JP3713508B2 - バチルス・チューリンジェンシスの培養液を有効成分とする水産魚介類病原カビであるフサリウム菌に対する防除剤 - Google Patents

Description

本発明は、水産魚介類の病原カビを防除するための防除剤、特にクルマエビ類の病原カビ例えばフサリウム菌を防除するための生物的防除剤に関する。

クルマエビは西日本を中心に盛んに養殖されている。日本のクルマエビの漁獲量の約５０％が養殖で担われている。限られた面積で養殖を行うため、高密度養殖を余儀なくされる。また、短期間で成長をさせるために、飼育餌料の大量投与が行われることによる残餌、糞などの環境悪化も問題となっている。

クルマエビなどの水棲動物は周りの環境に影響されやすく、高密度飼育や環境の悪化が直接、液性免疫や細胞性免疫など生体防御能の低下を引き起こす。特に哺乳類の白血球に相当する貪食細胞の異物捕食能の低下、生体防御にかかわる酵素活性の低下などが顕著である。病原体による疾病被害の軽減には、クルマエビの養殖環境を整えることが不可欠である。

クルマエビにはウイルス病としてクルマエビ属の急性ウイルス血症、細菌病ではビブリオ病、真菌（カビ）病では鰓黒病が３大疾病として非常に問題となっている。

特に、フサリウム菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）が引き起こす鰓黒病は、高密度の養殖環境で多発する疾病で、一度発生すると周年感染を繰り返すことから、大きな問題となっている。被害の大きさにもかかわらず、本病の治療・予防対策がほとんどないのが現状である。

本病を抑える手段としては、現状では塩素剤による養殖池内の消毒が広く行われている。しかしながら、塩素剤による消毒は、殺菌の選択性がないこと、塩素剤の吸引等による人体への悪影響、残留性などの問題がある。また、塩素剤以外の抗生物質や抗菌剤などの化学薬剤を使用する場合も同様の問題がある。

近年は消費者の食への安全性の意識が高くなってきており、従来のような抗生物質や化学薬品を使って養殖を行うことは、時代の流れに逆行しており好ましくない。

また、本症の予防治療法として、養殖用水の一部を採取してその採取した用水に電解水（塩化ナトリウムを含有しない水に塩酸を添加し、塩酸添加水を無隔膜電解槽に通水し、通水した塩酸添加水を電気分解して得られる水）を添加して養殖場に戻す方法も、近年提案されている（特許文献１参照）。しかしながら、このような電解水を利用する方法は、前記電気分解のための設備や消費電力などの多大な設備コスト・ランニングコストが掛かってしまうという問題がある。
特開平１１−２６６７３３号公報

本発明は前述のような従来技術の問題点に着目してなされたものであって、消費者の食への安全性の要請を満たすことができ、設備コスト・ランニングコストを最小に抑えることができる、水産魚介類の病原カビを防除するための防除剤、特にクルマエビ類の病原カビ例えばフサリウム菌を防除するための生物的防除剤を提供することを目的とするものである。

以上のような課題を解決するための本発明による水産魚介類病原カビを防除するための生物的防除剤、特にクルマエビ類の病原カビ（例えばフサリウム菌）を防除するための生物的防除剤は、バチルス・チューリンジェンシスを有効成分とするものである。また、本発明による生物的防除剤は、バチルス・チューリンジェンシスが産生する物質をも含むことが望ましい。さらに、本発明による水産魚介類病原カビを防除するための防除剤は、バチルス・チューリンジェンシスの培養液を有効成分とするものである。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）は、好気性または通性嫌気性で、グラム陽性の桿菌である。環境条件によっては、菌体内に構造変化を生じ、前胞子（ｆｏｒｅｓｐｏｒｅ）の段階を経て完成した一個の胞子（芽胞）を形成することを特徴とする。バチルス属は、菌体の大きさ、胞子の形と菌体内での位置、糖の利用と生成物、硫酸還元の有無、高濃度の食塩存在下での違いなどから主に分けられている。水中・空中・土壌中に広く分布している。

バチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ。以下「ＢＴ」ということがある）は、１９０１年にカイコの病原細菌として世界で初めて日本人研究者の石渡により分離された。土壌細菌の一種であるが、近年、淡水や海水環境からの分離も報告され、自然界に幅広く分布していることがわかってきた。胞子を形成して長期間土壌中で生育が可能であるが、増殖時には桿状の栄養細胞となり、増殖する。

ＢＴの胞子は熱・放射線、化学物質に対する抵抗性が強く、成分的には栄養細胞には存在しないジピコリン酸カルシウム塩を多量に含む。

ＢＴは栄養細胞中に胞子を形成する際、胞子に隣接して結晶性のタンパク質を産生する。このタンパク質は昆虫の中腸内で、プロテアーゼにより活性化され、昆虫に対して殺虫活性を示すことが知られている。ＢＴは、その殺虫活性の特異性の高さから、野菜の害虫駆除用の微生物殺虫剤（微生物農薬）として登録され、現在広く用いられている。

しかしながら、近年の調査からバチルス・チューリンジェンシスの結晶性タンパク質のうちの多くが殺虫活性を有しないことがわかってきた（例えば、特開２００２−２８４８００号公報参照）。殺虫活性を持たない結晶性タンパク質には、細胞認識破壊などの新しい機能があることがわかってきており、環境中の生態系をほとんど乱さないことや安全性の高さから微生物殺虫剤以外の利用方法も検討されている。

農業分野では早くから、微生物によって害虫を駆除するという生物的防除（または微生物的防除）の考え方が広く浸透してきた。化学農薬の残留性などの問題から、化学農薬を用いない、やさしい農業への転換が急がれている。前述のように、ＢＴは、安全性の高さから微生物農薬として広く用いられてきた。

本研究では、クルマエビの病原カビのフサリウム菌の防除方法として、ＢＴが産生する抗菌（カビ）物質を利用した生物的防除剤を開発した。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（ＢＴ）に関しては、特表２００１−５２４８０６号公報により、「植物病害を制御するためのＢａｃｉｌｌｕｓの新規の株」として特定の寄託された菌株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ２１６１９）が紹介されている。しかしながら、前記の寄託された菌株の用途は、前記公報では「植物及び果実における真菌・細菌の感染予防」に限定されている。よって、前記公報の発明と本発明（クルマエビなどの水産魚介類の病原カビの防除を用途としている）とは、その菌株・用途共に、全く異なっている。

一方、バチルス属の菌株の利用に関しては、特開平１１−２９００６３号公報により、バチルス・ズブチリスＹ０１（寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１６６５８）を「抗真菌・抗菌性培養組成物及び微生物」として用いた例が紹介されている（前記公報では、その用途として医療用抗真菌剤、農園芸用抗真菌剤、金属加工油剤を挙げるだけである）。しかしながら、前記公報の発明と本発明とは、同じバチルス属でも種が全く異なっている。また、前記公報の発明は、その用途として医療用抗真菌剤、農園芸用抗真菌剤、金属加工油剤を挙げるだけであることから、本発明（クルマエビなどの水産魚介類の病原カビの防除を用途としている）とは、その用途も全く異なっている。

また、特開２００１−１２１１８６号公報（「細菌を利用した水の浄化方法、並びに、細菌を利用した水産養殖方法及びシステム」）は、バチルス属の細菌を水産で利用する例を紹介している。しかしながら、前記公報では、「バチルス属の細菌」とするだけでその種を特定していない点で本発明と全く異なっている。また、前記公報の発明は、前記「バチルス属の細菌」の用途として「飼育対象の体内でのタンバク質及び炭水化物の消化吸収を促進して飼育対象の成長を促進する」（前記公報の段落００３５，００４１参照）ことを挙げるのみであるから、本発明（クルマエビなどの水産魚介類の病原カビの防除を用途としている）とはその用途も全く異なっている。

しかしながらＢＴを水産魚介類の抗カビ剤として応用した例は公開公報の中にも学術論文の中にも見当たらない。よって、本発明の内容は極めて新規なものであると考えられる。従来、クルマエビ養殖においてフサリウム菌の防除には塩素剤等の化学殺菌剤が使用されてきた。また養殖池内や使用機材の消毒により防除を試みてきた。しかしながら、化学殺菌剤の使用は時代にマッチせず、今後は微生物殺菌剤が広く使われるものと考えられる。

ＢＴは生物農薬すなわち微生物殺虫剤として登録されており、環境に安全な微生物農薬として広く用いられている。本発明者は、ＢＴの微生物殺虫剤以外の新たな機能を調べるために、ＢＴ菌株に抗カビ活性を有するものがあるかを調査した。本発明者は、３，０００株のＢＴ菌株についてクルマエビのフサリウム菌の増殖を抑制する効果があるかどうかを実験したところ、その全ての菌株にフサリウム菌に対する抗菌活性が認められ、本発明に至った。

また、本発明の一つは、ＢＴ菌（ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ２１６１９のバチルス・チューリンジェンシス株を除く）が増殖するときに産生し、水産魚介類病原カビであるフサリウム菌を抑制する、菌体外物質を主成分とする、菌体を含んだ培養液より成るものである。

フサリウム菌の増殖を抑えるＢＴ菌株は、いずれの菌株でも良いが、たとえば、Ａ７５８，Ａ１０７９，Ａ１４６９，Ａ１６２４，Ａ１８２６，Ａ２１５２，Ａ２３１３，Ｂ５２１，Ｂ５４４などを挙げることができるが、前述のように本発明者の実験によればＢＴ菌株の全てが抗フサリウム活性を有する。また、ＢＴ菌株は、鞭毛抗原により血清型（Ｈ血清型）に分類できるが、抗フサリウム活性を持つ菌株は血清型とは無関係である。

本発明に使用するＢＴ菌株は、各地域の土壌、植物、河川などから分離して入手することができるが、これ以外の方法で入手することも可能である。例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（住所：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）では、希望する菌株を有償で分譲してくれるので、ここからＢＴ菌株を入手することも可能である。

また、バチルス・チューリンジェンシスは、現在、野菜の害虫防除用の生物農薬として多数市販されているので、この生物農薬として市販されているものを購入することによっても入手可能である（そして、この購入した生物農薬をそのまま養殖池又はエビ等の水産魚介類に投与したり、この購入した生物農薬からバチルス・チューリンジェンシスを分離・培養して、それを養殖池又はエビ等の水産魚介類に投与することなどが可能である）。前記生物農薬として現在市販されているものの中の主な製品名、及びその製造販売会社名（住所）を次に例示する。
「トアローフロアブルＣＴ」 大塚化学株式会社（〒５４０−００２１ 大阪市中央区大手通３丁目２番２７号）
「エスマルクＤＦ」 住友化学工業株式会社（〒１０４−８２６０ 東京都中央区新川２丁目２７番１号 東京住友ツインビル東館）
「ゼンターリ顆粒水和剤」 住化武田農薬株式会社）〒１０４−００３３ 東京都中央区新川１−１６−３ 住友不動産茅場町ビル５・６階）

本発明者が開発したフサリウム菌に対する生物的防除剤は、菌体、菌体外物質を含む培養液からなる。ＢＴ培養液の主成分である胞子は熱や乾燥に安定であるため、製品形態としては培養液、乾燥物等が含まれる。また、製品の形態は上記に限られない。

ＢＴ菌は、胞子が発芽し、増殖するときに抗カビ物質を産生することから、本発明者は、本発明の製品化に関しては、製品中の胞子が生存している生菌製剤を予定している。ただ、本発明を実用化した製品としては、ＢＴ菌の生菌が存在していないＢＴ菌の培養液により構成されているもの（ＢＴの死菌体が含まれているもの）であってもよい。ＢＴ菌の培養液の中に、ＢＴ菌が産生した物質（有効成分）が十分に含まれていれば、生菌剤でなくても、水産魚介類病原カビを防除するための防除剤としての効果が得られるからである。

フサリウム菌による鰓黒病の防除のためは、ＢＴ菌培養液を、餌に混合、エビに直接噴霧や浸漬することなどにより、エビに投与することもできるし、また、養殖場の底土にすきこむこと、水中に直接投与すること等が考えられる。また、養殖に用いる器具を浸漬など上記と同様な方法で処理することもできる。

また、上記の本発明によるクルマエビのフサリウム菌に対する生物的防除剤は、クルマエビ類の前記フサリウム菌以外の他の病原カビを防除するための生物的防除剤としても、さらに、クルマエビ類以外の他の水産魚介類の病原カビを防除するための生物的防除剤としても有効である。

本発明によれば、消費者の食への安全性の要請を満たすことができ、設備コスト・ランニングコストを最小に抑えることができる、水産魚介類の病原カビを防除するための防除剤、特にクルマエビ類の病原カビ例えばフサリウム菌を防除するための生物的防除剤を実現することができる。

本発明を実施するための最良の形態は、以下の実施例１について述べるような形態である。

本実施形態で用いるＢＴ菌株は、各地域の土壌、植物、河川などから分離した菌株であり、各菌株を菌体湿重量として０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に懸濁し、使用時まで−２０℃に保存した。ＢＴ懸濁液は使用時に解凍し、そのままもしくは培地で希釈したものを用いた。

本実施形態で用いるフサリウム菌分生子液の調製は、クルマエビ類に鰓黒病を引き起こすフサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）をポテト・デキストロース培地または肉エキス培地等で培養して、分生子（胞子）を形成させる。培地上に形成した分生子を培地、滅菌水、滅菌海水等で分散させたのちに、分生子数を血球計算版でカウントした。

１．ＢＴ菌株液の調製
土壌、耕地土壌、森林土壌、病死昆虫、植物、淡水、海水等から分離された、約５０種類のＨ血清型と未同定の血清型に属する３，０００株のＢＴ菌株を用いた。それぞれの菌株を培養、菌体を回収し、蒸留水に懸濁した。ＢＴ菌株懸濁液は湿重量０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、使用時まで−２０℃で保存した。なお、血清型（亜種）の同定は、フランスパスツール研究所より入手した標準菌株を用いることにより行った。

２．フサリウム分生子液の調製
フサリウム菌をポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ）に植菌し、１０日から１ヶ月培養した。液体培地または滅菌海水を培地に加え、十分に懸濁し、培地表面上に形成した分生子を回収した。得られた分生子液を滅菌ガーゼまたは茶こしでろ過し、菌糸を取り除いたのちに、遠心洗浄（６，０００ｇ，１５ｍｉｎ）を３回繰り返した。適量の培地または滅菌海水で懸濁し、血球計算盤を用いて分生子数を計数した。１ｘ１０^６／ｍｌとなるように分生子液を調製した。使用する分生子液は用事調製した。

３．抗フサリウム活性の探索
３％のＮａＣｌを添加した普通培地（肉エキス５ｇ／ｌ、ポリペプトン１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．６）に抗生物質ディスク（直径８ｍｍ）（東洋濾紙）を均等に並べた。それぞれに調製した分生子液を５０マイクロリットルずつ加えて、静置した。１０段階希釈したＢＴ希釈液１マイクロリットルをさらに加えて、２７度に設定したインキュベーター内で１週間培養を行った。

４．結果例
上記３，０００株のＢＴ菌株の全てについて、フサリウム・ソラニの菌糸の伸長を阻害する効果が見られた。得られた結果例の中の主なものを次に示す。

例えば、Ａ７５８株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへの寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９５５４）の場合、無処理のものに比べて、５０％フサリウム・ソラニの菌糸の伸長を阻害した。

また、例えば、Ａ１０７９株（同寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９５５５）の場合、無処理のものに比べて、４２％フサリウム・ソラニの菌糸の伸長を阻害した。

前述のように前記のＡ７５８株、Ａ１０７９株以外のＢＴ菌株についても同様の効果が見られた。前記のＡ７５８株、Ａ１０７９株を含む１０株について、その分離源、血清型、効果（阻害活性）を次表で示す。

Claims (1)

1. バチルス・チューリンジェンシス（ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ２１６１９のバチルス・チューリンジェンシス株を除く）の培養液を有効成分とする、水産魚介類病原カビであるフサリウム菌を防除するための防除剤。