出口に接続されて使用される。その測定室となる流路部分には検出光が照射され、検出光は試料室に存在する液体試料を透過した後、測定光学系により検出される。
【０００３】
近年、取扱いが煩雑なガラスキャピラリーに代わって、分析の高速化、装置の小型化が期待できる形態として、D. J. Harrison et al./ Science, Vol.261, p.895-897 (1993) に示されているように、２枚の基板を接合して形成されたキャピラリー電気泳動に用いるチップデバイスが提案されている。そのチップデバイスは、ガラス基板を材料とした電気泳動部材上に液体試料を導入するための流路と、液体試料を分離するための流路を半導体製造技術を基盤とするマイクロマシニング技術を用いて形成されたものである。チップデバイスを用いた電気泳動装置は、従来のキャピラリー電気泳動装置と比較して、高速分析が可能、溶媒消費量が極めて少ない、必要とするサンプルが極微量、装置の小型化が可能などの利点を有する。これの特徴は、上に述べた分析化学の分野において、従来の分析装置では実現が困難であった現場（オンサイドやベッドサイド）分析を可能とするものとして、またＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分析などの分野に対しては、高速分析の視点からスクリーニングに有利なものとして有望視されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来のバイオセンサーは酵素で構成されているが、酵素は変成しやすいため、安定性の向上が大きな課題となっている。
また、酵素を用いたバイオセンサーの場合、酵素は分子量が大きいため、電極表面との間で直接的な電子移動が困難な場合が多い。そのため、電子移動のためのメディエーター（中間媒体）を共存させる必要があるため、そのための試薬も必要になる。
その結果、バイオセンサーの製作にあたって、複雑な製造工程が必要となる。
【０００５】
そこで、本発明の第１の目的は、メディエーターを必要とせず、安定性にもすぐれて、しかも製作も容易なバイオセンサーを提供することである。
本発明の第２の目的は、そのようなバイオセンサーを検出部として備えた、微量分析装置の分析計セルやチップデバイスを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明のバイオセンサーは、触媒機能を有する核酸アプタマーの一端に金属との親和性のある官能基が導入されており、その官能基により電極表面に自己集積化されているものである。
核酸アプタマーは、酵素に比べて高い耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性を備えている。また、核酸アプタマーは分子量が低いため、空間的に電極表面に近づくことができるので、メディエーターなしでも高い感度を有する。
核酸アプタマーの一端に金属との親和性のある官能基を導入することにより、電極表面にも容易に固定化が可能になる。
本発明のチップデバイスは、検出部にこのバイオセンサーを備えたものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
核酸アプタマーの一例は、ＤＮＡ・ヘミン錯体であり、官能基はＤＮＡの５’端に導入されたチオール基である。
ＤＮＡ・ヘミン錯体が酸化還元反応に対する触媒活性をもつことは知られている（例えば、Chemistry & Biology, 1998, Vol.5, No.9, 505-517参照）。しかし、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの核酸アプタマーを電極に固定したり、さらにその固定された核酸アプタマーを分析計の検出部に用いることは知られていない。
チオール化した核酸は金属電極表面に容易に固定化できる。
【０００８】
図１に核酸アプタマーの一例としてＤＮＡとヘミンとの錯体を使用した例を示す。この核酸アプタマー２０はＤＮＡオリゴヌクレオチドとヘミンとの錯体から形成されており、ＤＮＡの一端に導入されたチオール基（ＳＨ）が金電極２２に吸着することにより、核酸アプタマーが電極２２に固定されている。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの分子量は低いため、ヘミンは金電極２２に対し空間的に接近した位置に固定されている。
この核酸アプタマー２０はペルオキシダーゼ活性をもっており、Ｈ2Ｏ2に対する酸化還元反応の触媒として作用する。
【０００９】
この核酸アプタマー２０を金電極２２に自己集積化（固定）する工程を図２に示す。
使用するＤＮＡオリゴヌクレオチドの塩基配列は、図４の上部に示されるようなＳＨ−ＰＳ２．Ｍ又はＳＨ−２０ｍｅｒ−１である。
何れかのＤＮＡを１ｍＭの濃度になるように調整して、９５℃で５分間加熱する（ステップＳ１）。
【００１０】
その溶液をバッファ液で１μＭに希釈する（ステップＳ２）。バッファ液としては２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＰＨ８.０）、２０ｍＭのＫＣｌ及び０.０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合溶液である。
その希釈された溶液を室温で３０分間放置する（ステップＳ３）。
その後、そのＤＮＡ溶液に、ヘミンを１０μＭの濃度になるように加え（ステップＳ４）、２０分間インキュベーションを行なう（ステップＳ５）。インキュベーションは３７℃で浸透しながら行なう。
【００１１】
その後、その溶液を金電極の上に１μｌ載せ（ステップＳ６）、１時間放置した後、イオン交換水で洗う（ステップＳ７）。
以上の操作により、図１に示されたように、核酸アプタマー２０が金電極２２に固定化されたバイオセンサーが得られる。
【００１２】
次に、このバイオセンサーを用いて、Ｈ2Ｏ2の酸化還元反応を測定した例を説明する。
試料としてＨ2Ｏ2をリン酸バッファとＫＣｌで希釈して６００μＭとなるように調製する。その試料溶液に、上のように作成したバイオセンサーを浸し、ＣＶ（サイクリックボルタノメトリ）測定を行った。ＣＶ測定では、０Ｖから−１.０Ｖに向かって電圧を低下させ、再び０Ｖへ戻すサイクルで、その走査速度を０.１Ｖ／秒とした。
【００１３】
その結果を図３に示す。▲１▼は上に示した本発明のＤＮＡ・ヘミン錯体によるＣＶ測定結果であり、それに対し、▲２▼は試料溶液にヘミンのみを加えた場合の測定結果である。ヘミンのみの場合はヘミンは電極に固定されていない。
図３の結果から、ヘミンのみの測定結果とＤＮＡ・ヘミン錯体の測定結果とでは、還元ピークの位置がずれている。このことから、ヘミンをＤＮＡと錯体とし、ＤＮＡを金電極上に固定することにより、金電極上での状態が変化し、その影響で還元ピークの位置がずれたものと考えられる。
【００１４】
次に、ＤＮＡ・ヘミン錯体を金電極に固定した実施例におけるＨ2Ｏ2に対する応答性を調べた結果を図４（Ａ）と（Ｂ）に示す。（Ａ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号１に示したＳＨ−ＰＳ２．Ｍの場合、（Ｂ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号２に示したＳＨ−２０ｍｅｒ−１の場合である。上に記載したように金電極へＤＮＡ・ヘミン錯体を固定した後、バッファで希釈した各濃度のＨ2Ｏ2の試料でＣＶ測定を行なった結果を示している。
Ｈ2Ｏ2試料溶液の濃度は６０、６００、６０００μＭであった。図４（Ａ）と（Ｂ）の結果から、ＤＮＡの種類により応答特性が異なることがわかる。
また、１００℃で３０分間加熱した後も図４（Ａ）と（Ｂ）と同じ応答特性を示したことから、核酸アプタマーは高い耐熱性を備えていることがわかる。
【００１５】
【実施例】
図５は本発明をチップデバイスに適用した一実施例を表わしたものであり、（ａ）はその上面図、（ｂ）はそのＡ−Ａ線位置での断面図である。
このチップデバイスは、板状部材の内部に形成された微小断面積の流路８を備え、その流路８の少なくとも一部を検出部としており、その検出部には本発明のバイオセンサーが設けられている。
【００１６】
具体的に示すと、石英にてなるガラス基板１，２が貼り合わされ、その貼り合わされた面のガラス基板１側には数１００μｍ以下の幅と深さをもつ液体試料用流路用の微小な流路溝８が形成されている。流路溝８の一端には試料導入口９ａがガラス基板２を貫通して設けられ、流路溝８の他端には試料排出口９ｂがガラス基板２を貫通して設けられている。
【００１７】
流路溝８の試料排出口側には、金電極１０が形成されており、金電極１０につながるリード部分１２が基板１の側端面まで伸びている。リード部分１２の端部では、基板２の一部が切りかかれて凹部１４が形成され、リード部分１２の端部がその凹部１４に露出して測定回路と接続できるようになっている。金電極１０及びリード部分１２は金をマスク蒸着することにより、５０〜３００ｎｍの厚さに形成されている。その金電極１０には、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの触媒機能を有する核酸アプタマーが、その一端に導入されたチオール基など金属との親和性のある官能基によって固定されてバイオセンサーを構成している。そのバイオセンサーが検出部となっている。
両基板１，２は、接合すべき面を向かい合わせて密着させ、接着剤により、又はフッ酸溶液による接合で、気密に接合することにより流路溝８を形成している。
【００１８】
図６は本発明を電気泳動装置のチップデバイスに適用した実施例を示したものである。（ａ）は一方の基板３１の平面図、（ｂ）は他方の基板の平面図、（ｃ）は両基板３１，３２を組み合わせてチップデバイスとした状態の正面図である。
このチップデバイスは電気泳動により試料を分離し分析する電気泳動チップであり、その板状部材にはその内部に電気泳動による分析流路３５と分析流路３５に交差して分析流路３５に試料を導入するためのサンプル流路３４が形成され、この板状部材の一表面には分析流路３５又はサンプル流路３４に達する穴３３が形成されており、分析流路３５の下流側の一部が検出部となって、その検出部には本発明のバイオセンサーが設けられている。
【００１９】
具体的に示すと、このチップデバイスは一対の透明ガラス基板３１，３２からなり、一方の基板３２の表面に互いに交差するサンプル流路３４と分析流路３５が形成され、分析流路３５の下流側には図５の実施例と同様に、金電極３７が形成されており、金電極３７につながるリード部分３８が基板３２の側端面まで伸びている。金電極３７及びリード部分３８は金をマスク蒸着することにより、５０〜３００ｎｍの厚さに形成されている。その金電極３７にも、図５の実施例と同様に、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの触媒機能を有する核酸アプタマーが、その一端に導入されたチオール基など金属との親和性のある官能基によって固定されてバイオセンサーを構成している。そのバイオセンサーが検出部となっている。
【００２０】
他方の基板３１にはサンプル流路３４及び分析流路３５の両端に対応する位置にリザーバ３３を貫通穴として設けられている。また、リード部分３８の端部に該当する位置では、基板３１の一部が切りかかれて凹部４０が形成され、両基板３１，３２を組み合わせたとき、リード部分３８の端部がその凹部４０から露出して測定回路と接続できるようになる。
【００２１】
両基板３１，３２は、（ｃ）に示すように、流路３４，３５、電極３７及びリード部分３８が内側にくるように重ねて張り合わされて、チップデバイスが形成されている。両基板３１，３２は、接合すべき面を向かい合わせて密着させ、接着剤により、又はフッ酸溶液による接合で、気密に接合されている。
【００２２】
このチップデバイスを使用するときは、いずれかのリザーバ３３から泳動媒体として泳動バッファ又はゲル溶液をサンプル流路３４及び分析流路３５中に注入する。その後、サンプル流路３４の一方の端のリザーバ３３にサンプルを注入した後、各リザーバ３３にそれぞれ電極を差し込むか、又は予め各リザーバ３３に形成された電極を用いて、サンプル流路３４の両端に所定時間だけ所定の高電圧を印加し、これによりサンプルをサンプル流路３４と分析流路３５の交差部６に導く。次に、分析流路３５の両端に泳動のための所定の電圧を印加し、交差部３６に存在するサンプルを分析流路３５内に導き、分離させる。分析流路３５の下流側の位置に形成された検出部としてのバイオセンサーにより、分離成分の検出を行なう。
【００２３】
【発明の効果】
本発明のバイオセンサーは、触媒機能を有する核酸アプタマーの一端に金属との親和性のある官能基を導入し、その官能基により電極表面に自己集積化したものであるので、製作が容易で、酵素に比べて高い耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性を達成することができ、メディエーターなしでも高い感度で検出することができる。
検出部にこのバイオセンサーを備えた本発明のチップデバイスは検出信号を電気信号として直接取り出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸アプタマーの一例としてＤＮＡとヘミンとの錯体を使用して本発明を概略的に示す図である。
【図２】核酸アプタマーを金電極２２に自己集積化する工程を示すフローチャート図である。
【図３】ＤＮＡ・ヘミン錯体によるＣＶ測定結果とヘミンのみによる測定結果を示す図である。
【図４】実施例におけるＨ2Ｏ2に対する応答性を調べた結果を示す図で、（Ａ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号１に示したＳＨ−ＰＳ２．Ｍの場合、（Ｂ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号２に示したＳＨ−２０ｍｅｒ−１の場合である。
【図５】本発明をチップデバイスに適用した一実施例を示す図で、（ａ）はその上面図、（ｂ）はそのＡ−Ａ線位置での断面図である。
【図６】本発明を電気泳動装置のチップデバイスに適用した実施例を示す図で、（ａ）は一方の基板の平面図、（ｂ）は他方の基板の平面図、（ｃ）は両基板を組み合わせてチップデバイスとした状態の正面図である。
【符号の説明】
１，２，３１，３２ ガラス基板
８ 流路溝
９ａ 試料導入口
９ｂ 試料排出口
１０，２２，３７ 金電極
２０ 核酸アプタマー
３４ サンプル流路
３５ 分析流路
【配列表】
Claims (4)
- ＤＮＡ・ヘミン錯体からなり触媒機能を有する核酸アプタマーの一端に、金属との親和性のある官能基としてＤＮＡの５'端に導入されたチオール基を有し、その官能基により電極表面に自己集積化されていることを特徴とするバイオセンサー。
- 板状部材の内部に形成された微小断面積の流路を備え、その流路の少なくとも一部を検出部としているチップデバイスにおいて、前記検出部には請求項１に記載のバイオセンサーが設けられていることを特徴とするチップデバイス。
- このチップデバイスの板状部材には、前記流路に液体試料を導入する試料導入口と、前記流路を通過した液体試料を排出する試料排出口が設けられている請求項２に記載のチップデバイス。
- このチップデバイスは電気泳動により試料を分離し分析する電気泳動チップであり、その板状部材にはその内部に電気泳動による分析流路とその分析流路に交差して分析流路に試料を導入するためのサンプル流路が形成され、前記板状部材の一表面には前記分析流路又はサンプル流路に達する穴が形成されており、前記分析流路の下流側の一部が前記検出部となっている請求項２又は３に記載のチップデバイス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001002755A JP3777984B2 (ja) | 2001-01-10 | 2001-01-10 | 核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001002755A JP3777984B2 (ja) | 2001-01-10 | 2001-01-10 | 核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002207026A JP2002207026A (ja) | 2002-07-26 |
| JP3777984B2 true JP3777984B2 (ja) | 2006-05-24 |
Family
ID=18871206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001002755A Expired - Fee Related JP3777984B2 (ja) | 2001-01-10 | 2001-01-10 | 核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3777984B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104049011A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-17 | 安徽师范大学 | 一种电化学生物传感器，其制备方法，用途以及检测血小板源生长因子的方法 |
| KR20200046681A (ko) | 2018-10-25 | 2020-05-07 | 광주과학기술원 | 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법 |
| KR20210007005A (ko) | 2021-01-05 | 2021-01-19 | (주)에스비바이오사이언스 | 단일 가닥 dna 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 접합체를 포함하는 면역 검출 키트 및 이를 사용한 면역 검출 방법 |
| KR20210008429A (ko) | 2021-01-05 | 2021-01-21 | (주)에스비바이오사이언스 | 인플루엔자 a 바이러스 검출용 접합체 및 이를 사용한 인플루엔자 a 바이러스 검출 방법 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4729030B2 (ja) * | 2002-07-31 | 2011-07-20 | 株式会社東芝 | 塩基配列検出装置 |
| CN101358945A (zh) * | 2002-07-31 | 2009-02-04 | 株式会社东芝 | 碱基序列检测装置及碱基序列自动解析装置 |
| KR100748408B1 (ko) * | 2005-06-28 | 2007-08-10 | 한국화학연구원 | 압타머를 이용한 탄소 나노튜브 트랜지스터 바이오센서 및이것을 이용한 타겟물질 검출 방법 |
| CN101738425B (zh) * | 2010-01-06 | 2013-03-13 | 天津科技大学 | 用于抗生素和心脏病标记物快速检测的适配子生物传感器的制作方法 |
| CN103923304B (zh) * | 2014-04-03 | 2016-04-27 | 南京理工大学 | 微波辅助法合成的Hemin-石墨烯/聚（3,4-乙撑二氧噻吩）三元复合物及其制备 |
| JP7202563B6 (ja) * | 2018-11-01 | 2023-02-03 | 国立大学法人徳島大学 | 電気化学センサー用電極、電気化学センサー、及び電気化学的検出装置 |
| CN116970584B (zh) * | 2023-09-19 | 2023-12-22 | 中国石油大学(华东) | 一种多肽过氧化物酶模拟物及其制备方法和应用 |
-
2001
- 2001-01-10 JP JP2001002755A patent/JP3777984B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104049011A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-17 | 安徽师范大学 | 一种电化学生物传感器，其制备方法，用途以及检测血小板源生长因子的方法 |
| KR20200046681A (ko) | 2018-10-25 | 2020-05-07 | 광주과학기술원 | 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법 |
| KR20210007005A (ko) | 2021-01-05 | 2021-01-19 | (주)에스비바이오사이언스 | 단일 가닥 dna 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 접합체를 포함하는 면역 검출 키트 및 이를 사용한 면역 검출 방법 |
| KR20210008429A (ko) | 2021-01-05 | 2021-01-21 | (주)에스비바이오사이언스 | 인플루엔자 a 바이러스 검출용 접합체 및 이를 사용한 인플루엔자 a 바이러스 검출 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002207026A (ja) | 2002-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bilitewski et al. | Biochemical analysis with microfluidic systems | |
| Pumera et al. | New materials for electrochemical sensing VII. Microfluidic chip platforms | |
| US20060141469A1 (en) | Multi-layered electrochemical microfluidic sensor comprising reagent on porous layer | |
| KR100635110B1 (ko) | 현장분석용 랩온어칩 및 랩온어칩용 신호탐지기 | |
| Gavin et al. | Continuous Separations with Microfabricated Electrophoresis− Electrochemical Array Detection | |
| EP2144057B1 (en) | Method for analyzing a sample containing glycosylated hemoglobin and glucose | |
| Wang et al. | Electrochemical enzyme immunoassays on microchip platforms | |
| Nesakumar et al. | Microfluidic electrochemical devices for biosensing | |
| Xu et al. | Electrochemical detection method for nonelectroactive and electroactive analytes in microchip electrophoresis | |
| Ronkainen-Matsuno et al. | Electrochemical immunoassay moving into the fast lane | |
| Goral et al. | Electrochemical microfluidic biosensor for the detection of nucleic acid sequences | |
| US9494553B2 (en) | Electrophoresis chip, electrophoresis apparatus, and method for analyzing sample by capillary electrophoresis | |
| JP4216712B2 (ja) | マイクロ流体式化学検定装置および方法 | |
| Uchiyama et al. | Detection method for microchip separations | |
| Ertl et al. | Capillary electrophoresis chips with a sheath-flow supported electrochemical detection system | |
| US9039973B2 (en) | Hybrid digital and channel microfluidic devices and methods of use thereof | |
| US7153407B2 (en) | Multi-dimensional electrophoresis apparatus | |
| JP2009533658A (ja) | 最適化電流測定検出を用いる小型バイオセンサー | |
| JP3777984B2 (ja) | 核酸アプタマー自己集積化バイオセンサー及びそれを検出部として備えたチップデバイス | |
| WO2004034025A2 (en) | Nano-chem-fet based biosensors | |
| JPH08501392A (ja) | 電気泳動法による化学分析 | |
| WO2008029685A1 (fr) | Procédé pour analyse d'échantillon par électrophorèse capillaire | |
| Costa et al. | Microchip electrophoresis and electrochemical detection: A review on a growing synergistic implementation | |
| Guihen | Recent advances in miniaturization—The role of microchip electrophoresis in clinical analysis | |
| Cong et al. | Recent progress in preparation and application of microfluidic chip electrophoresis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050317 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051004 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051201 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060207 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060220 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100310 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100310 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110310 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110310 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120310 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120310 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130310 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140310 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |