JP3749709B2 - ヒトグリオーマ抗原及びその調製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの悪性脳腫瘍であるグリオーマに発現し、免疫反応を示すグリオーマ抗原やその遺伝子、それらグリオーマ抗原やその遺伝子の調製方法、グリオーマ検出用診断薬や、検出・診断用プローブ、グリオーマ抗原やその遺伝子に対する抗体、グリオーマ抗原を用いた免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫療法は古くから期待され、様々な試みがなされてきたが、未だ十分な抗腫瘍効果を示すには至っていない。従来、癌の免疫療法は非特異的免疫療法を中心として行われてきたが、近年、Ｔ細胞が生体内での腫瘍拒絶に重要な役割を果たすことがヒトメラノーマにおいて明らかになり、さらにＭＡＧＥ−１抗原（例えば、非特許文献１参照。）が１９９１年にベルギーのグループより報告されて以来、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：cytotoxic T lymphocyte）を誘導しうるＴ細胞認識腫瘍抗原の単離とＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープの決定に努力がそそがれている。本発明者らはメラノーマの腫瘍反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８＋Ｔ細胞認識抗原を単離し（例えば、非特許文献２〜６参照。）、この抗原を用いた特異的免疫療法により、一部のメラノーマに対して抗腫瘍効果が認められることを報告している（例えば、非特許文献７〜９参照。）。またＴ細胞が認識する抗原は、ＭＨＣ分子に結合したペプチドであり、しかもペプチドの起源は細胞表面蛋白である必要がなく、核内蛋白や細胞質蛋白でも抗原として認識されることが明らかになっている（例えば、非特許文献１０参照。）。
【０００３】
１９９５年にドイツのPfreundschuhや米国のOldらのグループにより、腫瘍及びＣＴＬを必ずしも必要とせず、細胞株の樹立が困難である癌腫において適用できる、癌患者血清中のＩｇＧ抗体が認識する癌抗原タンパクを検出するＳＥＲＥＸ法(例えば、非特許文献１１参照。)が報告されている。この方法によって多くの腫瘍抗原が単離されているが、本方法を用いて単離された抗原の中にはＣＴＬを誘導するＭＡＧＥ−１やチロシナーゼなどの抗原がみられることから、細胞性免疫が認識する抗原を検出する方法としても有用であることが指摘されている。また、上記方法を用いて、メラノーマ、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等において、患者ＩｇＧ抗体が認識する癌抗原を単離した報告もなされている（例えば、非特許文献１２〜１７参照。）。これらの抗原にはＣＴ（cancer-testis）抗原（ＳＳＸ２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＣＰ−１、ＣＴ７など）、分化抗原（ｇａｌｅｃｔｉｎ−４／ＮＹ−ＣＯ−２７）、変異抗原（ｐ５３など）等の重要な抗原がある。これらの抗原の中で特にＮＹ−ＥＳＯ−１はＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープが決定されている。また、ＳＥＲＥＸ法を用いて単離された抗原の中には、ｅｌＦ−４γやＨＥＲ２／ｎｅｕのように癌に高発現する分子もあり、これら分子は癌化に関連している可能性がある。このような癌に高発現する分子は、治療に応用しうるだけではなく診断のマーカーや再発、予後を推定しうるマーカーとなる可能性がある。
【０００４】
他方、中枢神経系は免疫学的寛容の場として知られていたが、近年、活性化されたリンパ球が、血液脳関門を通過して脳内に侵入し、脳内抗原と反応することが示されている（例えば、非特許文献１８、１９参照）。また本発明者らにより、脳内の腫瘍抗原に対する特異的な免疫誘導は新しい有効な治療法となる可能性が示唆されている（例えば、非特許文献２０参照。）。現在、悪性脳腫瘍であるグリオーマの診断法として、ＭＲＩ等による画像解析と手術検体を用いた病理組織解析が中心に行われているが、近年の分子細胞生物学の進歩により、グリオーマの発生に関与する遺伝子も明らかになりつつあり、それらを解析する遺伝子診断の可能性も示唆されている（例えば、非特許文献２１参照。）。
【０００５】
【非特許文献１】
Science 254, 1643-7, 1991
【非特許文献２】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3515-3519, 1994
【非特許文献３】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6458-6462, 1994
【非特許文献４】
J. Exp. Med. 180, 347-352, 1994
【非特許文献５】
J. Immunol. 154, 3961-3968, 1995
【非特許文献６】
Immunologic Res. 16, 313-340, 1997
【非特許文献７】
Microbiology Immunology 42, 803-813, 1998
【非特許文献８】
Kawakami, Y., P.F. Robbins, RF. Wang. et al. Identification of Melanoma antigens by T lymphocytes and their use in the immunotherapy of cancer. In Principle and Practice of Oncology. Update. V. DeVita, S. Hellman, S.A.Rosenberg eds. J.B.Lippincott Co. Philadelphia, p1-20, 1996
【非特許文献９】
Nature Med. 4, 321, 1998
【非特許文献１０】
Immunity 10, 281-7, 1999
【非特許文献１１】
serological identification of reconbinant cDNA expression cloning；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813, 1995
【非特許文献１２】
Int. J. Cancer 72, 965-971, 1997
【非特許文献１３】
Cancer Res. 58, 1034-1041, 1998
【非特許文献１４】
Int. J. Cancer 29, 652-658, 1998
【非特許文献１５】
Int. J. Oncol. 14, 703-708, 1999
【非特許文献１６】
Cancer Res. 56, 4766-4772, 1996
【非特許文献１７】
Hum. Mol. Genet 6, 33-39, 1997
【非特許文献１８】
J. Immunol. 158, 2318-26, 1997
【非特許文献１９】
J. Neurosci. 18, 5804-16, 1998
【非特許文献２０】
Neuro-Oncology 1, S105, 1999
【非特許文献２１】
Glia. 15, 308-27, 1995
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在、死亡原因の第一位となっている癌においては、その発生機序、診断法、治療法が進歩したにもかかわらず、未だに多くの進行癌を治療できないのが現状である。特に悪性脳腫瘍は極めて治療が困難な疾患で、近年の脳外科手術、放射線治療の進歩にもかかわらず、現在まで有効な治療法がなかった。これを改善するためには、新しい早期診断法と治療法の開発が必要とされている。本発明の課題は、グリオーマの診断・治療に応用することができるヒトグリオーマ抗原やそれをコードする遺伝子及びその調製方法等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、グリオーマ細胞株から得られたｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによって作製したグリオーマ細胞株由来のｃＤＮＡライブラリー（６．０×１０5個のλファージｃＤＮＡクローン）を用いて、グリオーマ患者一人ひとりの血清に対して逐一スクリーニングし、グリオーマ患者血清のみに反応し、健常人血清とは反応せず、グリオーマ細胞株を含む癌細胞に選択的に発現するグリオーマ抗原が存在し、免疫系がグリオーマの発現するタンパク質を認識することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の工程（１）〜（５）を含むグリオーマ抗原の調製方法により得られるグリオーマ抗原である、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−１、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−２、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH1及び／又はかかるグリオーマ抗原に特異的に結合する抗体を含有することを特徴とするグリオーマ検出用診断薬
（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；
（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；
（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；
（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；
（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；（請求項１）や、
以下の工程（１）〜（５）を含むグリオーマ抗原遺伝子の調製方法により得られるグリオーマ抗原である配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−１、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−２、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH1をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡのアンチセンス鎖、又は前記ＤＮＡ若しくはＲＮＡの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列のアンチセンス鎖を含有することを特徴とするグリオーマ検出・診断用プローブ
（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；
（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；
（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；
（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；
（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；（請求項２）に関する。
【０００９】
また本発明は、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項３）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（請求項４）や、請求項４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項５）や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ
(ａ)配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項６）や、配列番号３、５、７又は９に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列（但し、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッションナンバーＡＡ１３１３３０として登録されている塩基配列を除く）からなるＤＮＡ（請求項７）や、請求項７記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項８）や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ
(ａ)配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項９）や、配列番号１１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列（但し、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッションナンバーＡＩ５４９３８０として登録されている塩基配列を除く）からなるＤＮＡ（請求項１０）や、請求項１０記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１１）に関する。
【００１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１２）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項１３）や、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１４）や、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項１５）や、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１６）や、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項１７）や、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項１８）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質に対する抗体（請求項１９）や、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項２０）や、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物（請求項２１）や、請求項９〜１４のいずれか記載のタンパク質と被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価することを特徴とする免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２２）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のグリオーマ抗原及び／又はグリオーマ抗原遺伝子の調製方法としては、（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；を含む調製方法を好適に例示することができるが、工程（４）で得られた陽性クローンのｃＤＮＡインサートをＰＣＲにより増幅し、配列を決定して、既存の遺伝子データベース等を利用して相同性検索をすることが好ましい。また、工程（５）においては、グリオーマ患者血清、健常人血清の他、他の脳疾患患者や他の癌患者等の血清を用いて血清スクリーニングをすることが好ましい。
【００１３】
上記調製方法により、グリオーマ患者血清とのみ反応するグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）群と、グリオーマ患者血清とグリオーマ以外の他の癌患者血清とも反応するグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）群を得ることができる。グリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）群としては、例えば、新規なＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、Ｌ１３の他、Cytochrome-C、DEK oncogene、Nuclear Antigen SP100、Sarcolemmal associated protein、KIAA1014 protein、MutL (E. coli)homolog1 (hMLH1)（GenBankアクセッション番号NM_000249）等を挙げることができ、また、グリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）群としては、ＫＵ−ＧＢ−１、Mitoticcentromere associated protein、human S5A（GenBankアクセッション番号NM_002810, U24704, U51007）やhuman S5Aのアイソフォームであるhuman pUb-R5（GenBankアクセッション番号AB033605）、Minichromosome maintenance deficient-3等を挙げることができる。なお、これらグリオーマ抗原を強力な抗原提示細胞である樹状細胞にインビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原発現樹状細胞投与により免疫誘導を行うことができる。
【００１４】
本発明のグリオーマ検出用診断薬としては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等のグリオーマ抗原を含有する試薬を用いることができ、また、２種以上の抗原を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群又はグリオーマ非特異抗原群の中から選択することが好ましい。また、本発明のグリオーマ検出用診断薬としては、前記グリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等に特異的に結合するモノクローナル抗体等の抗体を含有する試薬も使用することができ、かかる抗体についても２種以上の抗体を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群に対する抗体又はグリオーマ非特異抗原群に対する抗体の中から選択することが好ましい。本発明のグリオーマ検出用診断薬を用いたグリオーマの診断方法としては、標識化グリオーマ抗原を用いて検体から得られた血清中のＩｇＧ抗体と反応させ、抗体反応が認められるかどうかを調べる方法を例示することができる。
【００１５】
本発明のグリオーマ検出・診断用プローブとしては、上記のグリオーマ抗原遺伝子の調製方法により得られる１種若しくは２種以上のグリオーマ抗原をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖、又は前記ＤＮＡ若しくはＲＮＡの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列のアンチセンス鎖を含有する試薬であれば特に制限されるものではないが、２０ｂｐ以上からなるＤＮＡ又はＲＮＡが好ましく、また、２種以上のプローブを組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群又はグリオーマ非特異抗原群をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の中から選択することが好ましい。本発明のグリオーマ検出・診断用プローブを用いたグリオーマの検出・診断方法としては、標識化アンチセンス鎖を用いて検体から得られた本件グリオーマ抗原のｍＲＮＡを検出する方法等が挙げられる。かかる検出・診断方法に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の抗腫瘍剤としては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等のグリオーマ抗原を有効成分として含有する製剤をいることができ、また、２種以上の抗原を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群又はグリオーマ非特異抗原群の中から選択することが好ましい。また、本発明の抗腫瘍剤としては、前記グリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等に特異的に結合するモノクローナル抗体等の抗体を有効成分として含有する製剤も使用することができ、かかる抗体についても２種以上の抗体を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群に対する抗体又はグリオーマ非特異抗原群に対する抗体の中から選択することが好ましい。本発明の抗腫瘍剤を経口、静脈、皮内、皮下注射等により投与すると、インビボにおけるＴ細胞誘導活性が増大することによる抗腫瘍効果が期待できる。また、本発明の抗腫瘍剤を用いてＴ細胞をインビトロで刺激することにより活性化Ｔ細胞に誘導することができ、例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球にＩＬ−２とともに本発明の抗腫瘍剤で刺激すると腫瘍反応性活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体等の抗体を用いて、選択的にグリオーマに遺伝子を導入させる遺伝子治療や、選択的にグリオーマに抗腫瘍剤を作用させるミサイル療法等を行うこともできる。
【００１７】
本発明の対象となるタンパク質としては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるグリオーマ抗原のうち新規な抗原タンパク質やそのアイソフォームを挙げることができ、例えば、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−１や、グリオーマＫＵ−ＧＢ−２の４つのアイソフォーム、すなわち配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ａや、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ｂや、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ｃや、配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ｄや、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−５や、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質を例示することができ、ここで免疫誘導活性とは、抗体産生、細胞性免疫、免疫寛容等の免疫反応を誘導する活性をいい、かかる免疫誘導活性の中でも、末梢血の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）前駆細胞の頻度を上昇させるＴ細胞誘導活性を有するものが特に好ましい。また、本発明のペプチドとしては、上記タンパク質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチドを例示することができ、かかるペプチドは特に制限されるものではないが、抗体の認識部位や、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の認識部位を構成するペプチドを好適に例示することができる。上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチドに加えて、これらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体に対して特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドも本発明に含まれ、これらを総称して、以下「本件グリオーマ抗原」ということがある。なお、本件グリオーマ抗原の由来はヒトに限定されるものではなく、また本件グリオーマ抗原は、腫瘍検出用診断薬や、後述するように免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法に有用である。
【００１８】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるグリオーマ抗原のうち新規な抗原タンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができ、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−１をコードするＤＮＡ、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ａをコードするＤＮＡ、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ｂをコードするＤＮＡ、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ｃをコードするＤＮＡ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ｄをコードするＤＮＡ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−５をコードするＤＮＡ、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１、３、５、７、９又は１１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。
【００１９】
また、配列番号１、３、５、７、９又は１１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列をプローブとして、各種グリオーマ細胞由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等のグリオーマ抗原と同効な目的とする免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲内である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
また、上記本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、本件グリオーマ抗原等は、以下に具体的に説明するように、本件グリオーマ抗原とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド又は融合タンパク質や、本件グリオーマ抗原に対する抗体、本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、本件グリオーマ抗原を過剰発現する非ヒト動物を作製する際に使用することができる。
【００２１】
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件グリオーマ抗原とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどの従来知られているマーカータンパク質を具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができるがこれらに限定されるものではない。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等の精製や、Ｔ細胞誘導活性を有するタンパク質の検出や、グリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等に対する抗体の定量、グリオーマ等の癌の診断用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２２】
本発明の本件グリオーマ抗原に対する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本件グリオーマ抗原を用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点で好ましく、特にＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等のエピトープあるいは該エピトープとＨＬＡとの複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体がより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、グリオーマ等の癌の診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、グリオーマ等の悪性腫瘍の発症機構を明らかにする上で有用である。
【００２３】
また本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件グリオーマ抗原若しくはエピトープを含むその断片、又は該本件グリオーマ抗原、特にエピトープとＨＬＡとの複合体を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２４】
上記本件グリオーマ抗原に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その本件グリオーマ抗原を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件グリオーマ抗原やその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、グリオーマ等の診断や治療に使用できる可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件グリオーマ抗原に包含される。
【００２５】
また、本発明の本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞は、宿主細胞に本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子を導入することにより作製することができ、かかる本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の宿主細胞への導入方法としては、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等による方法を具体的に挙げることができる。
【００２６】
そして、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。また、ＨＬＡ発現能を有する宿主細胞や、元来ＨＬＡ発現能を有さない宿主細胞にＨＬＡｃＤＮＡをトランスフェクションした宿主細胞に本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子を上記の方法で導入することにより、本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなるＨＬＡ発現能を有する宿主細胞を作製することができる。
【００２７】
また、発現系としては、上記本件グリオーマ抗原を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２８】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件グリオーマ抗原は、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができ、また、かかる本件グリオーマ抗原を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件グリオーマ抗原に対する抗体を結合させたカラムや、上記本件グリオーマ抗原に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件グリオーマ抗原を得ることができる。
【００２９】
本発明の本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件グリオーマ抗原を発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件グリオーマ抗原を過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件グリオーマ抗原を大量に産生する非ヒト動物をいう。そして、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件グリオーマ抗原欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、本件グリオーマ抗原のノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００３１】
例えば、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００３２】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスを作製することができる。また、本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００３３】
また、本発明のグリオーマ抗原のトランスジェニックマウスは、本件グリオーマ抗原をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３４】
本発明の免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本件グリオーマ抗原と被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、被検物質と本件グリオーマ抗原とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、被検物質と本件グリオーマ抗原を発現している細胞膜又は細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、ＨＬＡを発現するベクターと被検ポリペプチドを発現するベクターを共にトランスフェクトした本件グリオーマ抗原発現宿主細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、被検ポリペプチドを発現するベクターをトランスフェクトしたＨＬＡ発現能を有する本件グリオーマ抗原発現宿主細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、前記ノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＴ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法等を挙げることができる。上記細胞膜又は細胞としては、前記本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物又は野生型非ヒト動物などから得られる初代培養した細胞などの細胞や、前記本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、これら細胞の細胞膜などを具体的に例示することができ、かかる細胞膜又は細胞と被検物質との接触方法としては、被検物質の存在下に本件グリオーマ抗原を発現している細胞膜又は細胞をインビトロで培養し、次いでＴ細胞と接触させる方法等を挙げることができる。Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法としては、Ｔ細胞から培地中に放出されたＩＦＮγ量を指標として評価する方法を具体的に例示することができる。また上記スクリーニング方法により得られる免疫誘導活性促進物質は、免疫誘導活性の促進を必要としている患者の治療等に用いることができ、また、免疫誘導活性抑制物質は、免疫誘導活性の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［細胞株と組織］
ヒトグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１）、ヒト悪性黒色腫細胞株（ＳＫｍｅｌ２３、１３６２ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ、ＥＢＣ１）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、乳癌細胞株（ＭＤＡ２３１）、膵癌細胞株（ＰＫ１）、腎細胞癌細胞株（ＲＣＣ６）、膀胱癌細胞株（ＢＣ４７）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）、白血病細胞株（ＨＬ６０、Ｍｏｌｔ４）を、それぞれペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩで培養した。膵癌細胞株（ＫＵ７）を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｌ−グルタミン（１％）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＥＧＦ（６μｇ／ｌ）、インシュリン（１５０Ｕ／ｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（１０ｍｇ／ｌ）を添加した１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。ヒトグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１６、ＧＢ１７、ＧＢ４）は、手術時に摘出された病変の一部を用いた。正常組織（脳、心臓、肺、胃、大腸、肝臓、脾臓、小腸、腎臓、精巣、胎盤、筋肉、胎児脳）のＲＮＡは全てクローンテック社製より購入した。
【００３６】
［ｃＤＮＡライブラリーの作製］
上記グリオーマ細胞株Ｕ８７−ＭＧ及びＴ９８Ｇから塩化セシウム超遠心法により全ＲＮＡを単離し、それぞれ１ｍｇずつ混合した後、オリゴテックス(ｄＴ)３０（TAKARA社製）を用いたポリ(A)セレクションを行いｍＲＮＡを精製した。５μｇの精製ｍＲＮＡからZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用いて逆転写によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλＺＡＰ発現ファージミドベクターに組み込み、λファージｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００３７】
［血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング］
上記構築したｃＤＮＡライブラリーを１５０ｍｍＮＺＹアガロースプレートに１×１０4クローンで播き、４２℃で４時間培養した後、３７℃で４時間培養して大腸菌（XL1-Blue）上で１０ｍＭのＩＰＴＧにより発現誘導されたリコンビナント蛋白を、ニトロセルロースフィルター（Hybond-c, Amersham, Buckinghamshire, England）に転写し、０．０５％のＴＷＩＮ２０を含むＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．５）でフィルターを洗浄することにより吸着したバクテリア、ファージを除去した後、５％のスキムミルクを含むＴＢＳにて非特異反応を抑制した。このフィルターを１００倍又は４００倍に希釈した患者血清と３７℃で４時間反応させた。なお、患者血清としては、表１に示す１２人のグリオーマ患者から採取したものや、表２に示す８人のグリオーマ患者からそれぞれ採取し、グリオーマ患者血清４人分を混合したもの［（Ｇ２０，Ｇ２１，Ｇ２２，Ｇ２７患者血清を混合）、（Ｇ１８，Ｇ２３，Ｇ２４，Ｇ２８患者血清を混合）］を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に５％のスキムミルクを含むＴＢＳ溶液で５倍に希釈して、さらにバクテリアに反応する抗体をあらかじめ除去するため、溶菌した大腸菌のライセートと１：２の割合で混合して４℃で８時間反応させた後、その上清を最終的に１００倍（表１に示す患者血清を用いた場合）又は４００倍（表２に示す４人分の患者血清を用いた場合）に希釈したものを用いた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
かかる処理血清とニトロセルロースフィルターにブロットしたリコンビナント蛋白とを３７℃で４時間反応させ、血清中の抗体が反応したリコンビナント蛋白を、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ICN Parmaceuticals社製）を用いて検出した。次いで、発色反応陽性部位に一致する陽性クローンを前記１５０ｍｍＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％のgelatin；ｐＨ７．５）に溶解させた。さらにこのスクリーニングを数回繰り返し行い、陽性クローンの抗体反応性を確認した。患者血清１人あたり５×１０5個のファージクローンからスクリーニングして、表１に示された患者血清から合計９２個の陽性クローンを、表２に示された患者血清から合計２１個の陽性クローンを単離した。患者別の単離陽性クローン数を表１及び表２に示す。表１に示された患者血清から得られた９２個の陽性クローンのうち、１８個は膠芽腫（Glioblastoma）患者Ｋから、１８個は膠芽腫（Glioblastoma）患者Ｒから、１５個は退形成性稀突起星細胞腫（Anaplastic oligoastrocytoma）患者Ｌのものであり、特定の患者血清に陽性クローンが集中する傾向が認められたが、この傾向は年齢や悪性度とは明らかな関係がないことがわかった。
【００４１】
［単離抗原遺伝子の相同性検索］
上記得られた表１に示された患者血清を用いることにより得られた９２個のファージ、及び表２に示された患者血清を用いることにより得られた２１個のファージに組み込まれたｃＤＮＡインサートをＰＣＲ法により増幅し、各塩基配列を決定した。反応酵素にはＥｘＴａｑ（TAKARA社製）を用い、センスプライマーにＴ３（５′−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３′；配列番号１３）、アンチセンスプライマーにＴ７（５′−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３′；配列番号１４）を用いた。なお、反応条件は、サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）を用いて最初のみ９４℃で５分間変性させ、その後９４℃で１分間熱変性させ、５５℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間伸張反応させるというサイクルを３５回繰り返し行い、最後に７２℃で７分間伸張させた。得られたＰＣＲ産物を、Big Dye DNA Sequencing Kit（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０オートシークエンサーとを用いてＤＮＡシークエンスを行い、５′側の塩基配列を３００〜５００ｂｐ程決定した。この決定したＤＮＡを、米国国立生体工学情報センターの遺伝子データーベース又はＥＳＴデーターベースにおいて登録されている遺伝子情報との間で比較し、既知の遺伝子との相同性を検索した。この結果、上記表１に示された患者血清を用いることにより得られた９２個の陽性クローンは、３８種類の既知タンパク質をコードするｃＤＮＡと１４種類の新規タンパク質をコードするｃＤＮＡの５２種類の抗原ｃＤＮＡであることがわかった。患者別の５２種類の抗原ｃＤＮＡ数を表１に示す。また、上記表２に示された患者血清を用いることにより得られた２１個の陽性クローンは、７種類の既知タンパク質をコードするｃＤＮＡと１種類の新規タンパク質をコードするｃＤＮＡの８種類の抗原ｃＤＮＡであることがわかった。患者別の８種類の抗原ｃＤＮＡ数を表２に示す。
【００４２】
［血清スクリーニング］
表１の患者血清を用いることにより単離された５２種類の抗原を発現する各クローンを用いて、グリオーマの血清診断への応用を検討するために、グリオーマ患者１７人（膠芽腫９人、退形成性星細胞腫５人、退形成性稀突起星細胞腫２人、びまん性星細胞腫１人）、一部の抗原に関しては、グリオーマ患者２９人（膠芽腫１２人、退形成星細胞腫７人、退形成稀突起星細胞腫４人、星細胞腫４人、稀突起星細胞腫２人）、他の脳疾患患者８人（悪性リンパ腫２人、脳膿瘍１人、髄膜腫３人、転移性グリオーマ１人、くも膜下出血１人）、他の癌患者１６人（悪性黒色腫４人、膵癌４人、腎細胞癌４人、食道癌４人）、及び健常人１６人（一部の抗原については２６人あるいは５４人）の１００倍に希釈した各血清を用いてスクリーニングを行い、これら血清中に各単離グリオーマ抗原に対するＩｇＧ抗体が検出しうるかどうかについて調べた。この結果、グリオーマ患者血清とのみ反応する７種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）と、グリオーマ患者血清とグリオーマ以外の他の癌患者血清とも反応するが、その他の健常人血清等とは反応しない４種のグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）を得ることができた。７種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）は、表３に示されるように、新規なＫＵ−ＧＢ−２、Ｌ１３の他、Cytochrome-C、DEK oncogene、Nuclear Antigen SP100、Sarcolemmal associated protein、KIAA1014 proteinであった。また４種のグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）は、表４に示されるように、新規なＫＵ−ＧＢ−１の他、Mitotic centromere associated protein、human S5A、Minichromosome maintenance deficient-3であり、これらグリオーマ非特異抗原が反応するグリオーマ以外の他の癌患者血清は、ＫＵ−ＧＢ−１ではメラノーマと腎細胞癌、Mitotic centromere associated proteinでは膵癌、human S5aでは食道癌、Minichromosome maintenance deficient-3ではメラノーマの癌患者血清であった。
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
上記の７種のグリオーマ特異抗原と４種のグリオーマ非特異抗原は、他の脳疾患患者や健常人の血清と抗体反応を示さないことから、グリオーマあるいはグリオーマを含む癌の血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。例えば上記ＩｇＧ抗体の検出結果から、human S5aに対する抗体反応がグリオーマ患者及び食道癌患者血清において認められ、他の脳疾患患者及び健常人血清に対する反応が見られないため、human S5aはグリオーマを含む癌の血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。なお、このhuman S5aはＧｅｎＢａｎｋに３種類の名前［Human proteasome 26S subunit, non-ATPase 4（PSMD4）：アクセッション番号NM_002810、Antisecretory factory 1：アクセッション番号U24704、26S protease subunit S5a：アクセッション番号U51007］で登録されている。このhuman S5aには神経特異的な発現を示すアイソフォームが１種類存在することが報告（EMBO J.19,4144-4153,2000）されており、このアイソフォームhuman pUb-R5（アクセッション番号AB033605）は、human S5aと同様にグリオーマ抗原である可能性が高い。
【００４６】
表２の患者血清を用いることにより単離された８種類の抗原を発現する各クローンを用いて、グリオーマの血清診断への応用を検討するために、グリオーマ患者２９人（膠芽腫１２人、退形成星細胞腫７人、退形成稀突起星細胞腫４人、星細胞腫４人、稀突起星細胞腫２人）、他の脳疾患患者１４人（悪性リンパ腫２人、脳膿瘍１人、くも膜下出血１人、パーキンソン病２人、髄膜腫４人、神経細胞腫１人、頭蓋咽頭腫１人、転移性脳腫瘍２人）、及び健常人３７人の１００倍に希釈した各血清を用いてスクリーニングを行い、上記と同様にこれら血清中に各単離グリオーマ抗原に対するＩｇＧ抗体が検出しうるかどうかについて調べた。この結果、グリオーマ患者血清とのみ反応を示すか、又は多くのグリオーマ患者血清と反応を示し健常人の血清とはほとんど抗体反応を示さない２種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）を得ることができた。２種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）は、表５に示されるように、新規なＫＵ−ＧＢ−５及びMutL (E. coli)homolog1 (hMLH1)（GenBankアクセッション番号NM_000249）であることがわかった。上記２種のグリオーマ特異抗原は、グリオーマ患者血清と特異的に、あるいは多くのグリオーマ患者血清と反応することから、グリオーマの血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。
【００４７】
【表５】
【００４８】
［抗原の塩基配列とアミノ酸配列の決定］
単離されたクローンの塩基配列を、自動ＤＮＡシークエンサー（ALF Express；ファーマシアバイオテク社製）を用いて調べた結果、ＫＵ−ＧＢ−１は１１２０個のアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を含む全長３７０９ｂｐの塩基配列（配列番号１）から構成されていることがわかった。これに対してＫＵ−ＧＢ−２には４種類のアイソフォーム（isoform）が存在することがわかった。すなわち、１１５４個のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする遺伝子を含む全長３５３３ｂｐの塩基配列（配列番号３）から構成されているＫＵ−ＧＢ−２ａの他、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、及びＫＵ−ＧＢ−２ｄの３種類のアイソフォームが見つかった。ＫＵ−ＧＢ−２ｂの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５と６に、ＫＵ−ＧＢ−２ｃの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７と８に、ＫＵ−ＧＢ−２ｄの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９と１０にそれぞれ示す。さらに、ＫＵ−ＧＢ−５は８９１個のアミノ酸配列（配列番号１２）をコードする遺伝子を含む全長３８４７ｂｐの塩基配列（配列番号１１）から構成されていることがわかった。
【００４９】
［グリオーマ抗原のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット法］
正常組織（脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、小腸、肺、精巣、胎盤、胃）由来のＲＮＡ、ヒトグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｕ８７−ＭＧ、Ｔ９８Ｇ）及びヒトグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１７）由来のＲＮＡ、並びに、ヒト悪性黒色腫細胞株（１３６２ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、乳癌細胞株（ＭＤＡ２３１）、膵癌細胞株（ＰＫ１）、腎細胞癌細胞株（ＲＣＣ６）、膀胱癌細胞株（ＢＣ４７）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）及び白血病細胞株（ＨＬ６０、Ｍｏｌｔ４）の各細胞株由来のＲＮＡを用いて、ＫＵ−ＧＢ−１に対するノーザンブロットを行った。ＲＮＡ（各１１μｇ）を、ホルムアミド及びホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブランフィルター（Hybond XL, Amersham）に移した。
【００５０】
次に長さ３７０９ｂｐのＫＵ−ＧＢ−１全長を含む遺伝子断片を、High Prime DNA Labeling Kit（Boehringer）を用いて32Ｐでラベリングしたプローブとし、Quik Hyb（Stratagene）をハイブリダイゼーションバッファーとして用いてナイロンメンブランフィルターを浸し、６８℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上記プローブを加えたQuik Hyb中で６８℃で２時間ハイブリダイゼーションした。次いで、このハイブリダイゼーションしたナイロンメンブランフィルターを洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）で室温で１５分間２回洗浄し、洗浄液II（０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）で６８℃で１５分間２回洗浄した。洗浄したナイロンメンブランフィルターを、Molecular Imager（BIORAD）を用いて放射性シグナルの検出を行った。結果を図１に示す。
【００５１】
図１に示されているように、ＫＵ−ＧＢ−１の正常組織における遺伝子発現は精巣以外に認められず、グリオーマを含む癌細胞株においてのみ高い発現が認められた。これらのことから、ＫＵ−ＧＢ−１遺伝子はグリオーマを含む癌の遺伝子診断薬として有用であると考えられる。また前記のように、ＫＵ−ＧＢ−１抗原に対する抗体反応がグリオーマ及び他の癌（悪性黒色腫、腎癌）の患者血清において認められ、他の脳疾患患者や健常人血清に対する抗体反応が認められなかったことから、ＫＵ−ＧＢ−１抗原はグリオーマを含む癌の診断薬や治療薬として有用であると考えられる。なお、精巣における発現については、免疫系から隔離された組織であることから、ＫＵ−ＧＢ−１抗原を実際に免疫療法等に用いる際に精巣の障害が問題となる可能性は殆どないと考えられる。
【００５２】
［グリオーマ抗原の発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法］
次にグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−２遺伝子又はＫＵ−ＧＢ−５遺伝子の各正常組織、グリオーマ細胞株及び組織並びに他の腫瘍細胞株における発現特異性をＲＴ−ＰＣＲ法により調べてみた。脳、心臓、肺、胃、肝臓、脾臓、小腸、腎臓、胎盤、精巣、大腸、筋肉、胎児脳の各正常組織由来のＲＮＡ（全てクローンテック社製より購入）、４種のグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｕ２５１、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ）及び４種のグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１６、ＧＢ１７、ＧＢ４）由来のＲＮＡ、並びに、悪性黒色腫細胞株（ＳＫｍｅｌ２３）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＥＢＣ１）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、膵癌細胞株（ＫＵ７）、乳癌細胞株（ＭＤＡ２３１）及び白血病細胞株（Ｍｏｌｔ４）の各細胞株由来のＲＮＡを、各５μｇづつ使用し、トリ骨髄芽球ウイルス逆転写酵素（TAKARA社製）と、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて、全反応量２００μｌ、４２℃でＲＴ−ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡのパネルを作製した。
【００５３】
ＫＵ−ＧＢ−２検出用には、センスプライマーとして（５′−ＡＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡ−３′；配列番号１５）を、アンチセンスプライマーとして（５′−ＡＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴ−３′；配列番号１６）を、ＫＵ−ＧＢ−５検出用には、センスプライマーとして（５′−ＡＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＣＣ−３′；配列番号１７）を、アンチセンスプライマーとして（５′−ＡＧＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡ−３′；配列番号１８）を、コントロールとしてのβアクチン検出用（５５１ｂｐ）には、センスプライマーとして（５′−ＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡ−３′；配列番号１９）とアンチセンスプライマー（５′−ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧ−３′；配列番号２０）を用いた。これらのＰＣＲプライマーを用い、反応酵素にＥＸＴａｑ（TAKARA社製）を使用して、サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）を用いて、９４℃で１分間熱変性させ、アニーリングの後に７２℃で１分間（ＫＵ−ＧＢ−５は３０秒間）伸張反応させるというサイクルで、３０サイクル繰り返し行った。アニーリング温度はプライマーのＴｍ値［ＫＵ−ＧＢ−２は６２℃、ＫＵ−ＧＢ−５は６０℃、コントロールとしてのβアクチンは６８℃］に設定し１分間（ＫＵ−ＧＢ−５は３０秒間）行なった。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（２．０％）にかけ、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、紫外線照射によりバンドを検出した。ＫＵ−ＧＢ−２のＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に、ＫＵ−ＧＢ−５のＲＴ−ＰＣＲの結果を図３にそれぞれ示す。図２に示すように、ＫＵ−ＧＢ−２は、Ｕ８７−ＭＧ、ＧＩ−１（ヒトグリオーマ細胞株）、ＧＢ１３、ＧＢ１７（グリオーマ組織）、Ｓｋｍｅｌ２３（悪性黒色腫細胞株）及び精巣において強い発現が認められ、Ｕ２５１（ヒトグリオーマ細胞株）、ＬＵ９９（肺癌細胞株）、脳、小腸及び胃においては弱い発現が認められた。また、図２においては２本のバンドが認められるが、前記のようにＫＵ−ＧＢ−２には４種類のアイソフォームが存在し、大きいサイズのバンド（レーン上；６２８ｂｐ）がＫＵ−ＧＢ−２ｂ及びＫＵ−ＧＢ−２ｄの発現を示し、小さいサイズのバンド（レーン下；４４７ｂｐ）がＫＵ−ＧＢ−２ａ及びＫＵ−ＧＢ−２ｃの発現を示している。また、図３から、ＫＵ−ＧＢ−５は、ＧＩ−１、Ｕ２５１（ヒトグリオーマ細胞株）、ＧＢ１３、ＧＢ１７（グリオーマ組織）、精巣において強い発現が見られ、Ｕ８７ＭＧ（ヒトグリオーマ細胞株）、ＧＢ１６（グリオーマ組織）、脳、肺、脾臓、胎児脳においては弱い発現が認められた。
【００５４】
図２及び図３に示されているように、ＫＵ−ＧＢ−２及びＫＵ−ＧＢ−５は、ＫＵ−ＧＢ−１の場合と同様に、精巣以外の正常組織における高い遺伝子発現は認められず、グリオーマやＳｋｍｅｌ２３（悪性黒色腫細胞株）においてのみ高い遺伝子発現が認められた。また上記のようにＫＵ−ＧＢ−２には４種類のアイソフォームが存在するが、これら４種類のアイソフォームについても個別にＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、特にＫＵ−ＧＢ−２ａ及びＫＵ−ＧＢ−２ｂは神経系に特異的な発現パターンを示すことがわかった。これらのことから、ＫＵ−ＧＢ−２に属する個々の遺伝子もグリオーマを含む癌の遺伝子診断薬として有用であると考えられる。さらに前記のように、ＫＵ−ＧＢ−２抗原に対する抗体反応がグリオーマ患者血清において特異的に認められ、他の癌、他の脳疾患患者及び健常人血清に対する抗体反応が認められなかったことから、ＫＵ−ＧＢ−２抗原はグリオーマの診断薬や治療薬として有用であると考えられる。また、ＫＵ−ＧＢ−５抗原は、グリオーマ患者血清と特異的に反応することから、グリオーマの血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。なお、精巣における発現については、免疫系から隔離された組織であることから、ＫＵ−ＧＢ−２抗原やＫＵ−ＧＢ−５抗原を実際に免疫療法等に用いる際に精巣の障害が問題となる可能性は殆どないと考えられる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のグリオーマ抗原及び／又はグリオーマ抗原遺伝子の調製方法により得られるグリオーマ抗原やグリオーマ抗原遺伝子ＤＮＡは、グリオーマ等の癌に対する治療や診断に有用であり、またグリオーマ発症に関する基礎的知見を得る上でも有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のノーザンブロット法によるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１の発現解析の結果を示す図である。
【図２】本発明のＲＴ−ＰＣＲによるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−２の発現解析の結果を示す図である。
【図３】本発明のＲＴ−ＰＣＲによるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−５の発現解析の結果を示す図である。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの悪性脳腫瘍であるグリオーマに発現し、免疫反応を示すグリオーマ抗原やその遺伝子、それらグリオーマ抗原やその遺伝子の調製方法、グリオーマ検出用診断薬や、検出・診断用プローブ、グリオーマ抗原やその遺伝子に対する抗体、グリオーマ抗原を用いた免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫療法は古くから期待され、様々な試みがなされてきたが、未だ十分な抗腫瘍効果を示すには至っていない。従来、癌の免疫療法は非特異的免疫療法を中心として行われてきたが、近年、Ｔ細胞が生体内での腫瘍拒絶に重要な役割を果たすことがヒトメラノーマにおいて明らかになり、さらにＭＡＧＥ−１抗原（例えば、非特許文献１参照。）が１９９１年にベルギーのグループより報告されて以来、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：cytotoxic T lymphocyte）を誘導しうるＴ細胞認識腫瘍抗原の単離とＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープの決定に努力がそそがれている。本発明者らはメラノーマの腫瘍反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８＋Ｔ細胞認識抗原を単離し（例えば、非特許文献２〜６参照。）、この抗原を用いた特異的免疫療法により、一部のメラノーマに対して抗腫瘍効果が認められることを報告している（例えば、非特許文献７〜９参照。）。またＴ細胞が認識する抗原は、ＭＨＣ分子に結合したペプチドであり、しかもペプチドの起源は細胞表面蛋白である必要がなく、核内蛋白や細胞質蛋白でも抗原として認識されることが明らかになっている（例えば、非特許文献１０参照。）。
【０００３】
１９９５年にドイツのPfreundschuhや米国のOldらのグループにより、腫瘍及びＣＴＬを必ずしも必要とせず、細胞株の樹立が困難である癌腫において適用できる、癌患者血清中のＩｇＧ抗体が認識する癌抗原タンパクを検出するＳＥＲＥＸ法(例えば、非特許文献１１参照。)が報告されている。この方法によって多くの腫瘍抗原が単離されているが、本方法を用いて単離された抗原の中にはＣＴＬを誘導するＭＡＧＥ−１やチロシナーゼなどの抗原がみられることから、細胞性免疫が認識する抗原を検出する方法としても有用であることが指摘されている。また、上記方法を用いて、メラノーマ、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等において、患者ＩｇＧ抗体が認識する癌抗原を単離した報告もなされている（例えば、非特許文献１２〜１７参照。）。これらの抗原にはＣＴ（cancer-testis）抗原（ＳＳＸ２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＣＰ−１、ＣＴ７など）、分化抗原（ｇａｌｅｃｔｉｎ−４／ＮＹ−ＣＯ−２７）、変異抗原（ｐ５３など）等の重要な抗原がある。これらの抗原の中で特にＮＹ−ＥＳＯ−１はＨＬＡ−Ａ２拘束性のエピトープが決定されている。また、ＳＥＲＥＸ法を用いて単離された抗原の中には、ｅｌＦ−４γやＨＥＲ２／ｎｅｕのように癌に高発現する分子もあり、これら分子は癌化に関連している可能性がある。このような癌に高発現する分子は、治療に応用しうるだけではなく診断のマーカーや再発、予後を推定しうるマーカーとなる可能性がある。
【０００４】
他方、中枢神経系は免疫学的寛容の場として知られていたが、近年、活性化されたリンパ球が、血液脳関門を通過して脳内に侵入し、脳内抗原と反応することが示されている（例えば、非特許文献１８、１９参照）。また本発明者らにより、脳内の腫瘍抗原に対する特異的な免疫誘導は新しい有効な治療法となる可能性が示唆されている（例えば、非特許文献２０参照。）。現在、悪性脳腫瘍であるグリオーマの診断法として、ＭＲＩ等による画像解析と手術検体を用いた病理組織解析が中心に行われているが、近年の分子細胞生物学の進歩により、グリオーマの発生に関与する遺伝子も明らかになりつつあり、それらを解析する遺伝子診断の可能性も示唆されている（例えば、非特許文献２１参照。）。
【０００５】
【非特許文献１】
Science 254, 1643-7, 1991
【非特許文献２】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3515-3519, 1994
【非特許文献３】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6458-6462, 1994
【非特許文献４】
J. Exp. Med. 180, 347-352, 1994
【非特許文献５】
J. Immunol. 154, 3961-3968, 1995
【非特許文献６】
Immunologic Res. 16, 313-340, 1997
【非特許文献７】
Microbiology Immunology 42, 803-813, 1998
【非特許文献８】
Kawakami, Y., P.F. Robbins, RF. Wang. et al. Identification of Melanoma antigens by T lymphocytes and their use in the immunotherapy of cancer. In Principle and Practice of Oncology. Update. V. DeVita, S. Hellman, S.A.Rosenberg eds. J.B.Lippincott Co. Philadelphia, p1-20, 1996
【非特許文献９】
Nature Med. 4, 321, 1998
【非特許文献１０】
Immunity 10, 281-7, 1999
【非特許文献１１】
serological identification of reconbinant cDNA expression cloning；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813, 1995
【非特許文献１２】
Int. J. Cancer 72, 965-971, 1997
【非特許文献１３】
Cancer Res. 58, 1034-1041, 1998
【非特許文献１４】
Int. J. Cancer 29, 652-658, 1998
【非特許文献１５】
Int. J. Oncol. 14, 703-708, 1999
【非特許文献１６】
Cancer Res. 56, 4766-4772, 1996
【非特許文献１７】
Hum. Mol. Genet 6, 33-39, 1997
【非特許文献１８】
J. Immunol. 158, 2318-26, 1997
【非特許文献１９】
J. Neurosci. 18, 5804-16, 1998
【非特許文献２０】
Neuro-Oncology 1, S105, 1999
【非特許文献２１】
Glia. 15, 308-27, 1995
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在、死亡原因の第一位となっている癌においては、その発生機序、診断法、治療法が進歩したにもかかわらず、未だに多くの進行癌を治療できないのが現状である。特に悪性脳腫瘍は極めて治療が困難な疾患で、近年の脳外科手術、放射線治療の進歩にもかかわらず、現在まで有効な治療法がなかった。これを改善するためには、新しい早期診断法と治療法の開発が必要とされている。本発明の課題は、グリオーマの診断・治療に応用することができるヒトグリオーマ抗原やそれをコードする遺伝子及びその調製方法等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、グリオーマ細胞株から得られたｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによって作製したグリオーマ細胞株由来のｃＤＮＡライブラリー（６．０×１０5個のλファージｃＤＮＡクローン）を用いて、グリオーマ患者一人ひとりの血清に対して逐一スクリーニングし、グリオーマ患者血清のみに反応し、健常人血清とは反応せず、グリオーマ細胞株を含む癌細胞に選択的に発現するグリオーマ抗原が存在し、免疫系がグリオーマの発現するタンパク質を認識することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の工程（１）〜（５）を含むグリオーマ抗原の調製方法により得られるグリオーマ抗原である、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−１、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−２、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH1及び／又はかかるグリオーマ抗原に特異的に結合する抗体を含有することを特徴とするグリオーマ検出用診断薬
（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；
（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；
（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；
（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；
（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；（請求項１）や、
以下の工程（１）〜（５）を含むグリオーマ抗原遺伝子の調製方法により得られるグリオーマ抗原である配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−１、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−２、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH1をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡのアンチセンス鎖、又は前記ＤＮＡ若しくはＲＮＡの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列のアンチセンス鎖を含有することを特徴とするグリオーマ検出・診断用プローブ
（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；
（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；
（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；
（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；
（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；（請求項２）に関する。
【０００９】
また本発明は、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項３）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（請求項４）や、請求項４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項５）や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ
(ａ)配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項６）や、配列番号３、５、７又は９に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列（但し、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッションナンバーＡＡ１３１３３０として登録されている塩基配列を除く）からなるＤＮＡ（請求項７）や、請求項７記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項８）や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ
(ａ)配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項９）や、配列番号１１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列（但し、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッションナンバーＡＩ５４９３８０として登録されている塩基配列を除く）からなるＤＮＡ（請求項１０）や、請求項１０記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１１）に関する。
【００１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１２）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項１３）や、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１４）や、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項１５）や、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１６）や、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質（請求項１７）や、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項１８）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質に対する抗体（請求項１９）や、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項２０）や、請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物（請求項２１）や、請求項９〜１４のいずれか記載のタンパク質と被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価することを特徴とする免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２２）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のグリオーマ抗原及び／又はグリオーマ抗原遺伝子の調製方法としては、（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程；を含む調製方法を好適に例示することができるが、工程（４）で得られた陽性クローンのｃＤＮＡインサートをＰＣＲにより増幅し、配列を決定して、既存の遺伝子データベース等を利用して相同性検索をすることが好ましい。また、工程（５）においては、グリオーマ患者血清、健常人血清の他、他の脳疾患患者や他の癌患者等の血清を用いて血清スクリーニングをすることが好ましい。
【００１３】
上記調製方法により、グリオーマ患者血清とのみ反応するグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）群と、グリオーマ患者血清とグリオーマ以外の他の癌患者血清とも反応するグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）群を得ることができる。グリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）群としては、例えば、新規なＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、Ｌ１３の他、Cytochrome-C、DEK oncogene、Nuclear Antigen SP100、Sarcolemmal associated protein、KIAA1014 protein、MutL (E. coli)homolog1 (hMLH1)（GenBankアクセッション番号NM_000249）等を挙げることができ、また、グリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）群としては、ＫＵ−ＧＢ−１、Mitoticcentromere associated protein、human S5A（GenBankアクセッション番号NM_002810, U24704, U51007）やhuman S5Aのアイソフォームであるhuman pUb-R5（GenBankアクセッション番号AB033605）、Minichromosome maintenance deficient-3等を挙げることができる。なお、これらグリオーマ抗原を強力な抗原提示細胞である樹状細胞にインビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原発現樹状細胞投与により免疫誘導を行うことができる。
【００１４】
本発明のグリオーマ検出用診断薬としては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等のグリオーマ抗原を含有する試薬を用いることができ、また、２種以上の抗原を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群又はグリオーマ非特異抗原群の中から選択することが好ましい。また、本発明のグリオーマ検出用診断薬としては、前記グリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等に特異的に結合するモノクローナル抗体等の抗体を含有する試薬も使用することができ、かかる抗体についても２種以上の抗体を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群に対する抗体又はグリオーマ非特異抗原群に対する抗体の中から選択することが好ましい。本発明のグリオーマ検出用診断薬を用いたグリオーマの診断方法としては、標識化グリオーマ抗原を用いて検体から得られた血清中のＩｇＧ抗体と反応させ、抗体反応が認められるかどうかを調べる方法を例示することができる。
【００１５】
本発明のグリオーマ検出・診断用プローブとしては、上記のグリオーマ抗原遺伝子の調製方法により得られる１種若しくは２種以上のグリオーマ抗原をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖、又は前記ＤＮＡ若しくはＲＮＡの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列のアンチセンス鎖を含有する試薬であれば特に制限されるものではないが、２０ｂｐ以上からなるＤＮＡ又はＲＮＡが好ましく、また、２種以上のプローブを組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群又はグリオーマ非特異抗原群をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の中から選択することが好ましい。本発明のグリオーマ検出・診断用プローブを用いたグリオーマの検出・診断方法としては、標識化アンチセンス鎖を用いて検体から得られた本件グリオーマ抗原のｍＲＮＡを検出する方法等が挙げられる。かかる検出・診断方法に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の抗腫瘍剤としては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等のグリオーマ抗原を有効成分として含有する製剤をいることができ、また、２種以上の抗原を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群又はグリオーマ非特異抗原群の中から選択することが好ましい。また、本発明の抗腫瘍剤としては、前記グリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２、ＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH等に特異的に結合するモノクローナル抗体等の抗体を有効成分として含有する製剤も使用することができ、かかる抗体についても２種以上の抗体を組み合わせて用いる場合には、前記グリオーマ特異抗原群に対する抗体又はグリオーマ非特異抗原群に対する抗体の中から選択することが好ましい。本発明の抗腫瘍剤を経口、静脈、皮内、皮下注射等により投与すると、インビボにおけるＴ細胞誘導活性が増大することによる抗腫瘍効果が期待できる。また、本発明の抗腫瘍剤を用いてＴ細胞をインビトロで刺激することにより活性化Ｔ細胞に誘導することができ、例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球にＩＬ−２とともに本発明の抗腫瘍剤で刺激すると腫瘍反応性活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体等の抗体を用いて、選択的にグリオーマに遺伝子を導入させる遺伝子治療や、選択的にグリオーマに抗腫瘍剤を作用させるミサイル療法等を行うこともできる。
【００１７】
本発明の対象となるタンパク質としては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるグリオーマ抗原のうち新規な抗原タンパク質やそのアイソフォームを挙げることができ、例えば、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−１や、グリオーマＫＵ−ＧＢ−２の４つのアイソフォーム、すなわち配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ａや、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ｂや、配列表の配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ｃや、配列表の配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−２ｄや、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるグリオーマＫＵ−ＧＢ−５や、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質を例示することができ、ここで免疫誘導活性とは、抗体産生、細胞性免疫、免疫寛容等の免疫反応を誘導する活性をいい、かかる免疫誘導活性の中でも、末梢血の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）前駆細胞の頻度を上昇させるＴ細胞誘導活性を有するものが特に好ましい。また、本発明のペプチドとしては、上記タンパク質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチドを例示することができ、かかるペプチドは特に制限されるものではないが、抗体の認識部位や、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の認識部位を構成するペプチドを好適に例示することができる。上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチドに加えて、これらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体に対して特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドも本発明に含まれ、これらを総称して、以下「本件グリオーマ抗原」ということがある。なお、本件グリオーマ抗原の由来はヒトに限定されるものではなく、また本件グリオーマ抗原は、腫瘍検出用診断薬や、後述するように免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法に有用である。
【００１８】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記のグリオーマ抗原の調製方法により得られるグリオーマ抗原のうち新規な抗原タンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができ、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−１をコードするＤＮＡ、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ａをコードするＤＮＡ、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ｂをコードするＤＮＡ、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ｃをコードするＤＮＡ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−２ｄをコードするＤＮＡ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＫＵ−ＧＢ−５をコードするＤＮＡ、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１、３、５、７、９又は１１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。
【００１９】
また、配列番号１、３、５、７、９又は１１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列をプローブとして、各種グリオーマ細胞由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等のグリオーマ抗原と同効な目的とする免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲内である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
また、上記本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、本件グリオーマ抗原等は、以下に具体的に説明するように、本件グリオーマ抗原とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド又は融合タンパク質や、本件グリオーマ抗原に対する抗体、本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、本件グリオーマ抗原を過剰発現する非ヒト動物を作製する際に使用することができる。
【００２１】
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件グリオーマ抗原とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどの従来知られているマーカータンパク質を具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができるがこれらに限定されるものではない。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等の精製や、Ｔ細胞誘導活性を有するタンパク質の検出や、グリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等に対する抗体の定量、グリオーマ等の癌の診断用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２２】
本発明の本件グリオーマ抗原に対する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本件グリオーマ抗原を用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点で好ましく、特にＫＵ−ＧＢ−１、ＫＵ−ＧＢ−２ａ、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、ＫＵ−ＧＢ−２ｄ、ＫＵ−ＧＢ−５等のエピトープあるいは該エピトープとＨＬＡとの複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体がより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、グリオーマ等の癌の診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、グリオーマ等の悪性腫瘍の発症機構を明らかにする上で有用である。
【００２３】
また本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件グリオーマ抗原若しくはエピトープを含むその断片、又は該本件グリオーマ抗原、特にエピトープとＨＬＡとの複合体を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２４】
上記本件グリオーマ抗原に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その本件グリオーマ抗原を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件グリオーマ抗原やその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、グリオーマ等の診断や治療に使用できる可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件グリオーマ抗原に包含される。
【００２５】
また、本発明の本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞は、宿主細胞に本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子を導入することにより作製することができ、かかる本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の宿主細胞への導入方法としては、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等による方法を具体的に挙げることができる。
【００２６】
そして、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。また、ＨＬＡ発現能を有する宿主細胞や、元来ＨＬＡ発現能を有さない宿主細胞にＨＬＡｃＤＮＡをトランスフェクションした宿主細胞に本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子を上記の方法で導入することにより、本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなるＨＬＡ発現能を有する宿主細胞を作製することができる。
【００２７】
また、発現系としては、上記本件グリオーマ抗原を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２８】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件グリオーマ抗原は、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができ、また、かかる本件グリオーマ抗原を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件グリオーマ抗原に対する抗体を結合させたカラムや、上記本件グリオーマ抗原に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件グリオーマ抗原を得ることができる。
【００２９】
本発明の本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件グリオーマ抗原を発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件グリオーマ抗原を過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件グリオーマ抗原を大量に産生する非ヒト動物をいう。そして、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件グリオーマ抗原欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、本件グリオーマ抗原のノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００３１】
例えば、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００３２】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスを作製することができる。また、本件グリオーマ抗原ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００３３】
また、本発明のグリオーマ抗原のトランスジェニックマウスは、本件グリオーマ抗原をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３４】
本発明の免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本件グリオーマ抗原と被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、被検物質と本件グリオーマ抗原とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、被検物質と本件グリオーマ抗原を発現している細胞膜又は細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、ＨＬＡを発現するベクターと被検ポリペプチドを発現するベクターを共にトランスフェクトした本件グリオーマ抗原発現宿主細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、被検ポリペプチドを発現するベクターをトランスフェクトしたＨＬＡ発現能を有する本件グリオーマ抗原発現宿主細胞とＴ細胞とを用い、該Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法や、前記ノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＴ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法等を挙げることができる。上記細胞膜又は細胞としては、前記本件グリオーマ抗原をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物又は野生型非ヒト動物などから得られる初代培養した細胞などの細胞や、前記本件グリオーマ抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、これら細胞の細胞膜などを具体的に例示することができ、かかる細胞膜又は細胞と被検物質との接触方法としては、被検物質の存在下に本件グリオーマ抗原を発現している細胞膜又は細胞をインビトロで培養し、次いでＴ細胞と接触させる方法等を挙げることができる。Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価する方法としては、Ｔ細胞から培地中に放出されたＩＦＮγ量を指標として評価する方法を具体的に例示することができる。また上記スクリーニング方法により得られる免疫誘導活性促進物質は、免疫誘導活性の促進を必要としている患者の治療等に用いることができ、また、免疫誘導活性抑制物質は、免疫誘導活性の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［細胞株と組織］
ヒトグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１）、ヒト悪性黒色腫細胞株（ＳＫｍｅｌ２３、１３６２ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ、ＥＢＣ１）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、乳癌細胞株（ＭＤＡ２３１）、膵癌細胞株（ＰＫ１）、腎細胞癌細胞株（ＲＣＣ６）、膀胱癌細胞株（ＢＣ４７）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）、白血病細胞株（ＨＬ６０、Ｍｏｌｔ４）を、それぞれペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩで培養した。膵癌細胞株（ＫＵ７）を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｌ−グルタミン（１％）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＥＧＦ（６μｇ／ｌ）、インシュリン（１５０Ｕ／ｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（１０ｍｇ／ｌ）を添加した１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。ヒトグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１６、ＧＢ１７、ＧＢ４）は、手術時に摘出された病変の一部を用いた。正常組織（脳、心臓、肺、胃、大腸、肝臓、脾臓、小腸、腎臓、精巣、胎盤、筋肉、胎児脳）のＲＮＡは全てクローンテック社製より購入した。
【００３６】
［ｃＤＮＡライブラリーの作製］
上記グリオーマ細胞株Ｕ８７−ＭＧ及びＴ９８Ｇから塩化セシウム超遠心法により全ＲＮＡを単離し、それぞれ１ｍｇずつ混合した後、オリゴテックス(ｄＴ)３０（TAKARA社製）を用いたポリ(A)セレクションを行いｍＲＮＡを精製した。５μｇの精製ｍＲＮＡからZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用いて逆転写によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλＺＡＰ発現ファージミドベクターに組み込み、λファージｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００３７】
［血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング］
上記構築したｃＤＮＡライブラリーを１５０ｍｍＮＺＹアガロースプレートに１×１０4クローンで播き、４２℃で４時間培養した後、３７℃で４時間培養して大腸菌（XL1-Blue）上で１０ｍＭのＩＰＴＧにより発現誘導されたリコンビナント蛋白を、ニトロセルロースフィルター（Hybond-c, Amersham, Buckinghamshire, England）に転写し、０．０５％のＴＷＩＮ２０を含むＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．５）でフィルターを洗浄することにより吸着したバクテリア、ファージを除去した後、５％のスキムミルクを含むＴＢＳにて非特異反応を抑制した。このフィルターを１００倍又は４００倍に希釈した患者血清と３７℃で４時間反応させた。なお、患者血清としては、表１に示す１２人のグリオーマ患者から採取したものや、表２に示す８人のグリオーマ患者からそれぞれ採取し、グリオーマ患者血清４人分を混合したもの［（Ｇ２０，Ｇ２１，Ｇ２２，Ｇ２７患者血清を混合）、（Ｇ１８，Ｇ２３，Ｇ２４，Ｇ２８患者血清を混合）］を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に５％のスキムミルクを含むＴＢＳ溶液で５倍に希釈して、さらにバクテリアに反応する抗体をあらかじめ除去するため、溶菌した大腸菌のライセートと１：２の割合で混合して４℃で８時間反応させた後、その上清を最終的に１００倍（表１に示す患者血清を用いた場合）又は４００倍（表２に示す４人分の患者血清を用いた場合）に希釈したものを用いた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
かかる処理血清とニトロセルロースフィルターにブロットしたリコンビナント蛋白とを３７℃で４時間反応させ、血清中の抗体が反応したリコンビナント蛋白を、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ICN Parmaceuticals社製）を用いて検出した。次いで、発色反応陽性部位に一致する陽性クローンを前記１５０ｍｍＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％のgelatin；ｐＨ７．５）に溶解させた。さらにこのスクリーニングを数回繰り返し行い、陽性クローンの抗体反応性を確認した。患者血清１人あたり５×１０5個のファージクローンからスクリーニングして、表１に示された患者血清から合計９２個の陽性クローンを、表２に示された患者血清から合計２１個の陽性クローンを単離した。患者別の単離陽性クローン数を表１及び表２に示す。表１に示された患者血清から得られた９２個の陽性クローンのうち、１８個は膠芽腫（Glioblastoma）患者Ｋから、１８個は膠芽腫（Glioblastoma）患者Ｒから、１５個は退形成性稀突起星細胞腫（Anaplastic oligoastrocytoma）患者Ｌのものであり、特定の患者血清に陽性クローンが集中する傾向が認められたが、この傾向は年齢や悪性度とは明らかな関係がないことがわかった。
【００４１】
［単離抗原遺伝子の相同性検索］
上記得られた表１に示された患者血清を用いることにより得られた９２個のファージ、及び表２に示された患者血清を用いることにより得られた２１個のファージに組み込まれたｃＤＮＡインサートをＰＣＲ法により増幅し、各塩基配列を決定した。反応酵素にはＥｘＴａｑ（TAKARA社製）を用い、センスプライマーにＴ３（５′−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３′；配列番号１３）、アンチセンスプライマーにＴ７（５′−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３′；配列番号１４）を用いた。なお、反応条件は、サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）を用いて最初のみ９４℃で５分間変性させ、その後９４℃で１分間熱変性させ、５５℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間伸張反応させるというサイクルを３５回繰り返し行い、最後に７２℃で７分間伸張させた。得られたＰＣＲ産物を、Big Dye DNA Sequencing Kit（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０オートシークエンサーとを用いてＤＮＡシークエンスを行い、５′側の塩基配列を３００〜５００ｂｐ程決定した。この決定したＤＮＡを、米国国立生体工学情報センターの遺伝子データーベース又はＥＳＴデーターベースにおいて登録されている遺伝子情報との間で比較し、既知の遺伝子との相同性を検索した。この結果、上記表１に示された患者血清を用いることにより得られた９２個の陽性クローンは、３８種類の既知タンパク質をコードするｃＤＮＡと１４種類の新規タンパク質をコードするｃＤＮＡの５２種類の抗原ｃＤＮＡであることがわかった。患者別の５２種類の抗原ｃＤＮＡ数を表１に示す。また、上記表２に示された患者血清を用いることにより得られた２１個の陽性クローンは、７種類の既知タンパク質をコードするｃＤＮＡと１種類の新規タンパク質をコードするｃＤＮＡの８種類の抗原ｃＤＮＡであることがわかった。患者別の８種類の抗原ｃＤＮＡ数を表２に示す。
【００４２】
［血清スクリーニング］
表１の患者血清を用いることにより単離された５２種類の抗原を発現する各クローンを用いて、グリオーマの血清診断への応用を検討するために、グリオーマ患者１７人（膠芽腫９人、退形成性星細胞腫５人、退形成性稀突起星細胞腫２人、びまん性星細胞腫１人）、一部の抗原に関しては、グリオーマ患者２９人（膠芽腫１２人、退形成星細胞腫７人、退形成稀突起星細胞腫４人、星細胞腫４人、稀突起星細胞腫２人）、他の脳疾患患者８人（悪性リンパ腫２人、脳膿瘍１人、髄膜腫３人、転移性グリオーマ１人、くも膜下出血１人）、他の癌患者１６人（悪性黒色腫４人、膵癌４人、腎細胞癌４人、食道癌４人）、及び健常人１６人（一部の抗原については２６人あるいは５４人）の１００倍に希釈した各血清を用いてスクリーニングを行い、これら血清中に各単離グリオーマ抗原に対するＩｇＧ抗体が検出しうるかどうかについて調べた。この結果、グリオーマ患者血清とのみ反応する７種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）と、グリオーマ患者血清とグリオーマ以外の他の癌患者血清とも反応するが、その他の健常人血清等とは反応しない４種のグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）を得ることができた。７種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）は、表３に示されるように、新規なＫＵ−ＧＢ−２、Ｌ１３の他、Cytochrome-C、DEK oncogene、Nuclear Antigen SP100、Sarcolemmal associated protein、KIAA1014 proteinであった。また４種のグリオーマ非特異抗原（グリオーマ非特異抗原遺伝子）は、表４に示されるように、新規なＫＵ−ＧＢ−１の他、Mitotic centromere associated protein、human S5A、Minichromosome maintenance deficient-3であり、これらグリオーマ非特異抗原が反応するグリオーマ以外の他の癌患者血清は、ＫＵ−ＧＢ−１ではメラノーマと腎細胞癌、Mitotic centromere associated proteinでは膵癌、human S5aでは食道癌、Minichromosome maintenance deficient-3ではメラノーマの癌患者血清であった。
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
上記の７種のグリオーマ特異抗原と４種のグリオーマ非特異抗原は、他の脳疾患患者や健常人の血清と抗体反応を示さないことから、グリオーマあるいはグリオーマを含む癌の血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。例えば上記ＩｇＧ抗体の検出結果から、human S5aに対する抗体反応がグリオーマ患者及び食道癌患者血清において認められ、他の脳疾患患者及び健常人血清に対する反応が見られないため、human S5aはグリオーマを含む癌の血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。なお、このhuman S5aはＧｅｎＢａｎｋに３種類の名前［Human proteasome 26S subunit, non-ATPase 4（PSMD4）：アクセッション番号NM_002810、Antisecretory factory 1：アクセッション番号U24704、26S protease subunit S5a：アクセッション番号U51007］で登録されている。このhuman S5aには神経特異的な発現を示すアイソフォームが１種類存在することが報告（EMBO J.19,4144-4153,2000）されており、このアイソフォームhuman pUb-R5（アクセッション番号AB033605）は、human S5aと同様にグリオーマ抗原である可能性が高い。
【００４６】
表２の患者血清を用いることにより単離された８種類の抗原を発現する各クローンを用いて、グリオーマの血清診断への応用を検討するために、グリオーマ患者２９人（膠芽腫１２人、退形成星細胞腫７人、退形成稀突起星細胞腫４人、星細胞腫４人、稀突起星細胞腫２人）、他の脳疾患患者１４人（悪性リンパ腫２人、脳膿瘍１人、くも膜下出血１人、パーキンソン病２人、髄膜腫４人、神経細胞腫１人、頭蓋咽頭腫１人、転移性脳腫瘍２人）、及び健常人３７人の１００倍に希釈した各血清を用いてスクリーニングを行い、上記と同様にこれら血清中に各単離グリオーマ抗原に対するＩｇＧ抗体が検出しうるかどうかについて調べた。この結果、グリオーマ患者血清とのみ反応を示すか、又は多くのグリオーマ患者血清と反応を示し健常人の血清とはほとんど抗体反応を示さない２種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）を得ることができた。２種のグリオーマ特異抗原（グリオーマ特異抗原遺伝子）は、表５に示されるように、新規なＫＵ−ＧＢ−５及びMutL (E. coli)homolog1 (hMLH1)（GenBankアクセッション番号NM_000249）であることがわかった。上記２種のグリオーマ特異抗原は、グリオーマ患者血清と特異的に、あるいは多くのグリオーマ患者血清と反応することから、グリオーマの血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。
【００４７】
【表５】
【００４８】
［抗原の塩基配列とアミノ酸配列の決定］
単離されたクローンの塩基配列を、自動ＤＮＡシークエンサー（ALF Express；ファーマシアバイオテク社製）を用いて調べた結果、ＫＵ−ＧＢ−１は１１２０個のアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を含む全長３７０９ｂｐの塩基配列（配列番号１）から構成されていることがわかった。これに対してＫＵ−ＧＢ−２には４種類のアイソフォーム（isoform）が存在することがわかった。すなわち、１１５４個のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする遺伝子を含む全長３５３３ｂｐの塩基配列（配列番号３）から構成されているＫＵ−ＧＢ−２ａの他、ＫＵ−ＧＢ−２ｂ、ＫＵ−ＧＢ−２ｃ、及びＫＵ−ＧＢ−２ｄの３種類のアイソフォームが見つかった。ＫＵ−ＧＢ−２ｂの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５と６に、ＫＵ−ＧＢ−２ｃの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７と８に、ＫＵ−ＧＢ−２ｄの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９と１０にそれぞれ示す。さらに、ＫＵ−ＧＢ−５は８９１個のアミノ酸配列（配列番号１２）をコードする遺伝子を含む全長３８４７ｂｐの塩基配列（配列番号１１）から構成されていることがわかった。
【００４９】
［グリオーマ抗原のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット法］
正常組織（脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、小腸、肺、精巣、胎盤、胃）由来のＲＮＡ、ヒトグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｕ８７−ＭＧ、Ｔ９８Ｇ）及びヒトグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１７）由来のＲＮＡ、並びに、ヒト悪性黒色腫細胞株（１３６２ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、乳癌細胞株（ＭＤＡ２３１）、膵癌細胞株（ＰＫ１）、腎細胞癌細胞株（ＲＣＣ６）、膀胱癌細胞株（ＢＣ４７）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）及び白血病細胞株（ＨＬ６０、Ｍｏｌｔ４）の各細胞株由来のＲＮＡを用いて、ＫＵ−ＧＢ−１に対するノーザンブロットを行った。ＲＮＡ（各１１μｇ）を、ホルムアミド及びホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブランフィルター（Hybond XL, Amersham）に移した。
【００５０】
次に長さ３７０９ｂｐのＫＵ−ＧＢ−１全長を含む遺伝子断片を、High Prime DNA Labeling Kit（Boehringer）を用いて32Ｐでラベリングしたプローブとし、Quik Hyb（Stratagene）をハイブリダイゼーションバッファーとして用いてナイロンメンブランフィルターを浸し、６８℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上記プローブを加えたQuik Hyb中で６８℃で２時間ハイブリダイゼーションした。次いで、このハイブリダイゼーションしたナイロンメンブランフィルターを洗浄液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）で室温で１５分間２回洗浄し、洗浄液II（０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）で６８℃で１５分間２回洗浄した。洗浄したナイロンメンブランフィルターを、Molecular Imager（BIORAD）を用いて放射性シグナルの検出を行った。結果を図１に示す。
【００５１】
図１に示されているように、ＫＵ−ＧＢ−１の正常組織における遺伝子発現は精巣以外に認められず、グリオーマを含む癌細胞株においてのみ高い発現が認められた。これらのことから、ＫＵ−ＧＢ−１遺伝子はグリオーマを含む癌の遺伝子診断薬として有用であると考えられる。また前記のように、ＫＵ−ＧＢ−１抗原に対する抗体反応がグリオーマ及び他の癌（悪性黒色腫、腎癌）の患者血清において認められ、他の脳疾患患者や健常人血清に対する抗体反応が認められなかったことから、ＫＵ−ＧＢ−１抗原はグリオーマを含む癌の診断薬や治療薬として有用であると考えられる。なお、精巣における発現については、免疫系から隔離された組織であることから、ＫＵ−ＧＢ−１抗原を実際に免疫療法等に用いる際に精巣の障害が問題となる可能性は殆どないと考えられる。
【００５２】
［グリオーマ抗原の発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法］
次にグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−２遺伝子又はＫＵ−ＧＢ−５遺伝子の各正常組織、グリオーマ細胞株及び組織並びに他の腫瘍細胞株における発現特異性をＲＴ−ＰＣＲ法により調べてみた。脳、心臓、肺、胃、肝臓、脾臓、小腸、腎臓、胎盤、精巣、大腸、筋肉、胎児脳の各正常組織由来のＲＮＡ（全てクローンテック社製より購入）、４種のグリオーマ細胞株（ＧＩ−１、Ｕ２５１、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ）及び４種のグリオーマ組織（ＧＢ１３、ＧＢ１６、ＧＢ１７、ＧＢ４）由来のＲＮＡ、並びに、悪性黒色腫細胞株（ＳＫｍｅｌ２３）、肺癌細胞株（ＬＵ９９、ＥＢＣ１）、食道癌細胞株（ＴＥ１０）、膵癌細胞株（ＫＵ７）、乳癌細胞株（ＭＤＡ２３１）及び白血病細胞株（Ｍｏｌｔ４）の各細胞株由来のＲＮＡを、各５μｇづつ使用し、トリ骨髄芽球ウイルス逆転写酵素（TAKARA社製）と、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて、全反応量２００μｌ、４２℃でＲＴ−ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡのパネルを作製した。
【００５３】
ＫＵ−ＧＢ−２検出用には、センスプライマーとして（５′−ＡＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡ−３′；配列番号１５）を、アンチセンスプライマーとして（５′−ＡＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴ−３′；配列番号１６）を、ＫＵ−ＧＢ−５検出用には、センスプライマーとして（５′−ＡＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＣＣ−３′；配列番号１７）を、アンチセンスプライマーとして（５′−ＡＧＣＡＡＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡ−３′；配列番号１８）を、コントロールとしてのβアクチン検出用（５５１ｂｐ）には、センスプライマーとして（５′−ＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡ−３′；配列番号１９）とアンチセンスプライマー（５′−ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧ−３′；配列番号２０）を用いた。これらのＰＣＲプライマーを用い、反応酵素にＥＸＴａｑ（TAKARA社製）を使用して、サーマルサイクラー（Perkin-Elmer）を用いて、９４℃で１分間熱変性させ、アニーリングの後に７２℃で１分間（ＫＵ−ＧＢ−５は３０秒間）伸張反応させるというサイクルで、３０サイクル繰り返し行った。アニーリング温度はプライマーのＴｍ値［ＫＵ−ＧＢ−２は６２℃、ＫＵ−ＧＢ−５は６０℃、コントロールとしてのβアクチンは６８℃］に設定し１分間（ＫＵ−ＧＢ−５は３０秒間）行なった。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（２．０％）にかけ、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、紫外線照射によりバンドを検出した。ＫＵ−ＧＢ−２のＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に、ＫＵ−ＧＢ−５のＲＴ−ＰＣＲの結果を図３にそれぞれ示す。図２に示すように、ＫＵ−ＧＢ−２は、Ｕ８７−ＭＧ、ＧＩ−１（ヒトグリオーマ細胞株）、ＧＢ１３、ＧＢ１７（グリオーマ組織）、Ｓｋｍｅｌ２３（悪性黒色腫細胞株）及び精巣において強い発現が認められ、Ｕ２５１（ヒトグリオーマ細胞株）、ＬＵ９９（肺癌細胞株）、脳、小腸及び胃においては弱い発現が認められた。また、図２においては２本のバンドが認められるが、前記のようにＫＵ−ＧＢ−２には４種類のアイソフォームが存在し、大きいサイズのバンド（レーン上；６２８ｂｐ）がＫＵ−ＧＢ−２ｂ及びＫＵ−ＧＢ−２ｄの発現を示し、小さいサイズのバンド（レーン下；４４７ｂｐ）がＫＵ−ＧＢ−２ａ及びＫＵ−ＧＢ−２ｃの発現を示している。また、図３から、ＫＵ−ＧＢ−５は、ＧＩ−１、Ｕ２５１（ヒトグリオーマ細胞株）、ＧＢ１３、ＧＢ１７（グリオーマ組織）、精巣において強い発現が見られ、Ｕ８７ＭＧ（ヒトグリオーマ細胞株）、ＧＢ１６（グリオーマ組織）、脳、肺、脾臓、胎児脳においては弱い発現が認められた。
【００５４】
図２及び図３に示されているように、ＫＵ−ＧＢ−２及びＫＵ−ＧＢ−５は、ＫＵ−ＧＢ−１の場合と同様に、精巣以外の正常組織における高い遺伝子発現は認められず、グリオーマやＳｋｍｅｌ２３（悪性黒色腫細胞株）においてのみ高い遺伝子発現が認められた。また上記のようにＫＵ−ＧＢ−２には４種類のアイソフォームが存在するが、これら４種類のアイソフォームについても個別にＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、特にＫＵ−ＧＢ−２ａ及びＫＵ−ＧＢ−２ｂは神経系に特異的な発現パターンを示すことがわかった。これらのことから、ＫＵ−ＧＢ−２に属する個々の遺伝子もグリオーマを含む癌の遺伝子診断薬として有用であると考えられる。さらに前記のように、ＫＵ−ＧＢ−２抗原に対する抗体反応がグリオーマ患者血清において特異的に認められ、他の癌、他の脳疾患患者及び健常人血清に対する抗体反応が認められなかったことから、ＫＵ−ＧＢ−２抗原はグリオーマの診断薬や治療薬として有用であると考えられる。また、ＫＵ−ＧＢ−５抗原は、グリオーマ患者血清と特異的に反応することから、グリオーマの血清診断薬や治療薬として有用であると考えられる。なお、精巣における発現については、免疫系から隔離された組織であることから、ＫＵ−ＧＢ−２抗原やＫＵ−ＧＢ−５抗原を実際に免疫療法等に用いる際に精巣の障害が問題となる可能性は殆どないと考えられる。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のグリオーマ抗原及び／又はグリオーマ抗原遺伝子の調製方法により得られるグリオーマ抗原やグリオーマ抗原遺伝子ＤＮＡは、グリオーマ等の癌に対する治療や診断に有用であり、またグリオーマ発症に関する基礎的知見を得る上でも有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のノーザンブロット法によるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−１の発現解析の結果を示す図である。
【図２】本発明のＲＴ−ＰＣＲによるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−２の発現解析の結果を示す図である。
【図３】本発明のＲＴ−ＰＣＲによるグリオーマ抗原ＫＵ−ＧＢ−５の発現解析の結果を示す図である。
【配列表】
Claims (22)
- 以下の工程（１）〜（５）を含むグリオーマ抗原の調製方法により得られるグリオーマ抗原である、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−１、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−２、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH1及び／又はかかるグリオーマ抗原に特異的に結合する抗体を含有することを特徴とするグリオーマ検出用診断薬。
（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；
（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；
（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；
（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；
（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程； - 以下の工程（１）〜（５）を含むグリオーマ抗原遺伝子の調製方法により得られるグリオーマ抗原である配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−１、配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−２、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＫＵ−ＧＢ−５、KIAA1014 protein、Mitotic centromere associated protein、human S5A、hMLH1をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡのアンチセンス鎖、又は前記ＤＮＡ若しくはＲＮＡの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列のアンチセンス鎖を含有することを特徴とするグリオーマ検出・診断用プローブ。
（１）グリオーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出・精製し、精製後のｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによってλファージｃＤＮＡライブラリーを構築する工程；
（２）グリオーマ患者の血清を希釈し、大腸菌の抽出物と反応させ、反応物を除去することにより反応用血清を作製する工程；
（３）前記λファージｃＤＮＡライブラリーと反応用血清を反応させ、標識抗ＩｇＧ抗体を用いて血清中の抗体が反応した陽性クローンを検出する工程；
（４）検出された陽性クローンに対して、さらに数回のスクリーニングを繰り返し、抗体反応性を確認する工程；
（５）陽性クローンから抗原を単離し、単離された抗原と少なくともグリオーマ患者血清、健常人血清とを用いて血清スクリーニングする工程； - 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質 - 配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
- 請求項４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質 - 配列番号３、５、７又は９に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列（但し、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッションナンバーＡＡ１３１３３０として登録されている塩基配列を除く）からなるＤＮＡ。
- 請求項７記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質 - 配列番号１１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列（但し、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッションナンバーＡＩ５４９３８０として登録されている塩基配列を除く）からなるＤＮＡ。
- 請求項１０記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質。
- 配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号４、６、８又は１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質。
- 配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質。
- 請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
- 請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質に対する抗体。
- 請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
- 請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、あるいは請求項１２〜１７のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物。
- 請求項９〜１４のいずれか記載のタンパク質と被検物質とＴ細胞を用い、Ｔ細胞における免疫誘導活性を測定・評価することを特徴とする免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
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