CN108395002B

CN108395002B - 偶氮染料降解脱色菌及其应用

Info

Publication number: CN108395002B
Application number: CN201710093073.3A
Authority: CN
Inventors: 吴世凯; 甘国娟; 梁岩; 潘永龙; 陈娇; 李其闯; 张琳
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS; Guangzhou Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS; Guangzhou Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: CN108395002A

Abstract

本发明公开了一种偶氮染料降解脱色菌及其应用。该偶氮染料降解脱色菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GDMCC No.60136。该偶氮染料降解脱色菌对偶氮染料具有降解脱色作用，4h对50mg/L甲基橙、25mg/L藏花猩红和50mg/L甲基红、50mg/L橙黄G、50mg/L橙黄G6、50mg/L刚果红等偶氮染料脱色率高达95％以上，是一种高效的偶氮染料降解脱色菌，在印染废水处理方面具有良好的应用前景。本发明研究可以填补领域技术空白，为解决印染废水处理尤其是脱色问题提供有力的技术支撑。

Description

偶氮染料降解脱色菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，尤其是涉及一种偶氮染料降解脱色菌及其应用。

背景技术

目前，全世界商用的染料已经超过10万种，分为偶氮染料、蒽醌染料、杂环染料、三苯甲烷染料、金属络合染料等。其中，偶氮类染料约占总量的70％。据报道，在生产和使用过程中，约有10％-15％的染料被释放到水环境中。水体中只要存在1mg/L左右染料就可产生很高色度，不仅影响水体美观，而且降低水体透光性和溶氧量，阻碍水生植物光合作用，造成自然水体污染并导致生态系统失衡。偶氮染料结构稳定，具有抗碱、抗酸、抗微生物、抗光等特性，可长时间滞留在环境中，因此具有长期潜在危害。同时，偶氮染料降解产物多为联苯胺等一些致癌的芳香类化合物，被排放到自然水体后，经过食物链富集进入人体后可导致膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌等恶性肿瘤疾病。因此偶氮染料的脱色降解处理刻不容缓。

国内外常用的偶氮染料废水脱色方法有物理法、化学法和生物法3类。生物法因其无二次污染、可回收目标物质、高效、节能等优点，已成为处理染料等持久性有机污染物研究的重点和热点。目前，微生物生物脱色瓶颈是：一种微生物只对一种或几种染料具有高效脱色效果，但处理耗时长，导致印染废水在曝气池的水力停留时间延长，进而增加了印染废水处理的成本。

发明内容

基于此，针对传统的生物法降解偶氮染料废水效果不太理想的问题，有必要提供一种对偶氮染料脱色降解效果好且效率高的偶氮染料降解脱色菌及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

本发明提供了一种偶氮染料降解脱色菌，并于2016年12月27日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GDMCC No.60136。

本发明是无意中发现刚果红染料会随着时间的推移，颜色越来越淡，并经过实验分析排除了温度、光照等因素的影响，经过对比未灭菌和灭菌处理的刚果红染料的脱色降解过程发现，未灭菌处理的刚果红染料更易脱色降解。在此基础上，通过将未灭菌处理的刚果红染料于LB培养基上培养，经过分离纯化最终得到一株单克隆菌落，命名为Paenibacillus dendritiformis GGJ7，其具有与Paenibacillus系列菌具有较高的同源性，尤其是与Paenibacillus dendritiformis CIP 105967(T)的同源性更高。

Paenibacillus dendritiformis GGJ7能降解脱色偶氮染料的原因是能够使偶氮键断裂。微生物对偶氮染料的脱色原理在于微生物在生长过程分泌的酶将偶氮键断裂，偶氮染料在偶氮键断裂后变成色度较低的芳香化合物，芳香化合物可被微生物利用，最终代谢为简单的化合物，完成偶氮染料的脱色。

因而，上述偶氮染料降解脱色菌可应用于脱色降解偶氮染料中。

通过对上述偶氮染料降解脱色菌进行染料的脱色降解实验分析，发现其具有较好的偶氮染料脱色效果，且降解效果显著。

在其中一个实施例中，所述偶氮染料是双偶氮染料。

在其中一个实施例中，所述双偶氮染料是刚果红。

在其中一个实施例中，所述偶氮染料是单偶氮染料。

在其中一个实施例中，所述单偶氮染料包括甲基橙、藏花猩红、甲基红、橙黄G及橙黄G6。

本发明的偶氮染料降解脱色菌可适用于偶氮染料的脱色降解，如双偶氮染料刚果红，尤其是刚果红浓度不大于1000mg/L的废液，也可以适用于单偶氮染料，如甲基橙、藏花猩红、甲基红、橙黄G、橙黄G6等。

在其中一个实施例中，所述脱色降解偶氮染料是指脱色降解含有偶氮染料的印染废水。

上述偶氮染料降解脱色菌可浓缩制成OD₆₀₀＝2的浓缩菌液，在使用时，按照体积比10％的接种量接种至偶氮染料的印染废水等废液中，在30-40℃、pH5-8等条件下静置处理，即可实现对偶氮染料的降解脱色。

此外，本发明还提供了一种偶氮染料脱色制剂，其含有上述偶氮染料降解脱色菌。

在其中一个实施例中，所述制剂为水剂、粉剂或膏剂。

通过将偶氮染料降解脱色菌制成脱色制剂，可便于使用，在使用时依据脱色制剂中菌体的浓度，按照合适的浓度加入至待处理的废液中即可。

附图说明

图1为Paenibacillus dendritiformis GGJ7的单克隆菌株在斜面培养基上的形态及颜色示意图；

图2为Paenibacillus dendritiformis GGJ7对刚果红的降解曲线；

图3为10株菌对刚果红的脱色效果图；图中：1为Ochrobactrum lupini LUP21T，2为Bacillus anthracis ATCC 14578T，3为Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717T，4为Bacillus subtilis NRRL B-23049T，5为Bacillus subtilis NRRL B-23049T，6为Moraxella osloensis DSM 6998T，7为Gordonia otitidis IFM 10032T，8为Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717T，9为Paenibacillus dendritiformis GGJ7，10为Ochrobactrum lupini LUP21T：Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717T：Paenibacillus dendritiformis GGJ7＝2：1：1的混合液；

图4为Paenibacillus dendritiformis GGJ7对10种染料的脱色效果；图中：1为刚果红，2为甲基橙，3为亚甲基蓝，4为甲基紫，5为藏花猩红，6为曙红B，7为甲基红，8为中性红，9为橙黄G，10为橙黄G6。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是可以更加透彻全面地理解本发明所公开的内容。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1：菌株Paenibacillus dendritiformis GGJ7的分离和富集

1)将未灭菌的40mg刚果红染料固体(国药集团化学试剂有限公司，CAS编号：573-58-0)投入灭菌的200mL LB培养基中，30℃静置培养72h后，随着时间的延长，发现刚果红颜色退去并有细菌生长。

2)对上述菌液进行梯度稀释，涂布于LB固体培养基上，37℃培养。

3)48h后，挑取单菌落，并涂布在新的LB固体培养基上，37℃继续培养，进一步分离和纯化菌体。

4)重复步骤3)，直到获得单克隆菌落，如图1所示，菌落颜色呈乳白色。

5)挑取单菌落加入到LB培养液中，过夜培养。

所述步骤1)～3)中LB培养基为25g LB肉汤溶解于超纯水，并定容于1L的容量瓶中，转移至1L三角瓶，121℃高压灭菌30min。LB固体培养基为：36g LB琼脂溶解于超纯水，并定容于1L的容量瓶中，转移至1L三角瓶，121℃高压灭菌30min；温度降到50℃倒平板。

提取细菌基因组RNA，采用细菌16S rRNA通用引物27F(5'–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID No.1)和1492R(5’-SGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID No.2)进行PCR扩增。PCR扩增的条件为：98℃预变性5min，95℃变性35S，55℃退火35S，72℃延伸1.5min，共39个循环，获得16S rRNA序列，回收纯化，送到公司测序，测序序列如SEQID No.3所示。将测序结果在EzBioCloud比对16S rRNA序列同源性，该菌株序列与Paenibacillusdendritiformis CIP 105967(T)同源性等于99.86％，命名为Paenibacillusdendritiformis GGJ7，并于2016年12月27日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号是GDMCC No.60136，2016年12月28检测证明菌体存活。

实施例2：Paenibacillus dendritiformis GGJ7对刚果红的脱色研究

将实施例1筛选得到的菌株Paenibacillus dendritiformis GGJ7接种于LB培养基中，于37℃、200rpm下摇床培养20h得菌株的培养液。

对菌株培养液以5000rmp离心10min收集菌，生理盐水洗涤2次浓缩，浓缩后菌液OD₆₀₀值为2。将5mL浓缩菌液接入含有45mL 50mg/L刚果红培养基的100mL三角瓶中，30℃静置培养，在培养一段时间后，取2mL培养物测其吸光度，设置2个重复。

用脱色率来考察菌株Paenibacillus dendritiformis GGJ7对偶氮染料的脱色能力。在200～1000nm波长范围内扫描染料LB溶液的吸光值，选出最大吸收峰M的波长作为染料吸光值的测定波长。将待测培养液于13000rpm条件下离心10min，取上清液测定吸光值。脱色率计算公式为：

脱色率＝(A-B)÷A×100％

式中，A表示不接种菌液的最大吸光度值；B表示接种菌液脱色一定时间后的吸光度值。

Paenibacillus dendritiformis GGJ7对刚果红脱色曲线如附图2所示，对50mg/L刚果红脱色率为95％仅需4h。

实施例3：Paenibacillus dendritiformis GGJ7对刚果红脱色的高效性研究

为了更好的说明Paenibacillus dendritiformis GGJ7对偶氮染料脱色具有高效性，实施例3选取了8个从浙江金华市某印染厂废水分离出菌株与Paenibacillusdendritiformis GGJ7一起对50mg/L刚果红进行脱色。

将9株菌株及1混合菌株分别接种于LB培养基中，于37℃、200rpm下摇床培养20h即得菌株培养液。对菌株培养液以5000rmp离心10min收集菌，生理盐水洗涤2次浓缩，浓缩后不同菌株OD₆₀₀值均调至2。将5mL浓缩菌液接入含有45mL 50mg/L刚果红培养基的100mL三角瓶中，30℃静置培养。在培养一段时间后，对培养液进行记录，并记录培养液随时间的变化。

结果如附图3所示：对于50mg/L刚果红溶液，Paenibacillus dendritiformisGGJ7仅需4h即可脱色完毕，而Bacillus anthracis ATCC 14578T和Moraxella osloensisDSM 6998T需要50h左右，而其它7个菌需要50h以上。从结果可以看出，Paenibacillusdendritiformis GGJ7对刚果红的脱色效率远远高于其它8个菌株。

实施例4：Paenibacillus dendritiformis GGJ7对不同类型染料的脱色效果研究

为了更好的说明Paenibacillus dendritiformis GGJ7对偶氮染料脱色具有高效性，实施例4使用Paenibacillus dendritiformis GGJ7对不同类型染料进行脱色。所述的染料包括偶氮染料刚果红、甲基橙、藏花猩红、甲基红、橙黄G、橙黄G6，杂环染料亚甲基蓝、曙红B、中性红，以及三苯甲烷染料甲基紫。

参照实施例2，培养并浓缩所述菌株，将OD₆₀₀＝2的浓缩菌液5mL分别接入含50mL不同染料培养基的100mL三角瓶中，其中染料的浓度分别为刚果红50mg/L、甲基橙50mg/L、藏花猩红25mg/L、甲基红25mg/L、橙黄G 50mg/L、橙黄G6 50mg/、亚甲基蓝10mg/L、曙红B50mg/L、中性红50mg/L、甲基紫50mg/L。将三角瓶置于恒温培养箱30℃静置培养。在培养一段时间后，对培养液进行记录，并记录培养液颜色随时间的变化。

结果如图4所示：Paenibacillus dendritiformis GGJ7对甲基橙、藏花猩红、甲基红完全脱色只需1h，对亚甲基蓝几乎完全脱色只需1h，对橙黄G和橙黄G6完全脱色只需3h,对刚果红完全脱色只需4h；在6h内对甲基紫、曙红B、中性红脱色不明显。Paenibacillusdendritiformis GGJ7对亚甲基蓝脱色明显，是细菌的吸附脱色，可通过摇晃三角瓶恢复颜色，而对偶氮染料的高效脱色是降解脱色，摇晃三角瓶不可恢复颜色。

由上述实施例可以看出：

(1)实施例1从刚果红染料中分离得到菌株Paenibacillus dendritiformisGGJ7，种源易得且分离纯化简便快捷，成本低，对环境友好。

(2)分离纯化得到Paenibacillus dendritiformis GGJ7可以有效脱色刚果红，4h对50mg/L的刚果红脱色95％；该菌株从毒性较高的刚果红染料分离纯化得到，因此该菌株能适应毒性较高的印染废水，这使得该菌的应用前景广阔。

(3)分离纯化得到Paenibacillus dendritiformis GGJ7不仅能高效脱色双偶氮染料刚果红，而且更高效的脱色单偶氮染料甲基橙、藏花猩红、甲基红、橙黄G、橙黄G6，并且对三苯甲烷染料及杂环染料也有脱色效果，对亚甲基蓝有很强的吸附作用。可见该菌对实际染料废水的处理具有较高的应用潜力。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州中国科学院先进技术研究所、深圳先进技术研究院

<120> 偶氮染料降解脱色菌及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

sgttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1426

<212> DNA

<213> 天然序列

<400> 3

aatacatgca agtcgagcgg agcggatgga gagcttgcac tcctgatgct tagcggcgga 60

cgggtgagta atacgtaggt aacctgccct taagaccggg ataactcacg gaaacgtggg 120

ctaataccgg ataggcgatt tcctcgcatg agggaatcgg gaaaggcgga gcaatctgcc 180

acttatggat ggacctacgg cgcattagct agttggtggg gtaacggctc accaaggcga 240

cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300

tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gcaagtctga cggagcaacg 360

ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgccagggaa gaacgctatg 420

gagagtaact gttccatagg tgacggtacc tgagaagaaa gccccggcta actacgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgta gggggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg 540

cgcaggcggt catgtaagtc tggtgtttaa acccggggct caactccggg tcgcatcgga 600

aactgtgtga cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct gggctgtaac tgacgctgag 720

gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780

gaatgctagg tgttaggggt ttcgataccc ttggtgccga agttaacaca ttaagcattc 840

cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag 900

cagtggagta tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960

ctctgaccgt cctagagata gggcttccct tcggggcaga ggtgacaggt ggtgcatggt 1020

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttaac 1080

tttagttgcc agcattaagt tgggcactct agagtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140

ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtactacaat 1200

ggctggtaca acgggaagcg aagccgcgag gtggagcgaa tcctaaaaag ccagtctcag 1260

ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat gaagtcggaa ttgctagtaa tcgcggatca 1320

gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380

ttacaacacc cgaagtcggt ggggtaaccg caaggagcca gccgcc 1426

Claims

1.一种偶氮染料降解脱色菌，其分类学名称是Paenibacillus dendritiformis，保藏号是GDMCC No.60136。

2.权利要求1所述的偶氮染料降解脱色菌在脱色降解偶氮染料中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述偶氮染料是双偶氮染料。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述双偶氮染料是刚果红。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述偶氮染料是单偶氮染料。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述单偶氮染料包括甲基橙、藏花猩红、甲基红及橙黄G。

7.如权利要求2～6中任一项所述的应用，其特征在于，所述脱色降解偶氮染料是指脱色降解含有偶氮染料的印染废水。

8.一种偶氮染料脱色制剂，其特征在于，含有如权利要求1所述的偶氮染料降解脱色菌。

9.如权利要求8所述的偶氮染料脱色制剂，其特征在于，所述制剂为水剂、粉剂或膏剂。