JP3616230B2 - 酵素転換デンプンの調製のための高固形分単相工程 - Google Patents

Description

【０００１】
酵素転換は一般にバッチ式又は連続式スラリー工程で実施される。一般に、「高固形分」酵素スラリーは約１８〜３５重量％の固形分を含む。この転換は自然デンプンの高粘度が達せられず、且つ撹拌が高固形分混合物において保たれうるようになるため、顆粒デンプンの加熱の際に（それを糊化するために）実施される。酵素転換の完了後、酵素を失活させる。転換酵素は往々にして使用前に希釈される。
【０００２】
酵素転換又は酸及び酵素転換を包括するいくつかの特許を以下に説明する。
【０００３】
米国特許第２，６０９，３２６号（Ｗ．Ｗ． Ｐｉｇｍａｎ ら，１９５２年９月２日に特許）は、デンプンを強い撹拌及び剪断にかけながら熱湯の中でデンプン顆粒を迅速に糊化及び分散し、デンプン分子を大型フラグメントへと加水分解する能力を特徴とするデンプン液化アミラーゼにより高温においてこの糊化及び分散化デンプンを直ちに転換し、酵素を失活させ、そして直ちにこの酵素転換デンプンを乾燥させることを開示する。
【０００４】
米国特許第３，５６０，３４３号（Ｆ．Ｃ． Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ら， １９７１年２月２日特許）は、デンプンを１５未満のＤ．Ｅ．に酸加水分解し、次いで細菌性アルファーアミラーゼにより１０〜２５のＤＥに転換する工程を開示する。
【０００５】
日本第４６−１４７０６号（１９７１年４月２０日公開）は、膨潤はするが、冷水に溶けず、そして粘度の低下した顆粒状転換デンプンを調製するための連続工程を開示する。ｐＨを５〜７に調節するためのバッファーを含む４０〜６０％の水分含量を有するデンプンアルファーアミラーゼ混合物を、室温にて、又は糊化温度以下の温度において数時間にわたり硬化させ、その後７０〜１５０℃に保ったデンプンドライヤーの中に入れる。乾燥中、その温度及び水分含量はデンプンの加水分解のために適切なものに変わる。加水分解、加水分解デンプンの乾燥及び残留酵素の不活性化が７０〜１５０℃での加熱の際に同時に起こる。液状タイプのアミラーゼは７０〜９０℃において最強の加水分解活性を示すが、高温（即ち、９０℃以上）では、水分含量が３５％を超えていると、デンプンは加水分解活性を受けるが、同時に糊化してしまい、そして混合物の水分含量が３０％未満だと、デンプンの糊化は困難なものとなるが、同時に酵素による加水分解は急低下する傾向にある。このような対立する性質を満足せしめるため、混合物の水分含量をドライヤーの中で４０〜６０％から３０〜３５％に下げ、そして酵素加水分解中の温度を９０〜１００℃にまで高める必要がある。
【０００６】
米国特許第３，６６３，３６９号（Ａ．Ｌ． Ｍｏｒｅｈｏｕｓｅら，１９７２年５月１６日特許）は二段加水分解を開示する。第一段階は非常にわずかなデキストリン化又は糖化を伴ってデンプンを液化するように酸又は酵素により高温で短時間で実施する。第二段階は所望のＤＥが達成されるように細菌性アルファーアミラーゼによりアルカリｐＨにおいて実施する。
【０００７】
米国特許第３，６４４，１２６号（Ｄ．Ａ． Ｂｏｄｎａｒ ，１９７２年２月２２日特許）は、デンプンの水性スラリーを＜３５のＤＥを有する製品が得られるのに十分な条件下でデンプン液化酵素により処理することによってデンプン転換シロップを作る二段工程を開示する。この液化デンプンスラリーを次いでグルコアミラーゼ及び麦芽酵素で消化して＜４５％のデキストロースと８５％の総発酵性糖を供するのに十分な量のマルトースとを有するシロップを得る。
【０００８】
米国特許第３，８４９，１９４号（Ｆ．Ｃ． Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ，１９７４年１１月１９日特許）は、ワキシーデンプンを細菌性アルファーアミラーゼにより８５℃以上の温度で処理してワキシーデンプンを液化し、その液化ワキシーデンプンを約８０℃に冷却し、そしてその液化ワキシーデンプンを細菌性アルファーアミラーゼにより約５〜約２５のＤ．Ｅ．へと転換することを開示する。
【０００９】
米国特許第３，８５３，７０６号（Ｆ．Ｃ． Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ ，１９７４年１２月１０日特許）はデンプンを細菌性アルファーアミラーゼにより１５未満のＤＥにまで加水分解し、加水分解を加熱処理により止め、そして更に約５〜２０のＤＥにまで転換することを開示する。
【００１０】
米国特許第３，９２２，１９６号（Ｈ．Ｗ． Ｌｅａｃｈ，１９７５年１１月２５日特許）はデンプン（５〜約４０％の固形分）の水性スラリーをアルファーアミラーゼ及び任意的に糖化酵素（例えばベーターアミラーゼ又はグルコアミラーゼ）で加水分解することを開示する。糖化酵素は好ましくは顆粒デンプンを可溶化温度又はそれより低い温度（例えば５０〜６５℃及びｐＨ４〜６）において実質的に可溶化させた後に加える。この混合物をデンプンの一次糊化温度と実際の糊化温度との間の温度において好ましくはｐＨ５〜７で加熱する。
【００１１】
米国特許第４，０１４，７４３号（Ｗ．Ｃ． Ｂｌａｃｋ，１９７７年３月２９日特許）はデンプンの連続酵素液化のための方法を開示する。好ましくは、デンプンは生デンプンとする。適当な酵素は細菌性アルファーアミラーゼである。デンプン（乾燥固形ベースで１０〜４５重量％）の酵素含有懸濁物を加熱した乾燥デンプン（１７０〜２１０°Ｆ）の撹拌本体に連続式に加える。仕込んだデンプンを糊化させ、そして部分転換したデンプンと混合し、容易に撹拌及びポンピングするのに十分に低い粘度を有するブレンドを維持する。ブレンドのストリームを転換タンクから連続式に取り出し、そして酵素を失活させるように処理する。この工程はブレンドの最大粘度を５０００ｃｐｓ 以下のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度（１００ｒｐｍ 及び８８℃−１９０°Ｆ）に制約するように管理する。様々な酵素転換度となったデンプンのブレンドが得られ、その理由は個々のデンプン顆粒又は分子に関して加熱及び酵素処理が均一にわたらないからである。
【００１２】
英国特許第１，４０６，５０８号（１９７５年９月１７日公開）は７０重量％以下の固形分含量を有するデンプンペーストを得るように自然又は化学修飾デンプンを液化するための連続式工程を開示する。顆粒形態のデンプンを、スラリーの中間形成することなく、反応ゾーンに連続式に供給し、そこでそれを撹拌水性媒体の中で高温（５０〜９８℃）及び４．５〜８のｐＨにおいて酵素（例えばアルファーアミラーゼ）の作用にかける。液化が完了したら、液化デンプンを酵素の不活性化により安定化させる。より多い高分子の比率及びより広い分子量分布が、分子がより小さく、且つ実質的に同サイズとなる不連続式工程と比べ、得られる。
【００１３】
ドイツ国特許第３７ ３１ ２９３Ａ１（１９８０年４月８日公開公報）はデンプンを連続式に分解及び消化するための工程を開示する。乾燥デンプン粉末を液体水又は水性デンプン懸濁物と一緒にデンプン分解酵素、好ましくはアルファーアミラーゼを含む撹拌転換器に入れ、その際温度はスチームを１２０〜１２５℃及び２〜４ｂａｒ で注入することにより７０〜９０℃にまで上げる。転換器を出る製品を所望の濃度への最終希釈の前に酵素不活性化性剤で処理する。８０％までの及びそれより高い固形分含有量を有するデンプンペーストが得られる。
【００１４】
米国特許第４，９２１，７９５号（Ｆ．Ａ． Ｂｏｚｉｃｈ． Ｊｒ， １９９０ 年５月１日特許）はアルファーアミラーゼをグルコアミラーゼと組合せて用いてデキストリン接着剤を作るための改良スラリー法を開示する。グルコアミラーゼの機能は限界デキストリンの問題及び機械剪断工程を排除することにある。アルファーアミラーゼは線形アミロース分子のａ（１→４）結合をランダム切断し、そして枝分れアミロペクチン分子を限界デキストリンの（１→６）グルコシド結合まで切断する。水性反応スラリーの中でボルテッスが生ずるのに十分なほどにスラリーを撹拌し、これにより剪断によらない適当な混合を保つ。最適なフラグメントサイズ混合物が得られるまで加水分解を続ける（２０ｒｐｍ ，１１０°Ｆ，４５〜５５％の固形分及び０〜１６％の硼酸ナトリウム五水和物にて１，０００〜２，０００ｃｐｓ のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度により表示）。次いで酵素を失活させる。得られるスラリーの流体特性は必要なだけ調整できうる。
【００１５】
ヨーロッパ特許第２３１，７２９号（１９９３年８月４日公開）はフラワーの酵素分解のための二段工程を開示する。第一段階はアルファーアミラーゼによる処理を包括する。第二段階は任意的にプルラナーゼと組合せたベーターアミラーゼによる処理を包括する。懸濁物の乾燥固形分含有量は可能な限り高く、例えば３０〜５０％とする。
【００１６】
米国特許第５，４４５，９５０号（Ｓ． Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９５年８月２９日特許）は顆粒デンプンをアルファーアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼにより１０〜６５℃において若干分解させて顆粒デンプンの粘度を下げる方法を開示する。デンプンは０．１〜１５％、好ましくは０．１〜１％分解する。
【００１７】
高固形分酵素転換デンプンを調製するために利用できる方法が必要である。
【００１８】
本発明は、液化酵素転換酵素を調製するための高固形分酵素転換方法であって、
（ａ）修飾又は未修飾の冷水不溶性デンプンに、水及びデンプン加水分解性酵素を、目に見える遊離水相のない単相粉末混合物が生成するのに十分な量で加える；
（ｂ）前記粉末混合物を前記酵素のほぼ至適温度に加熱することにより活性化し、その際その混合物において実質的に一定な水分含量を保っておく（即ち、出発水分含量の±５％以内）；
（ｃ）前記酵素で前記デンプンを加水分解する；そして
（ｄ）任意的に前記酵素を失活させる；
工程を含んで成る。
【００１９】
本発明は更に酵素転換修飾又は未修飾顆粒デンプンを調製するための高固形分工程であって、上記の通りに調製するものであるが、但しアルファーアミラーゼを使用する場合、工程（ｂ）における総水分含量を約１５〜３５％にし、そして酵素がアルファーアミラーゼ以外の酵素であるか又はアルファーアミラーゼを含む酵素混合物であるとき、総水分含量を約１５〜４０％にする方法に関する。
【００２０】
ここでいう「デンプン」とは、非アルファー化顆粒デンプン、アルファー化顆粒デンプン、及びアルファー化であるが冷水溶性でないデンプンを含むことを意図する。
【００２１】
ここでいう「単相」とは目に見える遊離水のない混合物を意味し、一方「スラリー」は二相、即ち水相とデンプン相とより成る。ここでいう好適な総水分含量は全混合物の約１５〜４０重量％であるが、但し転換顆粒デンプンがアルファーアミラーゼのみで調製されたものであるとき、総水分含量は約１５〜３５％である。
【００２２】
粉末又は好適には液体酵素と所望の総水分含量を供するのに十分な量の水とを顆粒デンプン粉末上に分散させる。顆粒デンプンの典型的な水分含量は約１０〜１４％とする。即ち、工程（ａ）において総水分量を所望の量にするのに十分な水を加える。ここでいう「総水分量」とは顆粒デンプンの中に一般的に存在している平衡水分と添加した水との合計を意味する。
【００２３】
湿った単相粉末混合物を一般の練り粉混合装置又は粘性ポリマー配合装置の中の如きで混練及び圧縮する混合工程にかけるとき、それは水分含量及び存在する溶質の量に依存して、糊化及び転換の開始前に非常に高粘度でコンパクトな練り粉状の塊となりうる。連続機械剪断は温度を上昇させ、そして糊化及び転換を及ぼすであろう。
【００２４】
粉末混合デンプンが顆粒デンプンを含むとき、粉末混合物が加熱されると、その熱及び水分はデンプン顆粒の膨潤を誘発し、そしてデンプンは完全又は部分的に糊化し、そして同時に転換する。粉末混合物がアルファー化冷水非分散性デンプンを含むとき、熱及び水分はデンプンを分散させ、そしてデンプンは完全に糊化し、そして同時に転換する。デンプンが転換されると、通常粉末は液化する。液化製品又は部分転換顆粒製品のいづれが得られるかは水分含量と濃度とに依存する。例えば、ワキシーメイズデンプンを３５％の水分において７０℃以下でアルファーアミラーゼで処理すると部分加水分解顆粒デンプンが得られる。しかしながら、４０％の水分及び９５℃以上では、ワキシーメイズトウモロコシはアルファーアミラーゼにより糊化、加水分解、液化する。自然デンプンのピーク粘度に達成されることはない。
【００２５】
デキストロース当量（Ｄ．Ｅ．）はマルトデキストリンの還元性糖含量により示される転換度の表示である。
【００２６】
最終製品はシロップ、転換顆粒デンプン、又はシロップと転換顆粒デンプンとの混合物の形態であってよい。ここでいう「シロップ」は液体及び粘性ペーストを包括する。得られるデンプンシロップは高固形含量（例えば６０重量％以上、一般には６５〜７５重量％）で得られる。シロップはスプレードライ、ベルトドライ又は凍結乾燥してよい。酵素転換デンプンは水溶性粉末としてデンプンシロップから回収し得る。所望するなら、糖副産物を洗浄により顆粒転換デンプンから回収し得る。
【００２７】
微孔性顆粒転換デンプンはグルコアミラーゼを単独で又はアルファーアミラーゼと混合して用い、高固形分酵素転換方法によっても調製できうる。
【００２８】
任意的に、酵素アクチベーター、例えば一定の無機塩類及び／又はｐＨ調整剤、例えば酸、塩基又は緩衝剤を使用してよい。
【００２９】
酵素は使用する特定の酵素のための至適温度及びｐＨに至る直接又は間接加熱及び／又はｐＨ調整により活性化し得る。酵素はｐＨを下げる、阻害塩を加える、又は温度を上げることにより失活し得る。
【００３０】
転換の際の水分含量は生成固体、直接加熱のために用いるインジェクションスチームの凝縮、及び転換中の蒸発に影響される。生成固体は加水分解により増加する。１００のＤ．Ｅ．に至る転換中、デンプンの乾燥重量は加水分解反応生成物に対する水の共有結合により１１．１１％上昇する。この乾燥重量の塩又は転換度に比例する。固体は凝縮スチームにより減り、そして蒸発により増える。
【００３１】
デンプン、水及び酵素の粉末混合物は酵素転換工程の際に撹拌を必要としない。従来技術の酵素転換工程に反して、本法は混合物が目に見える遊離水のない単相となるような高い固形分含量において実施する。
【００３２】
高固形分単相酵素転換方法において及び酵素転換デンプンの調製において使用するデンプンは任意の起源に由来しうる。デンプンのための典型的な起源は穀類、塊茎、根、豆及び果実デンプン並びにハイブリドデンプンである。適当な天然起源にはトウモロコシ、エンドウマメ、ジャガイモ、サツマイモ、モロコシ、コムギ、コメ、ワキシー（モチ）メイズ、ワキシータピオカ、ワキシーライス、ワキシーオオムギ、ワキシーコムギ、ワキシポテト、ワキシーモロコシ、４０％以上のアミロースを含むデンプン（高アミロースデンプンともいう）等が含まれる。
【００３３】
十分な転換が得られるのに有効なレベルの酵素が使用できることを条件としてフラワーを転換することが可能でありうる。
【００３４】
アルファー化していない顆粒デンプンが好ましい。顆粒アルファー化デンプンも本発明において有用である。アルファー化顆粒デンプンは当業界公知の方法により調製できる。アルファー化はデンプン顆粒の大半が膨潤されるが、完全なまま残るような態様で実施する。アルファー化顆粒デンプンを調製するための典型的な方法は米国特許第４，２８０，８５１号、同４，４６５，７０２号、同５，０３７，９２９号及び同５，１４９，７９９号に開示され、その開示内容は引用することで本明細書に組入れる。予備分散（即ち、アルファー化デンプン）も、それらが冷水不溶性であることを条件に、高固形分単相酵素転換方法において利用できうる。これらはジェット加熱及びスプレードライングにより調製できる。
【００３５】
以後に示す通り、種々の顆粒デンプンベースはこの高固形分工程において様々な酵素感受性を有す。顆粒高アミロースデンプンは高固形分単相工程において転換するのが一層困難である。デンプンの化学誘導化は糊化温度を下げ、転換し易くなりうる。
【００３６】
デンプンは化学的又は物理的に修飾してよい。化学修飾には熱−及び／又は酸−転換、酸化、リン酸化、エーテル化、エステル化、化学架橋、慣用酵素修飾等が含まれる。これらの修飾は好ましくはデンプンを酵素転換する前に施すのが好ましい。デンプンを修飾するための手順はＭ．Ｗ． Ｒｕｔｅｎｂｅｒｇ ｐ２２〜２６から２２〜４７， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔｅｒ Ｓｄｕｂｌｅ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｎｓ， Ｒ．Ｌ． Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｅｄｉｔｏｒ （ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９８０）の「Ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ 」の章に記載されている。
【００３７】
物理的に修飾を施したデンプン、例えばＷＯ ９５／０４０８２（１９９５年２月９日公開）に記載されている熱阻害型デンプンも本発明における使用に適する。
【００３８】
本発明において使用するのに適当な酵素には細菌、菌類、植物及び動物酵素、例えば、デンプンの１→４グルコシド結合を切断するエンド−アルファーアミラーゼ、アルファー１，４−結合の非還元性末端から段階式マルトース単位を除去するベーターアミラーゼ、デンプン分子の非還元性末端から段階式にグルコース単位を除去し、且つ、１→４及び１→６結合の双方を切断するグルコアミラーゼ、並びに枝切り酵素、例えばアミロペクチン含有デンプンの１→６グルコシド結合を切断するイソアミラーゼ及びプルラナーゼが含まれる。アルファーアミラーゼ及びそれとその他の酵素との混合物が好ましく、そして固有の二形態又は多形態分子量プロフィールをもつ酵素転換デンプンを調製するために使用される。
【００３９】
有意な転換（４５％）は、非アルファー化顆粒デンプンをプルラナーゼの如き枝切り酵素で処理するときに得られる。得られる枝切りデンプンは加熱した分散デンプンの慣用の枝切りにより生じる酵素転換デンプンよりもはるかに高いピーク分子量を有する。更に、酵素枝切りされたワキシーメイズの分子量は同一の転換条件でさえもアルファーアミラーゼ転換されたワキシーメイズのそれと異なる。
【００４０】
酵素は選択的吸着又は沈殿により精製できるが、多くの市販製品は有意な量のその他の酵素形態の不純物及び不活性形態のタンパク質を含む。例えば、市販の細菌性「アミラーゼ」は時折り「プロティナーゼ」（タンパク質を分解する酵素）を含むであろう。抽出及び部分精製を経て、市販の酵素は粉末又は液体濃縮物として販売されている。
【００４１】
特定の酵素の利用のための工程条件は異なり、そして通常は供給者により企案される。変動要因には温度、ｐＨ、基質固形分濃度、酵素用量、反応時間及びアクチベーターの存在が含まれる。たいてい、非絶対的な至適反応条件がある。「至適」ｐＨは温度に依存しうる；「至適」温度は反応時間に依存しうる；「至適」反応時間は費用に依存しうる；等々である。反応時間は１０分から２４時間、又はそれ以上、一般にはアルファーアミラーゼにとっては１〜１４時間である。従って、推漿する条件は通常妥協される。
【００４２】
条件を悪くする酵素の安定性は通常その基質の存在により改善される。いくつかの酵素は一定の塩類によっても安定化される（細菌性アミラーゼはカルシウム塩により安定化される）。重金属及びその他の酵素毒、例えば酸化剤を酵素反応体から除去することは必須である。これらの材料は通常酵素の永久的な失活（即ち、変性）をもたらす。しかしながら、往々にして反応生成物により（生成物阻害）又は通常の基質に構造的に近縁する物質により（競合阻害）、酵素活性が可逆的に低下する数多くの状況がある。可逆性インヒビターは酵素と一時的に複合し、それ故正常な反応に有用な酵素の量を減らしてしまうる。
【００４３】
典型的な酵素反応条件は「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｏｒｎ Ｗｅｔ Ｍｉｌｌｉｎｇ」Ｐ．Ｈ． Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｉｂｒａｒｙ， 第４巻（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９９２）に論じられている。
【００４４】
試験手順
デキストロース当量
Ｃａｎｅ Ｓｕｇａｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｓｐｅｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅａｄ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｉｎｃ．） のＥｙｎｏｎ−Ｌａｎｅ Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ＃４２３ より応用したフェーリング容量測定法をＤ．Ｅ．を決定するために利用する。
【００４５】
無水デンプンベースに基づく既知濃度のデンプン溶液（ｗ／ｖ）を調製する。通常の濃度は１０ｇ／２００ｍｌである。デンプン溶液を５０ｍｌのビュレットに移す。５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコの中の５０ｍｌの蒸留水に５ｍｌづつのフェーリング溶液Ａ及びＢをピペットにより加える。フェーリング溶液Ａは５００ｍｌの容量のメスフラスコの中に溶解され、その容量となった３４．６ｇの硫酸銅（ＣｕＳＯ_４ ・５Ｈ_２ Ｏ）を含む。フェーリング溶液Ｂは５００ｍｌのメスフラスコの中に溶解され、その容量となった１７３ｇのロッシェル塩（ＮａＫＣ_４ Ｈ_４ Ｏ_６ ・４Ｈ_２ Ｏ）及び５０ｇの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む。これらのフェーリング溶液をＢｕｒｅａｕ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓより得た標準化デキストロースに対して標準化する。
【００４６】
フェーリング系数を決定するため、この試験手順に従ったが、但し２００ｍｌの蒸留水当り０．５０００無水グラムのデキストロースを試験溶液として用いる。次式により、系数を計算する：
【数１】

【００４７】
この系数はフェーリング溶液Ａ及びＢの双方に適用され、そして小数点４位まで計算する。フラスコの内容物をホットプレートで沸騰させる。デンプン溶液を、沸騰させながら、明瞭な赤茶色の終点に至るまで滴定する（沈殿した酸化第一銅）。使用するデンプン溶液のｍｌを記録する。
【００４８】
デキストロース当量（ＤＥ）は次式を利用して計算する：
【数２】

（式中、「デンプン溶液」は終点に達するまで滴定において使用したデンプン溶液のｍｌに相当し、そして「デンプン濃度」はｇ／ｍｌで示す無水物ベースに基づくデンプン溶液の濃度に相当する）。
【００４９】
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
分子量（ＭＷ）分布を反射率（Ｒｌ）デクターの付いたＷａｔｅｒ Ａｓｓｏｃｉｃａｔｅｓ ＧＰＣ−１５０Ｃモデルを用いて決定する。Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）より入手した高度架橋型球状ポリスチレン／ジビニルベンゼンより成る２本のＰＬゲルカラム（１０^５ 及び１０^３ ）を一列に接続する。標準品としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｃｏｒｐ．（Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）由来のデキストランを使用する。実験条件は８０℃のカラム温度、１ｍｌ／ｍｉｎ の流速とする。移動相は５ｍＭの硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_３ ）を有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳ）とする。サンプル濃度は０．１％とし、そして注入容量は１５０μｌとする。
【００５０】
Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度測定手順
試験サンプルをＭｏｄｅｌ ＲＶＴ Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計及び適当なスピンドルを用いて測定する（スピンドルは材料の予測の粘度に基づいて選定する）。試験サンプルを入れ、そしてスピンドルをサンプル中の適当な高さにまで下げる。粘度計を回転させ、そしてスピンドルを一定の速度（例えば１０又は２０ｒｐｍ ）で少なくとも３回転、測定を行う前に回転させる。適当な変換係数を利用し、サンプルの粘度（センチポアズ）を記録する。
【００５１】
【実施例】
以下の実施例において、何らかのことわりのない限り非アルファー化顆粒デンプンを使用し、そして以降に記載の様々な酵素を使用した。
【００５２】
アルファーアミラーゼはＢａｎ １２０ Ｌ及びＴｅｒｍａｍｙｌとした。これらはＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋより入手した。Ｂａｎは約７０℃の至適温度、６．０〜６．５の至適ｐＨ、１２０ ＫＮＵ／ｇの活性、及び０．００５〜１．０％、好ましくは０．０１〜０．５％の推漿の用法（デンプンの重量に基づく）を有する慣用のアルファーアミラーゼである。Ｔｅｒｍａｍｙｌは９０℃以上の至適温度、１２０ ＫＮＵ／ｇの活性及び０．００５〜１．０％、好ましくは０．０１〜０．５％の推漿の用法（デンプンの重量に基づく）を有する熱安定性アルファーアミラーゼである。１キロＮｏｖｏ単位（１ＫＮＵ ）はＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋの標準法（基質として可溶性デンプン、溶媒中の０．００４３Ｍのカルシウム含有量、３７℃及びｐＨ５．６で７〜２０分を利用してアルファーアミラーゼを決定するための方法）において１時間当り５．２６ｇのデンプン（Ｍｅｒｃｋ， Ａｍｙｌｕｍ Ｓｏｌｕｂｉｌｅ， Ｅｒｇ． Ｂ６，バッチ ９９４ ７２７５）を分解する酵素の量である。
【００５３】
使用してアルファーアミラーゼ及びグルコアミラーゼの混合物はダイキン工業（株）（日本、大阪府）より得たＡｓｐｋ ２７とした。至適条件は開示されていない。
【００５４】
使用したオオムギベーターアミラーゼはＦｉｎｎｓｕｇａｒ Ｇｒｏｕｐより入手したＳｐｅｚｙｍｅ ＢＢＡ １５００とした。この酵素のための至適条件はｐＨ５．０〜７．０及び５５〜６５℃の温度である。これは１５００Ｄｐ°／ｍｌの活性を有し、そしてその推漿の用法（デンプンの重量に基づく）は０．１〜２．０％、好ましくは０．２〜０．８％である。１度のジアスターゼ力（Ｄｐ°）は、サンプルを１００ｍｌの基質と２０℃で１時間インキュベートしたときに５ｍｌのフェーリング溶液を還元するのに足りる還元性糖を供する５％のサンプル酵素調製品溶液０．１ｍｌの中に含まれる酵素の量である。
【００５５】
アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ ３００ｍｌ）はエクソ−１，４−アルファーＤ−グルコシダーゼである。至適条件はｐＨ４．５及び６０℃である。これは３００ ＡＧＵ／ｍｌの活性、０．００５〜１．０％、好ましくは０．０１〜０．５％の推漿用法（デンプンの重量に基づく）を有する。１Ｎｏｖｏ無水グリコシダーゼ単位（ＡＧＵ ）は、２５℃，ｐＨ４．３で３０分にて、基質としてマルトースを用い、１分間当り１μｍｏｌ のマルトースを加水分解する酵素の量して定義する。
【００５６】
使用する枝切り酵素はＰｒｏｍｏｚｙｍｅ ６００Ｌ（プルラナーゼ）であり、これもＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋより入手した。これは６０℃の至適温度及び５．１の至適ｐＨを有する熱安定性枝切り酵素である。これは２００ ＰＵＮ／ｇの活性を有し、そしてその推漿用法（デンプンの重量に基づく）は１〜１５％、好ましくは２〜１０％ ＰＵＮ／ｇである。これは６００ ＰＵＮ／ｍｌの濃縮物の活性を有するＰｒｏｍｏｚｙｍｅの濃縮形態である。１プルラナーゼ単位Ｎｏｖｏ（ＰＵＮ）は以下に示す条件下で１分当り１μｍｏｌ のグルコースに相当する還元力をもつ還元性炭水化物を遊離させるようにプルランを加水分解する酵素の量である。この酵素のための至適条件はｐＨ５．０（０．０５Ｍのクエン酸バッファー）及び４０℃の温度である。
【００５７】
例１
本例は顆粒デンプンの加水分解度に対する水分含量の効果を示す。
【００５８】
ワキシーメイズ（１，０００ｇ）を標準ブレードの付いたＲｏｓｓミキサー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｏｓｓ ＆ Ｓｏｎ Ｃｏ．， Ｈａｕｐｐａｕｇｅ， ＮＹ）の中に入れた。０．１％づつのＴｅｒｍａｍｙｌ及びＢａｎの混合物を使用した。２０％及び４０％の総水分含量とするのに十分な水を加えた。
【００５９】
天然ワキシーメイズに基づいて、即ち、１１％の平衡水分含量を有するものを用いて比較実験を行った。一の実験において、酵素（０．２％づつのＢａｎ １２０Ｌ及びＴｅｒｍａｍｙｌ）をディスポーザブルマイクロピペットから微液滴としてデンプンに加えた。このデンプン及び酵素をＨｏｂａｒｔミキサーの中で更に１０分混合した。この混合物の一部（１００ｇづつ）を２個の１６オンスジャーに移し、そして９８℃に設定したオーブンの中に２４時間入れておいた。別の実験において、１，０００ｇのデンプン（１０．３％の水分）をＨｏｂａｒｔミキサーボウルの中に入れた。Ｔｅｒｍａｍｙｌ（デンプンに基づいて０．２％）を４９５ｍｌの水道水（ｐＨ６．２）と混合し、そしてデンプンに加えて４０％の総水分含量にした。デンプン、酵素及び水の混合を低速で１０分実施した。この混合物を室温で１１．４％の水分含量となるまで風乾した。風乾したデンプン（１００ｇ）を２００ｍｌのジャーに入れ、そして蓋をした。このジャーを９８℃のオーブンの中に２４時間入れた。得られる生成物は、ＧＰＣにより検査したとき、基礎のワキシーメイズデンプンと比べ、あるにしてもわずかにしか転換されていなかった。
【００６０】
図１は非加水分解の天然ワキシーメイズ並びに２０及び４０％において加水分解したワキシーメイズの分子量分布を示す。同一の条件下で、総水分量は最終生成物の分子量により示される通り転換度に大きな作用を及ぼした。水分含量を増やすと、一般に転換度は上昇する。平衡水分含量では（添加水なし）、デンプン酵素転換は事実上なかった。
【００６１】
例２
本例はＢａｎ（Ｂ），Ｔｅｒｍａｍｙｌ（Ｔ），Ｓｐｅｚｙｍｅ（Ｓ）及びそれらの混合物を用い、１０ガロンのゲートミキサーリアクターの中で行った一連の酵素転換を示す。一部のケースにおいては、酵素を二段階で添加した。
【００６２】
タンクの内寸は高さ１６インチ、直径１６インチのものとした。幅１／２インチ、深さ２インチのステンレススチール製バーストックより成るゲート撹拌器は高１０ １／２インチの４本の鉛直レーキを有した。外側レーキは内側のタンク壁から１／２インチ離れている。内側レーキは外側セットから３ １／４インチ離れている。タンクの頂部に取付けられているのは同一のバーストックの４本のブレーカーバーであり、タンク壁から１ ３／４及び５ １／４インチ離れている。０〜６０ｒｐｍ で可変式の電気駆動が攪拌器を動かす。タンクの頂点の通気孔は可変式のドラフト強制排気を担う。タンクの側面及び底面にはスチーム加熱及び水冷のためのジャケットが付いている。直径１／２インチのスチーム注入ポートが側面壁において、タンク底部から１インチの高さで設けられている。熱対子プローブが一本の外側ブレーカーバーの底部に取り付けられている。タンクの底部において、ボールバルブを有する２インチのポートが製品の流出のために設けられている。このような転換のため、取外式金属プラグをドローポートの中に挿入し、初期乾燥添加物の一部が不均一な水分、酵素又は熱を受容する可能性をなくさせている。
【００６３】
各転換につき、３３ポンドの市販の乾燥顆粒デンプンをタンクに加えた。酵素添加物を、無水物ベースに基づき２５％の水分含量にその添加物をするのに十分な量の水で希釈した。水／酵素混合物をデンプンに混合しながら加えた。この混合物は、酵素／水混合物の添加を経て、乾燥デンプンと湿ったデンプンとのブレンドとなり、直径０．５インチ未満に凝集した。
【００６４】
この時点で、撹拌器を約３０分止め、水をデンプン全体に拡散させた。デンプンは、放置後、湿った流動性粉末となっていた。
【００６５】
この混合物を、一般にはその混合物への活性スチームの注入により（何らかの表示がない限り３２ｐｓｉ ）、及び／又は任意的にタンクジャケットの加熱により加熱した。一般に、塊は加熱中混合しておくが、これは必須ではない。混合は熱伝導を高めるにすぎない。
【００６６】
顆粒デンプンが糊化すると（又は冷水不溶性予備分散デンプンが溶解すると）、それは転換されており、そしてその反応混合物は湿った粉末から湿った練り粉状の塊、そして分散シロップへと変化する。このような変化は温度を５０℃から９０℃に上昇させると起こる。液化の開始が起こる温度は水の活性、酵素活性化温度及びデンプンのタイプに依存して変わる。
【００６７】
かかる通気タンクにおいて、全加熱サイクル中に水分の若干の損失がある。注入スチームを遮断したら、温度をジャケット加熱により３０分間表示温度に保っておく。次いでバッチを５０℃以下に冷やし、そして取り出す。任意的に、ｐＨをリン酸で３．５に下げ、そしてその混合物を３０分そのままにして任意の残留酵素を不活性化させる。ｐＨは必要に応じて再調整する。
【００６８】
使用するデンプンベース、酵素及び量、並びに保持温度を以下の表に示す。固形分含量及びデキストロース当量（Ｄ．Ｅ）も示す。化学誘導デンプンについては、置換度（Ｄ．Ｓ．）を示す。デンプンを誘導化するのに用いた試薬はプロピレンオキシド（ＰＯ）、オセンチルコハク酸無水物（ＯＳＡ）及び酢酸無水物（ＡＣ_２ Ｏ）、並びに３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（Ｑｕａｔ．）とし、それらは表示のＤ．Ｓ．を供するのに足りる量で使用した。デンプンベースが流動性デンプンのとき（酸転換デンプン）、水流動度（Ｗ．Ｆ．）を示す。デンプンベースの一方はジェット加熱（ＪＣ）及びスプレードライ（ＳＤ）した予備分散デンプンとした。
【００６９】

【００７０】
これらの結果は、未修飾デンプン、化学誘導デンプン、流動性化学誘導デンプン並びに化学誘導及び架橋デンプンを含む様々なデンプンが高固形分単相酵素転換方法を利用して転換できることを示す。サンプル Ｎｏ．１３の如き高度に誘導されたデンプンでさえも転換できた。
【００７１】
例３
本例はグルコアミラーゼによる顆粒ワキシーメイズの転換を示す。
全部で１，０００ｇのワキシーメイズデンプン（１０．５％の水分）を標準ブレードの付いたダブルプラネタリーＲｏｓｓミキサーの中に入れた。水（４９０ｍｌ）を１：３の塩酸：水（ｗ／ｗ）で混合することによりｐＨ４．５に調整し、そして１％のグルコアミラーゼＡＭＧ ３００Ｌを加えた。次いでこの酵素溶液を全部で４０％の水となるのに十分な量となるようにミキサーに加えた。ミキサーの蓋をし、そしてデンプン及び酵素溶液をミキサー設定値を２にして室温で５分混合した。得られる混合物は目に見える遊離水のない湿った粉末であった。この混合物の温度を６０℃にまで高め、グルコアミラーゼを活性化した。その混合物を６０℃に２時間保った後、サンプル（２６５ｇ）をミキサーから取り出した。
【００７２】
酵素処理を経て可溶化したデンプンの量を決定するため、５ｇのサンプルを１０．０３ｍｌの水の中にスラリー化し、そして１０，０００ｒｐｍ で１０分遠心分離した。リフラクトメーターによる測定に従い、上清液中の溶質は３．８％であった。計算を通じ、及び酵素溶液中の溶質についての補正後、酵素転換の際に可溶化したデンプンの量はデンプンの乾燥重量に基づき１２．６％と決定された。
【００７３】
残りのサンプル２６０ｇを４００ｍｌの水の中にスラリー化し、３：１の水：塩酸溶液でｐＨ３．４に調整し、ｐＨ３．４に１時間保持し、ｐＨ５．５に再調整し、濾過し、そして風乾してサンプルＡを得た。
【００７４】
残りの混合物を更に３時間６０℃に保った（全部で５時間）。サンプル（約７５ｇ）を取り出した。可溶化した材料はデンプンの乾燥重量に基づき１９．７％と決定された。残りのサンプルのｐＨを調整し、濾過し、そして風乾してサンプルＢを得た。
【００７５】
残りの混合物を７５℃に加熱し、そして７６〜７７℃に１時間保った。生成物はデンプン顆粒の膨潤及びグルコアミラーゼ転換により生成した溶質（即ち、グルコース）により若干練り粉状であった。この生成物をバラバラにし、そして風乾してサンプルＣを得た。
【００７６】
処理条件及び％溶質を以下にまとめる。

【００７７】
図２は未転換ワキシーメイズ及びグルコアミラーゼ転換ワキシーメイズデンプンの分子量分布を示す。グルコアミラーゼ転換ワキシーメイズに関し、もしその生成物を水で洗わないと（サンプルＣ）、その生成物はグルコースピークを示した。グルコースアミラーゼ転換ワキシーメイズを水で洗ったとき（サンプルＢ）、グルコースピークは存在しなかった。サンプルＢ及びＣは共に中間的な分子量の物質が本質的になり天然ワキシーメイズと似たような高分子量ピークを示した。グルコアミラーゼ転換ワキシーメイズが中間ＭＷ物質を含まないこと、及び洗浄生成物が似たようなＭＷ分布を有することは、グルコアミラーゼが顆粒の中のあるデンプン分子を選択的に加水分解し、そして残りの分子はそのままとすることを示唆した。
【００７８】
顆粒中のデンプン分子に対するグルコアミラーゼによる選択的及び局部的攻撃は酵素転換デンプンの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）でも示される。
【００７９】
未洗浄サンプルであるサンプルＣは、不規則であり、且つ５０ミクロンから約３００ミクロンに範囲する粒子塊を含んで成る。粒子塊の形成はおそらくは顆粒を接着させ合うグルコースによるであろう。詳細な図での表層は穴を示し、一部の顆粒には多くの穴があり、そして一部は比較的乱れていなかった。典型的な穴はサブミクロンの直径であった。
【００８０】
サンプルＡではあるにしてもわずかな粒子塊しかなく、グルコースが洗い流された後、その物質は個々の顆粒へとよく分散されることが示唆される。ここでも、一部の顆粒において穴形成があり、そして残りは比較的穴形成がなかった。
【００８１】
例４
本例はアルファーアミラーゼとグルコアミラーゼとの混合物を利用する顆粒ワキシーメイズの転換を示す。
【００８２】
上記の手順を利用して、ワキシーメイズを１％のＡｓｐｋ２７により５０℃、４０％の総水分量で処理した。乾燥粉末デンプンを５．５時間の転換後回収した。グルコースの有意な生成が未洗浄の酵素転換生成物のＧＰＣ曲線において示された。ＳＥＭも上記の通り、酵素転換顆粒においてピンホールを示した。
【００８３】
例５
本例は、枝切り酵素Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅによりワキシーメイズデンプンを転換することによる固有分子量プロフィールを有する新規マルトデキストリンの調製を示す。
【００８４】
１，０００ｇのワキシーメイズデンプン及び４０％の総水分を利用して前記の通りにデンプンをＰｒｏｍｏｚｙｍｅで処理したが、ただし水のｐＨは５．１０に調整し、そして０．３％の枝切り酵素を使用した。デンプン及び酵素混合物を５８〜６０℃に２４時間保った。最終生成物は若干練り粉状であり、そしてデンプン顆粒は凝集しているように認められた。
【００８５】
図３はＧＰＣにより決定した、ワキシーメイズベース及び酵素枝切りしたワキシーメイズの分子量分布を示す。面積の積分から、ワキシーメイズの約４５％が、ベースと比べ、転換されていた。転換はグルコアミラーゼ又はベーターアミラーゼによるのではなく、その理由はグルコース又はマルトース副産物が生成されなかったからである。
【００８６】
Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ枝切りをしたワキシーメイズ及びアルファーアミラーゼワキシーメイズ（Ｂａｎ）の分子量分布を比較した（図１４参照）。双方の酵素処理を６０℃及び４０％の水分で行った。Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ転換ワキシーメイズ及びＢａｎ転換ワキシーメイズは非常に異なるＭＷ分布を有していた。アルファーアミラーゼ転換ワキシーメイズは低分子量オリゴ糖と高分子量分子との混合物を有し、それぞれのピーク分子量は１，０００及び３．２×１０^７ であり、そして中間分子量物質は非常に低レベルでしかなかった。一方、Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ枝切りワキシーメイズは有意な量の１０^６ にピーク分子量をもつ物質を有していた。
【００８７】
顆粒ワキシーメイズデンプンを完全に分散させ、そしてそれらをＰｒｏｍｏｚｙｍｅで枝切りすると、得られる枝切り物質は上述の枝切り物質よりもはるかに低い分子量及び異なるプロフィールをもつであろう。
【００８８】
例６
本例は単相高固形分法により調製される固有分子量をもつ別の新規のマルトデキストリンの調製を示す。
【００８９】
ワキシーメイズ（１，０００ｇ）をＲｏｓｓミキサーの中に入れた。水道水（４８５ｍｌ，ｐＨ６．５）を０．２％のＢａｎ １２０Ｌと混合し、そしてその混合物をＲｏｓｓミキサーに加えた。総水分量は４０％とした。ミキサーの蓋をし、そしてデンプン及び酵素溶液を室温で、ミキサーの設定値を１にして混合した。次いで温度を６０℃に上げ、そしてその混合物をミキサー設定値を３にしてその温度に２時間保った。サンプル（約１００ｇ）を取り出し、そしてＧＰＣ分析のために風乾した。その温度を９５℃に高めて酵素を失活させ、そしてその混合物を９５℃に１５分保った。デンプンは６０℃で２時間加水分解された後でさえも粉末状のままであった。温度を９５℃に上げると、デンプンは液化した。サンプル（約１００ｇ）を取り出し、そしてＧＰＣ分析のためにガラスプレート上で風乾した。
【００９０】
得られるマルトデキストリンは、市販のワキシーメイズマルトデキストリン（ＤＥ４）及び天然ワキシーメイズと比べ、異常な分子量分布を示した（図４参照）。６０℃では、２８．３％のワキシーメイズが転換され、一方９５℃では、６０．２％のワキシーメイズが転換された。単相法により調製したマルトデキストリンは低分子量オリゴ糖と高分子量糖との混合物であり、それぞれ１，０００及び３．２×１０^７ のピーク分子量をもつ、そして中間分子量マルトデキストリンは事実上なかった。
【００９１】
例７
本例は化学誘導高アミロースデンプン（Ｈｙｌｏｎ ＶＩＩ −７０％のアミロース）の転換を示す。
【００９２】
ヒドロキシルプロピル化ＶＩＩ （Ｄ．Ｓ．０．４７）を例１の手順を利用し、１，０００ｇのデンプン、４０％の総水分量及び０．２％のＴｅｒｍａｍｙｌを用いてアルファーアミラーゼにより加水分解した。デンプンは９８℃で４時間経て液化し、そして冷却により最終生成物は粘性溶液となった。
【００９３】
図５はヒドロキシプロピル化ＶＩＩ 及びアルファーアミラーゼ転換ヒドロキシプロピル化ＶＩＩ の分子量分布を示す。
【００９４】
例８
本例は単相高固形分法を利用するワキシーメイズデンプンエステルの転換を示す。
【００９５】
ＯＳＡ処理したワキシーメイズを例１に記載の通りにして、１，０００ｇのデンプン、４０％の総水分量、及び１ｇのＢａｎ １２０Ｌと０．５ｇのＳｐｅｚｙｍｅとの混合物を利用し、アルファーアミラーゼとベーターアミラーゼとの混合物で処理した。この混合物を６０℃に４時間保った。練り粉状の物質が形成された。この生成物をバラバラにし、そして風乾した。この生成物の一部（４００ｇ）を１，０００ｍｌの水の中にスラリー化し、０．１Ｍの塩酸で３０分にわたりｐＨ３．０に調整しておき、３％の水酸化ナトリウムによりｐＨ６．０にもどし、そしてスプレードライした。
【００９６】
これらの結果は、ＯＳＡ処理したアミオカをアルファーアミラーゼとベーターアミラーゼとの混合物で転換すると、低分子量ピーク（８００）が認められることを示した。しかしながら、検出したピークの小さい標準化面積は、ほとんどのサンプルが消え、そして検出されなかったことを示唆する。低分子量物質は最終生成物の重量に基づき約１２％と推定された。
【００９７】
例９
本例はその他の酵素転換した高度アセチル化デンプンの調製を示す。これは単相高固形分法を利用して調製した。
【００９８】
アセチル化ワキシーメイズデンプン（１．０５Ｄ．Ｓ．）を例１に記載の通りにして、１，０００ｇのデンプン、４０％の総水分量並びに１ｍｌづつのＢａｎ １２０Ｌ及びＴｅｒｍａｍｙｌを用いてアルファーアミラーゼにより転換した。デンプンは約８０℃で液化し始めた。温度が９５〜９８℃に高まるとＲｏｓｓミキサーの中で水性液体生成物が観察された。この混合物を９５〜９８℃に２時間に保った後、硬化した石様の物質がＲｏｓｓミキサーの中で形成された。
【００９９】
未転換アセチル化ワキシーメイズ（１．０５Ｄ．Ｓ．）はＧＰＣによっては検出されず、おそらくはＤＭＳＯ移動相におけるその高い分子量又は高い流体動力学容量を理由とする。この転換アセチル化ワキシーメイズ（１．０５Ｄ．Ｓ．）のＧＰＣ分子量プロフィールは多数のピークを示した。そのＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度（ＤＭＳＯ中５％の固形分、スピンドル＃４，１００ｒｐｍ ）は５６ｃｐｓ であり、一方未転換アセチル化ワキシーメイズの同じ濃度でのＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度は２，４８０ｃｐｓ （５％の固形分、スピンドル＃４，２０ｒｐｍ ）であった。この有意な粘度低下はアセチル化ワキシーメイズがたとえそれが１．０５のＤ．Ｓ．を有していたとしても加水分解及び脱重合されたことを示唆する。
【０１００】
例１０
本例はアルファー化顆粒デンプンの酵素転換を示す。
【０１０１】
ゲート撹拌器の付いた１０ガロンのジャケット付タンクに３３ポンドの化学修飾アルファー化顆粒トウモロコシデンプンを添加した。デンプンは顆粒トウモロコシデンプンを約０．０５のＤ．Ｓ．となるのに十分なプロピレンオキサイドと反応させ、次いでそのヒドロキシプロピル化顆粒デンプンを米国特許第４，２８０，８５１号の方法を利用してスプレードライすることにより予備分散させた。このデンプン粉末に、約７５％の出発固形分のために５．６ポンドの水に希釈しておいた３０ｇのＴｅｒｍａｍｙｌ １２０Ｌを添加した。添加水及び酵素をデンプンの中に分布せしめるために最低限の混合を利用した。必要なら、ｐＨを６．５に調整する。撹拌を止め、そしてスチームを混合物に注入して温度を９０℃にまで高めた。混合物が９０℃に達したら、撹拌を再び開始し、スチームの注入を止め、そして温度をジャケット加熱により９０〜９５℃に保った。１時間以内に混合物はＤＥ１０〜１９の化学修飾マルトデキストリンシロップへと転換するであろう。このシロップは熱いときは透明から半透明であるが、冷却後は経時的に軟質ゲルへと硬化しうる。
【０１０２】
例１１
本例は高固形分の紙被覆製剤における単相転換法により作った４種類のマルトデキストリンの利用を示す。
【０１０３】
デンプンは、固形分１０．２％のアルファーアミラーゼ転換ワキシーメイズ、固形分７１．２％の３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド基を含むアルファーアミラーゼ転換カチオンワキシーメイズ（Ｄ．Ｓ．０．０４）、固形分６０．７％のアルファーアミラーゼ転換ヒドロキシプロピル化ワキシーメイズ（Ｄ．Ｓ．０．１６）及び固形分５７．８％のアルファーアミラーゼ転換オクテニルスクシネートワキシーメイズ（Ｄ．Ｓ．０．０２）とした。
【０１０４】
デンプンを、１２：４及び８：８のデンプン、対、ラテックスバインダー比においてアセテート／アクリレートラテックス（ＲＥＳＹＮ（登録商標）１１５１）を含むコーティングの中で６６％，６４％、及び６２％の固形成において評価した。各マルトデキストリンの粘度をコントロール、即ち、Ｐｅｎｆｏｒｄ Ｇｕｍ（紙被覆用途において一般的に利用されているエチル化された８０Ｗ．Ｆ．のトウモロコシデンプン）のそれに合うように調整した。
【０１０５】
コーティングを全てアルカリベースストック紙に７ ｌｂｓ／３０００ｆｔ^２ コート重量において適用した。サンプルを２６０°Ｆで２０秒オーブン乾燥し、次いでスーパーカレンダー処理した（１４０°Ｆ，３０００ｐｓｉ ，１ｎｉｐ ）。サンプルを７５°のＨｕｎｔｅｒ光沢、ＴＡＰＰＩ輝度、Ｐａｒｋｅｒプリント滑らかさ、ＩＧＴ表面強度、及びＮＰＡ％インク転写率について試験した。より詳細にはデーターシート参照のこと。結果を以下の表に示す。
【０１０６】

【０１０７】
カチオンサンプルを除き全てのサンプルが高めの被覆固形分においてコントロールに匹敵する流動性を示した。光沢、輝度及び滑らかさはコントロールと同等であった。ＩＧＴ表面強度は同等又は低かった。インク受容率は向上した。
【０１０８】
例１２
本例は４種の食品における単相酵素転換デンプンの利用を示し、ここでは標準の市販のマルトデキストリンを典型的に使用した。
【０１０９】
最初の３つの製品は、慣用のマルトデキストリンの典型的な特性である高い固形分／低い粘度の関係を必要とする分野である。これには、接着力、粘着力及び膜形成特性が必要とされ、脂肪代替品及び安定化剤としてフローズンデザートに使用される。並びに乳化剤／封入剤としてエマルション系に使用されるシリアル粘着付与剤として使用される。高粘度単相酵素転換デンプンはコーヒークリマーに、慣用のマルトデキストリンの用途を超える用途を発揮するように使用される。
【０１１０】
Ａ部−シリアル粘着付与剤
評価した単相酵素転換デンプンを以下に示す。

【０１１１】
サンプルを液状で回収し、そして塗布試験のために固形分３０％に希釈した。シリアル／スナック製品のためのサンプルをスクリーニング及び定性するために利用する接着及び粘着試験は以下の通りである：
【０１１２】
接着試験
塩ふりクラッカーを秤量し、クラッカーの上面に３０％の固形分の溶液をこすりつけ、そして秤量した。乾燥アップルビットを上薬の上に落とした。過剰なビットを振り落し、そして被覆クラッカーを秤量し、そしてオーブンの中で１０７℃（２２５°Ｆ）で１０分乾かし、そして室温に冷却した。任意のゆるく載ったアップルビットを軽くこすり落し、そしてビットを秤量した。重量を計算した。％損失を計算した。
【０１１３】
粘着力
課題の試験は指の間に溶液の液滴を載せ、そしてそれが乾く際の粘着力及び糸引きを観察することにより行った。結果を以下に示す：

【０１１４】
これらの結果は、１５．７〜２３．１％の還元性糖値を有する単相転換生成物の全てが、低いパーセンテージのアップルビット損失及び増大した粘着力を有することにより、シリアル粘着付与剤としての１０〜４２ＤＥマルトデキストリンより優れていた。
【０１１５】
Ｂ部−アイスクリーム
単相法により調製した高度酵素転換タピオカデンプンをコンビネーション増量剤、脂肪代替品及び安定化剤としてハードパックアイスクリーム製剤において試験した。これを、一般に４％の用法レベルにおいて使用されるＧｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｐ．（Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ，ｌｏｗａ）由来のＭａｌｔｒｉｎ １００（１０ＤＥのマルトデキストリン）と比べた。
【０１１６】
このアイスクリームは以下の成分を含む：

【０１１７】
単相酵素転換タピオカデンプンより作ったアイスクリームに、使用する脱脂乳の量の若干の減少を補うために追加の水を加えた。
【０１１８】
乾燥成分を液体成分へと完全に分散させ、そしてブレンダー／ミキサー装置（Ｂｒｅｄｄｏ Ｌｉｋｗｉｆｉｅｒ改良型８ガロンユニット：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｃｏ． １８ｔｈ ａｎｄ Ｋａｎｓａｓ Ａｖｅｎｕｅ， Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ， Ｋａｎｓａｓ ６６１１９） の中で湿らした。この混合物を、１８５〜１９０°Ｆ，３０秒間のＨＴＳＨ（高温短時間）工程で代表される間接管状熱交換器（Ｍｉｃｒｏ Ｔｈｅｒｍｉｃｓ， ＵＨＴ／ＨＴＳＴ ｌａｂ−２５Ｖ ： Ｍｉｃｒｏ Ｔｈｅｒｍｉｃｓ， Ｉｎｃ．， ５０２４Ｆ Ｄｅｐａｒｔｕｒｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｒａｌｅｉｇｈ， ＮＣ ２７６０４）の中でペースト状にした。このペースト状にした熱い混合物を次にＧａｕｌｉｎ Ｉｎｃ．，Ｅｖｅｒｔｔ，ＭＡ０２１４９のＧａｕｌｉｎモデル１５ＭＲ−８ＴＢＡの中で５００／２，０００ｐｓｉ で２段階においてホモジナイズした。
【０１１９】
このホモジナイズした混合物を冷却し、そしてハードパックアイスクリーム装置（Ｔａｙｌｏｒ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｔｏｎ， ＩＬ のＴａｙｌｏｒモデル １１０−２７）の中で製造者の仕様に従って凍結させた。凍結前の低温混合物のＺａｈｎカップ粘度測定値は同一であった（１０ＤＥマルトデキストリン−２１秒／２５ｇ及び単相酵素転換タピオカデンプン−２８秒／２５ｇ）。オーバーランパーセンテージも約６０％にて同一であった。溶融試験を行ったとき、その結果は、１０ＤＥのマルトデキストリンを含むサンプルの溶融速度が単相サンプルよりも若干速いことを示した。
【０１２０】
全部で２８人のパネル構成員が二重嗜好味覚試験においてこのアイスクリームを評価した。パネリストは性質に基づいて１５ｃｍのラインスケール上でサンプルを等級分けするように要求された（凍り具合い、溶け具合い、クリーミーさ、硬さ及び冷たさ）。更に、彼らは最良と思うサンプルを選定することを要求された。３０人が単相酵素転換タピオカサンプルを最良と選び、そして１５人が１０ＤＥマルトデキストリンを最良と選んだ。凍り具合いに関しては、ほとんどの人が単相酵素転換デンプンを１０ＤＥマルトデキストリンよりも凍り具合いが良いものとして選んだ。大半のパネルの構成員は単相酵素転換タピオカデンプンの方がゆっくりと溶けるものとも選んだ。単相酵素転換タピオカは１０ＤＥマルトデキストリンほどクリーミーさはなかった。単相酵素転換タピオカはまた１０ＤＥマルトデキストリンよりも硬いものと知覚された。この二製品は口の中での冷たさは同一であった。
【０１２１】
「Ｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（感覚評価技術）の第２６１頁の表Ｔ１２に従うと、適正な反応の数が全部で２８の反応のうち１４以下であるなら、９０％の信頼性をもって差がないという取るに足りない仮説が受け入れるであろう。我々の結果では２８人のうち１３人が単相酵素転換タピオカを好むというものであった。このような結果に基づき、単相酵素転換タピオカは１０ＤＥマルトデキストリンと比べ有意差がない。しかしながら、この単相酵素転換タピオカサンプルは１０ＤＥマルトデキストリンよりもゆっくりと溶け、そして硬いものであった。これらは主要アイスクリーム業者にとっては重要な積極的な性質である。
【０１２２】
Ｃ部−風味料エマルションの封入
本例は風味料エマルション系における単相酵素転換デンプンの効率を示す。

【０１２３】
低粘度エマルションは担体として転換デンプンを使用して作った。担体、対、風味料の比は８０／２０とした。単相アルファーアミラーゼ転換ＯＳＡワキシーメイズサンプルは粒子分布に基づきＬｏｄｅｘ１０と比べてはるかに微細なエマルションを供した。これは単相アルファーアミラーゼ転換デンプンの場合のクリーム状化ではなく、Ｌｏｄｅｘ１０の場合における一夜の明瞭な油分離により再確認もされた。
【０１２４】
データーを以下の表にまとめた。

【０１２５】
単相アルファー／ベーターアミラーゼ転換ＯＳＡワキシーメイズをコーヒークリーマー（スプレードライしたデンプン／植物性脂肪エマルション）製品において酸転換ＯＳＡ処理ワキシーメイズと比較した。単相アルファー／ベーターアミラーゼ転換ＯＳＡワキシー及び酸転換ＯＳＡ処理ワキシーメイズより作ったエマルションは似たような粒子サイズ分布及び同等の乳化特性を有していた。ホットコーヒーでは、双方のサンプルは中程度の油分離を示した。データーを以下の表にまとめた。

【０１２６】
例１３
本例は苛性の添加及び添加抜きの段ボール接着剤の高固形分単相酵素転換法により調製した完全転換ヒドロキシプロピル化（ＰＯ）ワキシーメイズ及び部分転換未修飾ワキシーメイズの利用を示す。これら完全可溶化接着剤をステン・ホール型コントロール（懸濁生デンプンを有する苛性分散化担体デンプン）と比較した。
【０１２７】
室温において、固形分６１％のＰ．Ｏ．ワキシーメイズ及び固形分７１％の転換ワキシーメイズはそれぞれ３，０００ｃｐｓ 及び＞２０，０００ｃｐｓ の粘度を有していた。沸騰湯浴の中に保ったとき、その材料は著しく粘度低下した。２００°Ｆでは、固形分６１％の転換Ｐ．Ｏ．ワキシーメイズはステン・ホールカップで測定して４５秒の粘度を有していた。高い固形分レベルを保ち、且つ接着粘度を標準レベルにするため、これらの材料はグルーパンの中に注ぎ入れる前に加熱しておいた。
【０１２８】
固形分６１％のＰ．Ｏ．ワキシーメイズを０．０１２インチの標準ギャップ設定を利用してコルゲーター上で評価した。接着剤は５０ｆｔ／ｍｉｎ を超えるスピードでは接着片面ウェブを誘導することができなかった。ボードをコルゲーターを出た直後に分析すると、繊維引裂の徴候はなかった。この接着剤は紙に浸透しないようであった。アルカリ度を高めるために及び紙の中への接着剤の浸透を高めるために苛性を接着剤に加えた。接着剤の質量に基づき０．５％において、苛性は有意差をもたらし、そして接着剤を１７５ｆｔ／ｍｉｎ で流した。
【０１２９】
７１％の部分分散転換ワキシーメイズを８８℃（１９０°Ｆ）で保持した。その温度でも、粘度は約２０００ｃｐｓ であった。接着剤の粘度を下げるため及び浸透性を高めるため、全質量に基づき０．５％の苛性を加えた。０．０１２インチのギャップでは、接着剤は２５０ｆｔ／ｍｉｎ のスピードで片面ウェブを供することができた。ボードは４５０ｆｔ／ｍｉｎ のトップスピードでも製造できた。
【０１３０】
この接着剤をステン・ホール接着剤と比べるため、２５０ｆｔ／ｍｉｎ の実験を０．００８，０．０１４及び０．０２０インチのギャップ設定で完了させた。結合強度、対、接着剤付着量を、ＩＣＤ手順を利用し、ピン強度分析及び付着量についてのＩＣＤ酵素試験を利用して決定した。実験接着剤は全て６６〜９３℃（１５０°Ｆ及び２００°Ｆ）に保った。実験の仕様を以下に示す。
【０１３１】

【０１３２】
双方の接着剤の一の主たる虚弱化は接着剤付着量で示される最終結合強度であった。許容される結合強度は５０ｌｂ／線上ｆｔ． と考えられる。９．９ｌｂ／ＭＳＦ でさえも、より良く機能する固形分７１％の転換ワキシーメイズは最低限の基準を上廻ることができなかった。同一の紙の上で、ステン・ホール接着剤は１．５ｌｂ／ＭＳＦ を利用して５０ｌｂ／線上ｆｔの結合強度に達することができた。固形分６３％の転換ワキシーメイズにより製造されたボードは繊維引裂を事実上有さなかった。固形分７１％のワキシーの最大付着力に関してさえも最大で２５％の繊維引裂があった。部分転換材料はおそらくは若干高めの分子量のポリマー鎖を有し、それが改善された結合強度の理由でありうる。
【０１３３】
例１４
本例はインフレート積層用接着剤の調製を示す。
【０１３４】
清浄なドライタンクに４５．５２部のＯＳＡ修飾ワキシーメイズ（３％のＯＳＡ）を加え、続いて７．２５部の水と０．０９部のＴｅｒｍａｍｙｌとの予備混合物を加えた。この予備混合物をゆっくりとした定常スチームに加えながら３０ｒｐｍ での混合を実施した。この混合物が均質な塊となるまで混合物続け、次いで撹拌器を止めた。この混合物を生スチーム及びジャケットスチームで１８０〜２００°Ｆに３０分、又はタンクのまわりとスチームラインとに均一な液体が形成されるまで加熱した。９．００部の水を加え、そして撹拌を３０ｒｐｍ で再始動し、その際加熱を続けた。温度は撹拌しながら２００〜２１０°Ｆに保った。生成物が清澄となり、且つ滑らかとなったら、粘度及び固形分を試験した。試験結果を記録したら、０．０５部の８５％のリン酸を加えた。
【０１３５】
必要ならば酵素活性を終結させるために追加の酸でｐＨを３．５に調整する。加熱を止め、そして１２．９０部の硝酸ナトリウムを加える。この混合物を１４０°Ｆ以下に冷やし、そして０．３０部の発泡抑制剤、１１．８４部の塩化マグネシウム六水和物、１２．９０部の塩化カルシウム及び０．１５部の保存剤を加えた。
【０１３６】
Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度を水の添加により２０００〜５０００ｃｐｓ に調整した。この接着剤は優れたインフレート、高い固形分、良好な接着力及び優れた安定性を示すものと予測される。
【０１３７】
例１５
本例はケース及びカートンシーリング剤の調製を述べる。
【０１３８】
清浄なドライタンクにジエチルアミノクロリド基（０．０４Ｄ．Ｓ．）を含むカチオン性ワキシーメイズデンプン４３．５２部を加え、次いで６．９５部の水と０．０９部のＴｅｒｍａｍｙｌとの予備混合物を加えた。
【０１３９】
予備混合物をゆっくりとした定常スチームに加えながら混合を３０ｒｐｍ で行った。混合はデンプンが均一な塊となるまで続け、次いで撹拌器を止めた。この混合物を生スチーム及びジャケットスチームで１８０〜２００°Ｆに３０分又はタンクのまわり及びスチームラインに均一な液体が形成されるまで加熱した。次いで６．９４部の水を加えた。撹拌を３０ｒｐｍ で再始動させ、その間加熱を続けた。この混合物を撹拌しながら２００〜２１０°Ｆに保った。生成物が清澄となり、そして滑らかとなったら、粘度及び固形分を試験する。試験結果を記録したら、０．０５部の８５％のリン酸を加える。必要なら酵素活性を終結させるためにｐＨを追加の酸で３．５に調整する。
【０１４０】
加熱を止め、次いで６．５部の水、３５．５部のポリビニルアセテート、０．３部の発泡抑制剤及び０．１５部の保存剤を加える。
【０１４１】
水による希釈によりＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度を５００〜５０００ｃｐｓ に調整する。この接着剤は即乾性、高凝集力及び優れた接着力のために考案されたものである。
【０１４２】
例１６
本例は食料雑貨袋接着剤の調製を述べる。
【０１４３】
例１２記載の手順を４３．５２部のヒドロキシプロピル化ワキシーメイズ（Ｄ．Ｓ．０．０９）を酵素転換するために用いる。予備混合は６．９５部の水と０．０９部のＴｅｒｍａｍｙｌより成る。デンプンが液化した後に加える水の量は６．９４部である。酵素を不活性化させ、そして加熱を止めたら、４２．００部の水、０．１５部の保存剤及び０．３０部の発泡抑制剤を添加する。この溶液を１５００〜５０００ｃｐｓ のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度に希釈する。この接着剤は標準の袋接着剤と比べて即硬化性、高固形分、一層強力な接着力及び最小限のしわ形成性を供するであろう。
【０１４４】
例１７
本例はチューブ巻取接着剤の調製を述べる。
【０１４５】
例１２において利用した手順を、４３．５２部のヒドロキシプロピル化流動性ワキシーメイズ（３５ＷＦ，Ｄ．Ｓ．０．１６）を酵素転換するために用いた。この予備混合物は６．９５部の水と０．０９部のＴｅｒｍａｍｙｌより成る。デンプンを液化した後、６．９４部の水を加えた。酵素を不活性化させた後、加熱を止め、１．１０部の２５％の水酸化ナトリウム、３０．０部の５ｍｏｌｅの硼砂、８．０部の珪酸アルミニウム、０．３０部の発泡抑制剤及び０．１５部の保存剤を加えた。
【０１４６】
水による希釈によりＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度を２，０００〜１０，０００ｃｐｓ に調整する。この接着剤は優れた凝集力及び最小限の縮みを伴う著しい即硬化速度、更には優れた接着力のために考案されたものである。
【０１４７】
例１８
本例は封筒継目接着剤の調製を述べる。
【０１４８】
例１２に記載の手順を４３．５２部のトウモロコシデンプンを酵素転換するために用いた。予備混合物は６．９５部の水と０．０９部のＴｅｒｍａｍｙｌとより成る。デンプンを液化させた後に加える水の量は６．９４部とする。試験結果を記録した後、０．０３部の２０ボーメの塩酸を加える。加熱を止め、そして溶液を冷却後、３２部の塩化マグネシウム六水和物、１０．０部の水、０．３０部の発泡抑制剤及び０．１５部の保存剤を加える。
【０１４９】
Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度を水による希釈により２００〜８０００ｃｐｓ に調整する。この接着剤は高められた固形分に基づくたれにくさ、きれいな機械仕上げのための優れた流動性、良好な接着力、及び紙の継目を退色させないであろう薄い色調を示すであろう。
【０１５０】
例１９
本例はラベル包装接着剤の調製を述べる。
【０１５１】
例１２記載の手順を利用し、４３．５２部のワキシーメイズトウモロコシを酵素転換させる。この予備混合物は６．９５部の水と０．０９部のＴｅｒｍａｍｙｌとより成る。デンプンを液化させた後、６．９４部の水を加える。酵素活性を止めるため、０．０３部の２０ボーメの塩酸を加える。冷却後、２０．０部の硝酸ナトリウム、１５．０部の尿素、０．３０部の発泡抑制剤、０．１５部の保存剤及び７．００部の水を加える。
【０１５２】
Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度を希釈剤として水を用いて１０，０００〜１００，０００ｃｐｓ （これは使用する装置に依存する）に調整する。この接着剤は紙のしわ形成のしにくさ、高い凝集力、良好な接着力及び薄い色調を供するものと予測される。
【図面の簡単な説明】
【図１】未転換自然ワキシーメイズデンプン（総水分量１１％）、並びにアルファーアミラーゼの混合物を用いて２０％及び４０％の総水分量において加水分解した酵素転換ワキシーメイズデンプンの分子量分布。
【図２】未転換ワキシーメイズデンプン（サンプルＡ）、並びに水で洗浄したグルコアミラーゼ転換ワキシーメイズデンプン（サンプルＢ）及び水で洗浄していないグルコアミラーゼ転換ワキシーメイズデンプン（サンプルＣ）の分子量分布。サンプルＣはグルコースピークを示す。
【図３】枝切りしていないワキシーメイズデンプン及び酵素枝切りしたワキシーメイズデンプンの分子量分布。
【図４】中間分子量のマルトデキストリンが事実上ない、低分子量オリゴ糖と高分子量糖との固有混合物であるアルファーアミラーゼ転換マルトデキストリン（２８．３％及び６０．２％転換）の分子量分布。比較のため、市販のワキシーマルトデキストリン（ＤＥ４）も示す。
【図５】未転換ヒドロキシプロピル化高アミロースデンプン（Ｈｙｌｏｎ ＶＩＩ ）及びアルファーアミラーゼ転換高アミロースデンプン（ＰＯ Ｈｙｌｏｎ ＶＩＩ ）の分子量分布。

Claims (3)

1. 酵素転換デンプンの調製のための方法であって、
   （ａ）修飾又は未修飾の顆粒デンプンに、水と、デンプン加水分解酵素又は当該酵素の混合物を添加し、ここで当該酵素又は酵素混合物はデンプンの１→４結合を加水分解する及び／又はデンプンの１→ 6 結合を加水分解し、これにより目に見える遊離水相のない単相粉末混合物を生成する；
   （ｂ）前記酵素又は酵素混合物を、その酵素又は酵素混合物にとっての至適温度に前記粉末混合物を加熱することにより活性化させ、その間前記混合物における一定な水分含有量を維持しておき、そして任意的にpHを前記酵素又は酵素混合物にとっての至適pHに調整する；
   （ｃ）前記酵素又は酵素混合物により前記デンプンを加水分解及び液化する；そして
   （ｄ）任意的に前記酵素又は酵素混合物を失活させる；
   工程を含んで成る方法。
2. 前記添加する水の量が１５〜４０％の総水分含量を供し、そして前記酵素又は酵素混合物がアルファーアミラーゼ、ベーターアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ及びそれらの混合物より成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。
3. 前記酵素が細菌性アルファーアミラーゼであり、前記至適温度が６５〜１０５℃であり、そして前記pHが５．８〜６．５であるか；又は
   前記酵素が高温細菌性アルファーアミラーゼであり、前記至適温度が９５〜１０５℃であり、そして前記pHが６．０〜６．５であるか；又は
   前記酵素が菌類アミラーゼであり、前記至適温度が５４〜５６℃であり、そして前記pHが４．９〜５．３であるか；又は
   前記酵素がグルコアミラーゼであり、前記至適温度が５８〜６０℃であり、そして前記pHが４〜５であるか；又は
   前記酵素が麦芽ベーターアミラーゼであり、前記至適温度が４５〜６０℃であり、そして前記pHが４．９〜５．３であるか；又は
   前記酵素が菌類アルファーアミラーゼとグルコアミラーゼとの混合物であり、前記至適温度が４５〜６５℃であり、そして前記pHが４．９〜５．３であるか；又は
   前記酵素がプルラナーゼであり、前記至適温度が４５〜７０℃であり、そして前記pHが４．５〜５．５であるか；又は
   前記酵素がイソアミラーゼであり、前記至適温度が２５〜５０℃であり、そして前記pHが３．５〜５．５であり；そして
   前記工程（ｃ）の液化デンプンが顆粒転換デンプン及び／又は未転換非アルファー化顆粒デンプンを任意的に含むシロップを含んで成り、このシロップが６０〜８０重量％の固体含有量を有する、請求項１記載の方法。

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