JP3640965B2 - 修飾乳成長因子 - Google Patents
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Description
幾つかの医薬、診断用および獣医学用の製品、例えばヒトのワクチン、リンホカイン、ホルモン、モノクローナル抗体、他の製薬上活性のあるタンパク質製品、および獣医学用ホルモンを得るために、また研究および開発の目的で、また診断の目的で動物細胞が培養される。
動物細胞の培養は、それら細胞が正常な状態で、生体内において浸されている筈の媒質と似せるために処方された塩類、栄養物、脂質前駆物質、核酸前駆物質、ビタミンおよびアミノ酸を含む限定された等張培地を必要とする。常用される例として、Eagle's Minimal Essential Medium Dulbecco改良Eagle's Minimal Essential Medium(DMEM),Medium 199,RPMI 1640培地およびHam's F12 Mediumが挙げられる。しかし、動物細胞はこのような培地では殆ど増殖せず、血清を同時に添加する必要がある。ウシ胎児血清がしばしば使用されるのは、これが出生後の動物から得た血清より効果的だからであり、また最小濃度でしか免疫グロブリンを含まないからである(そうでなければ望ましくない影響を及ぼすことがありうる)。
ウシ胎児血清の供給量は、妊娠雌牛の屠殺数により制限を受ける。これはまたロットごとに望ましくない変動があり、毒素を含むこともある。ヒトに使用するための組換えタンパク質および他の医薬品の究極の生産にこの血清を使うことについては特別な関心が取り巻いている。それは血清がヒトに有害なウイルスを含むこともありそしてウイルスが求める製品を生産する精製プロトコルを通して運ばれることがあるからである。主にこれらの理由のため、血清の代りに純粋成分を使用することに向けて多大の努力がなされて来た。このような成分の例は、成長因子、ホルモン、および細胞付着因子である。都合の悪いことに、培養される各細胞型の必要条件が異なり、その確立が困難である。ウシ胎児血清を含む培地で得ることができるのと同等の培養特性あるいは同等の細胞生成物生産量を「無血清」培地で達成することはしばしば不可能である。
前述したウシ胎児血清の入手量の制約、そのロット毎の変動、結果として生ずる多大のコストならびに「無血清」培地の欠陥のため、細胞培地の潜在的代替品として他の生物学的流体の発明が促された。下記の選ばれた報文:M.Klagsbrun,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75,5057(1978);M.Klagsbrun等、J.Supramol.Struct.11,349(1979);M.Klagsbrun.J.Cell Biol.84,808(1980);K.S.Strimer等、J.Cell Biol.88,294(1981);A.Sereni等、Cell Biol.litl,Rep.5,339(1981);A.Khar Experientia 39,534(1983);O.Damerdji等、Biotech.Tech.2,253(1988);O.T.Ramirez等、Lait 70,313(1990);H.Ichiba等、Biol.Neonate.61,47(1992);R.Pakkanen等、Appl.Microbiol.Biotechnol.37,451(1992)から明らかなように、牛乳およびウシ初乳を用いる先行技術に若干の進歩が報告された。本明細書中で言及したこれらの刊行物および他の刊行物は参考のため取り入れてある。
先行技術には米国特許第4,440,860号明細書(M.Klagsbrun)および特許公報第59166879号明細書も包含される。前者の明細書は、一面において、「乳または初乳およびフイブロネクチン(フイブロネクチンは培養基質上に前被覆するのがよい)を含む細胞培地を特別にとり上げた細胞増殖促進組成物および方法」を記載し、後者の特許公報(モリナガ)は「乳または乳成分を含む細胞インキュベーション用培地」を記載している。培養される細胞の増殖を支えるために乳ホエーの限外濾過液も使用されたことがあり、これはG.Linden等、Fractions de lait,Procedee d'obtention de ces fractions et milleux de culturo cellulaires renfemant ces fractionsの欧州特許第A0219372号明細書に、またG.Linden等、「乳産業から誘導された製品に基づく動物細胞培地の補助剤」の特許願第WO90/06357号明細書に記載の通りである。
B.Quinque等による特許願第WO92/00014号明細書「初乳処理法および初乳を含む細胞培地」にはヒドロキシアパタイト クロマトグラフィーにより得られる初乳の活性画分が、またF.J.Ballard等によるオーストラリア特許第645589号明細書「成長促進剤」には陽イオン交換クロマトグラフィーにより得られる初乳の活性画分が報告されている。先行技術にはまたF.J.Ballard等によるオーストラリア特許第598205号明細書「成長因子」およびR.R.Burk等による欧州特許第0313515号明細書「乳から生ずるポリペプチド成長因子」(個々の成長因子を純粋な形で初乳または乳から単離している)も包含される。
この発展は幾つかの細胞型の増殖を支える組成物の開発へと導いたが、通常は培地中にウシ胎児血清を含むより一般的に使用される濃度に近いタンパク質濃度を必要とする。
従って、本発明の一目的は先行技術に関連した欠陥の一つ以上を克服するか少なくとも緩和することにある。
本発明は複数の修飾乳成長因子の製造法を提供するもので、本法は
塩基性からほぼ中性の等電点を有する複数の乳成長因子、および
酸源
を用意し、
該酸源を用いて乳製品エキスを短時間酸性にし、そして
短時間酸性にした乳製品エキスから複数の修飾乳成長因子を単離する
ことからなる。
この単離工程は短時間酸性にした乳製品エキスを、エキスから不活性タンパク質を除去する精製工程にかけるのがよい。
「短時間の酸性化」とは、重要な意味をもつ程の因子の質低下を避けながら、因子の成長促進活性を高めるのに十分な時間酸性にすることを意味する。
本発明は更に約6.0以上の等電点と約5000から30,000の範囲の分子量を有し、短時間の酸性化により修飾した複数の修飾乳成長因子を含み、高度の成長刺激活性を発揮する成長促進組成物を提供する。
修飾乳成長因子はおよそ6.0から10.5の等電点を有することが好ましい。
本明細書中で使用した「乳」という用語はヒトまたは動物由来の乳汁分泌物を指す。
本明細書中で使用した「修飾乳成長因子」という用語は、それが生じた状態にある同じ成長因子あるいは乳、乳製品あるいは乳製品エキスから抽出されたときの同じ成長因子の成長促進活性と比較して高められた成長促進活性を示す乳成長因子を指す。
本明細書中で使用した「乳製品」という用語は、乳の脂肪および(または)タンパク質成分を減らしたヒトまたは動物の乳から得られる誘導体を指す。乳製品の例として乳ホエー、脱脂乳、チーズホエーおよび酸(カゼイン)ホエーが挙げられる。乳製品はなるべくチーズホエーがよい。
本明細書中で使用した「乳製品エキス」という用語は、塩および(または)主要タンパク質成分を減じた乳製品の抽出物(エキス)を指す。乳製品エキスの例は、乳製品の限外濾液あるいはクロマトグラフィーマトリックスへ吸着させ、そしてそこから溶離された乳製品の限外濾液である。なるべく乳製品エキスは、オーストラリア特許第645,589号明細書記載の方法により陽イオン交換クロマトグラフィーにかけたチーズホエーがよい。
修飾成長因子は塩基性からほぼ中性の等電点を有する成長因子を含有する乳製品エキスを酸性にすることにより得るのがよい。なるべくは本発明方法により修飾された乳成長因子から不活性タンパク質を除去するのがよい。酸性条件下でのモレキュラーシーブ クロマトグラフィーあるいは限外濾過を用いると不活性タンパク質を除去できる。モレキュラーシーブ クロマトグラフィーが特に好ましいのは、除去しなければ短時間の酸性化後にある種の成長因子と再結合するかも知れない成長因子結合性タンパク質のような高分子量タンパク質を除去できるからである。
本明細書中で使用した「高度の成長促進活性」という用語は、それが生じた状態にあるときの同じ成長因子あるいは乳、乳製品あるいは乳製品エキスから抽出されたときの同じ成長因子の成長促進活性と比較して、成長因子1単位当りの増加した細胞増殖量の尺度である。なるべく成長因子1単位当りの細胞増殖は10%だけ、更に好ましくは25%だけ増加するのがよい。
従って、本発明方法における精製工程は、特に適当な面において、短時間酸性にした乳製品エキスを、酸性条件下で、なるべくは約3.0以下のpHで、行なうクロマトグラフィーあるいは限外濾過法にかける処理を含む。
クロマトグラフィー法はモレキュラーシーブ クロマトグラフィー法がよく、限外濾過法は調節された細孔限外濾過法がよい。調節された細孔限外濾過は、約100kDa、更に好ましくは約50kDa、最も好ましくは約30kDaより大きい分子を除外する膜を使用して行なうのがよい。
更に、好ましい一面をあげると、本発明方法は
乳または乳製品の給源、
陽イオン交換樹脂、および
緩衝溶液
を用意し、
乳または乳製品を陽イオン交換樹脂と接触させて乳または乳製品のより塩基性の成分を樹脂に吸収させ、
陽イオン交換樹脂を緩衝溶液で溶離し、そして
乳製品抽出物を集める
という予備工程を更に提供する。
この予備精製工程は本出願者等によるオーストラリア特許第645,589号明細書により詳しく記載されている。
乳製品エキスは後に定義されるGFE−2または同様な成長促進剤を含むのがよい。
なるべくは成長因子を約3.0以下のpHまで酸性にするのがよい。更に好ましくは、2.0から3.0の範囲のpHまで因子を酸性にする。約2.5の酸性化pHが特に好ましい。
酸性化は無機酸、例えばHClを用いて行なうのがよい。例えば、酸性化は、乳製品エキスを水に溶解し、強無機酸、例えば5M HClで酸性にし、乾燥することにより達成できる。乳製品に対して陽イオン交換クロマトグラフィーを行なうことにより乳製品エキス中の成長刺激因子を得るのがよい。乳製品エキスはオーストラリア特許願第645,589号明細書に記載の方法により製造できる。
上記のように、本発明方法は酸性化を行なった後で不活性タンパク質を除去するもう一つの工程を含むことができる。
不活性タンパク質の除去は、酸性条件下でモレキュラーシーブ クロマトグラフィーまたは限外濾過を用いることにより実施できる。前記の通り、モレキュラーシーブ クロマトグラフィーが特に好ましいが、それはもし除去しなければ中和後にある種の成長因子と再結合するかもしれない高分子量タンパク質をこの方法で除けるからである。
本出願者等の初期のオーストラリア特許願第645,589号明細書(参照により本明細書中に取り入れている)に記載の乳製品エキスに関して本発明を更に詳しく説明することにする。しかし、これは単に例示に過ぎず、本発明の一般性に対する制限と解釈すべきでない。
本発明方法に使用される乳製品エキスは、これを前以て約pH3.0以下まで短時間の酸性化に付してはならない。
血清、乳または他の生物学的流体中に存在する個々の成長因子、例えば表皮成長因子、インシュリン様成長因子IまたはII、酸性または塩基性繊維芽細胞成長因子、形質転換成長因子アルファーまたはベーター、あるいは血小板由来増殖因子はすべて5,000から30,000の分子量をもつ小さいタンパク質である。従って、F.J.Ballard等によるオーストラリア特許第645589号明細書に記載の成長促進剤GFE−2の、中性pH付近の条件下でのモレキュラーシーブ クロマトグラフィー後、本質的にすべての細胞成長刺激活性が高分子量領域に存在するということは意外なことである。特定的に言えば、L6筋芽細胞、Balb/C 3T3繊維芽細胞およびヒトの皮膚繊維芽細胞上の成長促進活性は、GFE−2における最も豊富なタンパク質ラクトペルオキシダーゼ(分子量78,000を有する)と共に溶出する(図1、点線参照)。
本明細書中で使用した「GFE−2または同様な成長促進剤」という用語は、中性から塩基性の等電点をもつ複数の成長因子が存在し、かつ酸性条件に暴露することなく陽イオン交換クロマトグラフィーにより乳成長因子エキスとして単離された乳製品エキスを意味する。
チーズホエーから抽出されたGFE−2中の成長促進活性体が本質的にすべての公知の成長因子よりもはるかに高分子量をもつという予想外の発見は、GFE−2の成長効果が未知の因子により誘発されたのか、集合体の形にある公知の因子により誘発されたのかのいずれかであることを示唆した。本発明はこれら二者の間を区別するために用いる二つの解決法を説明し、そして乳製品エキスの成長促進活性を活性化する方法、あるいは高める方法、とりわけGFE−2あるいは同様な成長促進剤の成長促進活性を高める方法を提供する。
血漿中のある種の成長因子、例えばインシュリン様成長因子IおよびIIは、酸に対して不安定なサブユニットを含む結合タンパク質複合体中に主として共存する(R.C.Baxter等、Progress in Growth Factor Research 1,49,1989)。血漿を短時間酸性にすると、インシュリン様成長因子は高い活性をもつかもしれない低分子量形として解放される。形質転換成長因子ベーターを高分子量複合体から解放する同様な方法が知られている(M.B.Sporn等、J.Cell.Biol.105,1039,1987)。本出願者は、チーズホエーのような乳製品中の成長因子が乳製品エキス、例えばGFE−2、をつくるために要求される陽イオン交換クロマトグラフィー工程を通じて複合体に留まるならば、短時間の酸性化がこれら因子を解放し、そのため培養された細胞の増殖を刺激する乳エキスの能力の増大につながることをここに発見した。このことは、CHO−K1細胞の増殖がGFE−2そのものよりも短時間酸性にしたGFE−2によってはるかに低いタンパク質濃度で、しかも大幅に刺激されるという、例2に示した実験で確認される。
従って、特に適当な具体例においては、高度の成長刺激活性を示し、かつおよそ6.0以上の等電点とおよそ5000から30,000の範囲の分子量をもち、短時間の酸性化によって修飾された複数の修飾乳製品成長因子が提供される。
なるべく複数の修飾乳製品因子は修飾されたGFE−2あるいは同様な成長促進剤がよい。
短時間の酸性化はCHO−K1細胞に高度の成長促進活性をもたらすが、GFE−2の全タンパク質濃度はこのような方法によって著しく減少することはない。酸性にした成長促進エキスのタンパク質含量は、成長促進活性を不活性タンパク質の大部分から分離する酸性条件下でのモレキュラーシーブ クロマトグラフィーにより実質的に減らすことができる。図3、図4および図5の例は、Superose 12 HR 10/30TM(pharmacia)およびMatrex Cellufine GCL 1000TM(Amicon)モレキュラーシーブ カラム充填材を用いているが、これらは例示に過ぎず、従ってこの技術に精通した当業者は他のモレキュラーシーブ カラム充填材を用いても同様な分離を行なえることを認識する筈である。
本発明のこの具体例においては、幾つかの細胞系に対する成長促進活性が低分子量領域に移され、GFE−2の外来タンパク質の大部分から分けられる(図3参照)。図3の例で集めた個々の画分を、そうしないで図4の例のように単一分子量プールとして集めれば、得られたプールは未分画GFE−2によって得られるよりも実質的に低いタンパク質濃度で成長促進活性を発揮する(図5参照)。
本発明の更に一つの方向として、酸性にした成長促進エキスのタンパク質濃度をモレキュラーシーブ クロマトグラフィーの代りに調節された細孔限外濾過によって減らすことができる。これを、例えば100kDaの公称寸法をカットオフをもつ限外濾過膜を使用して酸性条件下で行なうと、図6で実証するように、成長促進活性を浸透液に移すことができる。更にまた、成長促進活性は未分画GFE−2により実質的に低いタンパク質濃度で生ずる。100kDa膜によるこの使用例は単に例示に過ぎず、従って当業者は成長因子の浸透液フラクション中への通過は許すが、約30,000より大きい分子量をもつタンパク質の透過は遅らせる他の膜を使用しても同様な分離が得られることを認識する筈である。
本発明の更に一つの面は
約6.0以上の等電点と約5000から30,000の範囲の分子量を有し、短時間の酸性化により修飾した複数の修飾乳成長因子を含み高度の成長刺激活性を示す有効量の成長促進組成物、および
培地
を含む細胞培養組成物を提供するものである。
なるべく複数の修飾乳成長因子は、修飾されたGFE−2あるいは同様な成長促進剤であるのがよい。
更に好ましくは、培地は実質的に無タンパク質培地であり、そして(または)ウシ胎児血清を含むのがよい。
本発明はまたヒトまたは動物の細胞を培養する方法も提供するものであり、本発明は
動物細胞の給源、および
約6.0以上の等電点と約5000から30,000の範囲の分子量を有し短時間の酸性化により修飾された複数の修飾乳成長因子を含み、高められた成長刺激活性を発揮する有効量の成長促進組成物を含む細胞培養組成物、および
培地
を用意し、そして
細胞を細胞培養組成物中で所定の細胞濃度を達成するのに十分な時間と十分な温度で培養する
ことからなる。
約35℃から40℃の範囲の温度で約1日から5日の期間細胞を培養するのがよい。
乳製品の短時間の酸性化または酸性化に続き酸性条件下で低分子量画分を得るための分離のいずれかを包含する本発明方法は、培地中細胞の増殖に限定されない用途に向けられる生成物をつくるためにも適用できる。これと関連する特定の例は、更に組織化された構造物、例えば火傷を負った個人に後で移植するための、あるいは露出した傷を覆うための皮膚を培養する方法である。
本発明はまた表面の傷の治療用の医薬品組成物あるいは獣医学用組成物も提供するのであって、本組成物は
約6.0以上の等電点と約5000から30,000の範囲の分子量を有し短時間の酸性化により修飾された複数の修飾乳成長因子、および
製薬上あるいは獣医学上容認しうる希釈剤、担体あるいは付形薬を含む。
なるべくは本組成物は抗生物質、防腐剤、他の成長促進物質、およびそれらの混合物から選ばれる有効量の少なくとも1種の活性成分を更に含むことが好ましい。
従って、本発明はヒトを含めて動物の表面の傷の治療法を提供するものであり、本法は
約6.0以上の等電点と約5000から30,000の範囲の分子量を有し短時間の酸性化により修飾された複数の修飾乳成長因子、および
製薬上あるいは獣医学上容認しうる希釈剤、担体または付形薬
を含む有効量の医薬品組成物あるいは獣医学用組成物を治療すべき患者へ投与することからなる。
なるべく本組成物は抗生物質、防腐剤、他の成長促進物質、麻酔薬、およびそれらの混合物から選ばれる有効量の少なくとも1種の活性成分を更に含むことが好ましい。
本医薬品組成物あるいは獣医学用組成物は胃腸の損傷、疾患または潰瘍の治療に適合させることができる。従って、本発明は胃腸の損傷、疾患または潰瘍の治療用医薬品組成物あるいは獣医学用組成物を提供するものであり、本組成物は
約6.0以上の等電点と約5000から30,000の範囲の分子量を有し短時間の酸性化により修飾された複数の修飾乳成長因子、および
製薬上あるいは獣医学上容認しうる希釈剤、担体または付形薬
を含む。
なるべくは本組成物は抗生物質、防腐剤、他の成長促進物質、麻酔剤、およびそれらの混合物から選ばれる有効量の少なくとも1種の活性成分を更に含むことが好ましい。
本発明はヒトまたは動物治療対象の治療法を更に提供するものであり、前記方法は本発明に係る有効量の成長促進組成物を投与することからなる。
本発明の一つの応用は、高度の成長促進活性が傷の修復を早めることができる表面の傷へ直接添加できる製品をつくることである。
例
ここで本発明を下記の例に関して更に詳細に説明することにする。しかし下記の説明は例示に過ぎないのであって、如何なる場合にも前述した本発明の一般性の限定と見做すべきでないことは理解されるに違いない。
図の説明
図1:例1記載の乳製品エキスGFE−2をリン酸塩緩衝食塩水に溶かし、同じ緩衝液で平衡化したSuperose 12 HR10/30TM(Pharmacia)カラム上でクロマトグラフィーを行なった。280nmにおける吸光度によりタンパク質を測定した(点線)。各フラクションの成長促進活性を3細胞系[L6 筋芽細胞(図1A)、Balb/C 3T3(図1B)、SF 1972(図1C)]において、10%ウシ胎児血清を成長因子の標準源としたとき(●)到達した成長の百分率として測定した。
図2:例1記載の乳製品エキスGFE−2(●)および例2におけるように調製された短時間酸性化乳製品エキスGFE−2(○)によるCHO−K1細胞の成長促進活性。成長因子の標準源としてウシ胎児血清(FBS)を示す(■)。
図3:例1記載の乳製品エキスGFE−2を、例3記載のように酸性にし、モレキュラーシーブ クロマトグラフィーにかけた。タンパク質は280nmにおけるその吸光度により示される(点線)。乾燥し、再構成されたフラクションの成長促進活性を3細胞系[L6 筋芽細胞(図3A)、Balb/C 3T3(図3B)、SF 1972(図3C)]において、10%ウシ胎児血清を成長因子の標準源としたとき(●)到達した成長の百分率として測定した。
図4:例4記載の酸性条件下、Matrex Cellufine GCL 1000TM(Amicon)上での酸性化GFE−2のクロマトグラフィーによる修飾乳成長因子の大規模調製。低分子量プール(LMW.プール)を集め乾燥してその後の成長促進活性の検定に供した。
図5:例1記載のように調製したGFE−2(●)および例4記載のように調製したLMW−プールの、3細胞系[L6 筋芽細胞(図5A)、ヒト内皮細胞(図5B)、SF 3169(図5C)]に対する成長促進活性。ウシ胎児血清(FBS)を成長因子の標準源として示す(■)。
図6:例1記載のように調製したGFE−2(●)および100kDa膜(Sartorius)を通しての限外濾過により得られた酸性化GFE−2の浸透物(●)の、3細胞系[L6 筋芽細胞(図6A)、Balb/C 3T3(図6B)、SF 1967(図6C)に対する成長促進活性。活性は10%ウシ胎児血清を成長因子の標準源としたとき到達する活性と比較して表示する。
例 1
中性pH条件下ホエーエキスのモレキュラーシーブ クロ マトグラフィーは主として高分子量領域の細胞成長促進 活性を実証する
GFE−2はF.J.Ballard等のオーストラリア特許第645589号明細書に記載のように調製した。この方法は低温殺菌したホエーから固形物を除去するミクロ濾過、pH6.5の50mMクエン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したS−Sepharose Fast Flow STM陽イオン交換樹脂(Pharmacia)カラムへの成長促進物質の吸着、未吸着物質を除去するための同緩衝液によるカラムの洗浄、0.4M NaClを10mMクエン酸ナトリウム(pH6.5)に添加した溶液によるGFE−2の溶離、水に対する透析濾過(diafiltration)、限外濾過による濃縮および凍結乾燥を含む。
このGFE−2をpH7.4のDulbeccoリン酸塩緩衝食塩水(PBS)に溶かし、0.22μmフィルターに通過させ、200μlを同じ緩衝液で平衡化したSuperose 12 HR10/30TM(pharmacia)カラムに適用し、0.3ml/分でクロマトグラフィーを行なった。100μlの10mgウシ血清アルブミン/mlを含む管に0.9mlフラクションを集めた。
本例は各フラクションの活性試験に細胞系L6(ラット筋芽細胞)、Balb/C 3T3(マウス繊維芽細胞)およびSF 1972(ヒト二倍体皮膚繊維芽細胞)を使用した。
各細胞系を96−穴組織培養プレート上で、10%ウシ胎児血清(L6筋芽細胞に対して5%)を含むDulbecco−Modified Eagle's Mineral Essential Medium(DMEM)中で継代培養した。細胞付着を確実にするため5%CO2、37℃、加湿したインキュベーター中に一晩置いた。一貫して滅菌技術を用いた。プレートをDMEM中で十分よく洗浄して残留血清およびホエー分あるいは指示濃度で添加されたウシ胎児血清(FBS)を除去した。各ウエルの全体積は37℃、CO25%、100%湿度において0.1mlであった。
更に2日の後、プレートを洗浄し、固定し、自動化されたメチレンブルー法(M.H.Oliver等、J.Cell Sci.92,513,1989)を用いて細胞数を定量した。成長は、10%ウシ胎児血清を含むDMEM中で細胞増殖により起こる吸光度増加と比較した吸光度単位の増加百分率として表わした(図1)。
本例は、3細胞系のすべてにおいて、ウシ胎児血清およびカラムから得られた幾つかの画分20μlずつが成長を刺激することを示している。最も活性のあるフラクションは、280nmにおける吸光度により示されるように(図1、点線)、カラムから溶離された主要タンパク質領域と一致した。図1の活性は10%ウシ胎児血清を用いたとき得られた成長増加と比較した成長増加百分率として表わす。
例 2
短時間の酸性化はCHO−K1細胞の成長促進活性を高める
例1記載のように調製したGFE−2の50mg試料を水2mlに溶かし、5M HClでpH1.6まで酸性にし、0.5M NaOHでpH2.5に調節し、真空で乾燥した。乾燥した材料を、ウシ血清アルブミン10mgを含むHam's F12細胞培地1mlに溶かし、同培地で連続的に希釈した。同じ初濃度のGFE−2の試料およびウシ胎児血清を、ウシ血清アルブミンを含むHam's F12培地で同様に希釈した。
例1記載のように試験溶液を成長促進活性について評価するが、ただし細胞はCHO−K1とし、培地はDMEMの代りにHam's F12とした。
本例はGFE−2が中程度の成長効果を生ずるのに対し、低い全タンパク質濃度においてはるかに大きい成長が短時間酸性にした調製物により達成されることを示している。
例 3
酸性条件下でモレキュラーシーブ クロマトグラフィー を行なうと、ホエーエキスの成長促進活性は低分子量領 域に移る
GFE−2を例1記載のように調製した。0.15M NaClを含む1M酢酸に25mg部分を溶かし、0.22μmフィルターに通過させ、200μlを例1と同じSuperose 12 HR10/30カラムに適用するが、ただし0.15M NaClを含む1M酢酸でカラムを平衡化した。クロマトグラフィーおよび試料の採集は例1記載の通りであるが、ただし溶離緩衝液は0.15M NaClを含む1M酢酸とした。フラクションを真空下で乾燥し、DMEMに溶かし、その成長促進活性を例1記載と同様に評価した。結果を点線で示したタンパク質吸光度プロフィルと共に図3に示す。
この実験は、GFE−2の酸性化とそれに続くモレキュラーシーブ クロマトグラフィーにより、L6筋芽細胞、Balb/C 3T3およびSF 1972細胞に成長促進活性が得られたが、その活性はタンパク質吸光度ピークより遅れた溶離液に、従って低分子量領域に、移動することを示した。
例 4
酸性条件下でホエーエキスのモレキュラーシーブ クロ マトグラフィー後に得られた低分子量フラクションプー ルが細胞成長を支える比活性を高めた
GFE−2を例1記載と同様に調製した。0.2M NaClを含む10mM HCl 250mlに10g部分を溶かし、pHをNaOHで2.5に調節した。この溶液を用いて2lのCellufine GCL 1000TM(Amicon)カラムを平衡化した。溶解したGFE−2 125mlをカラムに適用し、同じ溶液を用いて6.8ml/分で溶離した。280nmにおける吸光度が0.4以下に落ちたときから675mlを集めた(図4)。このプールを0.1M重炭酸アンモニウムに対して透析濾過し、凍結乾燥して385mgの生成物を得た。
低分子量プール(LMWプール)およびGFE−2を例1記載のように溶解し、該例と同様に細胞成長を測定したが、ただし試験した細胞系はL6筋芽細胞、SF 3169ヒト皮膚繊維芽細胞およびヒト内皮細胞[E.Jaffe等、J.Clin.Inuest.52,2745(1973)記載のようにして得た]とした。
この実験は、より低濃度のLMWプールの方がGFE−2で得られたよりも成長を刺激することを示す。この比活性増加は、図5に示したように、ヒト皮膚繊維芽細胞およびヒト内皮細胞について特に明白であった。
例 5
酸性条件下で調節された細孔限外濾過を行なうとホエー エキスの成長促進活性が透過液中に移る
GFE−2を例1記載のように調製した。GFE−2 40gを40lの10mMクエン酸三ナトリウムに懸濁し、0.1M HClを用いてpH2.5に調節した。酸性にしたタンパク質溶液を4℃で一晩放置し、次に大きい細孔限外濾過膜(Sartorius,0.7m2、ポリスルホン、細胞寸法100kDaカットオフ)に対し5lまで濃縮した。pH2.5の150mM NaCl/HCl溶液100lを用いてこの濃縮液を広く(20:1)透析濾過した。この濃縮/透析濾過サイクルから集められた透過液(約130l)を0.1M NaOHでpH7.0に調節し、らせん巻きした単一の1.8m2ポリスルホン膜(細孔寸法3kDaカットオフ)を具えたAmicon限外濾過装置に移した。この装置で透過液を10lに濃縮し、50lの150mM NH4HCO3を用いて透析濾過し(5:1)、次に最終体積250mlまで更に濃縮した。濃縮された透過液を凍結乾燥し、約1.8gの粉末を得た。
乾燥透過物およびGFE−2を水に溶かし、その成長促進活性を例1記載のように評価した。結果を図6に示す。
この実験は、酸性にしたホエーエキスの限外濾過により得た透過物がL6筋芽細胞、Balb/C 3T3およびSF 1967細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞系(例1、例3および例4で用いたSF 1972およびSF 3169細胞に類似)の増殖を支えることを示す。更にまた、3細胞系すべての成長促進活性は、GFE−2で観察されたより実質的に低いタンパク質濃度で現れる。
最後に、本明細書中に概説された本発明の主旨から離れることなく種々な他の修正および(または)変更をなしうることは理解される筈である。
Claims (11)
- 酸性化成長促進抽出物を調製する方法において、
(a)チーズホエー、スキムミルク及びカゼインホエーからなる群から選ばれる乳製品から乳タンパク質混合物を単離し、単離された乳タンパク質混合物は、塩基性からおおむね中性の等電点を有し、成長促進活性に富み、かつラット筋芽細胞の増殖を刺激する能力を有する成長因子を含むものであり、該乳タンパク質混合物は、乳タンパク質混合物がクロマトグラフィーの間、30,000Daを 超える分子量を有する画分に溶出するように、酸性条件下に暴露されることなく、イオン交換クロマトグラフィーにより単離されるものであり、
(b)単離された乳タンパク質混合物を酸源を用いて短時間酸性にし、工程(a)で単離された乳タンパク質混合物の細胞成長促進活性と比較して増大した細胞成長促進活性を有する酸性化成長促進抽出物を得ることを含む上記方法。 - 前記単離された乳タンパク質混合物を約3以下のpHに短時間酸性にする請求項1記載の方法。
- 乳製品はチーズホエーである請求項1記載の方法。
- 酸性化成長促進抽出物を酸性条件下で精製工程に付して不活性タンパク質を除去することを更に含む請求項1記載の方法。
- 細胞培養組成物を調製する方法において、
(a)請求項1記載の酸性化成長促進抽出物を調製し、
(b)培地を用意し、そして
該酸性化成長促進抽出物を培地と組合せることを含む上記方法。 - 前記培地は実質的にタンパク質のない培地である請求項5記載の方法。
- ヒト及び動物細胞を培養する方法であって、
(i)(a)請求項1に従って酸性化成長促進抽出物を調製し;
(b)培地を用意し;
(c)該酸性化成長促進抽出物を培地と組合せる
ことを含むプロセスにより細胞培養組成物を調製し、そして
(ii)細胞培養組成物中で細胞を所定の細胞濃度を達成するのに十分な時間と温度で培養する
ことを含む上記方法。 - 表面の傷を治療するための医薬組成物又は獣医学用組成物の調製方法であって、
(a)請求項1に従って酸性化成長促進抽出物を調製し;
(b)そのための製薬上又は獣医学上許容し得る希釈剤、担体又は付形薬を用意し;
(c)該酸性化成長促進抽出物をそのための製薬上又は獣医学上許容し得る希釈剤、担体又は付形薬と組合せることを含む上記方法。 - 請求項1に従って調製した酸性化成長促進抽出物を含む、ヒトを含む動物における表面の傷を治療するための医薬又は獣医学用薬剤。
- 胃腸の損傷、疾患又は潰瘍を治療するための医薬組成物又は獣医学用組成物の調製方法であって、
(a)請求項1に従って酸性化成長促進抽出物を調製し;
(b)そのための製薬上又は獣医学上許容し得る希釈剤、担体又は付形薬を用意し;
(c)該酸性化成長促進抽出物をそのための製薬上又は獣医学上許容し得る希釈剤、担体又は付形薬と組合せることを含む上記方法。 - 請求項1に従って調製した酸性化成長促進抽出物を含む、胃腸の損傷、疾患又は潰瘍を治療するための医薬又は獣医学用薬剤。
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