JP3757236B6 - ファルネシル誘導体およびそれらを含む医薬組成物 - Google Patents
ファルネシル誘導体およびそれらを含む医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3757236B6 JP3757236B6 JP1995514078A JP51407895A JP3757236B6 JP 3757236 B6 JP3757236 B6 JP 3757236B6 JP 1995514078 A JP1995514078 A JP 1995514078A JP 51407895 A JP51407895 A JP 51407895A JP 3757236 B6 JP3757236 B6 JP 3757236B6
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- fts
- ras
- fta
- transformed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 title claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 108091005629 prenylated proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 claims description 4
- 125000002350 geranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000023320 Luma <angiosperm> Species 0.000 claims 1
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 114
- WUILNKCFCLNXOK-CFBAGHHKSA-N salirasib Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CSC1=CC=CC=C1C(O)=O WUILNKCFCLNXOK-CFBAGHHKSA-N 0.000 description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 43
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 36
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 36
- 101100049938 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) exr-1 gene Proteins 0.000 description 35
- 101150101384 rat1 gene Proteins 0.000 description 35
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 23
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 23
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 6
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- ALSCEGDXFJIYES-UHFFFAOYSA-N pyrrolidine-2-carbonitrile Chemical compound N#CC1CCCN1 ALSCEGDXFJIYES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 4
- STIAPHVBRDNOAJ-UHFFFAOYSA-N carbamimidoylazanium;carbonate Chemical compound NC(N)=N.NC(N)=N.OC(O)=O STIAPHVBRDNOAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- GVCFFVPEOLCYNN-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-chlorobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(Cl)C(C(O)=O)=C1 GVCFFVPEOLCYNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- SYSLNQMKLROGCL-BCYUYYMPSA-N S-[(2E,6E)-farnesyl]-L-cysteine zwitterion Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CSC[C@H](N)C(O)=O SYSLNQMKLROGCL-BCYUYYMPSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- -1 farnesyl thiopropionic acid Chemical compound 0.000 description 3
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- QFXOXDSHNXAFEY-SREVYHEPSA-N (Z)-4-Hydroxy-6-dodecenoic acid lactone Chemical compound CCCCC\C=C/CC1CCC(=O)O1 QFXOXDSHNXAFEY-SREVYHEPSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 3-mercaptopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCS DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000003568 synaptosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N thiosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1S NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940103494 thiosalicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- HHXKLPLAKJMLAI-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-5-(3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienylamino)benzoic acid Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCNC1=CC=C(Cl)C(C(O)=O)=C1 HHXKLPLAKJMLAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYKHFQKONWMWQM-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylidene-1h-pyridine-3-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1S WYKHFQKONWMWQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LIOBIWXWSBUTTB-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-sulfanylbenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(S)C(C(O)=O)=C1 LIOBIWXWSBUTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 1
- KEULMSWNRVRESW-YAUBYZHOSA-N CC(C)=CCC/C(/C)=C/CC/C(/C)=C/CSc1cccnc1C(O)=O Chemical compound CC(C)=CCC/C(/C)=C/CC/C(/C)=C/CSc1cccnc1C(O)=O KEULMSWNRVRESW-YAUBYZHOSA-N 0.000 description 1
- NFVUOZTYNXQMRV-UHFFFAOYSA-N CC(C)=CCCC(C)=CC(N)CC(C)=CCC1=CC=CC(C(O)=O)=C1Cl Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CC(N)CC(C)=CCC1=CC=CC(C(O)=O)=C1Cl NFVUOZTYNXQMRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKJKPTGMTIXOSL-UHFFFAOYSA-N CC(C)=CCCC(C)=CC(N)CC(C)=CCSC1=CC=CC=C1C(O)=O Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CC(N)CC(C)=CCSC1=CC=CC=C1C(O)=O OKJKPTGMTIXOSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100045694 Caenorhabditis elegans art-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 101000684275 Homo sapiens ADP-ribosylation factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001130437 Homo sapiens Ras-related protein Rap-2b Proteins 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 150000001204 N-oxides Chemical class 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001788 Proto-Oncogene Proteins c-raf Human genes 0.000 description 1
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100031421 Ras-related protein Rap-2b Human genes 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N anhydrous gallic acid Natural products OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- UIJGNTRUPZPVNG-UHFFFAOYSA-N benzenecarbothioic s-acid Chemical compound SC(=O)C1=CC=CC=C1 UIJGNTRUPZPVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002686 geranylgeranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 125000005358 mercaptoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000011242 neutrophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 125000004971 nitroalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010054353 p21(ras) farnesyl-protein transferase Proteins 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000013498 protein farnesylation Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HYHCSLBZRBJJCH-UHFFFAOYSA-M sodium hydrosulfide Chemical compound [Na+].[SH-] HYHCSLBZRBJJCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
Images
Description
発明の分野
本発明は、プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤として有用な新規ファルネシル誘導体、およびその癌治療における使用に関する。本発明はまた、これらの新規化合物を含んで成る医薬組成物、そしてより詳細には癌の治療または軽減のためのそのような医薬組成物に関する。
発明の背景
Rasタンパク質は、チロシンキナーゼ成長−因子レセプターの発信において鍵となる役割を果たす(Egan,S.E.およびWeinberg,R.A.,Nature,365,781-782(1993);McCormick,F.,Nature,363,15-16(1993))。これらのタンパク質はグアノシン三リン酸(GTP)に結合し、そして成長因子のシグナルをMAPキナーゼカスケードに伝達する。これらは、raf1キナーゼの活性化が直接的なras-raf相互作用を通して起こる形質膜と関連をもっている(Zheng,X.F.ら、Nature,364、308-313(1993);Warne、P.H.,Nature,364,352-353(1993))。成長因子信号伝達の終結には、タンパク質のGTP−結合rasからGDP状態への加水分解が関与する。発癌性rasタンパク質はGTPを加水分解しないので、永久に活性状態である。これは活性化されたrasタンパク質を発現する腫瘍細胞の制御されていない細胞成長に貢献している。突然変異したrasタンパク質はヒトの癌で高い頻度で見い出される(Bos,J.L.Cancer Res.,49,4682-4689(1989);Barbacid,M.,An.Rev.,Biochem,56,779-829(1987))。結腸および膵臓の癌腫のような腫瘍の種類の中には、活性化されたrasが50%より高く存在することがある。したがって、ras活性を変化させる薬学的方法は、特定の種類のヒトの癌を治療するために使用できる。
ras発癌タンパク質の活性を阻害するための薬学的研究が最近記載された(Kohl,N.E.ら、Science,260,1934-1937(1993);James G.L.,Science,260,1937-1942(1993))。CAAXファルネシルトランスフェラーゼの特定の細胞−活性阻害剤が、ras−依存性の細胞成長を阻害し、そして活性化rasを発現する細胞の形質転換した表現型を変えることが実証された。これらの研究は、ras発癌タンパク質のファルネシル化には、それらの膜固定および形質転換活性が絶対的に必要であることを示す初期の実験により方向づけられていた(Hancock,J.F.ら、Cell,57,1167-1177(1989);Casey,P.J.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86.8323-8327(1989))。rasタンパク質のファルネシル化の後に、それらのAAXのタンパク質溶解的除去、続いてファルネシルシステインのカルボキシルメチル化が行われるので、プロテアーゼまたはメチルトランスフェラーゼの阻害剤は、ras活性に影響を与えることができると期待された。もしそうであれば、rasプロセッシングの最終的な、そして可逆的段階(すなわちカルボキシルメチル化)のみを阻害することが有利なはずであった。しかし、ras発癌タンパク質プロセッシングおよび活性の点突然変異分析で、ファルネシル化が膜固定および活性を付与するのに十分であることが示された(カトー.Kら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,6403-6407(1992))。また、N-アセチル-トランス-トランス-ファルネシル-L-システイン(AFC)(プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ(PPMTase)の基質)が、ras−形質転換NIH3T3細胞中でrasメチル化を阻害できるが、その成長は阻害しないことが報告された(Volker,C.,ら、J.Biol.Chem,226,21515-21522(1991))。rasタンパク質の第3の修飾を阻害する、プレニル化タンパク質の酵素的メチル化の遮断は、新生物的な細胞成長を制御するのに有用であることが判明した(米国特許第5,202,456号明細書)。
メチル化はras成熟経路の最終段階であり、そしてこれのみが真に可逆的な段階である。この段階の阻害が、rasタンパク質のファルネシル化またはタンパク質溶解の先行する不可逆的な段階の阻害よりも、非−腫瘍細胞中に存在する正常なrasタンパク質に対して害が少ないといういことは理の当然である。PPMTaseはrasプロセッシングのカスケード中の最後の酵素であり、そしてその基質認識部位は、rasのカルボキシ−末端ファルネシルシステインに結合する類似部位と幾つかの類似性を共有するということが予想される。したがって、PPMTaseインヒビターは、非腫瘍細胞の機能について重要なプレニル化タンパク質のプロセッシングに影響を及ぼす事なく、ras機能に重要なファルネシルシステイン認識部位ドメインを認識し、そして遮断することができる。
ras活性の遮断に有用となることができ、かつ抗−腫瘍剤として使用できるPPMTaseインヒビターが大変望ましい。
成長−因子レセプター信号伝達におけるrasの中心的役割から、ras機能を遮断するファルネシル誘導体も成長因子に関連する非腫瘍性のヒトの疾患に有用であり得る。AFCおよび関連するファルネシル誘導体は、血小板凝集および好中球走化性を阻害することが示された(Philips,M.R.,ら、Science,259,977-980(1993);Akbar,H.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90.868-872(1993))。したがって、有力なPPMTaseインヒビターはマクロファージが関与する敗血症ショック症候群、bEGF−依存性カルテノサイト増殖に関与する乾癬、ならびに血小板の活性化およびPDGF−依存性平滑筋増殖が関与する再狭窄およびアテローム性硬化症の緩和にも有用である、というのは当然だろう。
発明の要約
本発明は、
(a)式I:
式中、
R1はファルネシル、ゲラニルまたはゲラニル−ゲラニルを表し;
ZはC−R2またはNを表し;
R2はH、CN、基COOR7、SO3R7、CONR7R8およびSO2NR7R7を表し、式中、R7およびR8はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルケニルならびに基COOMおよびSO3Mであり、式中、Mはカチオンであり;
R3、R4、R5およびR6はそれぞれ独立して水素、カルボキシル、アルキル、アルケニル、アミノアルキル、ニトロアルキル、ニトロ、ハロ、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、メルカプト、メルカプトアルキル、アジドまたはチオシアナトであり;
XはO、S、SO、SO2、NHまたはSeを表す
の化合物;および
(b)式中ZがNである式(I)の化合物の四級アンモニウム塩およびN−オキシド、
から成る群の員である化合物を提供する。
式(I)を有する化合物の例には以下のものがある:
(i)以下の式IIのファルネシル−チオサリチル酸(FTS):
(ii)以下の式IIIを有する2-クロロ-5-ファルネシルアミノ安息香酸(NFCB)
(iii)以下の式IVを有するファルネシルチオニコチン酸(FTN)
以下に用語“該化合物”は、上記式IからIVの化合物またはこれら化合物の2つ以上の組み合わせを表す時に使用する。
本発明はさらに、有効成分として該化合物を医薬的に許容できるキャリアーと一緒に含んで成る医薬組成物を提供する。特別な態様は、そのような医薬組成物の癌治療または軽減に関する。
本発明はまた、該化合物を医薬組成物の調製に使用すること、より詳細には癌の治療または軽減のための医薬組成物を調製するために使用することに関する。
本発明は該化合物をPPMTaseインヒビターとして使用することも対象とする。
本発明の別の観点によれば、該化合物はPPMTase酵素を試料から単離するために使用される。
この観点に従えば、該化合物は例えば共有結合のような、それ自体は周知な手段により固体支持体上に固定化される。試料は固定化された化合物上に、PPMTaseが該化合物に特異的に結合できるような条件下で加えられる。固定化されたPPMTaseを含んで成るこの固定化支持体は、液体相から分離され、そして非結合分子が次に洗い出される。最後に、PPMTase酵素のみが固体支持体から回収される。
また本発明は、癌の治療が必要な個体に薬学的に有効量の該化合物を投与することにより、癌を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図1は、PPMTaseの2つの合成基質(AFCおよびFTP)ならびにPPMTaseの2つの阻害剤(FTSおよびFTA)の構造式を示す;
図2は、シナプトソームの膜調製物中の、FTSおよびFTAによるPPMTase活性の用量依存性阻害を示す;
図3は、100μM FTSまたは100μM FTAによるインタクトHEC1A、ras-形質転換rat1およびメラノーマ細胞中の、内因性21-24KDa小GTP-結合タンパク質のメチル化阻害を示す;
図4は、200μm FTSによるインタクトなras-形質転換rat1細胞中のrasタンパク質のメチル化阻害を示す;
図5は、10および50μM FTSの不在または存在下で5日間成長した後のMTT染色ras-形質転換rat1細胞を示す;
図6は、MTT法で測定した50μM FTSの、rat1およびras-形質転換rat1細胞の生存能に対する効果を示す;
図7は、処置3、7および10日後の非形質転換rat1およびras-形質転換rat1細胞の成長に対する、様々な濃度(0.1-50)μMのFTAおよびFTSの効果を示す;
図8は、処置3日後のHEC1A細胞の成長に対する、様々な濃度(0.1-50)μMのFTAおよびFTSの効果を示す;
図9は、rat1細胞(左)、未処理(A)、および50μM FTS(B)または50μM FTA(C)処理;ならびにRas-形質転換rat1細胞(右)、未処理(D)、および5μM FTS(E)または10μM FTA(F)処理(100倍)の写真を示す;
図10は、10μM FTS(B)または50μM FTA(C)の不在(A)または存在中でのHEC1A細胞の成長の写真を示す(100倍);
図11は、PPMTase阻害剤としてのファルネシル誘導体のKiと、ras-形質転換rat1細胞の成長阻害剤としてそのEc50値との間の相関を示す;
図12は、典型的な実験で提供された8匹の溶媒処理および8匹のFTS処理(3.2mg/kg、日)のヌードマウスで実際に測定された腫瘍の大きさを示し(Ha-ras-形質転換細胞移植および同日に開始した薬剤の全身投与);そして
図13は、Ha-ras-形質転換細胞移植の37日後の3匹の対照および3匹のFTS処理(1.6mg/kg、隔日)ヌードマウスの写真を示す(細胞移植および全身投与は同日に開始した)。
発明の詳細な説明
材料:
N-アセチル-L-システイン,3-メルカプトプロピオン酸およびメルカプト酢酸を米国のシグマ(Sigma)から購入した。トランス,トランス-ファルネシルブロミド、チオサリチル酸および5-アミノ-2-クロロ安息香酸を米国のアルドリッチ(Aldrich)から購入した。S-アデノシル-L-メチオニンを米国のシグマから購入し、[メチル-3H]-S-アデノシル-L-メチオニン(AdoMet,75Ci/mmol)を米国のRCIから購入し、そして[メチル-3H]メチオニン(15Ci/mmol)を米国のデュポンNEN(DuPont NEN)から購入した。他の全ての化学品はメルク(Merck)、アルドリッチまたはシグマからのA.R.等級のものであった。ゲル電気泳動サプライは米国のバイオラッド(Bio-Rad)から、そしてゲル電気泳動用のタンパク質マーカーはスウェーデンのファルマシア−LKB(Pharmacia-LKB)からのものだった。組織培養補足物(培地、血清および抗生物質)はイスラエルのバイト−ヘメック(Beit-Haemek)のものだった。組織培養プレートは、英国のコーニング(Corning)からのものだった。カラムクロマトグラフィー用(メルク製品#7733)および薄層クロマトグラフィー用(メルク製品#5575)のシリカ-ゲルは、独国のメルクからのものだった。
ファルネシル誘導体の合成:
PPMTase用の合成基質として役立つN-アセチル-フェルネシル-L-システイン(AFC)およびファルネシルチオプロピオン酸(FTP)、ならびにPPMTase活性の阻害剤として役立つS-トランス,トランス-ファルネシルチオ酢酸(FTA)は、以前に詳細に記載された方法(Tanら、J.Biol.Chem,266,10719-10722(1991))をわずかに変更して、トランス,トランス-ファルネシル−ブロミドおよびN-アセチル-L-システイン,3-チオプロピオン酸およびメルカプト酢酸から調製した。類似体はシリカゲルカラムで精製し、そしてプロトン核磁気共鳴(1H−NMR)により、質量分析により、そしてヨウ素蒸気で視覚化したTLCにより分析した。
1H−NMRデータはBruker AMX360-WB NMRスペクトロメーターにより、重水素化したクロロホルム(CDCl3)溶媒およびテトラメチルシラン(TMS)を内部対照として使用して測定した。
マススペクトル(MS)は、Du-Pont 49113スペクトロメーターを使用して測定した。AFC、FTPおよびFTAに関する1H−NMRおよびマススペクトルデータは、Tanら、同上により得られたデータと同一であった。
FTS(ファルネシルチオサリチル酸)の合成:
チオサリチル酸(0.9g、6mmol)、グアニジン炭酸塩(1.3g、7mmol)およびトランス,トランス-ファルネシルブロミド(1.7g、6mmol)を、75mlのアセトン中で室温にて一晩混合した。アセトンを蒸発させた後、クロロホルムを2−3滴の2N HClと一緒に加えた。混合物を水で洗浄し、そして有機相を分離し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に蒸発させた。黄色い油状物が得られた。この生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチル(5:1-1:5)の混合物、および酢酸エチルを溶出液として使用して精製した(85%収量)。
FTAの特性決定
IUPAC名:(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル)-2-チオ安息香酸。
外観:淡い黄色味がかった油状物。
マススペクトル:
m/e358(M+),222、204、152、136、121、107、93、81、69、68。
1H−NMR(CDCl3,TMS,δ)1.55(3H,s)、1.57(3H,s)、1.6(3H,s)、1.67(3H,s)、1.97(m,4H)、2.02(m,4H)、3.45(bs,2H)、5.1(m,2H)、5.25(m,1H)、7.0(m,1H)、7.2(m,3H)、7.9(m,1H)ppm。
使用した略号は:単重項(s)、幅広い単重項(bs)、多重項(m)。
NFCB(5-アミノ-ファルネシル-2-クロロ安息香酸)の合成:
5-アミノ-2-クロロ安息香酸(1.58gr、5.8mmol)を75mlの乾燥アセトン中に溶解した。グアニジン炭酸塩(1.3gr、7mmol)およびトランス,トランス-ファルネシルブロミド(1.3gr、4.6mmol)を加え、反応物を室温にて2〜3時間混合した。さらに1.3grの炭酸グアニジンを室温で一晩混合しながら加えた。反応混合物を濾過し、そして固体フィルターをアセトンで洗浄した。フィルターを合わせ、蒸発させた。生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチルを溶出液として使用して精製した。
NFCBの特性決定
IUPAC名:5'-(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル)アミノ-2'-クロロ安息香酸。
外観:白色の固体物質。
マススペクトル:
m/e375/377(M+)。
1H−NMR(CDCl3,TMS,δ):1.55、1.57、1.60、1.67(4singlets,12H)、1.97(m,4H)、2.0(m,4H)、3.8(d,2H)、5.1(m,4H)、6.6(m,1H)、7.05(d,1H);7.1(m,1H)ppm。
5-アミノ-FTS(5-アミノ-ファルネシル-チオサリチル酸)の合成:
5-アミノ-2-クロロ安息香酸(1.5gr、5.5mmol)を水に溶解し、そしてNaHS(1.2gr、0.022mmol)を加えた。混合物を2時間還流し、そして水を蒸発させて2.1grの灰色の固体物質(5-アミノ-2-メルカプト-安息香酸)を得た。生成物の一部(3.6gr、3.5mmol)を最少容量のジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、そしてKHCO3(0.4gr、4mmol)を加えた。1時間連続して混合した後、1gr(3.5mmol)のトランス-ファルネシルブロミドを加え、そして反応を一定に撹拌しながら室温で一晩行った。このDMFおよび水を蒸発させ、そしてこのようにして得た固体物質をメタノールに溶解し、そして不溶性物質を除去するために濾過した。可溶性物質をシリカ−ゲルカラムで、メタノールおよびクロロホルム(1:9-9:1)の混合物で精製した。期待された生成物をさらに、メタノール/2%アンモニア(Rf0.4)で展開した調製用のシリカ−ゲルプレートで精製した。
5-アミノ-FTSの特性決定
IUPAC名:5'-アミノ-2'-(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-(トリエニル)チオ安息香酸。
外観:淡い黄色味がかった油状物。
マススペクトル:
m/e302、256、235、204、171、135(分子ピークは見えなかった)。
1H−NMR(DMSO6);1.53(s,6H)、1.60(s,3H)、1.65(2,3H)、1.9−2.1(m,8H)、3.8(d,2H)、5−5.2(2m,3H)、6.4(dd,1H)、6.65(bs,1H)、6.95(d,1H)ppm。
ファルネシル-チオニコチン酸(FTN)の合成:
2-メルカプトニコチン酸(0.6gr、6mmol)、グアニジン炭酸塩(1.3gr、7mmol)およびトランス,トランス-ファルネシルブロミド(1.7g、6mmol)を75mlの乾燥アセトン中で室温にて一晩混合した。蒸発後、クロロホルムを2−3滴の2N HClと一緒に加えた。混合物を水で洗浄し、そして有機相を集め、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして蒸発させた。生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチルの混合物を溶出液として精製した。生成物をTLC、マススペクトルメトリーおよびNMRにより特性決定した。
FTNの特性決定
IUPAC名:2′-(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル)チオ-ピリジン-3′カルボン酸。
マススペクトル:m/e 359(M+)
1H−NML(CDCl3,TMS,δ):1.55、1.57、1.60、1.67(4s,12H)、2.05(m,4H)、2.10(m,4H)3.75(d,2H)、5.1(m,2H)、5.4(m,1H)、7.0(m,1H)、8.25(m,1H)、8.5(m,1H)、9.6(m,H)ppm。
シナプトソーム膜調製物を使用したプレニル化合成基質のメチル化の評価:
メチル化の基質としてAFCを使用し、そしてメチルの供与体として[メチル-H3]標識AdoMetを使用した。酵素プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ(PPTMase)の供給源として、この酵素が豊富である膜として知られているラット小脳膜を使用した(Ben-Baruch,Biochem.Biophys.Res.Commun.195,282-288(1993))。
オスのチャールズ リバー 成長ラットを、小脳のシナプトソーム膜を調製するために使用した。小脳を断頭後に取り出し、そして50mM Tris-HCl pH7.4、3mM EDTA、1mM EGTA、5単位/mlのアプロチニンおよび5μg/mlのペプスタチンを含む0.32Mのスクロース中(緩衝液A)で均一化し、10%(重量/容量)のホモジネートを得た。核画分を10分間、600×g遠心により得、そしてシナプトソーム画分を20分間、14,500×gの遠心により得た。使用する様々な種類の細胞膜は、上記緩衝液A中で60分間、100,000×gで遠心して調製した。
ペレットを均一化緩衝液中に再懸濁し、そして-70℃に保存した。メチル化アッセイは37℃で、50mM Tris-HCl緩衝液pH7.4中で、75-125μgタンパク質、25μM[メチル-3H]AdoMet(300,000cpm/mmol)をメチル供与体として、そして150μMのAFCをメチル化基質として(DMSO中のストック溶液として調製)、50μlの全量で行った。DMSO濃度はすべてのアッセイで4%であった。
反応は10分後に、500μlのクロロホルム メタノール(1:1)を加えて終了し、続いて250μlのH2Oを加え混合し、続いて相分離を行った。125μlのクロロホルム相部分を、40℃で乾燥させ、そして200μlの1N NaOH/1%SDS溶液をそれに加えた。このように生成した[3H]メタノールを、既に記載されているように(Haklaiら、Cell Mol.Neurbiol.,11,415-431(1991);Lennerら、Cell Mol.Neurobiol.,12,333および3351(1992);Ben-Baruchら、Biochem.Biophy.Res.Commun.,195,282-288(1993))、気相平衡法により計数した。典型的なバックグラウンドカウント(すなわち、AFCを加えない場合のメチル化のカウント)は、50-100cpmであり、一方基質としてAFCが存在する典型的なメチル化のカウントは、500-6000cpmであった。アッセイは3連で行い、そしてバックグラウンドのカウントを引いた。インタクトな細胞中の内因性の基質のメチル化、および[α-32P]GTP−ブロットオーバーレイアッセイおよびゲル電気泳動は、すでに記載されたように行った(Haklaiら、同上(1991);Lennerら、同上(1993))。
インビトロでの様々な細胞系に対するファルネシル誘導体の効果
細胞系:
使用した細胞系はrat1、-EJ、これらはVal-12活性化ヒトHa-ras遺伝子を安定して発現しているart1細胞である(Land Hら、Nature,304,596-602(1983));V-raf-3T3、これらはV-raf遺伝子を安定して発現している3T3細胞である(Xu,N.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.90,6741-6745);RB-22、これらはラットErb-B2遺伝子を安定して発現している3T3細胞である(Pelesら、EMBO J.10,2077-2086(1991));CO60細胞(SV40-CHO)、これらはSV-40 T-抗原遺伝子を安定して発現しているCHE細胞である(Lavi、Proc.Natl.Acad.Sci.78,6144-6148(1981));ヒト子宮内膜腫細胞系HEC1A、これらは活性化K-rasを発現する細胞である(エノモトT.,Cancer Res.,50,6139-6145);マウスB16F10メラノーマ細胞、ラットクロム親和性細胞腫PC12細胞、373細胞CHEおよびCOS細胞であった。
細胞培養法:
HEC1A、V-raf-3T3およびSV40-CHE細胞を、10%ウシ胎児血清(FCS)、4mM L-グルタミン、10μg/mlストレプトマイシンおよび10U/mlペニシリンを含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)中で成長させた。Rat1および-EJ細胞を、12.5U/mlのニオスタチンを補足した以外は同じ培地中で成長させた。RB-22細胞を、4mM L-グルタミン、10μl/mlストレプトマイシン、10U/mlペニシリンを含有する改良DMEM(1mMピルビン酸ナトリウム、20mM重炭酸ナトリウム)/10%FCS中で成長させた。PC-12細胞をDMEM15%FCS/5%ウマ血清および上記抗生物質中で成長させた。
HEC1A細胞を24ウェルプレートに、5×103細胞/ウェルの密度でまき、そして1mlの培地を供給した。細胞を37℃、95%/5%の空気/CO2の湿潤環境下で成長させた。使用した全ての種類の他の細胞は、2×103細胞/ウェルの密度24ウェルプレートにまき、そして適当な培地を供給した。
培養物をファルネシル誘導体または溶媒で、示したようにプレーティングの3時間後か、またはプレーティングの1日後のいずれかに処理した。薬剤をDMSO中に、所望の最終薬剤濃度(0.1-50μM)および0.1%DMSOとなるように調製した。対照培養物は、0.1%DMSOのみを受容した。培養物に実験の6、7および9日に薬剤または溶媒含有培地を供給した。
細胞は薬剤処理の開始後3、7および10日に計数した。計数のために、細胞をプレートからトリプシン/EDTAではがし、そしてDMEM/10%FCSの存在中で低速遠心により回収した。このペレット化細胞を小容量のDMEM/10%FCSに再懸濁し、そして顕微鏡下で計数した。細胞の生存能を、(3-(4,5-ジメチルチオゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)で染色し、染色された、またはされていない細胞を顕微鏡で検査するか、あるいは各ウェル中の全染色を分光光度的測定(OD490 690)により評価した。非生存細胞はトリパンブルー除外法により評価した。
生化学的方法のために使用した細胞
生化学的方法のために、HEC1A、rat1およびras-形質転換rat1細胞を上記培地中で、1×104細胞/ウェルの密度で成長させた。
B16F10メラノーマ細胞を、RPMI1640/10%ウシ血清、2mMグルタミンおよびHEC1A細胞用抗生物質中で、1×404細胞/ウェルの密度で成長させた。シナプトソーム膜調製用にAFCを上記のような基質として使用して、4つの種類の全ての細胞がPPMTase活性を測定するために使用された。通常、150μgの膜のタンパク質を10分間のインキューベーション時間でこのアッセイに使用した。
HEC1A、rat1、ras-形質転換rat1細胞およびB16F10メラノーマ細胞も、100-300μCi/ml[メチル−3H]メチオニン(これはまたPPMTase活性の指標でもある)で内因性タンパク質を代謝的標識化に使用した。代謝的標識化法はいたるところに記載されており(Haklaiら、同上(1991);Lennerら、同上(1992))、そしてrasのY13-159 Abでの免疫沈降はClarkeら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,4643-4647(1988))に詳細に記載された。
ヌードマウスを対象とした腫瘍成長に対するFTSの効果:
オスのヌードマウス(CD1-Nu)を、イスラエル、レホボットのワイズマン科学研究所(Weizmann Institute of Science)から入手した。5-8匹のマウス群(3-4週齢、25±2gr体重)を、対照およびFTS処置の両実験に使用した。細胞(Ha-ras形質転換rat1(EJ)細胞、2×106細胞/100μl PBS)を計画的に投与(s.c.)した。細胞移植および薬剤投与は同時に開始した。EJ細胞をコンフルエント培養物から調製した。細胞をトリプシン/EDTAではがし、そしてDMEM/10%FCS、続いてPBSで3回洗浄した。2×107細胞/mlの懸濁液を調製し、そして調製の15-30分以内に実験に使用した。
FTSをエタノール中にストック溶液(0.225M)として調製した。これを薬剤投与の直前にPBSで希釈し、そして1.35mM FTS、0.6%エタノール溶液を得た。このような条件下でFTSは投与に要する時間、溶液中に留まった。
実験マウスは、それぞれ毎日または1日おきに100μlのFTS溶液を受容した。対照はPBS中の0.6%エタノールの適当な投与を受けた。腫瘍の成長を毎日観察することにより、そしてミリメートルのカリパスを使用して大きさを測定することにより監視した(2次元的な腫瘍の大きさを通常、週に2回測定した)。
結果
膜調製物中のPPMTase活性に対するFTAおよびFTSの効果
表Iは、メチル化の合成基質としてAFCを含む、または含まない、ラット小脳のシナプトソーム膜由来PPMTaseのメチルトランスフェラーゼ活性を表している。活性は形成した[H3−メチル]エステルの量により測定した。
表IIは様々なPPMTase阻害剤の阻害定数(ki)を示す:
表Iから、FTAおよびFTSの両方がAFCの効率的な阻害剤であるが、FTSはそれ自体がメチル化の基質として役立たないことが分かる。同様に、NFCB、FTNおよび5-アミノ-FTSも効率的な阻害剤であるが、PPMTaseの基質として役立たない(表II)。
図2は、様々なFTAおよびFTS濃度で、シナプトソーム膜中に存在するPPMTaseによる100μM AFCのメチル化阻害の典型的な曲線である。この図から、FTAおよびFTSの両方が、およそ同様な能力でAFC基質のメチル化を用量−依存的様式で阻害することが分かる。しかし、FTSのIC50(AFCメチル化の50%阻害を生じる濃度)値が10μMであるのに対し、FTAはわずか23μMであり、それぞれの阻害定数(Ki)は1.5μMおよび4μMであった。したがってPPMTase阻害において、FTSはFTAよりもおよそ2倍効果的である。
表IIから、様々な阻害剤の能力の順序はFTS>NFCB≒FTA>FTN>5-アミノFTSであった。
表IIIは、AFCのメチル化により測定した時、4種の細胞系から得られた膜中のPPMTase活性に対するFTAおよびFTS両方の阻害活性を示す。
表IIIから、PPMTase活性が試験した全ての膜で明らかであることが分かる。FTAおよびFTSの両方が、正常細胞を含む試験した全ての4種の細胞系中のPMTaseによるAFCのメチル化を阻害した。
インタクトな細胞中のPPMTase活性に対するFTAおよびFTSの効果:
上記表IIは、合成基質のメチル化をアッセイすることによりPPMTase活性を測定したが、図3はこの活性を100μMのFTAまたはFTSの存在または不在下にて、インタクトなHEC1A、ras-形質転換rat1およびメラノーマ細胞中に存在する様々な内因性ras−様プレニル化GTP−結合タンパク質のメチル化により測定する。図3は[メチル-3H]メチオンで代謝的に標識した、細胞の150μgの膜タンパク質を添加したゲルに見られるメチル化21-24kDaタンパク質の量を表す。この図から、FTAおよびFTSの両方が、内因性の21-24kDaタンパク質のメチル化も阻害できたことが分る。[α−32P]GTP−ブロットオーバーレイアッセイ(Haklaiら、同上(1991))の使用により、これら21-25KDaタンパク質がGTP−結合タンパク質であることを実証できた(データは示さず)。図4はFTS(100μM)が、[メチル−3H]メチオニン標識ras形質転換rat1細胞から免疫沈降したrasタンパク質のメチル化を阻害することを示す。
上記の結果から、FTAおよびFTSの両方がインタクトな細胞中に浸透し、そしてこれら細胞の内因性タンパク質のメチル化をこのように遮断することにより、PPMTase活性を阻害できることが明らかである。
毒性試験
インビトロ
細胞の生存に対するFTAおよびFTSの両方の長期的効果を測定するために、生存細胞のみを染色するMTTを使用して比色法を採用し(Mosmen,F.J.,Immunol.Meth.,65,55-63(1983)、ならびに死細胞のみを染色するトリパンブルー排除染色法を採用した。細胞を50μMのFTAまたはFTSと一緒に、最高5日間培養物中でインキューベーションした。この濃度は上記で算出したFTSおよびFTAのKi値の10-30倍である。対照として0.1%DMSO(薬剤無し)でインキューベーションした細胞を使用した。
対照およびFTSまたはFTA処理HEC1A、rat1およびras-形質転換rat1細胞の顕微鏡検査を行い、そして95%より多くの細胞(薬剤処理および未処理の両方)が、MTTで染色され、それらの生存能力を示していることが明らかであった。対照的に、トリパンブルー排除染色法では、5%未満の細胞がこれらの条件下で染色され、細胞死が無いことを示唆していることが明らかであった。
図5は、MTT-染色ras形質転換rat1細胞の典型的な例を示す(対照およびFTS処理、培養5日)。rat1細胞またはras-形質転換rat1細胞のいずれかで薬剤誘導細胞死が無いことは、図6に示すように、MTT染色後の分光光学的測定によっても判定された。データは、細胞のプレーティング後、24時間の対数期中に、OD490 690が対照または薬剤処置細胞のいずれでも増加しなかったことを示す。
さらに数種類の細胞を上記の条件にさらした別の実験で、95%より多くの細胞が生存していることが示された。これらの実験は、培養物中のB16F10マウスメラノーマ、PC-12、3T3、CHOおよびCOS細胞系、ウシ毛細管内皮細胞、ラット脳星状細胞、ラット脳プライマリーニューロン細胞で行い、全てにおいて同様な結果を得た。
インビボ
インタクトな動物での毒性試験を、C57ブラックおよびバルブ−Cマウスで行った。
C57ブラックマウス:各々が9匹のマウスを含んで成る4群を使用した。群の動物は、1%DMSOを含有する塩溶液中の150μM FTSを100μls.c.注射で受容した(0.21mg薬剤/kg体重)。薬剤を2週間、3日毎に注射した。対照として使用した2つの群は、同期間中に溶媒/塩溶液を受容した。第3(薬剤処置)および第4(対照)の動物を、治療の濃度、頻度および期間に関して同様な様式で、しかしs.c.の代わりにi.p.で処置した。薬剤処置した18匹の動物のうち1匹のみが死んだ(i.p.注射)。18匹の対照中、2匹のマウスが死んだ(1匹はi.p.そして1匹はs.c.注射)。これらの結果は、FTSが少なくとも最高0.21mg/kgの投与量ではC57マウスに対して毒性ではないことを示している。
バルブ−Cマウス:5匹の7群のマウスを使用した。マウスは一回のi.p.FTS投与(DMSO中)、または溶媒のみを受容した。この実験で使用した投与量は、0.5mg/kgから268mg/kgの範囲であった。以下の表IVに示すように、全てのマウスは最高の投与量でのみ死亡した。134mg/kgで、5匹のうちの2匹が死亡し、そして50mg/kg以下で全てのマウスが生存していた。すべてを総合すると、これらの結果はFTSに関してLD50(動物の50%が死亡する投与量)が、大変高く、すなわち100mg/kgより高い。
細胞の成長に対するFTSおよびFTAの効果
細胞の成長に対するFTSおよびFTAの効果を、3種類の細胞について試験した:非形質転換rat1細胞;Ha-ras-形質転換rat1細胞およびヒト子宮内膜腫HEC1A細胞。
細胞を2×103/ウェルの密度でまき、そして1日後、溶媒または薬剤のいずれかを与えた。上記のように薬剤処置の3、7または10日後、細胞を回収し、そして各ウェル中の細胞数を直接計数することにより評価した。図7から、FTAまたはFTSのいずれも正常なrat1細胞の成長に対して有意な効果をもたないことが分かる。対照的に両化合物はras-形質転換rat1細胞の成長に対して有意な効果を有した。この効果は少なくとも3日の遅れが明らかであった。処置の7および10日後に観察された、約40-60%の細胞成長の阻害はFTAまたはFTSのいずれかにより誘導された。この阻害は用量−依存的であり、そして最大の阻害が〜5μM(FTS)から50μM(FTA)の薬剤濃度で起こり、これはFTSがFTAよりも10倍低濃度で活性であることを示している。
さらに細胞がプレーティングの同日に薬剤を受容したことを除いて、1組の実験を図7と関連して上記に記載したものと同様に行った。これら実験結果は、FTSに関しては図6に類似する結果が得られたが、FTAに関しては異なっていた。後者の薬剤では、ras-形質転換rat1細胞−成長の阻害が培養中すでに3日後に観察された。これはMTT法(図6と関連して説明した)の使用により確認され;図に示されるように、対照およびFTA処理培養物で3日目に観察されたOD490 690は同様であったが、FTS処理培養物ははるかに低かった。これはFTS処理培養物中の細胞数がより少ないことを示している。
ras-形質転換rat1細胞で行ったものと同様な実験を、HEC1A細胞についても行い、そして結果を図8に示す。この図で分かるように、FTAおよびFTSの両方が、これらの細胞の成長を用量−依存的様式で阻害し、そしてこの効果は処置の3日後にすでに明らかであった。しかしFTSはFTAよりもはるかに能力があった。約50%阻害の最大効果は、50μM FTAと比較して10μM FTSで生じた。
ras-形質転換rat1およびHEC1A細胞の形質転換した表現型に対するFTSおよびFTAの効果
図9Aで分かるように、rat1繊維芽細胞は単層状態で培養中に成長し、一方Ha-ras-形質転換rat1細胞は多層凝集状態で成長し、悪性の形質転換を示している(図9D)。形質転換した細胞を5μM FTS(図9E)または10μM FTS(図9F)で5日間インキューベーションし、形質転換した表現型を変えた。2つの化合物は非−形質転換細胞の形態に対しては効果が無かった(図9Bおよび9C)。
HEC1A細胞も多層凝集状態で成長した(図10A)。示すように、これらの細胞を10μM FTS(10B)または50μM FTS(10C)でインキューベーションすると、形質転換したヒト細胞で多層凝集形成に有意な変化が起こった。
ras-形質転換rat1の細胞成長および表現型に対する、5-アミノFTS、FTNおよびNFCBの効果
FTSおよびFTAのように、調製した3つの他のファルネシル誘導体、すなわち5-アミノFTS、FTNおよびNFCBは、PPMTaseの阻害剤である(表II)。これらの細胞成長に対する効果を、図7および8(ras-形質転換rat1細胞)との関連で記載したものと同一の実験で研究した。これらの実験結果は、NFCBおよびFTNがFTSおよびFTAで得られた結果と同様の効果を有したが、5-アミノFTSは活性ではなかった(最高200μMの薬剤濃度で)。様々なファルネシル誘導体の用量−依存性曲線から評価されたEC50値(細胞の成長を50%阻害する薬剤濃度)(薬剤処置の7日目)を、表Vに要約する。示された能力の順位はFTS>NFCB≒FTA>FTNである。表I(PPMTaseに関するKi)に示すデータと一致して、Ki値とEC50値の間には良い相関がある(図11)。
ras-依存性成長-信号伝達経路に対するFTSの選択性
有力なPPMTase阻害剤FTSを、ras-依存性成長-信号伝達経路に対する薬剤の選択性を調べるために使用した。これらの実験で、Erb-B2(ras経路中、rasの上流で作用する)で形質転換した細胞、およびV-rafまたはT-抗原(rasに無関係に作用する)により形質転換した細胞を研究した。細胞を2×103細胞/ウェルの密度でまき、そしてまいた日に溶媒(対象)または25μM FTSのいずれかを与えた。細胞を実験5日目に計数した。これらの実験結果を以下の表VIに要約する:
見ると分かるように、25μM FTS(ras-形質転換細胞に対して最大の効果を引き起こす濃度)は、Erb-B2-形質転換細胞の成長を阻害するのに十分であった。しかし、この濃度でV-ras計質転換またはT-抗原-形質転換細胞の成長に対して、FTSは効果が無いことが観察された。表VIの結果は、Rat1細胞中のbFGFおよびEGFの有糸分裂促進効果がFTSにより阻害されることも示している。
Ha-ras-形質転換細胞を移植したヌードマウスを対象とした腫瘍成長に対するFTSの効果
Ha-ras-形質転換rat1細胞(2×106)を、ヌードマウスの右後方脚の皮下に移植した。マウスには細胞移植の開始日に、溶媒(PBS中の0.6%エタノール)またはFTSの全身性s.c.注射を行った。2組の実験を行った。1組のマウスは3.6mg/kg FTSを毎日受容した。腫瘍の大きさは実験の10日から始めて、3-4日毎に測定した。図12は8匹の対照(溶媒処理)および8匹のFTS−処置マウスについて、この実験で記録された実際に測定した腫瘍の大きさを表す;このデータは腫瘍の十分な抑制を示唆している。注目すべきは、8匹のFTS処置マウスのうちの6匹が2cm2以下の腫瘍を発生し、そして2匹が4cm2より大きい腫瘍を発生したことである。8匹の対照のうち、6匹が4cm2以上の大きさの腫瘍を発生し、そして2匹が2cm2以下の腫瘍を発生した。別の組の実験では、マウスは1.6mg/kg FTSを1日おきに受容した。FTSの腫瘍成長に対する抑制効果はこれらの実験でも同様に観察された。これは3匹の対照および3匹のFTS処置マウスの写真で実証される(図13)。
医薬組成物
効果的投与量:0.35-7mgの式IIの化合物/Kg体重
組成:中性またはNa+、K+またはNH+塩状態のいずれかの式Iまたは式IIの化合物、あるいは上記IおよびIIの混合物を以下のキャリアーの1つと混合する:
(a)0.02%−0.05%のアルキル没食酸溶液中。
(b)レシチンを含有する0.02%−0.05%のブチル化ヒドロキシアニソール溶液中。
(c)レシチンおよび0.01%のクエン酸または0.01%のリン酸を含有する0.02%−0.05%のブチル化ヒドロキシシアニソール溶液中。
上記の組成は非経口的投与に適する。
本発明は、プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤として有用な新規ファルネシル誘導体、およびその癌治療における使用に関する。本発明はまた、これらの新規化合物を含んで成る医薬組成物、そしてより詳細には癌の治療または軽減のためのそのような医薬組成物に関する。
発明の背景
Rasタンパク質は、チロシンキナーゼ成長−因子レセプターの発信において鍵となる役割を果たす(Egan,S.E.およびWeinberg,R.A.,Nature,365,781-782(1993);McCormick,F.,Nature,363,15-16(1993))。これらのタンパク質はグアノシン三リン酸(GTP)に結合し、そして成長因子のシグナルをMAPキナーゼカスケードに伝達する。これらは、raf1キナーゼの活性化が直接的なras-raf相互作用を通して起こる形質膜と関連をもっている(Zheng,X.F.ら、Nature,364、308-313(1993);Warne、P.H.,Nature,364,352-353(1993))。成長因子信号伝達の終結には、タンパク質のGTP−結合rasからGDP状態への加水分解が関与する。発癌性rasタンパク質はGTPを加水分解しないので、永久に活性状態である。これは活性化されたrasタンパク質を発現する腫瘍細胞の制御されていない細胞成長に貢献している。突然変異したrasタンパク質はヒトの癌で高い頻度で見い出される(Bos,J.L.Cancer Res.,49,4682-4689(1989);Barbacid,M.,An.Rev.,Biochem,56,779-829(1987))。結腸および膵臓の癌腫のような腫瘍の種類の中には、活性化されたrasが50%より高く存在することがある。したがって、ras活性を変化させる薬学的方法は、特定の種類のヒトの癌を治療するために使用できる。
ras発癌タンパク質の活性を阻害するための薬学的研究が最近記載された(Kohl,N.E.ら、Science,260,1934-1937(1993);James G.L.,Science,260,1937-1942(1993))。CAAXファルネシルトランスフェラーゼの特定の細胞−活性阻害剤が、ras−依存性の細胞成長を阻害し、そして活性化rasを発現する細胞の形質転換した表現型を変えることが実証された。これらの研究は、ras発癌タンパク質のファルネシル化には、それらの膜固定および形質転換活性が絶対的に必要であることを示す初期の実験により方向づけられていた(Hancock,J.F.ら、Cell,57,1167-1177(1989);Casey,P.J.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86.8323-8327(1989))。rasタンパク質のファルネシル化の後に、それらのAAXのタンパク質溶解的除去、続いてファルネシルシステインのカルボキシルメチル化が行われるので、プロテアーゼまたはメチルトランスフェラーゼの阻害剤は、ras活性に影響を与えることができると期待された。もしそうであれば、rasプロセッシングの最終的な、そして可逆的段階(すなわちカルボキシルメチル化)のみを阻害することが有利なはずであった。しかし、ras発癌タンパク質プロセッシングおよび活性の点突然変異分析で、ファルネシル化が膜固定および活性を付与するのに十分であることが示された(カトー.Kら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,6403-6407(1992))。また、N-アセチル-トランス-トランス-ファルネシル-L-システイン(AFC)(プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ(PPMTase)の基質)が、ras−形質転換NIH3T3細胞中でrasメチル化を阻害できるが、その成長は阻害しないことが報告された(Volker,C.,ら、J.Biol.Chem,226,21515-21522(1991))。rasタンパク質の第3の修飾を阻害する、プレニル化タンパク質の酵素的メチル化の遮断は、新生物的な細胞成長を制御するのに有用であることが判明した(米国特許第5,202,456号明細書)。
メチル化はras成熟経路の最終段階であり、そしてこれのみが真に可逆的な段階である。この段階の阻害が、rasタンパク質のファルネシル化またはタンパク質溶解の先行する不可逆的な段階の阻害よりも、非−腫瘍細胞中に存在する正常なrasタンパク質に対して害が少ないといういことは理の当然である。PPMTaseはrasプロセッシングのカスケード中の最後の酵素であり、そしてその基質認識部位は、rasのカルボキシ−末端ファルネシルシステインに結合する類似部位と幾つかの類似性を共有するということが予想される。したがって、PPMTaseインヒビターは、非腫瘍細胞の機能について重要なプレニル化タンパク質のプロセッシングに影響を及ぼす事なく、ras機能に重要なファルネシルシステイン認識部位ドメインを認識し、そして遮断することができる。
ras活性の遮断に有用となることができ、かつ抗−腫瘍剤として使用できるPPMTaseインヒビターが大変望ましい。
成長−因子レセプター信号伝達におけるrasの中心的役割から、ras機能を遮断するファルネシル誘導体も成長因子に関連する非腫瘍性のヒトの疾患に有用であり得る。AFCおよび関連するファルネシル誘導体は、血小板凝集および好中球走化性を阻害することが示された(Philips,M.R.,ら、Science,259,977-980(1993);Akbar,H.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90.868-872(1993))。したがって、有力なPPMTaseインヒビターはマクロファージが関与する敗血症ショック症候群、bEGF−依存性カルテノサイト増殖に関与する乾癬、ならびに血小板の活性化およびPDGF−依存性平滑筋増殖が関与する再狭窄およびアテローム性硬化症の緩和にも有用である、というのは当然だろう。
発明の要約
本発明は、
(a)式I:
式中、
R1はファルネシル、ゲラニルまたはゲラニル−ゲラニルを表し;
ZはC−R2またはNを表し;
R2はH、CN、基COOR7、SO3R7、CONR7R8およびSO2NR7R7を表し、式中、R7およびR8はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルケニルならびに基COOMおよびSO3Mであり、式中、Mはカチオンであり;
R3、R4、R5およびR6はそれぞれ独立して水素、カルボキシル、アルキル、アルケニル、アミノアルキル、ニトロアルキル、ニトロ、ハロ、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、メルカプト、メルカプトアルキル、アジドまたはチオシアナトであり;
XはO、S、SO、SO2、NHまたはSeを表す
の化合物;および
(b)式中ZがNである式(I)の化合物の四級アンモニウム塩およびN−オキシド、
から成る群の員である化合物を提供する。
式(I)を有する化合物の例には以下のものがある:
(i)以下の式IIのファルネシル−チオサリチル酸(FTS):
(ii)以下の式IIIを有する2-クロロ-5-ファルネシルアミノ安息香酸(NFCB)
(iii)以下の式IVを有するファルネシルチオニコチン酸(FTN)
以下に用語“該化合物”は、上記式IからIVの化合物またはこれら化合物の2つ以上の組み合わせを表す時に使用する。
本発明はさらに、有効成分として該化合物を医薬的に許容できるキャリアーと一緒に含んで成る医薬組成物を提供する。特別な態様は、そのような医薬組成物の癌治療または軽減に関する。
本発明はまた、該化合物を医薬組成物の調製に使用すること、より詳細には癌の治療または軽減のための医薬組成物を調製するために使用することに関する。
本発明は該化合物をPPMTaseインヒビターとして使用することも対象とする。
本発明の別の観点によれば、該化合物はPPMTase酵素を試料から単離するために使用される。
この観点に従えば、該化合物は例えば共有結合のような、それ自体は周知な手段により固体支持体上に固定化される。試料は固定化された化合物上に、PPMTaseが該化合物に特異的に結合できるような条件下で加えられる。固定化されたPPMTaseを含んで成るこの固定化支持体は、液体相から分離され、そして非結合分子が次に洗い出される。最後に、PPMTase酵素のみが固体支持体から回収される。
また本発明は、癌の治療が必要な個体に薬学的に有効量の該化合物を投与することにより、癌を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図1は、PPMTaseの2つの合成基質(AFCおよびFTP)ならびにPPMTaseの2つの阻害剤(FTSおよびFTA)の構造式を示す;
図2は、シナプトソームの膜調製物中の、FTSおよびFTAによるPPMTase活性の用量依存性阻害を示す;
図3は、100μM FTSまたは100μM FTAによるインタクトHEC1A、ras-形質転換rat1およびメラノーマ細胞中の、内因性21-24KDa小GTP-結合タンパク質のメチル化阻害を示す;
図4は、200μm FTSによるインタクトなras-形質転換rat1細胞中のrasタンパク質のメチル化阻害を示す;
図5は、10および50μM FTSの不在または存在下で5日間成長した後のMTT染色ras-形質転換rat1細胞を示す;
図6は、MTT法で測定した50μM FTSの、rat1およびras-形質転換rat1細胞の生存能に対する効果を示す;
図7は、処置3、7および10日後の非形質転換rat1およびras-形質転換rat1細胞の成長に対する、様々な濃度(0.1-50)μMのFTAおよびFTSの効果を示す;
図8は、処置3日後のHEC1A細胞の成長に対する、様々な濃度(0.1-50)μMのFTAおよびFTSの効果を示す;
図9は、rat1細胞(左)、未処理(A)、および50μM FTS(B)または50μM FTA(C)処理;ならびにRas-形質転換rat1細胞(右)、未処理(D)、および5μM FTS(E)または10μM FTA(F)処理(100倍)の写真を示す;
図10は、10μM FTS(B)または50μM FTA(C)の不在(A)または存在中でのHEC1A細胞の成長の写真を示す(100倍);
図11は、PPMTase阻害剤としてのファルネシル誘導体のKiと、ras-形質転換rat1細胞の成長阻害剤としてそのEc50値との間の相関を示す;
図12は、典型的な実験で提供された8匹の溶媒処理および8匹のFTS処理(3.2mg/kg、日)のヌードマウスで実際に測定された腫瘍の大きさを示し(Ha-ras-形質転換細胞移植および同日に開始した薬剤の全身投与);そして
図13は、Ha-ras-形質転換細胞移植の37日後の3匹の対照および3匹のFTS処理(1.6mg/kg、隔日)ヌードマウスの写真を示す(細胞移植および全身投与は同日に開始した)。
発明の詳細な説明
材料:
N-アセチル-L-システイン,3-メルカプトプロピオン酸およびメルカプト酢酸を米国のシグマ(Sigma)から購入した。トランス,トランス-ファルネシルブロミド、チオサリチル酸および5-アミノ-2-クロロ安息香酸を米国のアルドリッチ(Aldrich)から購入した。S-アデノシル-L-メチオニンを米国のシグマから購入し、[メチル-3H]-S-アデノシル-L-メチオニン(AdoMet,75Ci/mmol)を米国のRCIから購入し、そして[メチル-3H]メチオニン(15Ci/mmol)を米国のデュポンNEN(DuPont NEN)から購入した。他の全ての化学品はメルク(Merck)、アルドリッチまたはシグマからのA.R.等級のものであった。ゲル電気泳動サプライは米国のバイオラッド(Bio-Rad)から、そしてゲル電気泳動用のタンパク質マーカーはスウェーデンのファルマシア−LKB(Pharmacia-LKB)からのものだった。組織培養補足物(培地、血清および抗生物質)はイスラエルのバイト−ヘメック(Beit-Haemek)のものだった。組織培養プレートは、英国のコーニング(Corning)からのものだった。カラムクロマトグラフィー用(メルク製品#7733)および薄層クロマトグラフィー用(メルク製品#5575)のシリカ-ゲルは、独国のメルクからのものだった。
ファルネシル誘導体の合成:
PPMTase用の合成基質として役立つN-アセチル-フェルネシル-L-システイン(AFC)およびファルネシルチオプロピオン酸(FTP)、ならびにPPMTase活性の阻害剤として役立つS-トランス,トランス-ファルネシルチオ酢酸(FTA)は、以前に詳細に記載された方法(Tanら、J.Biol.Chem,266,10719-10722(1991))をわずかに変更して、トランス,トランス-ファルネシル−ブロミドおよびN-アセチル-L-システイン,3-チオプロピオン酸およびメルカプト酢酸から調製した。類似体はシリカゲルカラムで精製し、そしてプロトン核磁気共鳴(1H−NMR)により、質量分析により、そしてヨウ素蒸気で視覚化したTLCにより分析した。
1H−NMRデータはBruker AMX360-WB NMRスペクトロメーターにより、重水素化したクロロホルム(CDCl3)溶媒およびテトラメチルシラン(TMS)を内部対照として使用して測定した。
マススペクトル(MS)は、Du-Pont 49113スペクトロメーターを使用して測定した。AFC、FTPおよびFTAに関する1H−NMRおよびマススペクトルデータは、Tanら、同上により得られたデータと同一であった。
FTS(ファルネシルチオサリチル酸)の合成:
チオサリチル酸(0.9g、6mmol)、グアニジン炭酸塩(1.3g、7mmol)およびトランス,トランス-ファルネシルブロミド(1.7g、6mmol)を、75mlのアセトン中で室温にて一晩混合した。アセトンを蒸発させた後、クロロホルムを2−3滴の2N HClと一緒に加えた。混合物を水で洗浄し、そして有機相を分離し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次に蒸発させた。黄色い油状物が得られた。この生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチル(5:1-1:5)の混合物、および酢酸エチルを溶出液として使用して精製した(85%収量)。
FTAの特性決定
IUPAC名:(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル)-2-チオ安息香酸。
外観:淡い黄色味がかった油状物。
マススペクトル:
m/e358(M+),222、204、152、136、121、107、93、81、69、68。
1H−NMR(CDCl3,TMS,δ)1.55(3H,s)、1.57(3H,s)、1.6(3H,s)、1.67(3H,s)、1.97(m,4H)、2.02(m,4H)、3.45(bs,2H)、5.1(m,2H)、5.25(m,1H)、7.0(m,1H)、7.2(m,3H)、7.9(m,1H)ppm。
使用した略号は:単重項(s)、幅広い単重項(bs)、多重項(m)。
NFCB(5-アミノ-ファルネシル-2-クロロ安息香酸)の合成:
5-アミノ-2-クロロ安息香酸(1.58gr、5.8mmol)を75mlの乾燥アセトン中に溶解した。グアニジン炭酸塩(1.3gr、7mmol)およびトランス,トランス-ファルネシルブロミド(1.3gr、4.6mmol)を加え、反応物を室温にて2〜3時間混合した。さらに1.3grの炭酸グアニジンを室温で一晩混合しながら加えた。反応混合物を濾過し、そして固体フィルターをアセトンで洗浄した。フィルターを合わせ、蒸発させた。生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチルを溶出液として使用して精製した。
NFCBの特性決定
IUPAC名:5'-(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル)アミノ-2'-クロロ安息香酸。
外観:白色の固体物質。
マススペクトル:
m/e375/377(M+)。
1H−NMR(CDCl3,TMS,δ):1.55、1.57、1.60、1.67(4singlets,12H)、1.97(m,4H)、2.0(m,4H)、3.8(d,2H)、5.1(m,4H)、6.6(m,1H)、7.05(d,1H);7.1(m,1H)ppm。
5-アミノ-FTS(5-アミノ-ファルネシル-チオサリチル酸)の合成:
5-アミノ-2-クロロ安息香酸(1.5gr、5.5mmol)を水に溶解し、そしてNaHS(1.2gr、0.022mmol)を加えた。混合物を2時間還流し、そして水を蒸発させて2.1grの灰色の固体物質(5-アミノ-2-メルカプト-安息香酸)を得た。生成物の一部(3.6gr、3.5mmol)を最少容量のジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、そしてKHCO3(0.4gr、4mmol)を加えた。1時間連続して混合した後、1gr(3.5mmol)のトランス-ファルネシルブロミドを加え、そして反応を一定に撹拌しながら室温で一晩行った。このDMFおよび水を蒸発させ、そしてこのようにして得た固体物質をメタノールに溶解し、そして不溶性物質を除去するために濾過した。可溶性物質をシリカ−ゲルカラムで、メタノールおよびクロロホルム(1:9-9:1)の混合物で精製した。期待された生成物をさらに、メタノール/2%アンモニア(Rf0.4)で展開した調製用のシリカ−ゲルプレートで精製した。
5-アミノ-FTSの特性決定
IUPAC名:5'-アミノ-2'-(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-(トリエニル)チオ安息香酸。
外観:淡い黄色味がかった油状物。
マススペクトル:
m/e302、256、235、204、171、135(分子ピークは見えなかった)。
1H−NMR(DMSO6);1.53(s,6H)、1.60(s,3H)、1.65(2,3H)、1.9−2.1(m,8H)、3.8(d,2H)、5−5.2(2m,3H)、6.4(dd,1H)、6.65(bs,1H)、6.95(d,1H)ppm。
ファルネシル-チオニコチン酸(FTN)の合成:
2-メルカプトニコチン酸(0.6gr、6mmol)、グアニジン炭酸塩(1.3gr、7mmol)およびトランス,トランス-ファルネシルブロミド(1.7g、6mmol)を75mlの乾燥アセトン中で室温にて一晩混合した。蒸発後、クロロホルムを2−3滴の2N HClと一緒に加えた。混合物を水で洗浄し、そして有機相を集め、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして蒸発させた。生成物をシリカ−ゲルカラムで、クロロホルムおよび酢酸エチルの混合物を溶出液として精製した。生成物をTLC、マススペクトルメトリーおよびNMRにより特性決定した。
FTNの特性決定
IUPAC名:2′-(3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,6,10-トリエニル)チオ-ピリジン-3′カルボン酸。
マススペクトル:m/e 359(M+)
1H−NML(CDCl3,TMS,δ):1.55、1.57、1.60、1.67(4s,12H)、2.05(m,4H)、2.10(m,4H)3.75(d,2H)、5.1(m,2H)、5.4(m,1H)、7.0(m,1H)、8.25(m,1H)、8.5(m,1H)、9.6(m,H)ppm。
シナプトソーム膜調製物を使用したプレニル化合成基質のメチル化の評価:
メチル化の基質としてAFCを使用し、そしてメチルの供与体として[メチル-H3]標識AdoMetを使用した。酵素プレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ(PPTMase)の供給源として、この酵素が豊富である膜として知られているラット小脳膜を使用した(Ben-Baruch,Biochem.Biophys.Res.Commun.195,282-288(1993))。
オスのチャールズ リバー 成長ラットを、小脳のシナプトソーム膜を調製するために使用した。小脳を断頭後に取り出し、そして50mM Tris-HCl pH7.4、3mM EDTA、1mM EGTA、5単位/mlのアプロチニンおよび5μg/mlのペプスタチンを含む0.32Mのスクロース中(緩衝液A)で均一化し、10%(重量/容量)のホモジネートを得た。核画分を10分間、600×g遠心により得、そしてシナプトソーム画分を20分間、14,500×gの遠心により得た。使用する様々な種類の細胞膜は、上記緩衝液A中で60分間、100,000×gで遠心して調製した。
ペレットを均一化緩衝液中に再懸濁し、そして-70℃に保存した。メチル化アッセイは37℃で、50mM Tris-HCl緩衝液pH7.4中で、75-125μgタンパク質、25μM[メチル-3H]AdoMet(300,000cpm/mmol)をメチル供与体として、そして150μMのAFCをメチル化基質として(DMSO中のストック溶液として調製)、50μlの全量で行った。DMSO濃度はすべてのアッセイで4%であった。
反応は10分後に、500μlのクロロホルム メタノール(1:1)を加えて終了し、続いて250μlのH2Oを加え混合し、続いて相分離を行った。125μlのクロロホルム相部分を、40℃で乾燥させ、そして200μlの1N NaOH/1%SDS溶液をそれに加えた。このように生成した[3H]メタノールを、既に記載されているように(Haklaiら、Cell Mol.Neurbiol.,11,415-431(1991);Lennerら、Cell Mol.Neurobiol.,12,333および3351(1992);Ben-Baruchら、Biochem.Biophy.Res.Commun.,195,282-288(1993))、気相平衡法により計数した。典型的なバックグラウンドカウント(すなわち、AFCを加えない場合のメチル化のカウント)は、50-100cpmであり、一方基質としてAFCが存在する典型的なメチル化のカウントは、500-6000cpmであった。アッセイは3連で行い、そしてバックグラウンドのカウントを引いた。インタクトな細胞中の内因性の基質のメチル化、および[α-32P]GTP−ブロットオーバーレイアッセイおよびゲル電気泳動は、すでに記載されたように行った(Haklaiら、同上(1991);Lennerら、同上(1993))。
インビトロでの様々な細胞系に対するファルネシル誘導体の効果
細胞系:
使用した細胞系はrat1、-EJ、これらはVal-12活性化ヒトHa-ras遺伝子を安定して発現しているart1細胞である(Land Hら、Nature,304,596-602(1983));V-raf-3T3、これらはV-raf遺伝子を安定して発現している3T3細胞である(Xu,N.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.90,6741-6745);RB-22、これらはラットErb-B2遺伝子を安定して発現している3T3細胞である(Pelesら、EMBO J.10,2077-2086(1991));CO60細胞(SV40-CHO)、これらはSV-40 T-抗原遺伝子を安定して発現しているCHE細胞である(Lavi、Proc.Natl.Acad.Sci.78,6144-6148(1981));ヒト子宮内膜腫細胞系HEC1A、これらは活性化K-rasを発現する細胞である(エノモトT.,Cancer Res.,50,6139-6145);マウスB16F10メラノーマ細胞、ラットクロム親和性細胞腫PC12細胞、373細胞CHEおよびCOS細胞であった。
細胞培養法:
HEC1A、V-raf-3T3およびSV40-CHE細胞を、10%ウシ胎児血清(FCS)、4mM L-グルタミン、10μg/mlストレプトマイシンおよび10U/mlペニシリンを含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)中で成長させた。Rat1および-EJ細胞を、12.5U/mlのニオスタチンを補足した以外は同じ培地中で成長させた。RB-22細胞を、4mM L-グルタミン、10μl/mlストレプトマイシン、10U/mlペニシリンを含有する改良DMEM(1mMピルビン酸ナトリウム、20mM重炭酸ナトリウム)/10%FCS中で成長させた。PC-12細胞をDMEM15%FCS/5%ウマ血清および上記抗生物質中で成長させた。
HEC1A細胞を24ウェルプレートに、5×103細胞/ウェルの密度でまき、そして1mlの培地を供給した。細胞を37℃、95%/5%の空気/CO2の湿潤環境下で成長させた。使用した全ての種類の他の細胞は、2×103細胞/ウェルの密度24ウェルプレートにまき、そして適当な培地を供給した。
培養物をファルネシル誘導体または溶媒で、示したようにプレーティングの3時間後か、またはプレーティングの1日後のいずれかに処理した。薬剤をDMSO中に、所望の最終薬剤濃度(0.1-50μM)および0.1%DMSOとなるように調製した。対照培養物は、0.1%DMSOのみを受容した。培養物に実験の6、7および9日に薬剤または溶媒含有培地を供給した。
細胞は薬剤処理の開始後3、7および10日に計数した。計数のために、細胞をプレートからトリプシン/EDTAではがし、そしてDMEM/10%FCSの存在中で低速遠心により回収した。このペレット化細胞を小容量のDMEM/10%FCSに再懸濁し、そして顕微鏡下で計数した。細胞の生存能を、(3-(4,5-ジメチルチオゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)で染色し、染色された、またはされていない細胞を顕微鏡で検査するか、あるいは各ウェル中の全染色を分光光度的測定(OD490 690)により評価した。非生存細胞はトリパンブルー除外法により評価した。
生化学的方法のために使用した細胞
生化学的方法のために、HEC1A、rat1およびras-形質転換rat1細胞を上記培地中で、1×104細胞/ウェルの密度で成長させた。
B16F10メラノーマ細胞を、RPMI1640/10%ウシ血清、2mMグルタミンおよびHEC1A細胞用抗生物質中で、1×404細胞/ウェルの密度で成長させた。シナプトソーム膜調製用にAFCを上記のような基質として使用して、4つの種類の全ての細胞がPPMTase活性を測定するために使用された。通常、150μgの膜のタンパク質を10分間のインキューベーション時間でこのアッセイに使用した。
HEC1A、rat1、ras-形質転換rat1細胞およびB16F10メラノーマ細胞も、100-300μCi/ml[メチル−3H]メチオニン(これはまたPPMTase活性の指標でもある)で内因性タンパク質を代謝的標識化に使用した。代謝的標識化法はいたるところに記載されており(Haklaiら、同上(1991);Lennerら、同上(1992))、そしてrasのY13-159 Abでの免疫沈降はClarkeら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,4643-4647(1988))に詳細に記載された。
ヌードマウスを対象とした腫瘍成長に対するFTSの効果:
オスのヌードマウス(CD1-Nu)を、イスラエル、レホボットのワイズマン科学研究所(Weizmann Institute of Science)から入手した。5-8匹のマウス群(3-4週齢、25±2gr体重)を、対照およびFTS処置の両実験に使用した。細胞(Ha-ras形質転換rat1(EJ)細胞、2×106細胞/100μl PBS)を計画的に投与(s.c.)した。細胞移植および薬剤投与は同時に開始した。EJ細胞をコンフルエント培養物から調製した。細胞をトリプシン/EDTAではがし、そしてDMEM/10%FCS、続いてPBSで3回洗浄した。2×107細胞/mlの懸濁液を調製し、そして調製の15-30分以内に実験に使用した。
FTSをエタノール中にストック溶液(0.225M)として調製した。これを薬剤投与の直前にPBSで希釈し、そして1.35mM FTS、0.6%エタノール溶液を得た。このような条件下でFTSは投与に要する時間、溶液中に留まった。
実験マウスは、それぞれ毎日または1日おきに100μlのFTS溶液を受容した。対照はPBS中の0.6%エタノールの適当な投与を受けた。腫瘍の成長を毎日観察することにより、そしてミリメートルのカリパスを使用して大きさを測定することにより監視した(2次元的な腫瘍の大きさを通常、週に2回測定した)。
結果
膜調製物中のPPMTase活性に対するFTAおよびFTSの効果
表Iは、メチル化の合成基質としてAFCを含む、または含まない、ラット小脳のシナプトソーム膜由来PPMTaseのメチルトランスフェラーゼ活性を表している。活性は形成した[H3−メチル]エステルの量により測定した。
表IIは様々なPPMTase阻害剤の阻害定数(ki)を示す:
表Iから、FTAおよびFTSの両方がAFCの効率的な阻害剤であるが、FTSはそれ自体がメチル化の基質として役立たないことが分かる。同様に、NFCB、FTNおよび5-アミノ-FTSも効率的な阻害剤であるが、PPMTaseの基質として役立たない(表II)。
図2は、様々なFTAおよびFTS濃度で、シナプトソーム膜中に存在するPPMTaseによる100μM AFCのメチル化阻害の典型的な曲線である。この図から、FTAおよびFTSの両方が、およそ同様な能力でAFC基質のメチル化を用量−依存的様式で阻害することが分かる。しかし、FTSのIC50(AFCメチル化の50%阻害を生じる濃度)値が10μMであるのに対し、FTAはわずか23μMであり、それぞれの阻害定数(Ki)は1.5μMおよび4μMであった。したがってPPMTase阻害において、FTSはFTAよりもおよそ2倍効果的である。
表IIから、様々な阻害剤の能力の順序はFTS>NFCB≒FTA>FTN>5-アミノFTSであった。
表IIIは、AFCのメチル化により測定した時、4種の細胞系から得られた膜中のPPMTase活性に対するFTAおよびFTS両方の阻害活性を示す。
表IIIから、PPMTase活性が試験した全ての膜で明らかであることが分かる。FTAおよびFTSの両方が、正常細胞を含む試験した全ての4種の細胞系中のPMTaseによるAFCのメチル化を阻害した。
インタクトな細胞中のPPMTase活性に対するFTAおよびFTSの効果:
上記表IIは、合成基質のメチル化をアッセイすることによりPPMTase活性を測定したが、図3はこの活性を100μMのFTAまたはFTSの存在または不在下にて、インタクトなHEC1A、ras-形質転換rat1およびメラノーマ細胞中に存在する様々な内因性ras−様プレニル化GTP−結合タンパク質のメチル化により測定する。図3は[メチル-3H]メチオンで代謝的に標識した、細胞の150μgの膜タンパク質を添加したゲルに見られるメチル化21-24kDaタンパク質の量を表す。この図から、FTAおよびFTSの両方が、内因性の21-24kDaタンパク質のメチル化も阻害できたことが分る。[α−32P]GTP−ブロットオーバーレイアッセイ(Haklaiら、同上(1991))の使用により、これら21-25KDaタンパク質がGTP−結合タンパク質であることを実証できた(データは示さず)。図4はFTS(100μM)が、[メチル−3H]メチオニン標識ras形質転換rat1細胞から免疫沈降したrasタンパク質のメチル化を阻害することを示す。
上記の結果から、FTAおよびFTSの両方がインタクトな細胞中に浸透し、そしてこれら細胞の内因性タンパク質のメチル化をこのように遮断することにより、PPMTase活性を阻害できることが明らかである。
毒性試験
インビトロ
細胞の生存に対するFTAおよびFTSの両方の長期的効果を測定するために、生存細胞のみを染色するMTTを使用して比色法を採用し(Mosmen,F.J.,Immunol.Meth.,65,55-63(1983)、ならびに死細胞のみを染色するトリパンブルー排除染色法を採用した。細胞を50μMのFTAまたはFTSと一緒に、最高5日間培養物中でインキューベーションした。この濃度は上記で算出したFTSおよびFTAのKi値の10-30倍である。対照として0.1%DMSO(薬剤無し)でインキューベーションした細胞を使用した。
対照およびFTSまたはFTA処理HEC1A、rat1およびras-形質転換rat1細胞の顕微鏡検査を行い、そして95%より多くの細胞(薬剤処理および未処理の両方)が、MTTで染色され、それらの生存能力を示していることが明らかであった。対照的に、トリパンブルー排除染色法では、5%未満の細胞がこれらの条件下で染色され、細胞死が無いことを示唆していることが明らかであった。
図5は、MTT-染色ras形質転換rat1細胞の典型的な例を示す(対照およびFTS処理、培養5日)。rat1細胞またはras-形質転換rat1細胞のいずれかで薬剤誘導細胞死が無いことは、図6に示すように、MTT染色後の分光光学的測定によっても判定された。データは、細胞のプレーティング後、24時間の対数期中に、OD490 690が対照または薬剤処置細胞のいずれでも増加しなかったことを示す。
さらに数種類の細胞を上記の条件にさらした別の実験で、95%より多くの細胞が生存していることが示された。これらの実験は、培養物中のB16F10マウスメラノーマ、PC-12、3T3、CHOおよびCOS細胞系、ウシ毛細管内皮細胞、ラット脳星状細胞、ラット脳プライマリーニューロン細胞で行い、全てにおいて同様な結果を得た。
インビボ
インタクトな動物での毒性試験を、C57ブラックおよびバルブ−Cマウスで行った。
C57ブラックマウス:各々が9匹のマウスを含んで成る4群を使用した。群の動物は、1%DMSOを含有する塩溶液中の150μM FTSを100μls.c.注射で受容した(0.21mg薬剤/kg体重)。薬剤を2週間、3日毎に注射した。対照として使用した2つの群は、同期間中に溶媒/塩溶液を受容した。第3(薬剤処置)および第4(対照)の動物を、治療の濃度、頻度および期間に関して同様な様式で、しかしs.c.の代わりにi.p.で処置した。薬剤処置した18匹の動物のうち1匹のみが死んだ(i.p.注射)。18匹の対照中、2匹のマウスが死んだ(1匹はi.p.そして1匹はs.c.注射)。これらの結果は、FTSが少なくとも最高0.21mg/kgの投与量ではC57マウスに対して毒性ではないことを示している。
バルブ−Cマウス:5匹の7群のマウスを使用した。マウスは一回のi.p.FTS投与(DMSO中)、または溶媒のみを受容した。この実験で使用した投与量は、0.5mg/kgから268mg/kgの範囲であった。以下の表IVに示すように、全てのマウスは最高の投与量でのみ死亡した。134mg/kgで、5匹のうちの2匹が死亡し、そして50mg/kg以下で全てのマウスが生存していた。すべてを総合すると、これらの結果はFTSに関してLD50(動物の50%が死亡する投与量)が、大変高く、すなわち100mg/kgより高い。
細胞の成長に対するFTSおよびFTAの効果
細胞の成長に対するFTSおよびFTAの効果を、3種類の細胞について試験した:非形質転換rat1細胞;Ha-ras-形質転換rat1細胞およびヒト子宮内膜腫HEC1A細胞。
細胞を2×103/ウェルの密度でまき、そして1日後、溶媒または薬剤のいずれかを与えた。上記のように薬剤処置の3、7または10日後、細胞を回収し、そして各ウェル中の細胞数を直接計数することにより評価した。図7から、FTAまたはFTSのいずれも正常なrat1細胞の成長に対して有意な効果をもたないことが分かる。対照的に両化合物はras-形質転換rat1細胞の成長に対して有意な効果を有した。この効果は少なくとも3日の遅れが明らかであった。処置の7および10日後に観察された、約40-60%の細胞成長の阻害はFTAまたはFTSのいずれかにより誘導された。この阻害は用量−依存的であり、そして最大の阻害が〜5μM(FTS)から50μM(FTA)の薬剤濃度で起こり、これはFTSがFTAよりも10倍低濃度で活性であることを示している。
さらに細胞がプレーティングの同日に薬剤を受容したことを除いて、1組の実験を図7と関連して上記に記載したものと同様に行った。これら実験結果は、FTSに関しては図6に類似する結果が得られたが、FTAに関しては異なっていた。後者の薬剤では、ras-形質転換rat1細胞−成長の阻害が培養中すでに3日後に観察された。これはMTT法(図6と関連して説明した)の使用により確認され;図に示されるように、対照およびFTA処理培養物で3日目に観察されたOD490 690は同様であったが、FTS処理培養物ははるかに低かった。これはFTS処理培養物中の細胞数がより少ないことを示している。
ras-形質転換rat1細胞で行ったものと同様な実験を、HEC1A細胞についても行い、そして結果を図8に示す。この図で分かるように、FTAおよびFTSの両方が、これらの細胞の成長を用量−依存的様式で阻害し、そしてこの効果は処置の3日後にすでに明らかであった。しかしFTSはFTAよりもはるかに能力があった。約50%阻害の最大効果は、50μM FTAと比較して10μM FTSで生じた。
ras-形質転換rat1およびHEC1A細胞の形質転換した表現型に対するFTSおよびFTAの効果
図9Aで分かるように、rat1繊維芽細胞は単層状態で培養中に成長し、一方Ha-ras-形質転換rat1細胞は多層凝集状態で成長し、悪性の形質転換を示している(図9D)。形質転換した細胞を5μM FTS(図9E)または10μM FTS(図9F)で5日間インキューベーションし、形質転換した表現型を変えた。2つの化合物は非−形質転換細胞の形態に対しては効果が無かった(図9Bおよび9C)。
HEC1A細胞も多層凝集状態で成長した(図10A)。示すように、これらの細胞を10μM FTS(10B)または50μM FTS(10C)でインキューベーションすると、形質転換したヒト細胞で多層凝集形成に有意な変化が起こった。
ras-形質転換rat1の細胞成長および表現型に対する、5-アミノFTS、FTNおよびNFCBの効果
FTSおよびFTAのように、調製した3つの他のファルネシル誘導体、すなわち5-アミノFTS、FTNおよびNFCBは、PPMTaseの阻害剤である(表II)。これらの細胞成長に対する効果を、図7および8(ras-形質転換rat1細胞)との関連で記載したものと同一の実験で研究した。これらの実験結果は、NFCBおよびFTNがFTSおよびFTAで得られた結果と同様の効果を有したが、5-アミノFTSは活性ではなかった(最高200μMの薬剤濃度で)。様々なファルネシル誘導体の用量−依存性曲線から評価されたEC50値(細胞の成長を50%阻害する薬剤濃度)(薬剤処置の7日目)を、表Vに要約する。示された能力の順位はFTS>NFCB≒FTA>FTNである。表I(PPMTaseに関するKi)に示すデータと一致して、Ki値とEC50値の間には良い相関がある(図11)。
ras-依存性成長-信号伝達経路に対するFTSの選択性
有力なPPMTase阻害剤FTSを、ras-依存性成長-信号伝達経路に対する薬剤の選択性を調べるために使用した。これらの実験で、Erb-B2(ras経路中、rasの上流で作用する)で形質転換した細胞、およびV-rafまたはT-抗原(rasに無関係に作用する)により形質転換した細胞を研究した。細胞を2×103細胞/ウェルの密度でまき、そしてまいた日に溶媒(対象)または25μM FTSのいずれかを与えた。細胞を実験5日目に計数した。これらの実験結果を以下の表VIに要約する:
見ると分かるように、25μM FTS(ras-形質転換細胞に対して最大の効果を引き起こす濃度)は、Erb-B2-形質転換細胞の成長を阻害するのに十分であった。しかし、この濃度でV-ras計質転換またはT-抗原-形質転換細胞の成長に対して、FTSは効果が無いことが観察された。表VIの結果は、Rat1細胞中のbFGFおよびEGFの有糸分裂促進効果がFTSにより阻害されることも示している。
Ha-ras-形質転換細胞を移植したヌードマウスを対象とした腫瘍成長に対するFTSの効果
Ha-ras-形質転換rat1細胞(2×106)を、ヌードマウスの右後方脚の皮下に移植した。マウスには細胞移植の開始日に、溶媒(PBS中の0.6%エタノール)またはFTSの全身性s.c.注射を行った。2組の実験を行った。1組のマウスは3.6mg/kg FTSを毎日受容した。腫瘍の大きさは実験の10日から始めて、3-4日毎に測定した。図12は8匹の対照(溶媒処理)および8匹のFTS−処置マウスについて、この実験で記録された実際に測定した腫瘍の大きさを表す;このデータは腫瘍の十分な抑制を示唆している。注目すべきは、8匹のFTS処置マウスのうちの6匹が2cm2以下の腫瘍を発生し、そして2匹が4cm2より大きい腫瘍を発生したことである。8匹の対照のうち、6匹が4cm2以上の大きさの腫瘍を発生し、そして2匹が2cm2以下の腫瘍を発生した。別の組の実験では、マウスは1.6mg/kg FTSを1日おきに受容した。FTSの腫瘍成長に対する抑制効果はこれらの実験でも同様に観察された。これは3匹の対照および3匹のFTS処置マウスの写真で実証される(図13)。
医薬組成物
効果的投与量:0.35-7mgの式IIの化合物/Kg体重
組成:中性またはNa+、K+またはNH+塩状態のいずれかの式Iまたは式IIの化合物、あるいは上記IおよびIIの混合物を以下のキャリアーの1つと混合する:
(a)0.02%−0.05%のアルキル没食酸溶液中。
(b)レシチンを含有する0.02%−0.05%のブチル化ヒドロキシアニソール溶液中。
(c)レシチンおよび0.01%のクエン酸または0.01%のリン酸を含有する0.02%−0.05%のブチル化ヒドロキシシアニソール溶液中。
上記の組成は非経口的投与に適する。
Claims (5)
- 請求項2に記載の化合物を有効成分とする癌の治療または軽減のための医薬組成物。
- 癌の治療または軽減用の医薬組成物を調製するための請求項2に記載の化合物の使用方法。
- 請求項2に記載の化合物からなるプレニル化タンパク質メチルトランスフェラーゼ(PPMTase)の阻害剤。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IL107587 | 1993-11-12 | ||
IL10758793A IL107587A (en) | 1993-11-12 | 1993-11-12 | Farnesyl geranyl or geranyl-geranyl derivatives pharmaceutical compositions containing them and methods for their preparation |
PCT/US1994/013345 WO1995013059A1 (en) | 1993-11-12 | 1994-11-10 | Farnesyl derivatives and pharmaceutical compositions containing them |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09508618A JPH09508618A (ja) | 1997-09-02 |
JP3757236B2 JP3757236B2 (ja) | 2006-03-22 |
JP3757236B6 true JP3757236B6 (ja) | 2007-01-24 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2176373C (en) | Farnesyl derivatives and pharmaceutical compositions containing them | |
US5736576A (en) | Method of treating malignant tumors with thyroxine analogues having no significant hormonal activity | |
US5739169A (en) | Aromatic compounds for inhibiting immune response | |
US5688825A (en) | Anandamide amidase inhibitors as analgesic agents | |
EP1020179B9 (en) | Peptide derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof, method for producing the same, use of said derivatives and pharmaceutical composition | |
US5679688A (en) | Quinaldoyl-amine derivatives of oxo-and hydroxy-substituted hydrocarbons | |
US20090306201A1 (en) | Selective inhibitors for transferases | |
KR20240033119A (ko) | 모발 성장을 조절하기 위한 조성물 및 방법 | |
US5216023A (en) | Polyunsaturated fatty acid derivatives, pharmaceutical compositions containing the same, method for the preparation thereof, and their use as medicament | |
FR2685869A1 (fr) | Compositions therapeutiques a base d'inhibiteurs mixtes de la no synthase et de la cyclooxygenase. | |
EP2744487B1 (en) | No- and h2s- releasing compounds | |
CA3124820A1 (en) | Compositions and methods for modulating hair growth | |
KR100701876B1 (ko) | 약학적 및 화장품용 조성물의 제조에 적합한 아시아틱산및 마데카식산의 염 | |
US5530026A (en) | Certain aryl-ureido anti-cancer agents | |
US4394389A (en) | Hydroxybenzohydroxamic acids, benzamides and esters as ribonucleotide reductase inhibitors | |
WO1993010102A1 (fr) | Nouveaux composes a structure guanidique et composition pharmaceutique les contenant | |
US4448730A (en) | Hydroxybenzohydroxamic acids, benzamides and esters and related compounds as ribonucleotide reductase inhibitors | |
TW408099B (en) | Substituted kynurenines and process for their preparation | |
US20080039518A1 (en) | Maleiimide anti-tumor phosphatase inhibitors | |
JP3757236B6 (ja) | ファルネシル誘導体およびそれらを含む医薬組成物 | |
US4025649A (en) | Acetic acid derivatives having pharmacological activity and compositions containing the same | |
CN113461563B (zh) | Nqo1激活型6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸前药及其制备方法和应用 | |
WO1999000364A1 (en) | Poly-branched polycarboxamido compounds | |
JPH01165586A (ja) | 抗腫瘍プロドラッグ | |
FI66834B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva omega-dialkylalkansyrederivat |