JP3699987B2 - 光合成細菌およびラン色細菌 - Google Patents

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本発明は、耐アルカリ性光合成細菌に関する。詳しくは、アルカリ側でも畜産糞尿を始めとする有機物を分解する光合成細菌Rhodopseudomonas 2種の細菌の前培養法に関する。
Joong Kyun Kimらは(Aquacluture Engineering 19, 179−193 1999)、再循環型水産養殖システムに使用されている光合成反応汚泥から、光合成細菌およびラン色細菌を分離して、脱窒能力に優れている光合成細菌を同定している。この有効菌株はRhodopseudomonas palustrisと分類学的に同定している。また、生育要因は、嫌気条件フラスコ培養により特徴付けられており、最適なpH・温度・照度は、それぞれpH5.5・31℃・5000 luxであり、最大比増殖速度と脱窒によるガス生産速度は、それぞれ0.095 /hと0.2 ml N2/hとなっている。さらに分離菌による窒素ガスへの異化的硝酸還元は対数増殖後期の後に始まり、培養末期において少量の亜硝酸塩が蓄積され、最大生存細胞数は細胞乾燥重量1.07g /lに対して14×10 cellsml−1であり、バクテリオクロロフィルaの最大濃度は細胞乾燥重量にして0.17OD775 /gであるとなっている。以上のように本件では酸性側で機能する光合成細菌が用いられている。
また、特開2001−232388号(以下、先行技術1という)に、廃液処理に光合成硫黄細菌をもちいた記載がある。
従来、光合成細菌を畜産糞尿を始めとする有機物分解に用いることが行われているが、これは主に脱窒を目的としており、酸性側で機能する光合成細菌が主流である。また、先行技術1で用いられる細菌は光合成硫黄細菌であり、増殖には硫黄を大量に必要とする性質がある。
特開2001−232388号 Joong Kyun Kimら、(Aquacluture Enginee ring 19, 179−193 1999)
このように光合成細菌は有機物の分解よりもむしろ脱窒に主眼がおかれてきているため、主に酸性側で機能する光合成細菌が着目されてきた。これらの光合成細菌は、酸性側で機能するものである。しかし糞尿処理などにはアルカリ処理をほどこすことがあり、その際に酸性側でしか機能しない光合成細菌は使用できないという問題点がある。また、それ以外で有機物処理に用いられる細菌は光合成硫黄細菌であり、増殖には硫黄を大量に必要とする性質がある。
本発明は、アルカリ側で機能する光合成非硫黄細菌を提供することを目的とする。
本願発明者は、自然界より多数の細菌をスクリーニングすることにより、アルカリ側で機能する光合成細菌およびラン色細菌を分離培養し、効率のよい有機物分解を行わせることに成功し本発明を完成した。すなわち、
本発明ではアルカリ側で機能する光合成細菌Rhodopseudomonas2種およびラン色細菌Synechococcus1種の菌体、ならびにこの培養法を提供する。
本発明の光合成細菌Rhodopseudomonasは、pH8〜10の条件下で最大増殖速度を有する耐アルカリ性であるバクテリアクロロフィルa、ノイロスポレン、リオコピンを有する光合成細菌Rhodopseudomos A株(受託番号FERM P−19432)である。
本発明の光合成細菌Rhodopseudomonasは、耐アルカリ性でバクテリアクロロフィルa、ノイロスポレンを有する光合成細菌Rhodopseudomos B株(受託番号FERM P−19431)である。
このA株は、配列番号1記載の16s rDNA分子を有する光合成細菌Rhodopseudomosである。
このB株は、配列番号2記載の16s rDNA分子を有する光合成細菌Rhodopseudomosである。
本発明にいう光合成細菌Rhodopseudomonaとは、光合成非硫黄であり、Bergey’s Manual of Determinative bacteriology 3巻、1661−1682に記載の種をいう。
本発明の耐アルカリ性光合成細菌Rhodopseudomonaは、アルカリ性でよく増殖し、バクテリアクロロフィルa、ノイロスポレン、リオコピンを有する。
本発明にいう耐アルカリ性とは、主にpH8−10で最大増殖速度を持つものである。本発明にいう有機物分解とは、主に家庭有機排水ならびに畜産糞尿をいう。
本発明にいう培地とは、基本培地1であり、以下の構成による培地をいう。
基本培地1:
KH2PO4 0.3g
K2HPO4 0.3g
NH4Cl 1.0g
MgCl2・6H2O 0.2g
NaCl 0.2g
CaCl2・2H2O 0.05g
Yeast extract0.05g
Na2S2O3・5H2O 0.05g
D.L.Malic acid 0.1g
Sodium Acetate 0.1 g
Growth factor Solution 1ml
Trace Element Solution 1ml
D.W. 1000ml
pH 7.8
ここで、
Trace Element Solutionの組成は、
EDTA−2Na 2g
FeSO4・7H2O 2g
H3BO3 0.1g
ZnCl2 0.1g
MnCl・4H2O 0.1g
D.W. 100ml
である。
ここで、
Growth factor Solutionの組成は、
Vitamine B2 0.001g
Pyridoxine Hydrochloride(Vitamin B6)
0.001g
p−Aminobenzoic Acid 0.003g
D−Biotin(Vitamin H) 0.005g
D.W. 100ml
である。
寒天培地の場合:
1000mlの基本培地1に寒天10gを加える。
光合成細菌は有機物の分解よりもむしろ脱窒に主眼がおかれてきているため、主に酸性側で機能する光合成細菌が着目されてきた。これらの光合成細菌は、酸性側で機能するものである。しかし糞尿処理にはアルカリ処理をほどこすことがあり、その際に酸性側でしか機能しない光合成細菌は使用できないという問題点があった。また、それ以外で有機物処理に用いられる細菌は光合成硫黄細菌であり、増殖には硫黄を大量に必要とする性質があった。
そこで発明者は、自然界より多数の細菌をスクリーニングすることにより、アルカリ側で機能する光合成細菌およびラン色細菌を分離培養し、効率のよい有機物分解を行わせることに成功した。すなわち、本発明ではアルカリ側で機能する光合成細菌Rhodopseudomonas 2種とおよびラン色細菌Synechococcus 1種の菌体およびこの培養法を提供する。
鹿児島県内の30個所の土壌から光合成細菌およびラン色細菌20種を以下の方法で分離した。まず、集積培養では、1L容量のボトルに基本培地1(寒天無し)を満たし、現場土壌を加え15〜30℃、350〜2500luxの条件でインキュベータにて培養する。次にpercollにて、光合成細菌およびラン色細菌の画分を遠心分離する。さらに遠心分離して得られた着色画分を基本培地1の寒天培地上にて前記と同条件で培養し、コロニーを作らせる。得られた光合成細菌およびラン色細菌のコロニーを白金耳で釣菌し、嫌気的条件下でさらに純粋なコロニーを作らせる。
3種(A, B,)の選定。
上記の方法で20種のコロニーを純粋分離した。それぞれ有機物の分解活性を試験し最も分解活性の高い3種(A, B,)を選んだ。その他種類は有機物の分解活性を示さなかった。ここで、A、Bはそれぞれ、Rhodopseudomona、Rhodopseudomona、
原水 処理後(菌体をろ過した場合)
菌種 A, B,
SSppm 80,000 500 600
BODppm 24,000 80 100
CODppm 12,000 75 800
有機窒素ppm 800 200 300
有機リンppm 65 35 40
選定した菌体A、B、の落射蛍光顕微鏡写真を図1に示す。
3種(A、B)の同定結果を表1に示す。
Figure 0003699987
3種(A,B,C)の菌体色素の同定
菌体の色素成分の分光スペクトルを図2に示した。図2はアセトン−メタノールで抽出した色素成分を高速液体クロ的グラフによって分析したスペクトルである。この分光スペクトルはアセトン−メタノールで抽出した色素成分を高速液体クロ的グラフによって分析したスペクトルである。分析条件はいかのとおりである。ポンプ:日立高速液体クロマトグラフL−7100, デテクター: 日立L−7455、カラム:C−18、カラム温度:40℃、グラディエント条件、A:メタノール:1M酢酸アンモニウム=8:2 B:アセトニトリル:アセト=6:4、0分でA95%B5%、28分後Bが100%になるように設定した。
3種(A,B)の培養における、光合成細菌の最適pH
1 方法
基本培地1のpHをそれぞれ5.5、6.0、7.0、8.5、9.0に調製した。これらの培地を10mlネジ口試験管に満たし、光合成細菌培養体を接種した。その後、インキュベータにて培養した。結果を表2に示す。
2 結果
Figure 0003699987
3種(A, B)の培養における最大収量は表3の通りである
Figure 0003699987
アルカリ側で機能する光合成細菌の分離と組み合わせを検討した結果、以下の表4のとおり、3種(A, B, C)を混合して、糞尿を分解することが最も効率があがることを突き止めた。
Figure 0003699987
本分離菌株のDNA配列を定法にしたがって解析した。その結果を配列表に示す。
本発明の光合成細菌を用いることにより、畜産糞尿、食品廃棄物を処理することができる。
菌体A、Bの落射蛍光顕微鏡写真である。A、BにおいてはDAPI染色したものをUV励起で観察した。 菌体A、Bの色素成分の分光スペクトルである。
配列番号;1 配列の長さ;1406 配列の型;核酸 トポロジー;直鎖状 配列の種類;核酸 起源;16S rDNA 生物名;Rhodopseudomonas 株名; A株
配列
GGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGCGTAGCAATACGTCAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGGTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCGGATAAGCCCTTACGGGGAAAGATTTATCGCCGAAAGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGTGCGGGAAGATAATGACGGTACCGCAAGAATAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGGTTTCTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGCAGAGGTGAGTGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGGCCATTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTAGTGGGTTTACTCACTAGTGGCGCAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATGTCCAGGACCGGTCGCAGAGACGTGACCTTCTCTTCGGAGCCTGGAGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCGTCCTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGGGAAGCTAAGGGGCGACCCTTCGCAAATCTCAAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGGGCTCTGCAACTCGAGCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGCTTTACCTGAAGACGGTGCGCTAACCAGCAATGGAGGCAGCCGGCCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAA
配列番号;2 配列の長さ;1298 配列の型;核酸 トポロジー;直鎖状 配列の種類;核酸 起源;16S rDNA 生物名;Rhodopseudomonas 株名; B株
配列
GAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGGTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCGGATAAGCCCTTACGGGGAAAGATTTATCGCCGAAAGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGTGCGGGAAGATAATGACGGTACCGCAAGAATAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGGTTTCTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGCAGAGGTGAGTGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTNGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGGCCATTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTAGTGGGTTTACTCACTAGTGGCGCAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATGTCCAGGACCGGTCGCAGAGACGTGACCTTCTCTTCGGAGCCTGGAGCACAGGTGCTGCATGGCNGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCGTCCTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACCAGCTGCTACAATGGCGGTGACAATGGGAAGCTAAGGGGCGACCCTTCGCAAATCTCAAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGGGCTCTGCAACTCGAGCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGCTTTACCTGAAGACGGTGCGCTAACCAGC

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  1. pH8〜10の条件下で最大増殖速度を有する耐アルカリ性光合成細菌Rhodopseudomonas。
  2. 耐アルカリ性でバクテリアクロロフィルa、ノイロスポレン、リオコピンを有する光合成細菌Rhodopseudomos A株(受託番号FERM P−19432)。
  3. 耐アルカリ性でバクテリアクロロフィルa、ノイロスポレンを有する光合成細菌Rhodopseudomos B株(受託番号FERM P−19431)。
  4. 配列番号1記載の16s rDNA分子を有する光合成細菌Rhodopseudomos A株。
  5. 配列番号2記載の16s rDNA分子を有する光合成細菌Rhodopseudomos B株。
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