JP3672180B2 - アグリカン分解剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アグリカン分解剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＤＡＭＴＳ−１（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ｍｏｔｉｆｓ）タンパク質は、ＡＤＡＭタイプのメタロプロテアーゼ活性と、トロンボスポンジンタイプ１モチーフとを有するＡＤＡＭＴＳファミリーの最初のタンパク質として発見された。
【０００３】
ＡＤＡＭファミリー、すなわち、ジスインテグリンドメインとメタロプロテアーゼドメインとを有するタンパク質群は、それらの核酸及びアミノ酸配列がヘビ毒のジスインテグリン及びメタロプロテアーゼの核酸及びアミノ酸配列と非常に酷似している（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３１，２７５−２７８，１９９５；Ｃｅｌｌ，９０，５８９−５９２，１９９７；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２７８，２７８−２８４，１９９９）。ＡＤＡＭファミリーが発見された頃は、ジスインテグリン構造が細胞間の相互作用において重要な役割を果たしていると考えられた（Ｎａｔｕｒｅ，３５６，２４８−２５２，１９９２；Ｎａｔｕｒｅ，３７７，６５２−６５６，１９９５）が、その後の研究により、ＡＤＡＭファミリーの細胞膜結合型メタロプロテアーゼ活性が、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の前駆体やショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）デルタタンパク質のような細胞表面に存在する種々のタンパク質を切断し、細胞表面から放出させる活性を有することが判明した（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７２９−７３３，１９９７；Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７３３−７３６，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，９１−９４，１９９９）。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は、レプロリシン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）タイプのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ドメイン１個と、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）タイプ１モチーフ３個とを有し、ＡＤＡＭファミリーに属するタンパク質である。ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子は、癌悪疫質をイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で引き起こす大腸癌株ｃｏｌｏｎ２６から単離された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，５５６−５６２，１９９７；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４６，４６６−４７１，１９９７）。ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のＴＳＰタイプ１モチーフはヘパリンに結合するが、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は、細胞外マトリックス［ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ）］に取り込まれて存在する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１３９１２−１３９１７，１９９８）。ＭＭＰドメインにタンパク質分解酵素活性があるものと思われる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１８８２１−１８８２６，１９９９）。本発明者の以前の研究により、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は細胞外マトリックス結合型メタロプロテアーゼであることが判明しており、細胞外マトリックス中の硫酸化グリコサミノグリカンに結合していることが示唆された。
更に、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子の発現が、ヒト関節軟骨及び関節炎症組織で検出されていることも知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３４４３−２３４５０，１９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２６０，３１８−３２２，１９９９）。
【０００５】
アグリカンは、関節軟骨の細胞外マトリックスに存在する主要なプロテオグリカンであり、そのコアタンパク質は、コンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸グリコサミノグリカンにより修飾されている。これらの修飾により、軟骨組織に水分を供給したり、柔軟性を与えている（ＦＡＳＥＢ Ｊ．，６，８６１−８７０，１９９２；Ｔｒｅｎｄ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５，４５８−４６５，１９９５）。
アグリカンは、複数のドメイン、すなわち、Ｎ末端の球状ドメイン（Ｇ１及びＧ２）、グリコサミノグリカン結合領域、及びＣ末端の球状ドメイン（Ｇ３）からなっている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１７７５７−１７７６７，１９８７）。これらのアグリカンが、それぞれ単量体として、Ｇ１ドメインを介してヒアルロン酸に結合し、アグリカン集合体の形で軟骨マトリックス中に留まっている。
【０００６】
関節炎による軟骨破壊の際には、アグリカンの球状ドメイン中の２箇所の特定部位における切断により大量のアグリカンが軟骨組織から失われることが知られている。前記切断が起こる場所は、第３４１番目のアスパラギン残基と第３４２番目のフェニルアラニン残基との間（Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２）と、第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）とであり、後者のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の結合を切断する酵素はアグリカナーゼと呼ばれている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，８６８３−８６８５，１９９１；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｊ．，２８４，５８９−５９３，１９９２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３４４３−２３４５０，１９９９；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２６，４４９−４５５，１９９９）。
【０００７】
Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の結合を切断されることにより生じる分解物は、軟骨やコンドロサイト（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）培養液中（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，８６８３−８６８５，１９９１；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｊ．，２８４，５８９−５９３，１９９２；Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３２２，２２−３０，１９９５；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５５０−２５５６，１９９５）や、種々の関節疾患患者の関節滑液中に検出される（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．，８９，１５１２−１５１６，１９９２；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，９，１２１４−１２２２，１９９３；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．，１００，９３−１０６，１９９７）。このように、アグリカナーゼは、関節炎における軟骨破壊において重要な役割を果たしており、アグリカナーゼ活性の亢進は、種々の関節疾患（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は関節損傷）を引き起こすことが知られている。また、アグリカナーゼ活性の亢進が脳梗塞時の組織損傷を引き起こすことも示唆されている。
【０００８】
一方、アグリカナーゼ活性の低下は、軟骨のリモデリング（すなわち、軟骨の破壊と再生）異常を引き起こすことが知られており、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病として、例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症が知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、本発明者は、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の生体内での機能を鋭意探求する過程において、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質がアグリカナーゼ活性を有することを新たに見出した。
本発明者が見出したＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアグリカナーゼ活性を利用すると、軟骨のリモデリング異常の正常化や、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防が可能である。また、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることにより、アグリカナーゼ活性を調節（促進又は阻害）することのできる化合物のスクリーニングも可能である。このスクリーニングにより選択されるアグリカナーゼ活性調節剤の内、アグリカナーゼ活性促進剤は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する疾病、例えば、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防に有用である。また、アグリカナーゼ活性阻害剤は、アグリカナーゼ活性の亢進に由来する疾病、例えば、軟骨破壊に起因する疾病の治療又は予防に有用である。本発明はこのような知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明の課題は、新規のアグリカン分解剤、軟骨のリモデリング異常の正常化剤、及び軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防剤を提供すること、そして、アグリカナーゼ活性の低下又は亢進に由来する疾病の治療又は予防に有用なアグリカナーゼ活性調節剤をスクリーニングすることのできる方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、（１）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又は（２）天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質（以下、「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体」と称する）を有効成分として含有することを特徴とする、アグリカン分解剤によって解決することができる。
また、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を有効成分として含有することを特徴とする、軟骨のリモデリング異常の正常化剤に関する。
また、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を有効成分として含有することを特徴とする、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防剤にも関する。
【００１２】
本明細書において「アグリカン」とは、関節軟骨の細胞外マトリックスに存在し、Ｎ末端の２個の球状ドメイン（Ｇ１及びＧ２）、グリコサミノグリカン結合領域、及びＣ末端の球状ドメイン（Ｇ３）からなるコアタンパク質と、このコアタンパク質を修飾するコンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸グリコサミノグリカンとからなるプロテオグリカンを意味する。
また、本明細書において「アグリカナーゼ活性」とは、アグリカンを分解する活性を意味し、例えば、ヒトアグリカンのコアタンパク質の第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）の結合を切断する活性を意味する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアグリカン分解剤は、有効成分として、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を含有する。
【００１４】
本明細書において「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質」とは、特開平１１−４６７８１号公報に開示されているヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、及びこのヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質に相当する種々の動物におけるタンパク質、例えば、マウスＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，５５６−５６２，１９９７）を意味する。すなわち、ヒトを含む種々の動物の天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を意味する。前記ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質はアミノ酸残基７２７個からなり、そのアミノ酸配列は前記特開平１１−４６７８１号公報に開示されている。
【００１５】
また、本明細書において「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体」とは、天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又はそれ以上（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質を意味する。ここで、「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性」とは、前記特開平１１−４６７８１号公報に開示されているように、造血機能に影響を与える活性、例えば、白血球及び血小板の数を低下させ、同時に、赤血球の数を増加させる活性を意味する。
【００１６】
本発明のアグリカン分解剤に含有される前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体の形状は、そのアグリカナーゼ活性が維持されている限り、特に限定されるものではなく、例えば、天然型のＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質それ自体であることもできるし、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体と融合用パートナー（例えば、タンパク質又はペプチド）との融合タンパク質であることもできる。
前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用のタンパク質又はペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はヒスチジンのヘキサペプチド］、検出用のタンパク質又はペプチド［例えば、β−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ）］、又は発現用のタンパク質又はペプチド（例えば、シグナル配列）を挙げることができる。
【００１７】
本発明のアグリカン分解剤は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を、それ単独で、あるいは、所望により薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
【００１８】
投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００１９】
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００２０】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分としての前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明のアグリカン分解剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明のアグリカン分解剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００２１】
本発明のアグリカン分解剤は、これに限定されるものではないが、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明のアグリカン分解剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
更に、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００２２】
本発明のアグリカン分解剤に含有されるＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体は、アグリカナーゼ活性、すなわち、アグリカンを分解する活性を有する。従って、本発明によるアグリカン分解剤の有効成分として使用することのできるＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する異常（例えば、軟骨のリモデリング異常）の正常化剤の有効成分としても使用することができるし、あるいは、前記異常に起因する疾病（例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症）の治療又は予防剤の有効成分としても使用することができる。
【００２３】
本発明によるアグリカナーゼ活性調節剤のスクリーニング方法では、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体と、アグリカナーゼの基質であるアグリカンとを用いる。試験化合物不在下及び試験化合物存在下の各条件下において、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体とアグリカンとを接触させ、前記各条件下におけるアグリカン分解反応による変化の差異を比較する。前記「アグリカン分解反応による変化の差異」としては、例えば、アグリカン分解産物の量の増加又は減少を挙げることができる。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法に用いることのできるアグリカンは、ヒトアグリカンに限定されるものではなく、ヒト以外の種［例えば、ほ乳類（例えば、ウシ、マウス、又はウサギ）］のアグリカンを用いることができる。
また、本発明のスクリーニング方法に用いることのできるＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質も、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質に限定されるものではなく、ヒト以外の種［例えば、ほ乳類（例えば、ウシ、マウス、又はウサギ）］のＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることができる。
更に、本発明のスクリーニング方法においては、前記アグリカンと前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体との組み合わせも特に限定されるものではなく、例えば、同種由来のアグリカン及びＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることもできるし、異種由来のアグリカン及びＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることもできる。
【００２５】
ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体は、アグリカンのコアタンパク質における第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）の結合を切断するので、前記アグリカン分解産物として、コンドロイチン硫酸を有する約１００ｋｄのポリペプチドが生じる。アグリカン分解産物の量を比較する手段としては、公知のタンパク質分析方法、例えば、ウエスタンブロット法を用いることができる。
【００２６】
ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体とアグリカンとの接触は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体のアグリカナーゼ活性が認められる条件下で実施する限り、特に限定されるものではなく、例えば、後述の実施例１（２）に記載のアグリカナーゼ反応用バッファー中において実施することができる。
【００２７】
前記比較において、試験化合物不在下（すなわち、コントロール）におけるアグリカン分解産物の量よりも、試験化合物存在下におけるアグリカン分解産物の量が少ない場合には、前記試験化合物がアグリカナーゼ活性阻害作用を有すると判定することができる。アグリカナーゼ活性阻害作用を有する試験化合物（すなわち、アグリカナーゼ活性阻害剤）は、アグリカナーゼ活性の亢進に由来する疾病、例えば、軟骨破壊に起因する疾病（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は関節損傷）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。
【００２８】
一方、試験化合物不在下（コントロール）におけるアグリカン分解産物の量よりも、試験化合物存在下におけるアグリカン分解産物の量が多い場合には、前記試験化合物がアグリカナーゼ活性促進作用を有すると判定することができる。アグリカナーゼ活性促進作用を有する試験化合物（すなわち、アグリカナーゼ活性促進剤）は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する疾病、例えば、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病（例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。
【００２９】
本発明によるアグリカナーゼ活性調節剤のスクリーニング方法に用いることのできる試験化合物は、特に限定されるものではなく、天然化合物又は合成化合物のいずれであることもできる。また、本発明のスクリーニング方法に使用する際の形状も特に限定されるものではなく、精製した状態以外にも、未精製の状態、例えば、発酵生産物、又は細胞若しくは組織抽出液の形で用いることもできる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
（１）組換えヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の調製
塩基配列：
ｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｃｃａａｔｇｃａｇｃｇａｇｃｔｇｔｇ
からなるフォーワードプライマー及び塩基配列：
ｃａｃｔｃｔａｇａｃｔｃｃａｇｃｃｔｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｃｃｔｇ
からなるリバースプライマーと、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．；米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）とを用いて、常法に従い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質をコードする遺伝子（約３ｋｂｐのｃＤＮＡ）を単離した。得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、特開平１１−４６７８１号公報に記載のヒトＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子の塩基配列と一致した。
【００３１】
続いて、制限酵素ＸｂａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩにより前記ｃＤＮＡの末端を切断した後、アガロースゲル電気泳動にかけた。約３ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収し、動物細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）のＸｂａＩ／ＮｏｔＩサイトに連結することにより、ＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターを構築した。なお、このＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターにより発現されるタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のＣ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）残基６個が付加された組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質（以下、単に「組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質」と称する）である。
【００３２】
得られたＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターを、トランスフェクション用試薬（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いて、添付のプロトコールに従い、動物細胞株ＨＥＫ２９３に導入した。導入から８時間後に、ヘパリン（５μｇ／ｍＬ）を含有する無血清のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（日水，日本国東京）で細胞を洗い、更に２日間培養した。組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のＣ末端にはヒスチジン（Ｈｉｓ）残基６個が存在するので、ニッケルキレーティングカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；スウェーデン・ウプサラ）を用いて、添付のプロトコールに従い、前記組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を精製した（すなわち、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を含有する画分を得た）。
【００３３】
また、後述の「アグリカナーゼ活性の評価」においてコントロールとして使用するために、ＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターを導入した動物細胞の代わりに、前記ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質をコードする遺伝子を含まない）を導入した動物細胞を用いたこと以外は、前記の培養及び精製工程を繰り返すことにより、前記組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分に相当するコントロール用画分を取得した。
【００３４】
（２）アグリカナーゼ活性の評価
アグリカナーゼ活性の評価に用いたアグリカンの調製は、公知方法（Ｈａｒｄｉｎｇｈａｍの方法；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７７，２３７−２４７，１９７９）により行なった。すなわち、牛鼻軟骨組織より、グアニジン塩酸４ｍｏｌ／Ｌで抽出した後、塩化セシウム濃度勾配超遠心法により精製した。
【００３５】
アグリカン１０μｇと、前記実施例１（１）で調製した組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分（組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の量として０．５μｇ）又はコントロール用画分とを、アグリカナーゼ反応用バッファー［トリス−ＨＣｌ−２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．６），ＮａＣｌ−１５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣａＣｌ2５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＮ3０．０１％］１００μＬ中において、３７℃で１２時間反応させた。
【００３６】
反応終了後、更に、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業；日本国東京）（０．０５ユニット／プロテオグリカン１０μｇ）及びケラタナーゼ（生化学工業）（０．０５ユニット／プロテオグリカン１０μｇ）を加え、糖鎖分解反応用液［トリス−ＨＣｌ−５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０），酢酸ナトリウム３０ｍｍｏｌ／Ｌ，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ，フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）５ｍｍｏｌ／Ｌ，ペプスタチンＡ−０．３６ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎ−エチルマレイミド１０ｍｍｏｌ／Ｌ］２００μＬ中において、３７℃で３時間反応させることによって糖鎖を分解した。
【００３７】
２段階の反応を実施した反応液を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー［トリス−ＨＣｌ−６０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８），ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２％，メルカプトエタノール５％，グリセロール１０％］中において、１００℃で５分間処理した後、濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度勾配＝２〜１５％）を実施した。
常法に従い、ゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した後、このメンブレンをブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋ ＡＣＥ；大日本製薬；日本国大阪）中において、３７℃で一晩処理した。
【００３８】
ウエスタンブロット法は、一次抗体として、抗コンドロイチン４−硫酸抗体（２−Ｂ−６抗体；アグリカンのコアタンパク質を認識して結合する）を使用し、二次抗体として、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ由来抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用し、検出系として、ケミルミネッセンスシステム（ＥＣＬシステム；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して実施した。
【００３９】
ウエスタンブロット法の結果を図１に示す。図１において、レーン１は、コントロール用画分を用いた場合の結果であり、レーン２は、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分を用いた場合の結果である。また、図１において、レーン１の左側に上下方向に一列に並ぶ各横線は、分子量マーカーとして用いたタンパク質の位置を表わし、前記各横線の左側の各数字は、分子量マーカーとして用いたタンパク質の各分子量（単位＝ｋｄ）を表わす。
レーン２の約１００ｋｄの位置に現われたバンド（矢印で示すバンド）が、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質により分解されたアグリカンのコアタンパク質である。なお、データは示していないが、アグリカナーゼ反応用バッファー中におけるアグリカンと各画分との反応の際に、キレート試薬であるＥＤＴＡを添加すると（アグリカナーゼの活性発現のためには、Ｃａイオンが必要であることが知られている）、約１００ｋｄの前記バンドは検出されなかった。これらの結果から、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質にアグリカナーゼ活性があることが判明した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のアグリカン分解剤によれば、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病、例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症を治療又は予防することができる。
また、本発明によるアグリカナーゼ活性調節剤のスクリーニング方法によれば、アグリカナーゼ活性促進剤又はアグリカナーゼ活性阻害剤を選択することができる。前記アグリカナーゼ活性促進剤は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する異常（例えば、軟骨のリモデリング異常）に起因する疾病（例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。また、前記アグリカナーゼ活性阻害剤は、アグリカナーゼ活性の亢進に由来する疾病、例えば、軟骨破壊に起因する疾病（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は関節損傷）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分又はコントロール用画分とアグリカンとの反応物を電気泳動した結果を示す、図面に代わる写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アグリカン分解剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＤＡＭＴＳ−１（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ｍｏｔｉｆｓ）タンパク質は、ＡＤＡＭタイプのメタロプロテアーゼ活性と、トロンボスポンジンタイプ１モチーフとを有するＡＤＡＭＴＳファミリーの最初のタンパク質として発見された。
【０００３】
ＡＤＡＭファミリー、すなわち、ジスインテグリンドメインとメタロプロテアーゼドメインとを有するタンパク質群は、それらの核酸及びアミノ酸配列がヘビ毒のジスインテグリン及びメタロプロテアーゼの核酸及びアミノ酸配列と非常に酷似している（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３１，２７５−２７８，１９９５；Ｃｅｌｌ，９０，５８９−５９２，１９９７；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２７８，２７８−２８４，１９９９）。ＡＤＡＭファミリーが発見された頃は、ジスインテグリン構造が細胞間の相互作用において重要な役割を果たしていると考えられた（Ｎａｔｕｒｅ，３５６，２４８−２５２，１９９２；Ｎａｔｕｒｅ，３７７，６５２−６５６，１９９５）が、その後の研究により、ＡＤＡＭファミリーの細胞膜結合型メタロプロテアーゼ活性が、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の前駆体やショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）デルタタンパク質のような細胞表面に存在する種々のタンパク質を切断し、細胞表面から放出させる活性を有することが判明した（Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７２９−７３３，１９９７；Ｎａｔｕｒｅ，３８５，７３３−７３６，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，９１−９４，１９９９）。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は、レプロリシン（ｒｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）タイプのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ドメイン１個と、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）タイプ１モチーフ３個とを有し、ＡＤＡＭファミリーに属するタンパク質である。ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子は、癌悪疫質をイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で引き起こす大腸癌株ｃｏｌｏｎ２６から単離された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，５５６−５６２，１９９７；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４６，４６６−４７１，１９９７）。ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のＴＳＰタイプ１モチーフはヘパリンに結合するが、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は、細胞外マトリックス［ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ）］に取り込まれて存在する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１３９１２−１３９１７，１９９８）。ＭＭＰドメインにタンパク質分解酵素活性があるものと思われる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１８８２１−１８８２６，１９９９）。本発明者の以前の研究により、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質は細胞外マトリックス結合型メタロプロテアーゼであることが判明しており、細胞外マトリックス中の硫酸化グリコサミノグリカンに結合していることが示唆された。
更に、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子の発現が、ヒト関節軟骨及び関節炎症組織で検出されていることも知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３４４３−２３４５０，１９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２６０，３１８−３２２，１９９９）。
【０００５】
アグリカンは、関節軟骨の細胞外マトリックスに存在する主要なプロテオグリカンであり、そのコアタンパク質は、コンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸グリコサミノグリカンにより修飾されている。これらの修飾により、軟骨組織に水分を供給したり、柔軟性を与えている（ＦＡＳＥＢ Ｊ．，６，８６１−８７０，１９９２；Ｔｒｅｎｄ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５，４５８−４６５，１９９５）。
アグリカンは、複数のドメイン、すなわち、Ｎ末端の球状ドメイン（Ｇ１及びＧ２）、グリコサミノグリカン結合領域、及びＣ末端の球状ドメイン（Ｇ３）からなっている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１７７５７−１７７６７，１９８７）。これらのアグリカンが、それぞれ単量体として、Ｇ１ドメインを介してヒアルロン酸に結合し、アグリカン集合体の形で軟骨マトリックス中に留まっている。
【０００６】
関節炎による軟骨破壊の際には、アグリカンの球状ドメイン中の２箇所の特定部位における切断により大量のアグリカンが軟骨組織から失われることが知られている。前記切断が起こる場所は、第３４１番目のアスパラギン残基と第３４２番目のフェニルアラニン残基との間（Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２）と、第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）とであり、後者のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の結合を切断する酵素はアグリカナーゼと呼ばれている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，８６８３−８６８５，１９９１；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｊ．，２８４，５８９−５９３，１９９２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３４４３−２３４５０，１９９９；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２６，４４９−４５５，１９９９）。
【０００７】
Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４の結合を切断されることにより生じる分解物は、軟骨やコンドロサイト（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）培養液中（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，８６８３−８６８５，１９９１；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｊ．，２８４，５８９−５９３，１９９２；Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３２２，２２−３０，１９９５；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５５０−２５５６，１９９５）や、種々の関節疾患患者の関節滑液中に検出される（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．，８９，１５１２−１５１６，１９９２；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，９，１２１４−１２２２，１９９３；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．，１００，９３−１０６，１９９７）。このように、アグリカナーゼは、関節炎における軟骨破壊において重要な役割を果たしており、アグリカナーゼ活性の亢進は、種々の関節疾患（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は関節損傷）を引き起こすことが知られている。また、アグリカナーゼ活性の亢進が脳梗塞時の組織損傷を引き起こすことも示唆されている。
【０００８】
一方、アグリカナーゼ活性の低下は、軟骨のリモデリング（すなわち、軟骨の破壊と再生）異常を引き起こすことが知られており、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病として、例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症が知られている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、本発明者は、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の生体内での機能を鋭意探求する過程において、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質がアグリカナーゼ活性を有することを新たに見出した。
本発明者が見出したＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアグリカナーゼ活性を利用すると、軟骨のリモデリング異常の正常化や、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防が可能である。また、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることにより、アグリカナーゼ活性を調節（促進又は阻害）することのできる化合物のスクリーニングも可能である。このスクリーニングにより選択されるアグリカナーゼ活性調節剤の内、アグリカナーゼ活性促進剤は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する疾病、例えば、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防に有用である。また、アグリカナーゼ活性阻害剤は、アグリカナーゼ活性の亢進に由来する疾病、例えば、軟骨破壊に起因する疾病の治療又は予防に有用である。本発明はこのような知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明の課題は、新規のアグリカン分解剤、軟骨のリモデリング異常の正常化剤、及び軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防剤を提供すること、そして、アグリカナーゼ活性の低下又は亢進に由来する疾病の治療又は予防に有用なアグリカナーゼ活性調節剤をスクリーニングすることのできる方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、（１）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又は（２）天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質（以下、「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体」と称する）を有効成分として含有することを特徴とする、アグリカン分解剤によって解決することができる。
また、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を有効成分として含有することを特徴とする、軟骨のリモデリング異常の正常化剤に関する。
また、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を有効成分として含有することを特徴とする、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防剤にも関する。
【００１２】
本明細書において「アグリカン」とは、関節軟骨の細胞外マトリックスに存在し、Ｎ末端の２個の球状ドメイン（Ｇ１及びＧ２）、グリコサミノグリカン結合領域、及びＣ末端の球状ドメイン（Ｇ３）からなるコアタンパク質と、このコアタンパク質を修飾するコンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸グリコサミノグリカンとからなるプロテオグリカンを意味する。
また、本明細書において「アグリカナーゼ活性」とは、アグリカンを分解する活性を意味し、例えば、ヒトアグリカンのコアタンパク質の第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）の結合を切断する活性を意味する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアグリカン分解剤は、有効成分として、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を含有する。
【００１４】
本明細書において「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質」とは、特開平１１−４６７８１号公報に開示されているヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、及びこのヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質に相当する種々の動物におけるタンパク質、例えば、マウスＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，５５６−５６２，１９９７）を意味する。すなわち、ヒトを含む種々の動物の天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を意味する。前記ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質はアミノ酸残基７２７個からなり、そのアミノ酸配列は前記特開平１１−４６７８１号公報に開示されている。
【００１５】
また、本明細書において「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の機能的等価改変体」とは、天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又はそれ以上（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質を意味する。ここで、「ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性」とは、前記特開平１１−４６７８１号公報に開示されているように、造血機能に影響を与える活性、例えば、白血球及び血小板の数を低下させ、同時に、赤血球の数を増加させる活性を意味する。
【００１６】
本発明のアグリカン分解剤に含有される前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体の形状は、そのアグリカナーゼ活性が維持されている限り、特に限定されるものではなく、例えば、天然型のＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質それ自体であることもできるし、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体と融合用パートナー（例えば、タンパク質又はペプチド）との融合タンパク質であることもできる。
前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用のタンパク質又はペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はヒスチジンのヘキサペプチド］、検出用のタンパク質又はペプチド［例えば、β−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ）］、又は発現用のタンパク質又はペプチド（例えば、シグナル配列）を挙げることができる。
【００１７】
本発明のアグリカン分解剤は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を、それ単独で、あるいは、所望により薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
【００１８】
投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００１９】
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００２０】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分としての前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明のアグリカン分解剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明のアグリカン分解剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００２１】
本発明のアグリカン分解剤は、これに限定されるものではないが、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明のアグリカン分解剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
更に、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００２２】
本発明のアグリカン分解剤に含有されるＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体は、アグリカナーゼ活性、すなわち、アグリカンを分解する活性を有する。従って、本発明によるアグリカン分解剤の有効成分として使用することのできるＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する異常（例えば、軟骨のリモデリング異常）の正常化剤の有効成分としても使用することができるし、あるいは、前記異常に起因する疾病（例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症）の治療又は予防剤の有効成分としても使用することができる。
【００２３】
本発明によるアグリカナーゼ活性調節剤のスクリーニング方法では、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体と、アグリカナーゼの基質であるアグリカンとを用いる。試験化合物不在下及び試験化合物存在下の各条件下において、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体とアグリカンとを接触させ、前記各条件下におけるアグリカン分解反応による変化の差異を比較する。前記「アグリカン分解反応による変化の差異」としては、例えば、アグリカン分解産物の量の増加又は減少を挙げることができる。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法に用いることのできるアグリカンは、ヒトアグリカンに限定されるものではなく、ヒト以外の種［例えば、ほ乳類（例えば、ウシ、マウス、又はウサギ）］のアグリカンを用いることができる。
また、本発明のスクリーニング方法に用いることのできるＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質も、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質に限定されるものではなく、ヒト以外の種［例えば、ほ乳類（例えば、ウシ、マウス、又はウサギ）］のＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることができる。
更に、本発明のスクリーニング方法においては、前記アグリカンと前記ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体との組み合わせも特に限定されるものではなく、例えば、同種由来のアグリカン及びＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることもできるし、異種由来のアグリカン及びＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を用いることもできる。
【００２５】
ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体は、アグリカンのコアタンパク質における第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）の結合を切断するので、前記アグリカン分解産物として、コンドロイチン硫酸を有する約１００ｋｄのポリペプチドが生じる。アグリカン分解産物の量を比較する手段としては、公知のタンパク質分析方法、例えば、ウエスタンブロット法を用いることができる。
【００２６】
ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体とアグリカンとの接触は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又はその機能的等価改変体のアグリカナーゼ活性が認められる条件下で実施する限り、特に限定されるものではなく、例えば、後述の実施例１（２）に記載のアグリカナーゼ反応用バッファー中において実施することができる。
【００２７】
前記比較において、試験化合物不在下（すなわち、コントロール）におけるアグリカン分解産物の量よりも、試験化合物存在下におけるアグリカン分解産物の量が少ない場合には、前記試験化合物がアグリカナーゼ活性阻害作用を有すると判定することができる。アグリカナーゼ活性阻害作用を有する試験化合物（すなわち、アグリカナーゼ活性阻害剤）は、アグリカナーゼ活性の亢進に由来する疾病、例えば、軟骨破壊に起因する疾病（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は関節損傷）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。
【００２８】
一方、試験化合物不在下（コントロール）におけるアグリカン分解産物の量よりも、試験化合物存在下におけるアグリカン分解産物の量が多い場合には、前記試験化合物がアグリカナーゼ活性促進作用を有すると判定することができる。アグリカナーゼ活性促進作用を有する試験化合物（すなわち、アグリカナーゼ活性促進剤）は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する疾病、例えば、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病（例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。
【００２９】
本発明によるアグリカナーゼ活性調節剤のスクリーニング方法に用いることのできる試験化合物は、特に限定されるものではなく、天然化合物又は合成化合物のいずれであることもできる。また、本発明のスクリーニング方法に使用する際の形状も特に限定されるものではなく、精製した状態以外にも、未精製の状態、例えば、発酵生産物、又は細胞若しくは組織抽出液の形で用いることもできる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
（１）組換えヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の調製
塩基配列：
ｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｃｃａａｔｇｃａｇｃｇａｇｃｔｇｔｇ
からなるフォーワードプライマー及び塩基配列：
ｃａｃｔｃｔａｇａｃｔｃｃａｇｃｃｔｔｃｔｔｇｃｔｔｔｃｃｃｔｇ
からなるリバースプライマーと、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．；米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）とを用いて、常法に従い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質をコードする遺伝子（約３ｋｂｐのｃＤＮＡ）を単離した。得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析した結果、特開平１１−４６７８１号公報に記載のヒトＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子の塩基配列と一致した。
【００３１】
続いて、制限酵素ＸｂａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩにより前記ｃＤＮＡの末端を切断した後、アガロースゲル電気泳動にかけた。約３ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収し、動物細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）のＸｂａＩ／ＮｏｔＩサイトに連結することにより、ＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターを構築した。なお、このＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターにより発現されるタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のＣ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）残基６個が付加された組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質（以下、単に「組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質」と称する）である。
【００３２】
得られたＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターを、トランスフェクション用試薬（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いて、添付のプロトコールに従い、動物細胞株ＨＥＫ２９３に導入した。導入から８時間後に、ヘパリン（５μｇ／ｍＬ）を含有する無血清のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（日水，日本国東京）で細胞を洗い、更に２日間培養した。組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のＣ末端にはヒスチジン（Ｈｉｓ）残基６個が存在するので、ニッケルキレーティングカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；スウェーデン・ウプサラ）を用いて、添付のプロトコールに従い、前記組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を精製した（すなわち、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を含有する画分を得た）。
【００３３】
また、後述の「アグリカナーゼ活性の評価」においてコントロールとして使用するために、ＡＤＡＭＴＳ−１発現ベクターを導入した動物細胞の代わりに、前記ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質をコードする遺伝子を含まない）を導入した動物細胞を用いたこと以外は、前記の培養及び精製工程を繰り返すことにより、前記組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分に相当するコントロール用画分を取得した。
【００３４】
（２）アグリカナーゼ活性の評価
アグリカナーゼ活性の評価に用いたアグリカンの調製は、公知方法（Ｈａｒｄｉｎｇｈａｍの方法；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７７，２３７−２４７，１９７９）により行なった。すなわち、牛鼻軟骨組織より、グアニジン塩酸４ｍｏｌ／Ｌで抽出した後、塩化セシウム濃度勾配超遠心法により精製した。
【００３５】
アグリカン１０μｇと、前記実施例１（１）で調製した組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分（組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質の量として０．５μｇ）又はコントロール用画分とを、アグリカナーゼ反応用バッファー［トリス−ＨＣｌ−２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．６），ＮａＣｌ−１５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣａＣｌ2５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＮ3０．０１％］１００μＬ中において、３７℃で１２時間反応させた。
【００３６】
反応終了後、更に、コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業；日本国東京）（０．０５ユニット／プロテオグリカン１０μｇ）及びケラタナーゼ（生化学工業）（０．０５ユニット／プロテオグリカン１０μｇ）を加え、糖鎖分解反応用液［トリス−ＨＣｌ−５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０），酢酸ナトリウム３０ｍｍｏｌ／Ｌ，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ，フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）５ｍｍｏｌ／Ｌ，ペプスタチンＡ−０．３６ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎ−エチルマレイミド１０ｍｍｏｌ／Ｌ］２００μＬ中において、３７℃で３時間反応させることによって糖鎖を分解した。
【００３７】
２段階の反応を実施した反応液を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー［トリス−ＨＣｌ−６０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８），ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２％，メルカプトエタノール５％，グリセロール１０％］中において、１００℃で５分間処理した後、濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度勾配＝２〜１５％）を実施した。
常法に従い、ゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した後、このメンブレンをブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋ ＡＣＥ；大日本製薬；日本国大阪）中において、３７℃で一晩処理した。
【００３８】
ウエスタンブロット法は、一次抗体として、抗コンドロイチン４−硫酸抗体（２−Ｂ−６抗体；アグリカンのコアタンパク質を認識して結合する）を使用し、二次抗体として、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ由来抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用し、検出系として、ケミルミネッセンスシステム（ＥＣＬシステム；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して実施した。
【００３９】
ウエスタンブロット法の結果を図１に示す。図１において、レーン１は、コントロール用画分を用いた場合の結果であり、レーン２は、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分を用いた場合の結果である。また、図１において、レーン１の左側に上下方向に一列に並ぶ各横線は、分子量マーカーとして用いたタンパク質の位置を表わし、前記各横線の左側の各数字は、分子量マーカーとして用いたタンパク質の各分子量（単位＝ｋｄ）を表わす。
レーン２の約１００ｋｄの位置に現われたバンド（矢印で示すバンド）が、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質により分解されたアグリカンのコアタンパク質である。なお、データは示していないが、アグリカナーゼ反応用バッファー中におけるアグリカンと各画分との反応の際に、キレート試薬であるＥＤＴＡを添加すると（アグリカナーゼの活性発現のためには、Ｃａイオンが必要であることが知られている）、約１００ｋｄの前記バンドは検出されなかった。これらの結果から、組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質にアグリカナーゼ活性があることが判明した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のアグリカン分解剤によれば、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病、例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症を治療又は予防することができる。
また、本発明によるアグリカナーゼ活性調節剤のスクリーニング方法によれば、アグリカナーゼ活性促進剤又はアグリカナーゼ活性阻害剤を選択することができる。前記アグリカナーゼ活性促進剤は、アグリカナーゼ活性の低下に由来する異常（例えば、軟骨のリモデリング異常）に起因する疾病（例えば、軟骨形成不全症又は肥大性骨関節症）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。また、前記アグリカナーゼ活性阻害剤は、アグリカナーゼ活性の亢進に由来する疾病、例えば、軟骨破壊に起因する疾病（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は関節損傷）の治療又は予防剤の有効成分として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質含有画分又はコントロール用画分とアグリカンとの反応物を電気泳動した結果を示す、図面に代わる写真である。
Claims (3)
- （１）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又は
（２）天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質
を有効成分として含有することを特徴とする、アグリカン分解剤。 - （１）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又は
（２）天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質
を有効成分として含有することを特徴とする、軟骨のリモデリング異常の正常化剤。 - （１）ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質又は
（２）天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、前記天然型ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質と同じ活性を有するタンパク質
を有効成分として含有することを特徴とする、軟骨のリモデリング異常に起因する疾病の治療又は予防剤。
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