JP3624391B2 - Dog interleukin 12 and method for producing the same - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質の一次構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン12(以下、CaIL12と略す)を遺伝子操作技術により量産し、以って動物用医薬品(抗腫瘍・抗ウイルス・ワクチンアジュバント)とする事を目的とした、プラスミド、形質転換体、CaIL12およびその製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
インターロイキン12は、分子量約40kD蛋白質(以下P40と略記する)と約35kD蛋白質(以下P35と略記する)とのヘテロダイマーよりなり、ナチュラルキラー細胞および1型ヘルパーT細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカインで、IL12と略記され、例えば文献1のようにこれまでいくつかの文献が出版されている。 遺伝子操作技術によりヒトのIL12以外にもマウス(文献2)、ウシ(GenBank データベース 登録番号U11815およびU14416)のIL12のcDNAもクローニングされ、腫瘍やウイルス病などの治療薬として用途開発研究が行われている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかるに、イヌのIL12がクローニングされたという報告は未だない。
【0004】
イヌには、乳腺腫瘍など多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数のウイルス病、アレルギー性の皮膚炎などが知られている。
【0005】
そこで、イヌのIL12が容易に入手可能となれば、イヌの抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤としての用途が開かれると期待される。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる状況に鑑みCaIL12cDNAのクローニングおよびそれを用いた大量生産を目的とし、創意工夫を成し、イヌのcDNAからCaIL12のP40とP35をコードするそれぞれの遺伝子をクローニングすることに成功し、更にはこれらを発現ベクターに連結した2つのプラスミドを用いてCaIL12を生産する細胞の作製に成功し、以って簡単に大量にCaIL12を製造する方法を確立し、かくして本発明を完成させるに至った。
【0007】
すなわち本発明は、CaIL12を生産させるプラスミド、これらのプラスミドを有する大腸菌の形質転換体、およびこのプラスミドにより形質転換された動物細胞、並びにこれらの形質転換体から得られるCaIL12を提供するものである。さらに本発明はCaIL12蛋白質の2つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子も提供する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明のCaIL12蛋白質の2つのサブユニットをそれぞれコードするDNAを組込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ(A)RNAを抽出した後、cDNAを合成し、ウシやヒトのIL12の2つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(以下PCRと略す)を行うことによってCaIL12活性を示す2つのサブユニットをそれぞれコードする2つの遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したcDNA組換え体よりファージライブラリーを作製し、PCRによって得られた2つの遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、CaIL12P40cDNAとCaIL12P35cDNAの全長をクローニングすることができる。
【0009】
イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりRNAを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりRNAを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後CsCl密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法(文献3)バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法(文献4),グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してRNAを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【0010】
イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム/尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴdTセルロースカラム法等によりmRNAを単離し、得られたmRNAから通常の方法、例えば、Gublerらの方法(文献5),H.Okayamaらの方法(文献6)等によりcDNAを合成する。得られたmRNAからcDNAを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス(AMV)などの逆転写酵素などを用いるほか1部プライマーを用いてDNAポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【0011】
このcDNAを鋳型としてヒト、マウスおよびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてPCRを行うことによってCaIL12活性を示すP40サブユニットおよびP35サブユニットをコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したcDNAをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、1個1個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したPCRで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、CaIL12P40cDNAおよびCaIL12P35cDNAの全長をクローニングすることができる。
【0012】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌(Escherichia coli),バチルス属(Bacillus)細菌、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス(Saccharomyces)属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces serevisiae)等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨトウガ細胞(Spodoptera frugiperda),キャベツルーパー細胞(Trichoplusiani),カイコ細胞(Bombyx mori),動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【0013】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス(バキュロ(昆虫)、ワクチニア(動物細胞))等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはlacプロモーター、trpプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばadh1プロモーター、pqkプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、p10プロモーター等、動物細胞としてはSimian Virus40のearlyまたはlateプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。 発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley& Sons社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【0014】
産生されたCaIL12は,非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により決定すると、見かけの分子量が約70〜80kDである。
【0015】
SDS−PAGEでは、70〜80kDのバンドが、還元条件下では分子量約40kDと約35kDの2つのサブユニットを生じる。
CaIL12は、以下の実施例2で示すように、イヌ白血球からのイヌインターフェロンγ誘導能およびフィトヘムアグルチニンン(以下PHAと略記する)で刺激されたイヌリンパ球の増殖促進効果により主に特性化される。その他、NK細胞や細胞障害性T細胞を活性化してそれらの標的細胞、例えば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽細胞を融解する活性を有する。
【0016】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【0017】
実施例1
CaIL12P40、P35遺伝子のクローニング
(1)イヌcDNAの調製
イヌ肝臓、LPS(50μg/ml)で48時間刺激したイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウイルスで7時間処理した(107 pfu/ml)イヌ脾臓由来リンパ球よりISOGEN(ニッポンジーン社)を用いて総RNAを調製した。得られたRNAを1mM EDTAを含む10mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)(以下TEと略記する。)に溶解し、70℃で5分間処理した後、1M LiClを含むTEを同量加えた。0.5M LiClを含むTEで平衡化したオリゴdTセルロースカラムにRNA溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに0.3M LiClを含むTEにて洗浄後、0.01%SDSを含む2mM EDTA(pH7.0)で吸着したポリ(A)RNAを溶出した。こうして得られたポリ(A)RNAを用いて一本鎖cDNAを合成した。すなわち、滅菌した0.5mlのミクロ遠心チューブに5μgのポリ(A)RNAと0.5μgのオリゴdTプライマー(12−18mer)を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて12μlにし、70℃で10分間インキュベートしたのち氷中に1分間つけた。これに200mM トリス塩酸(pH8.4),500mM KCl溶液を2μl,25mM MgCl2 を2μl,10mM dNTPを1μlおよび0.1M DTTを2μlそれぞれ加え、42℃で5分間インキュベートしたのち、200ユニットのGibcoBRL社製SuperScript II RTを1μl加え、42℃でさらに50分間インキュベートしてcDNA合成反応を行った。さらに70℃で15分間インキュベートして反応を停止し、氷上に5分間置いた。この反応液に1μlのE.coli RNaseH(2units/ml)を加え、37℃で20分間インキュベートした。
【0018】
(2)イヌcDNAファージライブラリーの調製
上記(1)で得られたポリ(A)RNA1μgづつを用い、ファルマシア社のタイムセーバーcDNA合成キットにて添付のマニュアルに従い、オリゴdTプライマーを用いて2本鎖cDNAを合成し、さらにEcoRI/NotIアダプターを連結した。これを用いて、アマシャム社のcDNAラピットクローニングモジュール−λgt10にて添付のマニュアルに従い、組換えλgt10ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロパッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従い、組換え体ファージ作製した。
(3)CaIL12P40遺伝子のクローニング
ヒトIL12P40のN末端およびC末端の塩基配列(文献1)をもとに、
5´ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTT3´(配列番号3)
と
5´CTAACTGCAGGGCACAGATGCCCA3´(配列番号4)
の2種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。上記(1)のイヌ肝臓およびLPS刺激イヌ末梢血より得られたcDNAを別々の0.5mlのミクロ遠心チューブに2μlづつ取り、各プライマーを20pmol,20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、1.5mM MgCl2 、25mM KCl,100μg/ml ゼラチン、50μM各dNTP、4単位 TaqDNAポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量100μlとする。DNAの変性条件を94℃,1分、プライマーのアニーリング条件を55℃、2分、プライマーの伸長条件を72℃、3分の各条件でPerkin−Elmer Cetus社のDNAサーマルサイクラーを用い、35サイクル反応させた。これを1%アガロースゲルにて電気泳動し、約990bpのDNA断片を常法(文献7)に従って調製した。
【0019】
このDNA断片をInvitrogen社のT−Vectorに宝酒造(株)のDNA Ligation Kit Ver.1を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同じ条件のPCRによって確認し、Genesis2000 DNA analysis system(デュポン社)を用いて、ダイデオキシ法(文献9)でCaIL12活性を示すと思われる2つのサブユニットのうち一方のP40サブユニットDNAの塩基配列を決定した。この配列を配列番号1に示す。また、この配列を含む、990bpのDNA断片に宝酒造(株)のRandom Primer DNA Labeling Kitを用いて32Pを標識し、プローブを作製した。上記(2)で得られたイヌ肝臓cDNAから作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌NM514上でプラークとして形成させ、アマシャム社のHybond−N+に常法に従って転写した。Hybond−N+は、5×SSPE(0.9M NaCl,50mM NaH2 PO4 ,5mM EDTA,pH7.4),5×デンハルト溶液(0.1%フィコール、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%ウシ血清アルブミン)、0.1%SDS、100μg/mlサケ精子DNA中、65℃で2時間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した標識プローブ1×106 cpm/mlとハイブリダイズさせた。65℃で1晩インキュベートした後、Hybond−N+を0.2×SSC(30mM NaCl,3mMクエン酸ナトリウム)、0.1%SDS中15分、3回洗浄し、富士写真フィルム(株)の富士イメージングプレートに12時間露出し、富士写真フィルム(株)のバイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニングを行った。3回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する1個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージより常法に従ってファージDNAを抽出し、制限酵素EcoRIで切断した後、1%アガロースゲル電気泳動にて得られたDNA断片を常法に従い調製し、宝酒造(株)のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて、宝酒造(株)のpUC118BAP処理DNA(EcoRI/BAP)と連結した。これを用いてプラスミドDNAを常法により調製し、蛍光DNAシーケンサー(パーキンエルマー社製DNAシーケンサー373S)を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたDNA断片の塩基配列を決定した。このうち、CaIL12P40をコードする配列を配列番号11に示す。
【0020】
(4)CaIL12P35遺伝子のクローニング
ヒトIL12P35のN末端(文献1)およびウシIL12P35のC末端の塩基配列をもとに、
5´AGCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTCGCTACCCTG3´(配列番号5)
と
5´CTAGGAAGAACTCAGATAGCTCATCATTCTGTCGATGGT3´(配列番号6)
の2種類のプライマ−をDNAシンセサイザーにて合成した。上記(1)の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたcDNAを鋳型として上記(3)と同様にして約670bpのDNA断片を得、T−Vectorに挿入し、CaIL12活性を示すと思われる2つのサブユニットのうち一方のP35サブユニットDNAの塩基配列を決定した。この配列を配列番号2に示す。また、この配列を含む約670bpのDNA断片を用いて標識プローブを作製した。上記(2)で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたcDNAから作製した組換え体ファージライブラリーを上記(3)と同様にして標識プローブとハイブリダイズさせ、スクリーニングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する1個の組換え体ファージよりDNAを抽出し、制限酵素NotIで切断した後、1%アガロースゲル電気泳動にて得られた約1.2kbのDNA断片をSTRATAGENE社のpBluescriptIIのNotIサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドDNAを調製し、蛍光DNAシーケンサーを用いて、得られたDNA断片の塩基配列を決定した。このうち、CaIL12P35をコードする配列を配列番号12に示す。
【0021】
実施例2
CaIL12の生産
(1)CaIL12発現ベクターの調製
発現ベクターpCDL−SRα296(文献9)を制限酵素EcoRIで切断し、バクテリア由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化した。これを1%アガロースゲル電気泳動にて約3.6kbのDNA断片を常法に従い調製した。一方、CaIL12P40 DNA断片は
5´GGGGAATTCATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGG3´(配列番号7)
と
5´CCCGAATTCCTAACTGCAGGGCACAGATGCCCAGTCGCT3´(配列番号8)
の2種類のEcoRI切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例1(2)で調製したT−Vectorに挿入したCaIL12活性を示すと思われる2つのサブユニットのうち一方のP40サブユニットDNAを鋳型として、DNAの変性条件を94℃、1分、プライマーのアニーリング条件を55℃、2分、プライマーの伸長条件を72℃,3分、サイクル数30でPCRを行い、エタノール沈殿後、制限酵素EcoRIで切断し、1%アガロースゲル電気泳動にて約990bpのDNA断片を調製した。また、
5´GGGGAATTCATGCATCCTCAGCAGTTGGTCATCTCCTGG3´(配列番号13)
と
5´CCCGAATTCCTAACTGCAGGACACAGATGCCCAGTCGCT3´(配列番号14)
の2種類のEcoRI切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例1(2)で調製したpUC118に挿入したCaIL12P40DNAを鋳型として、PCRを行い、EcoRIで切断し、約990bpのDNA断片を調製した。得られたそれぞれのCaIL12P40DNA断片をT4DNAリガーゼを用いて上述のようにして調製したpCDL−SRα296に連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製し、CaIL12P40を発現するFOCaIL12P40およびFOCaIL12P40FLを得た。また、pCDL−SRα296を制限酵素PstIで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約3.6kbのDNA断片を調製した。CaIL12P35
DNA断片は
5´GGGCTGCAGATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTC3´(配列番号9)
と
5´GGGCTGCAGCTAGGAAGAACTCAGATAGCTCATCATTCT3´(配列番号10)
の2種類のPstI切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例1(3)で調製したT−Vectorに挿入したCaIL12活性を示すと思われる2つのサブユニットのうち一方のP35サブユニットDNAを鋳型として、94℃,1分、55℃,2分、72℃,3分、30サイクルでPCRを行い、エタノール沈殿後、制限酵素PstIで切断した。これを1%アガロースゲル電気泳動にて約670bpのDNA断片を調製した。また、
5´GGGCTGCAGATGTGCCCGCCGCGCGGCCTCCTCCTTGTG3´(配列番号15)
と
5´GGGCTGCAGTTAGGAAGAATTCAGATAACTCATCATTCT3´(配列番号16)
の2種類のPstI切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例1(2)で調製したpUC118に挿入したCaIL12P35DNAを鋳型として、PCRを行い、PstIで切断し、約670bpのDNA断片を調製した。得られたそれぞれのCaIL12P35DNA断片をT4DNAリガーゼを用いて上述のように、PstIで切断し調製したpCDL−SRα296に連結、大腸菌形質転換、プラスミドDNA調製を行い、CaIL12P35を発現するFOCaIL12P35およびFOCaIL12P35FLを得た。
【0022】
さらに、作製したこれら4つの発現プラスミド中のCaIL12P40DNAおよびCaIL12P35DNAの塩基配列を確認した。
【0023】
(2)サルCOS細胞でのCaIL12の生産
上記(1)で得られたそれぞれ5μgのFOCaIL12P40およびFOCaIL12P35を50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、400μg/mlのDEAEデキストラン(ファルマシア製)および100μMのクロロキン (シグマ社)を含む4mlのERDF培地(極東製薬(株)製)に加えておく。一方、直径10cmのディッシュを用いて10%ウシ胎児血清(ギブコ社、以下FBSと略記する)を含むERDF培地で50%コンフルエントになるまで増殖させたCOS−1細胞(ATCC CRL−1650)をPBSで一回洗浄した後、上記で得た4mlのDNA混合液を加え、5%CO2 、37℃の条件で培養した。4時間後、細胞をPBSで洗浄した後、10mlの10%FBS−ERDF培地にて5%CO2 ,37℃の条件で4日間培養し、CaIL12が生産された培養上清を得た。
【0024】
(3)CaIL12の活性測定
上記(2)で生産されたCaIL12の活性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌインタ−フェロンγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスIIMHC発現増強活性を測定した。
【0025】
イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、10%FBS−ERDFで106 cells/mlの細胞密度に懸濁し、このうち2.5mlを6cmディッシュに添加した。これに上記(2)で得られた培養上清2.5mlを加え、5%CO2 、37℃の条件で2日間培養し、ウイルスとしてVesicular Stomatitis Virus,感受性細胞としてMDCK(ATCC CCL−34)を用い、文献10のCPE法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、105 希釈単位/ml以上の抗ウイルス活性が確認された。一方、10μgのpCDL−SRα296を上記(2)と同様にCOS−1細胞に導入したコントロールの細胞培養液では抗ウイルス活性の誘導能は認められなかった。
【0026】
また、クラスIIMHCを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来細胞株FCBR1を用いて,上記のイヌ脾臓リンパ球培養上清のクラスIIMHC発現増強活性を測定した。6cmディッシュに105 cellsのFCBR1を接着させ、これにCaIL12で刺激したイヌ脾臓リンパ球培養上清5mlを添加し、5%CO2 、37℃の条件で1晩培養した。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、1.5mlのミクロ遠心チュ−ブにて遠心した。これに10μlのラット抗イヌMHCクラスIIモノクロ−ナル抗体(Stratagene社製)を添加し、さらに50μlの10%FBS−ERDFで懸濁後、氷上で1時間静置した。PBSで洗浄した後、5μlのFITC標識ラビット抗ラットモノクロ−ナル抗体(Stratagene社製)および50μlの10%FBS−ERDFで懸濁し、氷上で1時間静置した。PBSで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のFACScanにて解析した。その結果、CaIL12で刺激したイヌ脾臓リンパ球の培養上清はFCBR1上の、クラスIIMHCの発現量を約20%上昇させた。これらのことから、CaIL12はイヌリンパ球に作用して、イヌインタ−フェロンγを誘導する活性を有することが判明した。
【0027】
また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、10%FBS−ERDFで106 cells/mlの細胞密度に懸濁し、このうち5mlを6cmディッシュに添加した。これにPHA(ICN社製)を5μg/mlの濃度で添加し、5%CO2、37℃の条件で3日間培養してリンパ球を芽球化させた。この芽球化リンパ球を10%FBS−ERDFで106 cells/mlの細胞密度に懸濁し、96穴マイクロプレート1穴あたり、50μlを添加した。これに上記(2)で得られた培養上清を1穴あたり50μl加えた。また、コントロールとして10%FBS−ERDFを1穴あたり50μl加えた。これらをさらに5%CO2、37℃の条件で3日間培養した後、文献11のMTTアッセイ法により、CaIL12の芽球化リンパ球増殖促進活性を測定した。すなわち、5mg/mlのMTT(シグマ社製)溶液を1穴あたり10μlづつ添加し、さらに6時間培養した。150μlの0.04N塩酸イソプロパノ−ル溶液を加えた後、超音波にて細胞を破砕し、マイクロプレ−トリ−ダ−(BIO−RAD社製Model3550)にて波長595nmの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸光度が平均0.69であったのに対し、CaIL12は平均1.52であり、約2倍の芽球化リンパ球増殖促進活性が認められた。
【0028】
さらに、CaIL12のイヌ腫瘍に対する抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、10%FBS−ERDFで5×106cells/mlの細胞密度に懸濁し、このうち5mlを6cmディッシュに添加した。これにベ−リン
ガ−マンハイム(株)のリコンビナントヒトIL2を500U添加し、5%CO2、37℃の条件で3日間培養した。一方、イヌ腫瘍細胞株FCBR1およびA72(ATCC CRL−1542)を10%FBS−ERDFでそれぞれ105cells/mlの細胞密度に懸濁し、96穴プレ−ト1穴あたり50μlづつ添加し、プレ−トに接着させた。これにヒトIL2で刺激したイヌリンパ球50μlを加え、さらにCaIL12を発現している上記(2)で得られた培養上清100μlもしくはコントロ−ルとして10%FBS−ERDF100μlを添加し、5%CO2、37℃の条件で2日間培養した。培養後、上清を完全に取り除き、MTTアッセイを行った。%細胞障害性を次の式にて算出した。
【0029】
%細胞障害性=(1−OD2 /OD1 )×100
ここで、OD1=培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波長595nmの吸光度
OD2 =イヌリンパ球と共に培養したイヌ腫瘍細胞の波長595nmの吸光度を表す。
【0030】
その結果、FCBR1ではコントロ−ルが34%であったのに対し、CaIL12は75%の細胞障害性を示した。また、A72ではコントロ−ルが22%であったのに対し、CaIL12は83%の細胞障害性を示した。これらのことから、CaIL12はイヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を発揮することが判明した。
【0031】
参考文献
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8.Proberら:Science 238,336−341(1987).
9.Takebeら:Mol.Cell.Biol.8,466−472(1988).
10.F.L.Grabamら:Virology 54,536−539(1973).
11.Mosmannら:J.Immunol.Methods 65,55−63(1983)
【0032】
【配列表】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
配列番号:12配列の長さ:669配列の型:核酸鎖の数:二本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:cDNA to mRNA起源生物名:イヌ配列の特徴特徴を表わす記号:peptide存在位置:1..666特徴を決定した方法:S配列ATG TGC CCG CCG CGC GGC CTC CTC CTT GTG ACC ATC CTG GTC CTG CTA 48Met Cys Pro Pro Arg Gly Leu Leu Leu Val Thr Ile Leu Val Leu LeuAGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 96Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala SerCCA AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 144Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu LeuAGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 192Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu LeuTAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 240Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention mass-produces canine interleukin 12 (hereinafter abbreviated as CaIL12) whose primary protein structure is derived from canine genetic information by genetic engineering technology, and thus has veterinary drugs (antitumor / antivirus / vaccine adjuvants). The present invention relates to a plasmid, a transformant, CaIL12, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Interleukin 12 is a heterodimer of a protein with a molecular weight of about 40 kD (hereinafter abbreviated as P40) and a protein of about 35 kD (hereinafter abbreviated as P35), and activates natural killer cells and type 1 helper T cells. It is a cytokine having an active action and is abbreviated as IL12. For example, as in Reference 1, several documents have been published so far. In addition to human IL12, IL12 cDNA from mouse (Reference 2) and bovine (GenBank database registration numbers U11815 and U14416) has also been cloned by gene manipulation techniques, and application development research has been conducted as a therapeutic agent for tumors and viral diseases. Yes.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, there are no reports that canine IL12 has been cloned.
[0004]
Dogs are known to have numerous tumors such as breast tumors, numerous viral diseases such as parvovirus infection, distemper infection, and allergic dermatitis.
[0005]
Therefore, if canine IL12 becomes readily available, it is expected that the use as canine antitumor agents, antiallergic agents, and antiviral agents will be opened.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In view of such circumstances, the present inventor has succeeded in cloning the respective genes encoding P40 and P35 of CaIL12 from canine cDNA for the purpose of cloning of CaIL12 cDNA and mass production using the same. In addition, the inventors succeeded in producing a cell that produces CaIL12 using two plasmids in which they are linked to an expression vector, thereby establishing a method for easily producing CaIL12 in large quantities, thus completing the present invention. It came to.
[0007]
That is, the present invention provides plasmids for producing CaIL12, transformants of E. coli having these plasmids, animal cells transformed with this plasmid, and CaIL12 obtained from these transformants. Furthermore, the present invention also provides a gene encoding each of the two subunits of the CaIL12 protein.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A plasmid incorporating DNAs encoding the two subunits of the CaIL12 protein of the present invention can be produced, for example, as follows. That is, after extracting poly (A) RNA from canine cells, cDNA was synthesized and polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “polymerase chain reaction”) using primers based on gene sequences encoding two subunits of bovine and human IL12, respectively. (Abbreviated as PCR), two genes each encoding two subunits exhibiting CaIL12 activity can be cloned. Moreover, a full length of CaIL12P40 cDNA and CaIL12P35 cDNA can be cloned by preparing a phage library from the synthesized cDNA recombinant and performing plaque hybridization with two gene fragments obtained by PCR.
[0009]
As a method for obtaining RNA from dog furniture or cells, such as canine mononuclear cells or lymphocytes stimulated with mitogen, etc., conventional methods such as polysome separation, sucrose density gradient centrifugation and electrophoresis are used. The method that I did. As a method for extracting RNA from the above canine apparatus and canine cells, a guanidine thiocyanate-cesium chloride method in which CsCl density gradient centrifugation is performed after guanidine thiocyanate treatment (Reference 3) is used in the presence of a ribonuclease inhibitor in the presence of a ribonuclease inhibitor. Method of phenol extraction after treatment with activator (Reference 4), guanidine / thiocyanate-hot / phenol method, guanidine / thiocyanate / guanidine hydrochloride method, guanidine / thiocyanate / phenol / chloroform method, guanidine / thiocyanate and chlorination An appropriate method can be selected from the method of precipitating RNA by treatment with lithium.
[0010]
It can be obtained by isolating mRNA from canine mononuclear cells and lymphocytes stimulated with canine utensils, mitogens, etc. by conventional methods such as lithium chloride / urea method, guanidine isothiocyanate method, oligo dT cellulose column method, etc. From mRNA, a conventional method such as the method of Gubler et al. CDNA is synthesized by the method of Okayama et al. (Reference 6). In order to synthesize cDNA from the obtained mRNA, basically, a reverse transcriptase such as avian osteoblast virus (AMV) or the like may be used, or a method using a DNA polymerase or the like using a one-part primer may be combined. It is convenient to use a commercially available synthesis or cloning kit.
[0011]
By performing PCR using this cDNA as a template and primers based on the base sequences of human, mouse and bovine, genes encoding P40 subunit and P35 subunit exhibiting CaIL12 activity can be cloned. Further, the synthesized cDNA is linked to a λ phage vector, and then packaged by mixing with a coat protein of λ phage in vitro, and the generated phage particles are infected with E. coli serving as a host. At this time, Escherichia coli infected with λ phage is lysed, and each clone is recovered as a plaque. The plaques are transferred to a filter such as nitrocellulose, and the full lengths of CaIL12P40 cDNA and CaIL12P35 cDNA can be cloned by hybridization using a gene obtained by radiolabeled PCR as a probe.
[0012]
Prokaryotes or eukaryotes can be used as the host. As prokaryotes, bacteria, particularly Escherichia coli, Bacillus bacteria, such as Bacillus subtilis, and the like can be used. As eukaryotes, yeasts such as yeasts belonging to the genus Saccharomyces, e.g. eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, insect cells, for example, Yotoga Cells (Spodoptera frugiperda), cabbage looper cells (Trichoplusiani), silkworm cells (Bombyx mori), animal cells such as human cells, monkey cells, mouse cells and the like can be used. In the present invention, the organism itself, for example, an insect such as a silkworm, a cabbage looper, or the like can also be used.
[0013]
As expression vectors, plasmids, phages, phagemids, viruses (baculo (insects), vaccinia (animal cells)) and the like can be used. The promoter in the expression vector is selected depending on the host bacterium. For example, a lac promoter, a trp promoter or the like is used as a bacterial promoter, and an adh1 promoter, a pqk promoter, or the like is used as a yeast promoter. Examples of the promoter for insects include baculovirus polyhedrin promoter and p10 promoter, and examples of animal cells include, but are not limited to, the early or late promoter of Simian Virus 40. Transformation of a host with an expression vector can be carried out by conventional methods well known in the art, and these methods are described in, for example, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. The transformant can be cultured according to a conventional method.
[0014]
The produced CaIL12 has an apparent molecular weight of about 70-80 kD as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under non-reduction.
[0015]
In SDS-PAGE, the 70-80 kD band produces two subunits with molecular weights of about 40 kD and about 35 kD under reducing conditions.
As shown in Example 2 below, CaIL12 is mainly characterized by the ability to induce canine interferon γ from canine leukocytes and the effect of promoting proliferation of canine lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin (hereinafter abbreviated as PHA). Is done. In addition, it has the activity of activating NK cells and cytotoxic T cells to thaw their target cells, such as tumor-derived cell lines or virus-infected fibroblasts.
[0016]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0017]
Example 1
Cloning of CaIL12P40 and P35 genes
(1) Preparation of canine cDNA
Treated with canine liver, canine peripheral blood mononuclear cells stimulated with LPS (50 μg / ml) for 48 hours and chicken Newcastle disease virus for 7 hours (10 7 pfu / ml) Total RNA was prepared from canine spleen-derived lymphocytes using ISOGEN (Nippon Gene). The obtained RNA was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) (hereinafter abbreviated as TE) containing 1 mM EDTA, treated at 70 ° C. for 5 minutes, and then the same amount of TE containing 1 M LiCl was added. . The RNA solution was applied to an oligo dT cellulose column equilibrated with TE containing 0.5 M LiCl and washed with the same buffer. Further, after washing with TE containing 0.3 M LiCl, the poly (A) RNA adsorbed with 2 mM EDTA (pH 7.0) containing 0.01% SDS was eluted. Single-stranded cDNA was synthesized using the poly (A) RNA thus obtained. Specifically, 5 μg of poly (A) RNA and 0.5 μg of oligo dT primer (12-18mer) were placed in a sterilized 0.5 ml microcentrifuge tube, and diethylpyrocarbonate-treated sterilized water was added to make 12 μl. Incubated for 10 minutes and then placed on ice for 1 minute. To this, 2 μl of 200 mM Tris-HCl (pH 8.4), 500 mM KCl solution, 25 mM MgCl 2 2 μl, 10 μm dNTP 1 μl and 0.1 M DTT 2 μl, respectively, and incubated at 42 ° C. for 5 minutes. Then, 200 μl of GibcoBRL SuperScript II RT was added and incubated at 42 ° C. for an additional 50 minutes for cDNA synthesis. Reaction was performed. The reaction was stopped by further incubation at 70 ° C. for 15 minutes and placed on ice for 5 minutes. In this reaction solution, 1 μl of E. coli was added. E. coli RNase H (2 units / ml) was added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
[0018]
(2) Preparation of canine cDNA phage library
Using 1 μg of the poly (A) RNA obtained in (1) above, a double-stranded cDNA was synthesized using an oligo dT primer using a Pharmacia Time Saver cDNA synthesis kit according to the attached manual, and EcoRI / NotI. The adapter was connected. Using this, a recombinant λgt10 vector was prepared in accordance with the attached manual with Amersham cDNA Rapid Cloning Module-λgt10, and a recombinant phage was prepared with an in vitro packaging module of Amersham according to the attached manual. .
(3) Cloning of CaIL12P40 gene
Based on the base sequences of N-terminal and C-terminal of human IL12P40 (Reference 1),
5'ATGTGTCACCAGCAGTGTGTCATCTCTTGGTTT3 '(SEQ ID NO: 3)
When
5 ′ CTAACTGCAGGGGCACAGTGCCCA3 ′ (SEQ ID NO: 4)
These two types of primers were synthesized with a DNA synthesizer. 2 μl of cDNA obtained from dog liver and LPS-stimulated canine peripheral blood (1) above was taken in separate 0.5 ml microcentrifuge tubes, and each primer was 20 pmol, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 .5 mM MgCl 2 25 mM KCl, 100 μg / ml gelatin, 50 μM each dNTP, 4 units Each reagent is added to make Taq DNA polymerase to make a total volume of 100 μl. 35 cycles using a DNA thermal cycler from Perkin-Elmer Cetus under conditions of DNA denaturation at 94 ° C for 1 minute, primer annealing at 55 ° C for 2 minutes, and primer extension at 72 ° C for 3 minutes. Reacted. This was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 990 bp was prepared according to a conventional method (Reference 7).
[0019]
This DNA fragment was transferred to T-Vector of Invitrogen by Takara Shuzo Co., Ltd. DNA Ligation Kit Ver. 1 was used for ligation. Using this, Escherichia coli was transformed according to a conventional method, and plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by a conventional method. Next, it was confirmed by PCR under the same conditions as described above that the PCR fragment had been inserted into this plasmid, and CaIL12 activity was expected by the dideoxy method (Reference 9) using Genesis 2000 DNA analysis system (DuPont). The base sequence of one P40 subunit DNA was determined. This sequence is shown in SEQ ID NO: 1. In addition, a 990 bp DNA fragment containing this sequence was used using Takara Shuzo's Random Primer DNA Labeling Kit. 32 P was labeled to prepare a probe. The recombinant phage library prepared from the canine liver cDNA obtained in (2) above was formed as a plaque on E. coli NM514, and transcribed into Abondham's Hybond-N + according to a conventional method. Hybond-N + is 5 × SSPE (0.9 M NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM EDTA, pH 7.4), 5 × Denhardt's solution (0.1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% bovine serum albumin), 0.1% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA, Incubate for 2 hours at 65 ° C., then 1 × 10 labeled probe prepared as described above in the same solution 6 Hybridized with cpm / ml. After overnight incubation at 65 ° C., Hybond-N + was washed three times for 15 minutes in 0.2 × SSC (30 mM NaCl, 3 mM sodium citrate), 0.1% SDS, and Fuji Photo Film Co., Ltd. The sample was exposed to an imaging plate for 12 hours and analyzed with a bioimaging analyzer from Fuji Photo Film Co., Ltd. Plaques with a positive signal were rescreened according to conventional methods. As a result of screening three times, one recombinant phage having a positive signal was obtained. Phage DNA was extracted from this recombinant phage according to a conventional method and cleaved with the restriction enzyme EcoRI, and then a DNA fragment obtained by 1% agarose gel electrophoresis was prepared according to a conventional method, and DNA Ligation from Takara Shuzo Co., Ltd. Kit Ver. 2 was used to ligate with pUC118BAP-treated DNA (EcoRI / BAP) from Takara Shuzo Co., Ltd. Using this, a plasmid DNA was prepared by a conventional method, and obtained using a fluorescent DNA sequencer (DNA sequencer 373S manufactured by PerkinElmer Co.) and using a dye terminator cycle sequencing kit manufactured by PerkinElmer Co. according to the attached protocol. The base sequence of the DNA fragment was determined. Among these, the sequence encoding CaIL12P40 is shown in SEQ ID NO: 11.
[0020]
(4) Cloning of the CaIL12P35 gene
Based on the nucleotide sequence of the N-terminus of human IL12P35 (Reference 1) and the C-terminus of bovine IL12P35,
5 'AGCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCTCCTGTCGCTACCCTTG3' (SEQ ID NO: 5)
When
5 ′ CTAGGAAGAACTCAGATAGAGCTCATCATTCTGTCGATGGT3 ′ (SEQ ID NO: 6)
These two types of primers were synthesized with a DNA synthesizer. Using the cDNA obtained from canine spleen-derived lymphocytes treated with chicken Newcastle disease virus of (1) above as a template, a DNA fragment of about 670 bp was obtained in the same manner as in (3) above, inserted into T-Vector, and CaIL12 activity The base sequence of one P35 subunit DNA was determined. This sequence is shown in SEQ ID NO: 2. Also, a labeled probe was prepared using a DNA fragment of about 670 bp containing this sequence. A recombinant phage library prepared from cDNA obtained from canine spleen-derived lymphocytes treated with chicken Newcastle disease virus obtained in (2) above was hybridized with a labeled probe in the same manner as in (3) above, Screening was performed. As a result, DNA was extracted from one recombinant phage having a positive signal, cleaved with restriction enzyme NotI, and then a DNA fragment of about 1.2 kb obtained by 1% agarose gel electrophoresis was subjected to STRATAGENE. It was linked to the NotI site of pBluescript II of the company according to a conventional method. Plasmid DNA was prepared using this, and the base sequence of the obtained DNA fragment was determined using a fluorescent DNA sequencer. Among these, the sequence encoding CaIL12P35 is shown in SEQ ID NO: 12.
[0021]
Example 2
Production of CaIL12
(1) Preparation of CaIL12 expression vector
The expression vector pCDL-SRα296 (Reference 9) was cleaved with the restriction enzyme EcoRI, and the end was dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase. This was prepared by 1% agarose gel electrophoresis and a DNA fragment of about 3.6 kb was prepared according to a conventional method. On the other hand, the CaIL12P40 DNA fragment is
5 ′ GGGGAATTCATGTTCACCAGCAGTGTGTCATCTCTTG3 ′ (SEQ ID NO: 7)
When
5 'CCCGAATTCCTAACTGCAGGGCACAGATGGCCCAGTCCGCT 3' (SEQ ID NO: 8)
A primer added with the two types of EcoRI cleavage sites was prepared, and one P40 subunit DNA of the two subunits considered to exhibit CaIL12 activity inserted into the T-Vector prepared in Example 1 (2) was obtained. As a template, PCR was performed at 94 ° C. for 1 minute for DNA denaturation conditions, 55 ° C. for 2 minutes for primer annealing conditions, 72 ° C. for 3 minutes for primer extension conditions, 30 minutes for cycles, and after ethanol precipitation, restriction enzyme After cleaving with EcoRI, a DNA fragment of about 990 bp was prepared by 1% agarose gel electrophoresis. Also,
5 ′ GGGGAATTCATGCATCCCTCAGCAGTTGGTCCATCTCTGG3 ′ (SEQ ID NO: 13)
When
5 ′ CCCGAATTCCTAACTGCAGGACACAGATGGCCCAGTCCGCT 3 ′ (SEQ ID NO: 14)
PCR was performed using the CaIL12P40 DNA inserted into pUC118 prepared in Example 1 (2) as a template, and digested with EcoRI to prepare a DNA fragment of about 990 bp. . Each of the obtained CaIL12P40 DNA fragments was ligated to pCDL-SRα296 prepared as described above using T4 DNA ligase. Escherichia coli was transformed using this, plasmid DNA was prepared from the obtained transformant, and FOCaIL12P40 and FOCaIL12P40FL expressing CaIL12P40 were obtained. Further, pCDL-SRα296 was cleaved with the restriction enzyme PstI, dephosphorylated, and a DNA fragment of about 3.6 kb was prepared by electrophoresis. CaIL12P35
DNA fragments
5′GGGCTGCAGAGTGTCCAGCGCGGCAGCCTCCCTCTGTGTC3 ′ (SEQ ID NO: 9)
When
5 ′ GGGCTGCAGCTAGGAGAGAACTCAGATAGAGCTCATCATCTCT 3 ′ (SEQ ID NO: 10)
A primer added with two types of PstI cleavage sites was prepared, and one of the two P35 subunit DNAs, which was considered to exhibit CaIL12 activity, was inserted into the T-Vector prepared in Example 1 (3). As a template, PCR was performed at 94 ° C., 1 minute, 55 ° C., 2 minutes, 72 ° C., 3 minutes, 30 cycles, ethanol precipitation, and then digestion with restriction enzyme PstI. About 670 bp DNA fragment was prepared from this by 1% agarose gel electrophoresis. Also,
5 ′ GGGCTGCAGATGTGCCCGCCGCGCGGGCCTCCTCTTGTG3 ′ (SEQ ID NO: 15)
When
5 ′ GGGCTGCAGGTTAGGAAGAATTCAGATAACTCATCATCTCT 3 ′ (SEQ ID NO: 16)
PCR was performed using the CaIL12P35 DNA inserted into pUC118 prepared in Example 1 (2) as a template, and digested with PstI to prepare a DNA fragment of about 670 bp. . Each of the obtained CaIL12P35 DNA fragments was ligated to pCDL-SRα296 prepared by cutting with PstI using T4 DNA ligase as described above, E. coli transformation and plasmid DNA preparation were performed to obtain FOCaIL12P35 and FOCaIL12P35FL expressing CaIL12P35. .
[0022]
Furthermore, the base sequences of CaIL12P40 DNA and CaIL12P35 DNA in these four expression plasmids prepared were confirmed.
[0023]
(2) Production of CaIL12 in monkey COS cells
4 ml of ERDF medium containing 5 μg of FOCaIL12P40 and FOCaIL12P35 obtained in (1) above each containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 400 μg / ml DEAE dextran (Pharmacia) and 100 μM chloroquine (Sigma) (Add to Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) On the other hand, COS-1 cells (ATCC CRL-1650) grown to 50% confluent in ERDF medium containing 10% fetal bovine serum (Gibco, hereinafter abbreviated as FBS) using a dish having a diameter of 10 cm are used as PBS. After washing once with 4% of the DNA mixture obtained above, add 5% CO2. 2 The cells were cultured at 37 ° C. After 4 hours, the cells were washed with PBS and then 5% CO in 10 ml of 10% FBS-ERDF medium. 2 And culture at 37 ° C. for 4 days to obtain a culture supernatant in which CaIL12 was produced.
[0024]
(3) Measurement of CaIL12 activity
The activity of CaIL12 produced in the above (2) was measured as follows. For assay of canine inter-feron γ-inducing activity from canine lymphocytes, antiviral activity and canine cell class II MHC expression enhancing activity were measured.
[0025]
Lymphocytes are isolated from canine spleen and 10% with 10% FBS-ERDF. 6 It was suspended at a cell density of cells / ml, and 2.5 ml of this was added to a 6 cm dish. To this was added 2.5 ml of the culture supernatant obtained in (2) above, and 5% CO 2 was added. 2 The culture solution was cultured at 37 ° C. for 2 days, and the antiviral activity of this culture solution was measured according to the CPE method of Reference 10 using vesicular Stomatis virus as virus and MDCK (ATCC CCL-34) as sensitive cells. As a result, 10 5 Antiviral activity of dilution unit / ml or more was confirmed. On the other hand, the ability to induce antiviral activity was not observed in the control cell culture medium in which 10 μg of pCDL-SRα296 was introduced into COS-1 cells in the same manner as in (2) above.
[0026]
In addition, using the canine mammary tumor tissue-derived cell line FCBR1 expressing class II MHC, the class II MHC expression enhancing activity of the above canine spleen lymphocyte culture supernatant was measured. 10 in a 6cm dish 5 5 ml of 5% CO2 was added to 5 ml of the supernatant of cultured spleen lymphocytes of dog spleen lymphocytes stimulated with CaIL12. 2 And cultured overnight at 37 ° C. After culturing, the cells were detached with trypsin and centrifuged in a 1.5 ml microcentrifuge tube. To this was added 10 μl of rat anti-canine MHC class II monoclonal antibody (Stratagene), suspended in 50 μl of 10% FBS-ERDF, and allowed to stand on ice for 1 hour. After washing with PBS, the suspension was suspended in 5 μl of FITC-labeled rabbit anti-rat monoclonal antibody (Stratagene) and 50 μl of 10% FBS-ERDF, and left on ice for 1 hour. After washing with PBS, analysis was performed with FACScan from Becton Dickinson. As a result, the culture supernatant of canine spleen lymphocytes stimulated with CaIL12 increased the expression level of class II MHC on FCBR1 by about 20%. From these results, it was found that CaIL12 has an activity of inducing canine inter-feron γ by acting on canine lymphocytes.
[0027]
In addition, the proliferation promoting activity of blasted canine lymphocytes was measured. Lymphocytes are isolated from canine peripheral blood and 10% with 10% FBS-ERDF. 6 It was suspended at a cell density of cells / ml, and 5 ml of this was added to a 6 cm dish. PHA (manufactured by ICN) was added to this at a concentration of 5 μg / ml, and 5% CO 2 was added. 2 The cells were cultured at 37 ° C. for 3 days to allow lymphocytes to blast. The blasted lymphocytes were 10% with 10% FBS-ERDF. 6 The cells were suspended at a cell density of cells / ml, and 50 μl was added per well of a 96-well microplate. To this, 50 μl of the culture supernatant obtained in (2) above was added per well. As a control, 50 μl of 10% FBS-ERDF was added per well. These are further 5% CO 2 After culturing at 37 ° C. for 3 days, CaIL12's blastogenic lymphocyte proliferation promoting activity was measured by the MTT assay method of Reference 11. That is, 10 μl of a 5 mg / ml MTT (Sigma) solution was added per well and further cultured for 6 hours. After adding 150 μl of 0.04N isopropanolic hydrochloric acid solution, the cells were disrupted with ultrasonic waves, and the absorbance at a wavelength of 595 nm was measured with a microplate reader (Model 3550 manufactured by BIO-RAD). As a result, the absorbance of the control was 0.69 on average, whereas CaIL12 was 1.52 on average, and about twice as much blastogenic lymphocyte proliferation promoting activity was observed.
[0028]
Furthermore, the antitumor effect of CaIL12 on canine tumors was examined. Lymphocytes are isolated from canine peripheral blood and 5 × 10% with 10% FBS-ERDF 6 It was suspended at a cell density of cells / ml, and 5 ml of this was added to a 6 cm dish. This is Berin
Add 500 U of recombinant human IL2 from Garmanheim Co., Ltd. and add 5% CO 2 The cells were cultured at 37 ° C. for 3 days. Meanwhile, the canine tumor cell lines FCBR1 and A72 (ATCC CRL-1542) were each 10% FBS-ERDF 10 5 The cells were suspended at a cell density of cells / ml, and 50 μl per well of 96-well plate was added to adhere to the plate. To this was added 50 μl of canine lymphocytes stimulated with human IL2, and then 100 μl of the culture supernatant obtained in (2) above expressing CaIL12 or 100 μl of 10% FBS-ERDF as a control was added. 2 The cells were cultured at 37 ° C. for 2 days. After incubation, the supernatant was completely removed and MTT assay was performed. % Cytotoxicity was calculated by the following formula.
[0029]
% Cytotoxicity = (1-OD 2 / OD 1 ) × 100
Where OD 1 = Absorbance at wavelength 595 nm of canine tumor cells cultured only in medium
OD 2 = Represents absorbance at a wavelength of 595 nm of canine tumor cells cultured with canine lymphocytes.
[0030]
As a result, FCBR1 showed 34% control, whereas CaIL12 showed 75% cytotoxicity. In addition, the control of A72 was 22%, whereas CaIL12 showed 83% cytotoxicity. From these results, it was found that CaIL12 activates canine lymphocytes and exerts an antitumor effect on canine tumor cells.
[0031]
References
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10. F. L. Grabam et al .: Virology 54, 536-539 (1973).
11. Mosmann et al. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983)
[0032]
[Sequence Listing]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037]
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042]
[0043]
SEQ ID NO: 12 Sequence length: 669 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Double-stranded topology: Type of linear sequence: cDNA to mRNA Origin organism name: Symbol representing the characteristic features of the canine sequence: Peptide location : 1. . 666 Method of characterizing: S sequence ATG TGC CCG CCG CGC GGC CTC CTC CTT GTG ACC ATC CTG GTC CTG CTA 48 Met Cys Pro Pro ArG Gly Leu Leu Leu Leu AGC CTC CCC ACA GCC TCA 96Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala SerCCA AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 144Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln A sn Leu LeuAGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 192Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu LeuTAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 240Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
Claims (12)
Priority Applications (1)
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