JP3566043B2

JP3566043B2 - Hyaluronic acid degradation promoter, therapeutic agent for hyaluronic acid dysregulation disorder, and therapeutic agent for hyaluronic acid dysregulation disorder

Info

Publication number: JP3566043B2
Application number: JP25289397A
Authority: JP
Inventors: 進吾酒井; 哲也佐用; 紳太郎井上
Original assignee: カネボウ株式会社
Priority date: 1997-09-01
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2004-09-15
Anticipated expiration: 2017-09-01
Also published as: JPH1180205A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を促進するヒアルロン酸分解促進剤に関し、更にはヒアルロン酸の異常産生亢進又は異常分解抑制が伴う疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリクスを形成することに基づく細胞の保持、臓器組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力への抵抗、及び、細菌感染の防止等多くの機能を有している（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、８巻、３４６頁、１９９１年）。
【０００３】
しかし、ヒアルロン酸の正常のレベルを逸脱した合成亢進は生体において生理的異常な状態を引き起こす場合があると考えられている。炎症や動脈硬化、乾癬等では細胞間に産生促進されたヒアルロン酸は炎症細胞の浸潤を容易にし、炎症を遅延化する（ＥｕｒｏｐｅａｎＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＪｏｕｒｎａｌ４（４）：４０７−１４（１９９１））。また、骨再生異常においてもヒアルロン酸の異常蓄積が見られ、骨の硬さに影響すると考えられている（Ｂｏｎｅ１０（６）：４０９−１３（１９８９））。さらに軟骨細胞において、最終の軟骨細胞の分化に際し、ヒアルロン酸は細胞に吸収分解されることから、細胞の分裂ステージから分化ステージに移行する際はヒアルロン酸は積極的に分解され、細胞間のシグナル伝達が強化される必要があると考えられる。実際、細胞間のヒアルロン酸は細胞表層にヒアルロン酸リッチマトリクスとして存在しているため他の接着因子等の結合を抑制していると考えられる。さらに、ヒアルロン酸は悪性腫瘍においてヒアルロン酸マトリクスを形成促進し、みずからの分裂環境を最適にし、免疫細胞からの攻撃を防御すると考えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１７）９８７５−９８７８（１９９６））。
【０００４】
以上のことからヒアルロン酸合成の異常亢進は動脈硬化、心筋梗塞、骨形成異常、乾癬、悪性腫瘍の症状悪化に密接に関連すると考えられ、従ってこれらの疾患の治療においてはヒアルロン酸の分解を促進することが有効であると思われる。
【０００５】
一方、生体内で重要な細胞外成分であるヒアルロン酸は正常な生理状態でも分解が促進されている場合がある。例えば、毛成長に伴うヘアーサイクルにおいて成長期では毛包は毛の成長とともに皮膚真皮内を貫通することが知られている。この部分では積極的なマトリクスの分解が起きていると考えられる。したがってマトリクスの主要成分であるヒアルロン酸の分解促進をする薬剤は成長期を延長することで育毛効果をもつと考えられる。
【０００６】
ところで、従来よりヒアルロニダーゼ阻害剤については数多くの報告がなされているが（特公平６−４５８４号公報、特開平５−１７８８７６号公報、特開平６−８０５５３号公報、特開平６−８０５７６号公報、特開平６−９４１５号公報、特開平６−９４１６号公報、特開平３−６８５１５号公報）、ヒアルロン酸の分解を促進する薬剤は全く開発されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らが鋭意研究を行った結果、結合組織由来の正常皮膚線維芽細胞がヒアルロン酸分解活性を持ち、さらにその分解はコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体添加によって著しく促進されることをことを見いだし、本発明を完成したものであって、その目的とするところは、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を促進し得るヒアルロン酸分解促進剤、更にはヒアルロン酸の異常な産生亢進が伴う疾患やヒアルロン酸分解が異常に抑制されている疾患の治療効果に優れた疾患治療剤を提供するにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述の目的は、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体及び／又はその塩を含有することを特徴とするヒアルロン酸分解促進剤、該促進剤を含有するヒアルロン酸産生異常亢進疾患治療剤、ヒアルロン酸分解が異常に抑制されている疾患の治療剤によって達成される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成について詳説する。
【００１０】
本発明で用いられるコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体はコンドロイチン硫酸の構成糖であるＮ−アセチルガラクトサミンの６位が硫酸化されているものであり、コンドロイチン硫酸Ｃ，コンドロイチン硫酸Ｄ，コンドロイチン硫酸Ｅ及びこれらの塩が挙げられる。これらは単独でも、二種以上を組み合わせて用いることができる。コンドロイチン硫酸Ｃが、これらの中でも、効果，入手のし易さより特に好ましい。
【００１１】
また、本発明で用いられるコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体は特に限定されるものではなく、例えばサメやイカの軟骨からプロナーゼ処理、アルコール分画した常法で得られるものでよい。
【００１２】
コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体の塩としては、特に限定されないが、特に薬学的に許容されているナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。さらに生体内ではコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体は種々のプロテオグリカンとして存在しているのでコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体を多く含むプロテオグリカンをグアニジン塩酸等を用いて常法により抽出したものでもよい。
【００１３】
これらのコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体プロテオグリカン及びそれらの塩は、１種類または２種類以上を混合して用いることが可能である。
【００１４】
本発明のヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成亢進疾患治療剤、及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤におけるコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体及びその塩の総含有量は、対象とする疾患の種類および程度、患者の年齢、体重、性別などにより異なり一概には規定できないが、一般的には適用する組成物の総量を１００ｇ基準として、０．０００１〜５０ｇが好ましく、特に０．００１〜５ｇが好ましい。０．００１ｇ未満では本発明の効果が達成できない場合があり、５０ｇを超えて配合してもその配合量に見合った効果が得られない場合がある。
【００１５】
本発明のヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成亢進疾患治療剤、及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤の形態としては、特に限定されるものではない。例えば、適当な賦形剤、担体、希釈剤を用いて、錠剤、液剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤、坐剤、入浴剤等の剤形が挙げられ、またゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、パック類、乳液、パウダー及び入浴剤等の剤形が挙げられる。
【００１６】
係る製剤の調製は常法によって行われ、例えば、固形製剤については通常の医薬添加物、例えば、乳糖、でんぷん、結晶セルロース、タルクなどを用いて製剤化される。カプセル剤はそのようにして調製された細粒剤、散剤等を適当なカプセルに充填して得られる。液剤は白糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液に本発明の薬剤を溶解、懸濁することにより調製される。
【００１７】
また本発明のヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成亢進疾患治療剤及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤に配合される賦形剤または補助剤としては、本発明の効果を損なわない範囲において、化粧品、医薬品等に一般に使用されるものが配合可能であり、剤形等に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。例えば、ワセリン，スクワラン等の炭化水素、ステアリルアルコール等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン酸等の動物性油脂、グリセリン，プロピレングリコール等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル，モノステアリン酸ポリエチレングリコール，ポリエチレンアルキルエーテルリン酸等の界面活性剤、パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤、蝋、樹脂、各種香料、各種色素、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等の各種無機塩、酪酸，乳酸等の各種酸、水、およびエタノール等が挙げられる。
【００１８】
本発明のヒアルロン酸分解促進剤は、ヒアルロン酸の合成が亢進している疾患やヒアルロン酸の分解が異常抑制されている疾患の治療剤の有効成分として配合することができる。更に、通常の医薬品、化粧品の有効成分として、その他、培養細胞系に添加する研究・試験用試薬等として用いることもできる。
【００１９】
本発明において治療剤とは、後述するような疾患の症状を取り去るいわゆる治療剤の他、その症状を軽減する改善剤，その他症状が現れるのを予防する防止剤をも含むものである。
【００２０】
本発明において疾患とは、ヒアルロン酸合成が生理的に正常時より亢進しているか又はヒアルロン酸分解が異常に抑制されている状態を言う。
【００２１】
ヒアルロン酸合成が生理的に正常時より亢進している疾患としては、乾癬、動脈硬化、骨異常形成、心筋梗塞等が挙げられる。本発明のヒアルロン酸異常合成亢進疾患治療剤をこれらの疾患に用いる場合は、防止剤または予防剤として正常人に適用することもできるが、ヒアルロン酸の合成が生理的に正常時より亢進している症状者に適用する方が効果的である。
【００２２】
一方、ヒアルロン酸分解が異常に抑制されている疾患とは、ヒアルロン酸の分解が患部で異常抑制されていると考える脱毛症、若はげ等の疾患を言う。本発明のヒアルロン酸分解疾患治療剤をこれらの疾患に用いる場合は、症状の改善剤または治療剤として、ヒアルロン酸の分解が異常に抑制されている症状者に適用することができる。
【００２３】
今回、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体が結合組織に存在する線維芽細胞に作用し、その細胞間マトリクスの成分であるヒアルロン酸を分解促進する作用があることが明らかとなった。
【００２４】
本発明のヒアルロン酸分解疾患治療剤の１日当たりの投与量としては、通常経口投与では、コンドロイチン硫酸Ｃ誘導体及びその塩の総量として０．０１ｇ〜５０ｇが好ましく、特に好ましくは１ｇ〜１０ｇである。非経口投与では、０．１ｇ〜５ｇが好ましい。０．０１ｇ未満では本発明の効果が達成できない場合があり、５０ｇを超えて投与してもその投与量に見合った効果が得られない場合がある。
【００２５】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤は、培養細胞に添加して高分子ヒアルロン酸を産生させる時は、培養液中にコンドロイチン硫酸Ｃ誘導体が１μｇ／ｍｌ以上となるように添加するのが好ましく、更に好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌである。１μｇ／ｍｌ未満では効果を奏しない場合がある。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸分解疾患治療剤は、加熱滅菌、濾過滅菌等の方法により、滅菌してから用いるのが好ましい。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例、比較例により本発明を更に詳しく説明する。
尚、実施例に先立ちヒアルロン酸分解阻害剤の効果を調べるための評価系について説明する。また後記表３〜表９に示す配合量は、いずれも重量％を表す。
【００２８】
（１）ＭＥＭ培地の調製法
ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（大日本製薬社製、１０−１０１）１０．６ｇにそれぞれ終濃度として１％（Ｖ／Ｖ）ＮｏｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄ（大日本製薬社製、１６−８１０）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、１６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、蒸留水を加えて１ｌとした後、炭酸ガスを吹き込んでｐＨを約７にした（以下、ＭＥＭ培地と略記する）。
【００２９】
（２）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化
ＦＢＳ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５６℃で３０分間加熱処理した。
【００３０】
（３）細胞添加用高分子トリチウムヒアルロン酸の調製方法
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣＣＣＬ１１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて２×１０^５個／ｍｌに調整し、２２５ｃｍ^２のフラスコに５０ｍｌ入れ、３日間培養しコンフルエント状態にした。その後ヒアルロン酸の前駆体であるトリチウムグルコサミン（ＡｍｅｒｉｃａｎＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＣｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ．社製）を培養系に添加し（１０μＣｉ／ｍｌ）、さらに３日間培養したのち、培養液からトリチウムラベルされたヒアルロン酸をＵｎｄｅｒｈｉｌｌらの方法（Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，８２巻，４７５頁，１９７９年）によって精製し、さらにゲルろ過カラムにより分子量１００万以上の高分子トリチウムヒアルロン酸（比放射活性，０．１μＣｉ／μｇ）を調製した。これを細胞培養系への添加用高分子トリチウムヒアルロン酸とした。
【００３１】
（４）正常ヒト線維芽細胞への高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣＣＣＬ１１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．５×１０^５個／ｍｌに調整し、１２穴プレート（ファルコン社製）に０．８ｍｌずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに、ＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４，０００ＤＰＭ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。なお培地交換時、最終濃度１０μＭになるようにヒスタミンと各種アンタゴニストを添加した。
【００３２】
（５）リウマチ滑膜細胞への高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
ヒトリウマチ滑膜細胞の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．５×１０^５個／ｍｌに調整し、１２穴プレート（ファルコン社製）に０．８ｍｌずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに、１％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４，０００ＤＰＭ／ｍｌ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。なお培地交換時、最終濃度１０μＭになるようにヒスタミンと各種アンタゴニスト、コールドの高分子ヒアルロン酸を添加した。
【００３３】
（６）細胞による高分子トリチウムヒアルロン酸の分解評価
培養終了後、培養液を回収し、１００℃で５分間加熱処理を行った後、培地１ｍｌをセファロースＣＬ−２Ｂカラム（内径１ｃｍ，長さ６０ｃｍ）にアプライし以下の条件でゲルろ過を行った。
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
分画：４ｍｌ／１Ｆｒａｃｔｉｏｎ
分画総数：２５
更に分子量１０万以下のヒアルロン酸が溶出するフラクション１０〜２５の１６本を集め、［^３Ｈ］放射活性を測定し分解したヒアルロン酸の量を求めた。
【００３４】
実施例１，比較例１〜４
コンドロイチン硫酸Ａ（比較例２）、コンドロイチン硫酸Ｂ（比較例３）、コンドロイチン硫酸Ｃ（実施例１）、ヘパラン硫酸（比較例４）を最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにＭＥＭ培地に溶解した。また、ＭＥＭ培地のみを比較例１とした。
【００３５】
試験例１（ヒト正常皮膚線維芽細胞によるヒアルロン酸分解）
実施例１，比較例１〜４を用いて、前述した（６）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解量を算出した。結果を下記表１に示す。
【００３６】
【表１】

【００３７】
その結果、コンドロイチン硫酸Ｃ添加によって無添加時よりヒアルロン酸の分解は促進され（実施例１）、他のグリコサミノグリカンであるコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、ヘパラン硫酸、いずれの薬剤においても分解は促進しなかった（比較例１〜４）。
【００３８】
この結果からコンドロイチン硫酸Ｃはヒトのヒアルロン酸分解促進剤として非常に有効であることが判明した。また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤はヒアルロン酸合成が異常に亢進している疾患やヒアルロン酸の分解が異常に抑制されている疾患に対する治療剤の有効成分として用いることができるものである。
【００３９】
実施例２〜４
コンドロイチン硫酸Ｃを培地中での濃度が２０、１００、５００ｍｇ／ｍｌになるようにＭＥＭ溶解した（実施例２〜４）。
【００４０】
試験例２
実施例２〜４、比較例１（ＭＥＭ培地のみ），を用いて、前述した（６）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解を調べ、ヒアルロン酸分解量を算出した。結果を下記表２に示す。
【００４１】
【表２】

【００４２】
その結果、コンドロイチン酸Ｃは用量依存的にヒアルロン酸の分解を促進することが判明した（実施例２〜４）。
【００４３】
この結果からコンドロイチン硫酸Ｃはヒトのヒアルロン酸分解促進剤として非常に有効であることは明らかである。また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤を含有するヒアルロン酸合成異常亢進疾患治療剤は、ヒアルロン酸合成が異常に亢進している乾癬等の治療に有効である。
【００４４】
実施例５〜７（錠剤）
【００４５】
【表３】

【００４６】
上記表３の各成分を均一に混合し、常法に従って、１錠３００ｍｇとなるように打錠した。
【００４７】
実施例８〜１０（カプセル剤）
【００４８】
【表４】

【００４９】
上記表４の各成分を均一に混合し、常法に従って、混合物の２００ｍｇを３号硬カプセルに充填した。
【００５０】
実施例１１〜１２（液剤）
【００５１】
【表５】

【００５２】
精製水に上記表５の各成分を溶解し、攪拌均一化して液剤とした。
【００５３】
実施例１４〜１７（ローション）
【００５４】
【表６】

【００５５】
上記表６の各成分を常法により混合溶解して、ローションを調製した。
【００５６】
実施例１８〜１９（入浴剤）
【００５７】
【表７】

【００５８】
上記表７中の各成分を混合し、入浴剤を調製した。なお、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。
【００５９】
実施例２０〜２３（軟膏）
【００６０】
【表８】

【００６１】
上記表８中において、（Ｂ）の各成分を湯浴で８０℃に加温しながら混合し、これに、８０℃に加温した上記（Ａ）の各成分の混合物中に攪拌しながら徐々に加えた。つぎに、ホモジナイザー（ＴｏｋｕｓｙｕｋｉｋａＫｏｇｙｏｕ社製）で２．５分間激しく攪拌（２５００ｒｐｍ）して各成分を充分乳化分散させた後、攪拌しながら徐々に冷却してコンドロイチン硫酸Ｃまたはコンドロイチン硫酸Ｄを含む軟膏を得た。
【００６２】
実施例２４〜２６（注射剤）
【００６３】
【表９】

【００６４】
メスシリンダーに上記表９の処方にて、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、塩化ナトリウム、燐酸１水素ナトリウムをとり、注射用蒸留水を加え、溶解し、メンブランフィルター（０．２２μｍ）で濾過し、ガラスアンプルに分注し、注射剤を調製した。
【００６５】
【発明の効果】
以上の様に、本発明により、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を促進するヒアルロン酸分解促進剤、ヒアルロン酸合成異常亢進疾患治療剤、及びヒアルロン酸分解異常抑制疾患治療剤を提供できることは明らかである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a hyaluronic acid degradation promoter that acts on cells present in human connective tissue to promote hyaluronic acid degradation, and further relates to a therapeutic agent for a disease accompanied by abnormally enhanced production of hyaluronic acid or inhibition of abnormal degradation.
[0002]
[Prior art]
Hyaluronic acid retains water in the intercellular space, retains cells based on the formation of a jelly-like matrix in tissues, retains lubricity and flexibility of organ tissues, resists external forces such as mechanical obstacles, And it has many functions such as prevention of bacterial infection (BIO INDUSTRY, 8, 346, 1991).
[0003]
However, it is believed that enhanced synthesis of hyaluronic acid beyond normal levels may cause abnormal physiological conditions in living organisms. In inflammation, arteriosclerosis, psoriasis, and the like, hyaluronic acid produced between cells facilitates infiltration of inflammatory cells and delays inflammation (European Respiratory Journal 4 (4): 407-14 (1991)). Abnormal accumulation of hyaluronic acid is also observed in abnormal bone regeneration, which is considered to affect bone hardness (Bone 10 (6): 409-13 (1989)). Furthermore, in the chondrocytes, hyaluronic acid is absorbed and decomposed by the cells during the final differentiation of chondrocytes, so that hyaluronic acid is actively degraded during the transition from the cell division stage to the differentiation stage, and intercellular signals are transmitted. Communication needs to be strengthened. In fact, it is considered that the intercellular hyaluronic acid is present in the cell surface layer as a hyaluronic acid-rich matrix, thereby suppressing the binding of other adhesion factors and the like. Furthermore, it is believed that hyaluronic acid promotes the formation of a hyaluronic acid matrix in malignant tumors, optimizes its own dividing environment, and protects against attacks from immune cells (J. Biol. Chem. 271 (17) 9875-9878). (1996)).
[0004]
These findings suggest that abnormally elevated hyaluronic acid synthesis is closely related to arteriosclerosis, myocardial infarction, osteodystrophy, psoriasis, and worsening of the symptoms of malignant tumors, and thus promotes the degradation of hyaluronic acid in the treatment of these diseases. Seems to be effective.
[0005]
On the other hand, hyaluronic acid, which is an important extracellular component in a living body, may be decomposed even under normal physiological conditions. For example, it is known that the hair follicle penetrates into the dermis of the skin as the hair grows in the anagen phase in the hair cycle accompanying hair growth. It is considered that aggressive matrix decomposition is occurring in this part. Therefore, a drug that promotes the degradation of hyaluronic acid, which is a main component of the matrix, is considered to have a hair growth effect by extending the growth period.
[0006]
By the way, many reports have been made on hyaluronidase inhibitors (JP-B-6-4584, JP-A-5-178876, JP-A-6-80553, JP-A-6-80576, JP-A-6-9415, JP-A-6-9416, and JP-A-3-68515) and a drug that promotes the degradation of hyaluronic acid have not been developed at all.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present inventors have conducted intensive studies and found that normal skin fibroblasts derived from connective tissue have hyaluronan-degrading activity, and that the degradation is significantly promoted by the addition of chondroitin sulfate C derivative. The present invention has been completed and aims to act on cells present in human connective tissue to promote the degradation of hyaluronic acid, and further promote the abnormal production of hyaluronic acid. It is an object of the present invention to provide a therapeutic agent having an excellent therapeutic effect for a disease associated with the above or a disease in which hyaluronic acid degradation is abnormally suppressed.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
An object of the present invention is to provide a hyaluronic acid degradation accelerator characterized by containing a chondroitin sulfate C derivative and / or a salt thereof, a therapeutic agent for a disease in which hyaluronic acid production is abnormally enhanced, and a hyaluronic acid degradation is abnormally suppressed. Is achieved by therapeutic agents for the diseases being treated.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.
[0010]
The chondroitin sulfate C derivative used in the present invention has N-acetylgalactosamine, which is a constituent sugar of chondroitin sulfate, in which the 6th position is sulfated. Chondroitin sulfate C, chondroitin sulfate D, chondroitin sulfate E and salts thereof are used. No. These can be used alone or in combination of two or more. Among these, chondroitin sulfate C is particularly preferable because of its effect and availability.
[0011]
In addition, the chondroitin sulfate C derivative used in the present invention is not particularly limited, and may be, for example, one obtained from cartilage of shark or squid by pronase treatment and alcohol fractionation by a conventional method.
[0012]
Examples of the salt of the chondroitin sulfate C derivative include, but are not particularly limited to, pharmaceutically acceptable sodium salts and potassium salts. Further, in vivo, chondroitin sulfate C derivatives exist as various proteoglycans, and therefore proteoglycans containing a large amount of chondroitin sulfate C derivatives may be extracted by a conventional method using guanidine hydrochloride or the like.
[0013]
These chondroitin sulfate C derivatives, chondroitin sulfate C derivative proteoglycans and salts thereof can be used alone or in combination of two or more.
[0014]
The total content of the chondroitin sulfate C derivative and its salt in the hyaluronic acid degradation accelerator, the therapeutic agent for hyaluronic acid synthesis-enhancing disease, and the therapeutic agent for abnormally suppressing hyaluronic acid degradation according to the present invention depends on the type and degree of the target disease, the patient Although it depends on the age, body weight, sex, etc. of the composition and cannot be specified unconditionally, it is generally preferably 0.0001 to 50 g, particularly preferably 0.001 to 5 g, based on 100 g based on the total amount of the composition to be applied. If the amount is less than 0.001 g, the effect of the present invention may not be achieved in some cases. Even if the amount exceeds 50 g, the effect corresponding to the amount may not be obtained.
[0015]
The forms of the hyaluronic acid degradation promoter, the therapeutic agent for hyaluronic acid synthesis-enhanced disease, and the therapeutic agent for abnormally suppressed hyaluronic acid degradation disease of the present invention are not particularly limited. For example, using appropriate excipients, carriers, and diluents, tablets, solutions, capsules, granules, powders, ointments, patches, injections, suppositories, bath forms, and the like can be mentioned. In addition, dosage forms such as gels, creams, sprays, patches, lotions, packs, emulsions, powders, and bath salts are included.
[0016]
The preparation of such a preparation is carried out by a conventional method. For example, a solid preparation is prepared using ordinary pharmaceutical additives such as lactose, starch, crystalline cellulose, talc and the like. Capsules can be obtained by filling fine granules, powders and the like thus prepared in suitable capsules. Liquid preparations are prepared by dissolving and suspending the agent of the present invention in an aqueous solution containing sucrose, carboxymethyl cellulose, and the like.
[0017]
The excipients or adjuvants to be added to the hyaluronic acid degradation promoter of the present invention, the therapeutic agent for hyaluronic acid hypersynthesis disease and the therapeutic agent for abnormal hyaluronic acid degradation disorder, as long as the effects of the present invention are not impaired. And those commonly used in pharmaceuticals and the like can be blended, and are appropriately selected according to the dosage form and the like, and are not particularly limited. For example, hydrocarbons such as petrolatum and squalane, higher alcohols such as stearyl alcohol, lower alkyl esters of higher fatty acids such as isopropyl myristate, animal fats and oils such as lanolinic acid, polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol, glycerin fatty acid esters, Surfactants such as polyethylene glycol monostearate and polyethylene alkyl ether phosphoric acid; preservatives such as methyl paraoxybenzoate and butyl paraoxybenzoate; waxes, resins, various flavors, various dyes, and various types such as sodium citrate and sodium carbonate Examples thereof include inorganic salts, various acids such as butyric acid and lactic acid, water, and ethanol.
[0018]
The hyaluronic acid degradation promoter of the present invention can be blended as an active ingredient of a therapeutic agent for a disease in which the synthesis of hyaluronic acid is enhanced or in which the degradation of hyaluronic acid is abnormally suppressed. Furthermore, it can be used as an active ingredient of ordinary pharmaceuticals and cosmetics, and as a research / test reagent added to a cultured cell system.
[0019]
In the present invention, the therapeutic agent includes not only a so-called therapeutic agent for removing symptoms of a disease as described below, but also an improving agent for reducing the symptoms and an inhibitor for preventing the appearance of the symptoms.
[0020]
In the present invention, a disease refers to a state in which hyaluronic acid synthesis is physiologically increased from normal or hyaluronic acid degradation is abnormally suppressed.
[0021]
Diseases in which hyaluronic acid synthesis is physiologically higher than normal are psoriasis, arteriosclerosis, abnormal bone formation, myocardial infarction and the like. When the therapeutic agent for abnormally promoted hyaluronic acid synthesis of the present invention is used for these diseases, it can be applied to normal persons as a preventive agent or a preventive agent, but the synthesis of hyaluronic acid is physiologically enhanced from the normal state. It is more effective to apply to those who have symptoms.
[0022]
On the other hand, the disease in which the degradation of hyaluronic acid is abnormally suppressed refers to diseases such as alopecia and young baldness, in which the degradation of hyaluronic acid is considered to be abnormally suppressed in the affected part. When the therapeutic agent for degrading hyaluronic acid of the present invention is used for these diseases, it can be used as a symptom ameliorating agent or therapeutic agent for patients with abnormally suppressed degradation of hyaluronic acid.
[0023]
This time, it was revealed that the chondroitin sulfate C derivative acts on fibroblasts present in connective tissues and has an effect of promoting the degradation of hyaluronic acid which is a component of the intercellular matrix.
[0024]
The daily dose of the agent for treating a hyaluronic acid-degrading disease of the present invention is usually 0.01 g to 50 g, particularly preferably 1 g to 10 g, as a total amount of the chondroitin sulfate C derivative and a salt thereof for oral administration. For parenteral administration, 0.1 g to 5 g is preferred. If the amount is less than 0.01 g, the effect of the present invention may not be achieved, and even if the amount exceeds 50 g, the effect corresponding to the dose may not be obtained.
[0025]
When the hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention is added to cultured cells to produce high molecular weight hyaluronic acid, it is preferably added so that the chondroitin sulfate C derivative is 1 μg / ml or more in the culture solution. Preferably it is 10 μg / ml to 10 mg / ml. If the amount is less than 1 μg / ml, the effect may not be exhibited.
[0026]
It is preferable that the therapeutic agent for hyaluronic acid-degrading disease of the present invention is sterilized by a method such as heat sterilization or filtration sterilization before use.
[0027]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples.
Prior to Examples, an evaluation system for examining the effect of a hyaluronic acid degradation inhibitor will be described. In addition, the blending amounts shown in Tables 3 to 9 described below all represent% by weight.
[0028]
(1) Preparation Method of MEM Medium Minimum Essential Medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 10-101) 10.6 (1 V) (V / V) Non Essential Amino Acid (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd .; 810) 1 mM sodium pyruvate (16-820, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 1.2% (W / V) sodium bicarbonate, and distilled water were added to make 1 liter. 7 (hereinafter abbreviated as MEM medium).
[0029]
(2) Inactivation of Fetal Bovine Serum (FBS) FBS (Irvine Scientific) was heated at 56 ° C. for 30 minutes.
[0030]
(3) Method for preparing high molecular tritium hyaluronic acid for cell addition The number of cells of a normal human fibroblast cell line [Detroit 551 (ATCC CCL 110)] was increased to 10% (V / V) of MEM medium containing inactivated FBS. The mixture was adjusted to 2 × 10 ⁵ cells / ml, and 50 ml was placed in a 225 cm ² flask, and cultured for 3 days to be confluent. Thereafter, tritium glucosamine (manufactured by American Radioactive Chemicals Inc.), which is a precursor of hyaluronic acid, was added to the culture system (10 μCi / ml). After further culturing for 3 days, tritium-labeled hyaluronic acid from the culture solution was extracted from Underhill et al. (J. Cell Biology, Vol. 82, p. 475, 1979), and a high molecular weight tritium hyaluronic acid (specific radioactivity, 0.1 μCi / μg) having a molecular weight of 1,000,000 or more was prepared using a gel filtration column. . This was used as a polymer tritium hyaluronic acid for addition to a cell culture system.
[0031]
(4) Addition of high molecular weight tritium hyaluronic acid to normal human fibroblasts The number of cultured normal human fibroblasts [Detroit 551 (ATCC CCL 110)] was increased by 10% (V / V) of inactivated FBS. The medium was adjusted to 1.5 × 10 ⁵ cells / ml in a MEM medium containing the mixture, and 0.8 ml of each was seeded on a 12-well plate (manufactured by Falcon), and 95% (V / V) air-5% (V / V) The culture was allowed to stand at 37 ° C. for 3 days in an atmosphere of carbon dioxide, and the medium was replaced with only a MEM medium, followed by culturing for 1 day. Thereafter, a MEM medium containing high molecular tritium hyaluronic acid (14,000 DPM / ml, 10 μg / ml) was prepared, the medium was replaced, and the cells were cultured for 3 days. At the time of medium exchange, histamine and various antagonists were added to a final concentration of 10 μM.
[0032]
(5) Addition of high molecular weight tritium hyaluronic acid to rheumatoid synovial cells Cultured human rheumatoid synovial cells were increased to 1.5 × 10 ⁵ cells in MEM medium containing 10% (V / V) inactivated FBS. / Ml, inoculated in a 12-well plate (manufactured by Falcon) in an amount of 0.8 ml each, and allowed to stand at 37 ° C for 3 days in an atmosphere of 95% (V / V) air-5% (V / V) carbon dioxide gas. The cells were placed and cultured, and the medium was replaced with only a MEM medium containing 1% FBS, followed by culturing for one day. Thereafter, a MEM medium containing high molecular tritium hyaluronic acid (14,000 DPM / ml) was prepared, the medium was replaced, and the cells were cultured for 3 days. At the time of medium exchange, histamine, various antagonists, and cold high molecular weight hyaluronic acid were added to a final concentration of 10 μM.
[0033]
(6) Evaluation of degradation of high molecular tritium hyaluronic acid by cells After completion of the culture, the culture solution was collected and subjected to a heat treatment at 100 ° C. for 5 minutes, and then 1 ml of the medium was subjected to a Sepharose CL-2B column (inner diameter 1 cm, length 60 cm). ) And subjected to gel filtration under the following conditions.
Flow rate: 0.6 ml / min
Fractionation: 4 ml / 1 Fraction
Total number of fractions: 25
Furthermore collected 16 fractions 10-25 which molecular weight of 100,000 or less hyaluronic acid elutes were determined the amount of [3 ^H] radioactivity was measured decomposed hyaluronic acid.
[0034]
Example 1, Comparative Examples 1-4
Chondroitin sulfate A (Comparative Example 2), chondroitin sulfate B (Comparative Example 3), chondroitin sulfate C (Example 1), and heparan sulfate (Comparative Example 4) were dissolved in a MEM medium to a final concentration of 1 mg / ml. . In addition, only the MEM medium was used as Comparative Example 1.
[0035]
Test Example 1 (Hyaluronic acid degradation by human normal skin fibroblasts)
Using Example 1 and Comparative Examples 1 to 4, the decomposition amount of the polymer tritium hyaluronic acid was calculated by the method (6) described above. The results are shown in Table 1 below.
[0036]
[Table 1]

[0037]
As a result, the addition of chondroitin sulfate C accelerates the degradation of hyaluronic acid from the absence of chondroitin sulfate (Example 1), and the degradation of any of the other glycosaminoglycans, chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate B, and heparan sulfate. Did not accelerate (Comparative Examples 1-4).
[0038]
From this result, it was found that chondroitin sulfate C was very effective as a human hyaluronic acid degradation promoter. The hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for a disease in which hyaluronic acid synthesis is abnormally enhanced or a disease in which the degradation of hyaluronic acid is abnormally suppressed.
[0039]
Examples 2 to 4
Chondroitin sulfate C was dissolved in MEM so that the concentration in the medium was 20, 100, and 500 mg / ml (Examples 2 to 4).
[0040]
Test example 2
Using Examples 2 to 4 and Comparative Example 1 (MEM medium only), the decomposition of high molecular tritium hyaluronic acid was examined by the method (6) described above, and the amount of decomposed hyaluronic acid was calculated. The results are shown in Table 2 below.
[0041]
[Table 2]

[0042]
As a result, it was found that chondroitic acid C promotes the degradation of hyaluronic acid in a dose-dependent manner (Examples 2 to 4).
[0043]
From these results, it is clear that chondroitin sulfate C is very effective as a human hyaluronic acid degradation promoter. Further, the therapeutic agent for a disease with abnormally enhanced hyaluronic acid synthesis containing the hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention is effective for treating psoriasis or the like in which hyaluronic acid synthesis is abnormally enhanced.
[0044]
Examples 5 to 7 (tablets)
[0045]
[Table 3]

[0046]
The components shown in Table 3 above were uniformly mixed, and the mixture was tableted so as to be 300 mg per tablet according to a conventional method.
[0047]
Examples 8 to 10 (capsules)
[0048]
[Table 4]

[0049]
The components shown in Table 4 were uniformly mixed, and 200 mg of the mixture was filled into No. 3 hard capsules according to a conventional method.
[0050]
Examples 11 to 12 (solutions)
[0051]
[Table 5]

[0052]
The respective components shown in Table 5 were dissolved in purified water, and the mixture was stirred and homogenized to obtain a liquid.
[0053]
Examples 14 to 17 (lotion)
[0054]
[Table 6]

[0055]
A lotion was prepared by mixing and dissolving each of the components shown in Table 6 in a conventional manner.
[0056]
Examples 18 to 19 (bath additives)
[0057]
[Table 7]

[0058]
Each component in Table 7 above was mixed to prepare a bath agent. In addition, this bath agent is diluted about 3000 times at the time of use.
[0059]
Examples 20 to 23 (Ointment)
[0060]
[Table 8]

[0061]
In Table 8 above, each component of (B) was mixed while being heated to 80 ° C. in a hot water bath, and gradually added to the mixture of each component of (A) heated to 80 ° C. while stirring. Added. Next, after vigorously stirring (2500 rpm) for 2.5 minutes with a homogenizer (manufactured by Tokusyukika Kogyo) to sufficiently emulsify and disperse each component, the mixture was gradually cooled while stirring, and the ointment containing chondroitin sulfate C or chondroitin sulfate D was added. Got.
[0062]
Examples 24 to 26 (injections)
[0063]
[Table 9]

[0064]
Take chondroitin sulfate C, chondroitin sulfate D, sodium chloride, and sodium monohydrogen phosphate in a measuring cylinder according to the formulation in Table 9 above, add distilled water for injection, dissolve, filter through a membrane filter (0.22 μm), The mixture was dispensed into a glass ampule to prepare an injection.
[0065]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the present invention, a hyaluronic acid degradation promoter that acts on cells present in human connective tissue and promotes the degradation of hyaluronic acid, a therapeutic agent for a disease in which hyaluronic acid synthesis is abnormally increased, and a therapeutic agent for a disease in which hyaluronan degradation is abnormal It is clear that can be provided.

Claims

A hyaluronic acid degradation accelerator comprising chondroitin sulfate C.