JP3822187B2

JP3822187B2 - Terphenyl derivatives and uses

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Publication number: JP3822187B2
Application number: JP2003148687A
Authority: JP
Inventors: 進吾酒井; 哲也佐用; 紳太郎井上; 洋和河岸; 弘晃村上
Original assignee: 株式会社カネボウ化粧品
Priority date: 2003-05-27
Filing date: 2003-05-27
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2018-03-02
Also published as: JP2003306409A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化粧料、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している乾皮症，乾せん，あれ肌，乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待できるヒアルロン酸分解阻害剤及び治療剤、並びにあれ肌又は乾燥肌防止剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリクスを形成することに基づく細胞の保持、臓器組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力への抵抗、及び細菌感染の防止等多くの機能を有している（非特許文献１）。
【０００３】
さらに、近年ヒアルロン酸はその分子量によってさまざまな生理作用を持つことがわかってきた。例えば、生体内で合成されていると考えられている高分子ヒアルロン酸（分子量１００万以上）はプロテオグリカン遊離抑制作用，ブラジキニン関節疼痛抑制作用，損傷軟骨修復作用，関節炎抑制作用を持つことから炎症抑制効果を持ち（非特許文献２）、その分解（低分子化）産物である低分子化ヒアルロン酸は、血管新生促進作用（非特許文献３）、白血球走化性促進作用（特許文献１）を持つことから炎症促進作用を持つと考えられている。そして老化による皮膚のヒアルロン酸の減少は皮膚の水分環境や柔軟性、張りやしわの形成に大きく関与していると考えられている（非特許文献４、５)。
【０００４】
以上のことからヒアルロン酸の低分子化は肝炎，歯肉炎（非特許文献６），関節リウマチ，変形性関節症（非特許文献７），悪性腫瘍（非特許文献８）の症状悪化に密接に関連すると考えられ、さらに老化によるヒアルロン酸の減少は皮膚の張り減少、しわ形成にも関連し、従ってヒアルロン酸の低分子化を予防・防止するヒアルロン酸の分解阻害剤及び化粧料が望まれている。
【０００５】
実際、結合組織中のヒアルロン酸を低分子化するヒアルロニダーゼが想定され、その阻害剤が薬理効果があることが期待された（非特許文献９）。しかし、ヒト結合組織を形成する線維芽細胞からヒアルロニダーゼが単離された報告はいまだなく、そのためヒト線維芽細胞の酵素が牛精巣由来のヒアルロニダーゼと同様な性質を持っていると仮定し、牛精巣由来のヒアルロニダーゼを用いた種々の阻害剤が報告されている（特許文献２〜９）のが現状である。
【０００６】
しかし、近年、関節に存在するヒト滑膜細胞（非特許文献１０），ヒト子宮けい管細胞（非特許文献１１），ヒト皮膚線維芽細胞（非特許文献１２），ヒト肺線維芽細胞（非特許文献１３）において、ヒアルロン酸を４糖、６糖にまで分解する牛精巣由来のヒアルロニダーゼとは明らかに異なるエンド型のヒアルロン酸分解機構の存在が報告されている。これらのことから精巣由来のヒアルロニダーゼの阻害剤ではヒトのヒアルロン酸分解を効果的に阻害することは困難である。
【０００７】
【特許文献１】
特公平６−８３２３号公報
【特許文献２】
特公平６−２９２７１号公報
【特許文献３】
特公平６−４５８４号公報
【特許文献４】
特開平５−１７８８７６号公報
【特許文献５】
特開平６−８０５５３号公報
【特許文献６】
特開平６−８０５７６号公報
【特許文献７】
特開平６−９４１５号公報
【特許文献８】
特開平６−９４１６号公報
【特許文献９】
特開平３−６８５１５号公報
【非特許文献１】
ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、８巻、３４６頁、１９９１年
【非特許文献２】
ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、１１巻、６３２頁、１９９１年
【非特許文献３】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８巻，１３２４頁，１９８５年
【非特許文献４】
Int．J．Dermatol(1994),33,119-122
【非特許文献５】
Int．J．Dermatol(1996)35,539-544
【非特許文献６】
炎症、４巻、４３７頁、１９８４年
【非特許文献７】
結合組織、２５巻、２４３頁、１９９４年
【非特許文献８】
Ｊ.Cellar Physiology,160巻,275頁,1994年
【非特許文献９】
炎症、４巻、４３７頁、１９８４年
【非特許文献１０】
結合組織、２５巻、２４３頁、１９９４年
【非特許文献１１】
FEBS Letters,347巻,９５頁、1994年
【非特許文献１２】
B.B.A.,172巻, ７０頁、1990年
【非特許文献１３】
J.Clin.Invest.９０巻、１４９２頁、１９９２年
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的とするところは、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している乾皮症，乾せん，あれ肌，乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待でき、しかもヒトの線維芽細胞に直接作用し、優れた効果を発揮するヒアルロン酸分解阻害剤及び治療剤、並びにあれ肌又は乾燥肌防止剤を提供するにある。また、しわ防止や張り、柔軟性の改善等に効果のある化粧料を提供するにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、クロカワ抽出物を含有又は有効成分とすることを特徴とする化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤、並びにヒアルロン酸異常分解疾患治療剤によって達成される。また、下記一般式（Ａ）で示されるテルフェニル誘導体を含有又は有効成分とすることを特徴とする化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤によって達成される。即ち、本発明はクロカワ抽出物又は下記一般式（Ａ）で示されるテルフェニル誘導体を含有又は有効成分とする化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤、並びにヒアルロン酸異常分解疾患治療剤にある。
【００１０】
【化３】

（但し、式中Ｒ₁〜Ｒ₄は水酸基又はアセチル基である）
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳説する。
【００１２】
本発明に係るクロカワ抽出エキスを製造する方法としては、イボタケ科由来きのこであるクロカワ（Boletopsis Leucomelas）子実体を適当な抽出溶媒に一定期間浸漬すればよく、必要により減圧下還流抽出や加圧抽出等の通常の抽出手段を利用できる。例えば、クロカワ子実体凍結乾燥粉砕物に対し重量（質量）比で５〜３０倍の抽出溶媒を加え、通常１５〜５０℃で２４時間〜１週間浸漬して抽出エキスを得る方法等が挙げられる。また、抽出エキスをろ過又は遠心分離等により不溶物を除去したり、通常の濃縮手段、例えば減圧濃縮等して濃縮抽出エキスとして得ることもできる。また通常の粉末化方法により乾燥エキス末として用いることもできる。
【００１３】
クロカワの乾燥エキス末を製造する方法としては、前記抽出エキスを通常の乾燥手段、例えば減圧乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥等により乾燥エキス末として得る方法等が挙げられる。
【００１４】
クロカワ抽出エキスを製造する際に用いる抽出溶媒としては、例えば、水や、メタノール、エタノール、１，３ブチレングリコール等の水溶性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。更に酢酸エチル等の極性有機溶媒によって再抽出してもよい。または、クロロフォルム等の非極性溶媒処理によって疎水性物質を除いたあと上述した方法で濃縮、粉末化することもできる。
【００１５】
本発明に係るテルフェニル誘導体は、例えば、上記のクロカワ抽出エキス又はその乾燥エキス末から得ることができる。
【００１６】
本発明に係るテルフェニル誘導体を単離する方法としては、前記クロカワ抽出エキス又は乾燥エキス末を酢酸エチル等の有機溶媒で再抽出し、シリカゲルカラム等の分離手段で精製してテルフェニル誘導体画分として得る、又は更にシリカゲルカラム等の分離手段を繰り返したり、ＨＰＬＣを用いて単離する方法等が挙げられる。
【００１７】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤は、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している疾患に対して、優れた治療剤として用いることができ、また乾燥肌又はあれ肌防止剤としても用いられる。また、老化による皮膚の張り低下やしわの形成を予防する効果が期待できる。更には、通常の化粧品等の有効成分としての他、培養細胞系に添加して研究・試験用試薬等として用いることもできる。化粧料として用いる場合は、特に（頭皮を含む）皮膚に適用する皮膚化粧料が望ましい。尚、本発明において化粧料とは歯磨き、入浴剤をも包含するものである。歯磨きに用いた場合、歯肉炎の予防効果が期待できる。
【００１８】
本発明において疾患とは、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している症状を示し、ヒアルロン酸分解の結果として患部で水分保持能力が低下している乾皮症，乾燥肌，あれ肌，その他光加齢や老化にともなう張り、柔軟性の低下やしわの形成した症状を含む。
【００１９】
本発明におけるヒアルロン酸異常分解疾患治療剤とは、ヒアルロン酸の分解が亢進した疾患に適用する薬剤を言い、改善効果を奏するものも含む。
【００２０】
ヒスタミンは線維芽細胞のヒアルロン酸分解を促進することが知られていることから（特開平８−２２５４４７号公報）、前記ヒアルロン酸の分解亢進が伴う疾患の内、特にマスト細胞の浸潤によりヒスタミン量が増大していると考えられる光加齢に対しても効果が期待できる。
【００２１】
本発明における防止剤とは、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者に適用するもの、及び予防として正常人が適用するものをいい、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者が適用するのが特に好ましい。
【００２２】
本発明の化粧料の形態としては、適当な賦形剤，担体，希釈剤を用いて、ゲル，クリーム，スプレー剤，貼付剤，ローション，パック類，乳液，パウダー，入浴剤（顆粒剤、液剤、粉末等）等、化粧品に一般に用いられている種々の剤形に調製することができる。
【００２３】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及び防止剤の形態としては、適当な賦形剤，担体，希釈剤を用いて、錠剤，液剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，軟膏剤，貼付剤，注射剤，坐剤，入浴剤等の剤形とすることができ、またゲル，クリーム，スプレー剤，貼付剤，ローション，パック類，乳液，パウダー等の剤形を挙げることができる。
【００２４】
上記化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及び防止剤の調製は、常法によって行われ、例えば、固形製剤については用途によって通常の医薬部外品添加物，食品添加物，化粧品添加物等適宜選択でき、例えば、乳糖，でんぷん，結晶セルロース，タルク等を用いて製剤化することができる。カプセル剤はそのようにして調製された細粒剤，散剤等を適当なカプセルに充填して得ることができる。液剤は白糖，カルボキシメチルセルロース等を含む水溶液に本発明の薬剤を溶解、又は懸濁することにより調製することができる。
【００２５】
また本発明の化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及び防止剤に使用される賦形剤又は補助剤としては、本発明の効果を損なわない範囲において、通常化粧品，医薬品，医薬部外品，食品等に使用されるものが使用可能であり、用途、剤形に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。例えばワセリン，スクワラン等の炭化水素類、ステアリルアルコール等の高級アルコール類、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル類、ラノリン酸等の動物性油脂類、グリセリン，プロピレングリコール等の多価アルコール類、グリセリン脂肪酸エステル，モノステアリン酸ポリエチレングリコール，ポリエチレンアルキルエーテルリン酸等の界面活性剤、パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤、蝋、樹脂、各種香料、各種色素、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸等の各種有機酸や無機酸及びそれらの塩、水、及びエタノール等が挙げられる。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤を培養細胞系において研究・試験用試薬として用いる場合、配合量としては、培養細胞により高分子ヒアルロン酸を産生させるときは、クロカワ抽出エキス乾燥重量（質量）又はテルフェニル誘導体として培養液中に０．１μｍｏｌ／ｌ以上含有されるのが好ましく、更に好ましくは１μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｍｏｌ／ｌが望ましい。
【００２７】
また、本発明の化粧料、ヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤、及びあれ肌又は乾燥肌防止剤におけるクロカワ抽出エキス、テルフェニル誘導体の配合量としては、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等種々の要因により異なり一概には規定できないが、適用する組成物の総量を１００ｇ基準として、０．０００１ｇ〜１. ５ｇが好ましく、特に０．００１ｇ〜１ｇが好ましい。０．０００１ｇ未満では本発明の効果が得られない場合があり、１．５ｇを超えて配合しても配合量に見合った効果が得られない場合がある。尚、該抽出エキスにおいては上記数値は乾燥エキス末としての換算値を適用する。
【００２８】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及びあれ肌又は乾燥肌防止剤の投与方法としては、経口又は非経口投与が可能である。
【００２９】
通常１日当たり投与量としては、経口投与では、テルフェニル誘導体の量として１μｇ〜１ｇが好ましく、特に５μｇ〜０．１ｇが好ましい。非経口投与では、５０μｇ〜０．１ｇが好ましい。しかしながら、投与量は、目的、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等により適宜変更されうるものであり、一概には規定できない。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例、比較例により本発明を更に詳しく説明する。尚、実施例に先立ちヒアルロン酸分解阻害剤の効果を調べるための評価系について説明する。以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥと略記する。
【００３１】
（１）ＭＥＭ培地の調製法
ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（大日本製薬社製、１０−１０１) １０．６ｇにそれぞれ終濃度として１％（Ｖ／Ｖ）ＮｏｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄ（大日本製薬社製、１６−８１０）、１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、１６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、蒸留水を加えて１ｌとした後、炭酸ガスを吹き込んでｐＨを約７にした（以下、ＭＥＭ培地と略記する）。
【００３２】
（２）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化
ＦＢＳ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製) を５６℃で３０分間加熱処理した。
【００３３】
（３）細胞添加用高分子トリチウムヒアルロン酸の調製方法
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣＣＣＬ１１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて２×１０⁵個／ｍｌに調整し、２２５ｃｍ²のフラスコに５０ｍｌ入れ、３日間培養しコンフルエント状態にした。その後、ヒアルロン酸の前駆体であるトリチウムグルコサミン（American Radiolabeled Chemicals Inc.社製）を培養系に添加し（１０μＣｉ／ｍｌ）、さらに３日間培養したのち、培養液からトリチウムラベルされたヒアルロン酸をUnderhillらの方法（J.Cell Biology，８２巻，４７５頁，１９７９年）によって精製し、さらにゲルろ過カラムにより分子量１００万以上の高分子トリチウムヒアルロン酸（比放射活性０．１μＣｉ／μｇ）を調製した。これを細胞培養系への添加用高分子トリチウムヒアルロン酸とした。
【００３４】
（４）高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
正常ヒト線維芽細胞株〔デトロイト５５１株（ＡＴＣＣＣＣＬ１１０）〕の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．５×１０⁵個／ｍｌに調整し、１２穴プレート（ファルコン社製）に０．８ｍｌずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、さらに、ＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４０００ＤＰＭ／ｍｌ＝２３３．３Ｂｑ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。尚、培地交換時にヒスタミン（１０μｍｏｌ／ｌとなるように）と各種評価を行う薬剤（試料）を添加した。
【００３５】
（５）細胞による高分子トリチウムヒアルロン酸の分解評価
培養終了後、培養液を回収し、１００℃で５分間加熱処理を行った後、培地１ｍｌをセファロースＣＬ─２Ｂカラム（内径１ｃｍ，長さ６０ｃｍ）にアプライし、以下の条件でゲルろ過を行った。
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
分画：４ｍｌ／画分
分画総数：２５
更に分子量１０万以下のヒアルロン酸が溶出する画分１０〜２５の１６本を集め、［³Ｈ］放射活性を測定し，分解したヒアルロン酸の量を求めた。さらに、ヒアルロン酸分解率および分解阻害率は以下の数１および数２によって求めた。
【００３６】
【数１】
ヒアルロン酸分解率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
Ａ＝ヒスタミン添加によるヒアルロン酸分解量
Ｂ＝ヒスタミン＋薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００３７】
【数２】
ヒアルロン酸分解阻害率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ＝ヒスタミン添加によるヒアルロン酸分解量
Ｂ＝ヒスタミン＋薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００３８】
実施例１（クロカワ抽出エキスの調製）
クロカワの子実体４ｋｇ９０％エタノールで抽出後、減圧乾燥し、アセトンで抽出後、減圧下アセトンを留去した。クロロフォルムで疎水性画分を除いたあと、さらに酢酸エチルにて可溶化し、酢酸エチル可溶性画分（２４ｇ）を得た。
【００３９】
実施例２
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２, ０／１０）で展開し、１０画分を得、第９画分を減圧濃縮し４．８ｇを得た。
【００４０】
実施例３
上記実施例２（４．８ｇ）をシリカゲルカラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／メタノール（８／２，０／１０）で展開し、１４画分を得、第６画分を減圧濃縮し７１０．５ｍｇのテルフェニル誘導体含有画分を得た。
【００４１】
実施例４
上記テルフェニル誘導体含有画分７１０．５ｍｇをＭＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、７０％メタノールで分画し、５画分を得、第３画分（１７．２ｍｇ）を減圧濃縮し、さらにＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、９０％メタノールで５分画し、第３分画より５ｍｇのテルフェニル誘導体を得、以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりジアセテートテルフェニル誘導体化７であることを確認した。
【００４２】
【化４】

（但し、式中Ａｃはアセチル基である）
【００４３】
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ） δ；1.97, 2.42, 6.86(d,8.6), 7.07(s), 7.12(s), 7.18(d,8.6)
【００４４】
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ；20.1，20.3, 170.3, 170.6, 99.3, 107.3, 114.9, 115.9, 119.2, 122.0, 125.1, 129.5, 132.8, 137.2, 138.8, 143.6, 144.2, 147.9, 152.3, 157.8
【００４５】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ４２５
【００４６】
実施例５
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２, ０／１０）で展開し、１３画分を得、第４画分を減圧濃縮し１．３ｇを得た。その内１０１．１ｍｇをＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、７０％メタノールで溶出し、９画分を得、第２画分を減圧濃縮し１７．８ｍｇのテルフェニル誘導体を得た。以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりテトラアセテートテルフェニル誘導体化８であることを確認した。
【００４７】
【化５】

（但し、式中Ａｃはアセチル基である）
【００４８】
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃） δ；2.06, 2.21, 2.32, 2.43, 6.57(s), 6.65(s), 7.16(d,8.9), 7.29(d,8.9)
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ） δ；1.99, 2.12, 2.29, 2.47, 7.02(s), 7.16(s), 7.18(d,8.3), 7.29(d,8.3)
【００４９】
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ；20.3, 20.5, 20.6, 21.3, 167.8, 169.3, 170.3, 171.1, 98.0, 106.1, 112.7, 120.5, 121.7, 125.7, 129.2, 130.3, 130.9,133.8, 135.8, 141.7, 145.6, 145.9, 150.9, 151.8
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ；20.0, 20.0, 20.3, 20.9, 169.4, 169.8, 170.0, 171.0, 99.4, 107.4, 114.1, 121.1, 122.7, 127.2, 130.9, 131.9, 132.2,135.1, 137.1, 144.4, 147.3, 149.0, 152.2, 152.8
【００５０】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ５０９
【００５１】
実施例６
上記実施例２（４．８ｇ）をシリカゲルカラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／メタノール（８／２，０／１０）で展開し、１４画分を得、第１４画分を減圧濃縮し４５４．５ｍｇのテルフェニル誘導体含有画分を得た。その画分の１５１．１ｍｇをＨＰＬＣ（ｆｌｕｏｆｉｘカラム）に供与し、４５％メタノールで分画し、１１画分を得、第６画分より１０．４ｍｇテルフェニル誘導体を得、以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりテルフェニル誘導体化９であることを確認した。
【００５２】
【化６】

【００５３】
¹Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；6.67(d,8.3), 7.14(s), 7.27(s), 7.33(d,8.3)
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ；6.74(d,6.5) 7.04(s), 7.25(d,6.5), 7.30(s)
【００５４】
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；98.9, 105.2, 112.6, 113.3, 114.1, 115.2,127.7, 132.0, 143.7, 144.7, 145.8, 153.7, 158.2,
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ；99.4, 106.5, 115.3, 115.6, 116.8, 126.0, 133.6, 146.6, 148.5, 152.1, 156.7
【００５５】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ３４１
【００５６】
実施例７
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２, ０／１０）で展開し、１３画分を得、第７画分を減圧濃縮し２８４．９ｍｇを得た。それを分取用ＴＬＣに供与しクロロフォルム／メタノール（８／２）で展開分取し、６画分を得、第２画分を減圧濃縮し１２０．５ｍｇを得て、それをＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、７０％メタノールで分画し、６画分を得、第３画分より４０．２ｍｇのテルフェニル誘導体を得た。以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりトリアセテートテルフェニル誘導体化１０であることを確認した。
【００５７】
【化７】

（但し、式中Ａｃはアセチル基である）
【００５８】
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ） δ；1.99, 2.11, 2.44, 6.86(d,8.6), 7.03(s),7.10(d,8.6), 7.14(s)
【００５９】
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ；20.0, 20.1, 20.3, 169.7, 170.2, 170.4, 99.4, 107.4, 114.1, 116.1, 120.3, 124.0, 128.0, 131.8, 132.1, 134.9, 137.0,144.1, 147.1, 148.5, 152.6, 158.3
【００６０】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ４６７
【００６１】
実施例８
上記実施例１の酢酸エチル画分２４ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ７７５ｇ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロフォルム／アセトン（１０／０，８／２）、クロロフォルム／メタノール（９／１，８／２, ０／１０）で展開し、１３画分を得、第１０画分を減圧濃縮し２．６ｇを得た。これをシリカゲルカラムに供与しクロロフォルム／メタノール（８／２，０／１０）で溶出し、９画分を得、第５画分を減圧濃縮し７８５．８ｍｇを得た。その画分の１９９．１ｍｇをそれをＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム）に供与し、５０％メタノールで分画し、９画分を得、第５画分より４７．９ｍｇのテルフェニル誘導体を得た。以下に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）とマススペクトル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）によりテトラアセテートテルフェニル誘導体化１１であることを確認した。
【００６２】
【化８】

（但し、式中Ｒ₅、Ｒ₆はいずれかがアセチル基で、他方は水酸基である）
【００６３】
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ） δ；2.04, 6.85(d,8.3), 6.91(s), 7.16(d,8.3),7.49(s)
¹Ｈ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；2.13, 6.87(d,8.3), 7.03(s), 7.14(d,8.3),7.51(s)
【００６４】
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ；20.2, 171.2, 99.0, 108.7, 115.0, 116.0, 116.3, 123.3, 125.4, 126.2, 132.7, 137.8, 139.4, 142.9, 143.8, 146.3, 151.8, 157.8
¹³Ｃ−ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ）δ；20.2, 168.7, 98.3, 107.5, 113.7, 114.2,114.7, 114.5, 114.7, 122.2, 123.8, 124.6, 131.3, 132.1, 141.7, 145.6, 149.5, 156.5
【００６５】
ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓ．）：ｍ／ｚ３８３
【００６６】
実施例１〜６、比較例３
実施例１〜６をそれぞれ５０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶解し、それぞれのＤＭＳＯ溶液を調整した。また、比較例３として従来知られている牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチン（炎症、４巻、ＮＯ４、４３７（１９８４））０．１８ｇを水１０ｇに溶解し、水溶液（２００μＭ）を調整した。
【００６７】
試験例
実施例１〜６、比較例１（水溶液）、比較例２（ＤＭＳＯのみ）並びに上記比較例３を用いて、前述した（５）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解を調べ、ヒアルロン酸分解率およびヒアルロン酸分解阻害率を前記数１、数２より算出した。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】

【００６９】
その結果、ヒスタミン添加によって無添加時よりヒアルロン酸の分解は促進された状態において、実施例１〜６のテルフェニル誘導体を含むクロカワ抽出エキス、テルフェニル誘導体画分、テルフェニル誘導体、いずれの薬剤においてもヒアルロン酸分解の阻害効果が認められた。また比較例３に示した牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチンの添加は、ヒトの細胞培養系である本評価系において全く効果がないことがわかった。
【００７０】
この結果からテルフェニル誘導体は、ヒトのヒアルロン酸分解阻害剤として有効であることは明らかである。また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤はヒアルロン酸分解が異常に亢進している疾患に有効であると考えられる。
【００７１】
実施例９〜１１（錠剤）
以下実施例中の表中の値は、特段の断りなければ全て重量（質量）％である。
【００７２】
【表２】

【００７３】
上記表２の各成分を均一に混合し、常法に従って、１錠１７０ｍｇとなるように打錠し、錠剤を調製した。
【００７４】
実施例１２〜１４（カプセル剤）
【００７５】
【表３】

【００７６】
上記表３中の各成分を均一に混合し、常法に従って、混合物の１５０ｍｇを３号硬カプセルに充填した。
【００７７】
実施例１５〜１７（液剤）
【００７８】
【表４】

【００７９】
精製水に上記表４中のの各成分を溶解し、攪拌均一化してシロップ剤とした。
【００８０】
実施例１８〜２１（クリーム）
【００８１】
【表５】

【００８２】
上記表５中において、成分（Ａ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｂ）を混合溶解した（混合液Ｉ）。これとは別に、成分（Ｄ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｃ）を混合溶解した（混合液ＩＩ）。つぎに、混合液Ｉに、徐々に混合液ＩＩを加えて、充分攪拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００８３】
実施例２２〜２５（ローション）
【００８４】
【表６】

【００８５】
上記表６中の各成分を常法により混合溶解して、ローションを調製した。
【００８６】
実施例２６〜２７（入浴剤）
【００８７】
【表７】

【００８８】
上記表７中の各成分を混合し、常法により入浴剤を調製した。なお、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈されて使用される。
【００８９】
実施例２８〜３０（薬用練歯磨）
【００９０】
【表８】

【００９１】
常法に従い、水、グリセリン，カラギナン，サッカリン，パラオキシ安息香酸ブチル，クロルヘキシジンジグリコネート，香料及びテルフェニル誘導体を計量し、混合して粘結剤を膨潤させたのち、第２リン酸カルシウム，ラウリル硫酸ナトリウムを加え、更によく混合し脱泡したのち、チューブに充填して練歯磨を得た。
【００９２】
実施例３１〜３３（洗口剤）
【００９３】
【表９】

【００９４】
常法に従い、上記表９の組成からなる洗口剤を調製した。
【００９５】
【発明の効果】
以上の様に、本発明により、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を阻害するヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している乾皮症，乾せん，あれ肌，乾燥肌等の疾患に対し優れた効果を発揮するヒアルロン酸異常分解疾患治療剤及びあれ肌又は乾燥肌防止剤、あれ肌又は乾燥肌防止剤及びしわ防止や張り、柔軟性の改善等に効果のある化粧料を提供できることは明らかである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a cosmetic, a hyaluronic acid degradation inhibitor and a therapeutic agent that can be expected to have a prophylactic / therapeutic effect on xeroderma, psoriasis, rough skin, dry skin and the like in which hyaluronic acid degradation is physiologically enhanced from normal. , And that skin or dry skin prevention agent.
[0002]
[Prior art]
Hyaluronic acid retains moisture in the interstitial space, retains cells based on the formation of a jelly-like matrix in the tissue, maintains the lubricity and flexibility of organ tissue, and resists external forces such as mechanical failure, And has many functions such as prevention of bacterial infection (Non-patent Document 1).
[0003]
Furthermore, in recent years, it has been found that hyaluronic acid has various physiological actions depending on its molecular weight. For example, high molecular weight hyaluronic acid (molecular weight of 1 million or more), which is thought to be synthesized in vivo, has proteoglycan release inhibitory action, bradykinin joint pain inhibitory action, damaged cartilage repair action, and arthritis inhibitory action. Low molecular weight hyaluronic acid, which has an effect (Non-patent Document 2) and is a degradation (low molecular weight) product, has an angiogenesis promoting action (Non-Patent Document 3) and a leukocyte chemotaxis promoting action (Patent Document 1). It is thought to have inflammation-promoting action because it has. And it is thought that the reduction | decrease of the hyaluronic acid of the skin by aging is greatly concerned in the water | moisture environment of a skin, a softness | flexibility, and formation of a tension | tension and wrinkles (nonpatent literature 4, 5).
[0004]
From the above, low molecular weight of hyaluronic acid is closely related to worsening symptoms of hepatitis, gingivitis (Non-patent document 6), rheumatoid arthritis, osteoarthritis (Non-patent document 7), and malignant tumor (Non-patent document 8). Hyaluronic acid reduction due to aging is also related to skin tension reduction and wrinkle formation. Therefore, hyaluronic acid degradation inhibitors and cosmetics that prevent and prevent hyaluronic acid molecular weight reduction are desired. Yes.
[0005]
Actually, hyaluronidase that lowers the molecular weight of hyaluronic acid in connective tissue is assumed, and the inhibitor was expected to have a pharmacological effect (Non-patent Document 9). However, there has been no report that hyaluronidase has been isolated from fibroblasts that form human connective tissue, so it is assumed that the enzyme of human fibroblasts has properties similar to those of bovine testis-derived hyaluronidase. Various inhibitors using derived hyaluronidase have been reported (Patent Documents 2 to 9).
[0006]
However, in recent years, human synovial cells (Non-patent document 10), human uterine cervical canal cells (Non-patent document 11), human dermal fibroblasts (Non-patent document 12), human lung fibroblasts (non-patent document) present in joints. Patent Document 13) reports the existence of an endo-type hyaluronic acid degradation mechanism that is clearly different from bovine testis-derived hyaluronidase that degrades hyaluronic acid into tetrasaccharides and hexasaccharides. For these reasons, it is difficult to effectively inhibit human hyaluronic acid degradation with testicular-derived hyaluronidase inhibitors.
[0007]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 6-8323
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No. 6-29271
[Patent Document 3]
Japanese Patent Publication No. 6-4584
[Patent Document 4]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-17876
[Patent Document 5]
JP-A-6-80553
[Patent Document 6]
JP-A-6-80576
[Patent Document 7]
JP-A-6-9415
[Patent Document 8]
JP-A-6-9416
[Patent Document 9]
JP-A-3-68515
[Non-Patent Document 1]
BIO INDUSTRY, 8, 346, 1991
[Non-Patent Document 2]
BIO INDUSTRY, 11, 632, 1991
[Non-Patent Document 3]
Science, 228, 1324, 1985
[Non-Patent Document 4]
Int. J. Dermatol (1994), 33, 119-122
[Non-Patent Document 5]
Int. J. Dermatol (1996) 35,539-544
[Non-Patent Document 6]
Inflammation, 4, 437, 1984
[Non-Patent Document 7]
Connective tissue, 25, 243, 1994
[Non-Patent Document 8]
J. Cellar Physiology, 160, 275, 1994
[Non-patent document 9]
Inflammation, 4, 437, 1984
[Non-Patent Document 10]
Connective tissue, 25, 243, 1994
[Non-Patent Document 11]
FEBS Letters, 347, 95, 1994
[Non-Patent Document 12]
BBA, 172, 70, 1990
[Non-Patent Document 13]
J. Clin. Invest. 90, 1492, 1992
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, it is an object of the present invention to be expected to have a preventive / therapeutic effect on psoriasis, psoriasis, rough skin, dry skin, etc. in which hyaluronic acid degradation is physiologically enhanced from normal, and human fibrosis An object of the present invention is to provide a hyaluronic acid degradation inhibitor and a therapeutic agent that directly act on blast cells and exhibit excellent effects, and that skin or dry skin prevention agent. Another object of the present invention is to provide a cosmetic that is effective in preventing wrinkles, improving tension and improving flexibility.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The above-mentioned object is achieved by a cosmetic, a hyaluronic acid degradation inhibitor, a skin or dry skin inhibitor, and a therapeutic agent for abnormal degradation of hyaluronic acid, characterized by containing Kurokawa extract or an active ingredient. . Moreover, it achieves with the cosmetics characterized by containing the terphenyl derivative shown by the following general formula (A), or making it an active ingredient, the hyaluronic acid degradation inhibitor, and the rough skin or dry skin prevention agent. That is, the present invention relates to a cosmetic, a hyaluronic acid degradation inhibitor, a skin or dry skin inhibitor, and a hyaluronic acid abnormality containing or active as an active ingredient the kurokawa extract or the terphenyl derivative represented by the following general formula (A) It is in the therapeutic agent for degradation diseases.
[0010]
[Chemical 3]

(However, R in the formula ₁ ~ R _Four Is a hydroxyl group or an acetyl group)
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
[0012]
As a method for producing the extract of Kurokawa according to the present invention, the fruit body of Kurokawa (Boletopsis Leucomelas), which is a mushroom-derived mushroom, may be immersed in a suitable extraction solvent for a certain period of time, and if necessary, reflux extraction or pressure extraction under reduced pressure Ordinary extraction means such as can be used. For example, a method of adding an extraction solvent 5 to 30 times in weight (mass) ratio to a lyophilized pulverized Kurokawa fruit body and usually immersing at 15 to 50 ° C. for 24 hours to 1 week to obtain an extract or the like. . In addition, the extract can be obtained as a concentrated extract by removing insolubles by filtration or centrifugation, or by concentrating with a normal means such as reduced pressure. Moreover, it can also be used as a dry extract powder by a normal powdering method.
[0013]
Examples of a method for producing a dry extract powder of Kurokawa include a method of obtaining the extract extract as a dry extract powder by a usual drying means such as reduced pressure drying, spray drying or freeze drying.
[0014]
Examples of the extraction solvent used when producing the Kurokawa extract include water, water-soluble organic solvents such as methanol, ethanol, 1,3 butylene glycol, and mixed solvents thereof. Further, re-extraction may be performed with a polar organic solvent such as ethyl acetate. Or it can also concentrate and pulverize by the method mentioned above, after removing a hydrophobic substance by nonpolar solvent processing, such as chloroform.
[0015]
The terphenyl derivative according to the present invention can be obtained, for example, from the above Kurokawa extract or its dried extract powder.
[0016]
As a method for isolating the terphenyl derivative according to the present invention, the Kurokawa extract extract or the dried extract powder is re-extracted with an organic solvent such as ethyl acetate and purified by a separating means such as a silica gel column to obtain a terphenyl derivative fraction. Or a method of repeating separation means such as a silica gel column or isolating using HPLC.
[0017]
The hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention can be used as an excellent therapeutic agent for diseases in which hyaluronic acid degradation is physiologically higher than normal, and also as a dry skin or that skin prevention agent. It is done. Moreover, the effect which prevents the skin tension fall and wrinkle formation by aging can be expected. Furthermore, in addition to active ingredients such as normal cosmetics, they can be added to cultured cell systems and used as research and test reagents. When used as a cosmetic, a skin cosmetic applied to the skin (including the scalp) is particularly desirable. In the present invention, the cosmetic includes toothpaste and bathing agent. When used for brushing teeth, it can be expected to prevent gingivitis.
[0018]
In the present invention, a disease refers to a symptom in which hyaluronic acid degradation is physiologically increased from normal, and as a result of hyaluronic acid degradation, moisture retention ability is reduced in the affected area, dry skin, dry skin, that skin , Other symptoms include tension, decreased flexibility and wrinkles associated with photoaging and aging.
[0019]
The therapeutic agent for abnormal degradation of hyaluronic acid in the present invention refers to a drug applied to a disease in which the degradation of hyaluronic acid is enhanced, and includes those that have an improvement effect.
[0020]
Since histamine is known to promote hyaluronic acid degradation of fibroblasts (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-225447), among the diseases accompanied by the enhanced degradation of hyaluronic acid, in particular, the amount of histamine due to infiltration of mast cells An effect can be expected for photoaging that is considered to increase.
[0021]
The inhibitor in the present invention refers to those applied to a symptomatic person whose degradation of hyaluronic acid is physiologically higher than normal, and those applied to normal persons as prevention, where the degradation of hyaluronic acid is physiologically It is particularly preferable to apply to symptomatic patients who are more elevated than normal.
[0022]
The cosmetics of the present invention may be in the form of gels, creams, sprays, patches, lotions, packs, emulsions, powders, bathing agents (granules, solutions) using appropriate excipients, carriers, and diluents. , Powders, etc.) can be prepared in various dosage forms generally used in cosmetics.
[0023]
As a form of the hyaluronic acid degradation inhibitor, the hyaluronic acid abnormal degradation disease therapeutic agent and the inhibitor of the present invention, tablets, liquids, capsules, granules, powders, using appropriate excipients, carriers, and diluents, The dosage form can be ointments, patches, injections, suppositories, bathing agents, etc., and the dosage forms should be gels, creams, sprays, patches, lotions, packs, emulsions, powders, etc. Can do.
[0024]
Preparation of the cosmetics, hyaluronic acid degradation inhibitor, hyaluronic acid abnormal degradation disease therapeutic agent and preventive agent is carried out by a conventional method. For example, for a solid preparation, a normal quasi-drug additive or food additive depending on the application. , Cosmetic additives, and the like, and can be formulated using, for example, lactose, starch, crystalline cellulose, talc, and the like. Capsules can be obtained by filling fine granules, powders and the like thus prepared into suitable capsules. The liquid preparation can be prepared by dissolving or suspending the agent of the present invention in an aqueous solution containing sucrose, carboxymethylcellulose and the like.
[0025]
Further, as an excipient or an auxiliary agent used in the cosmetic, hyaluronic acid degradation inhibitor, hyaluronic acid abnormal decomposition disease therapeutic agent and preventive agent of the present invention, cosmetics and pharmaceuticals are usually used as long as the effects of the present invention are not impaired. Those used in quasi-drugs, foods, etc. can be used, and are appropriately selected depending on the application and dosage form, and are not particularly limited. For example, hydrocarbons such as petrolatum and squalane, higher alcohols such as stearyl alcohol, higher fatty acid lower alkyl esters such as isopropyl myristate, animal fats such as lanolinic acid, polyhydric alcohols such as glycerin and propylene glycol, Surfactant such as glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol monostearate, polyethylene alkyl ether phosphate, preservative such as methyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, wax, resin, various fragrances, various dyes, sodium citrate, carbonic acid Examples include various organic acids such as sodium and lactic acid, inorganic acids and salts thereof, water, and ethanol.
[0026]
When the hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention is used as a reagent for research / test in a cultured cell system, the blending amount thereof is the dry weight (mass) of kurokawa extract extract or tellurium when high molecular hyaluronic acid is produced by cultured cells. The phenyl derivative is preferably contained in the culture solution in an amount of 0.1 μmol / l or more, more preferably 1 μmol / l to 1 mmol / l.
[0027]
In addition, the amount of Kurokawa extract extract and terphenyl derivative in the cosmetics, hyaluronic acid degradation inhibitor, therapeutic agent for abnormal degradation of hyaluronic acid, and that skin or dry skin preventive agent of the present invention is the type of the target disease However, depending on various factors such as degree, patient age, weight, and gender, it cannot be defined unconditionally. However, based on the total amount of the composition to be applied as 100 g, 0.0001 g to 1.5 g is preferable, particularly 0.001 g to 1 g is preferred. If it is less than 0.0001 g, the effect of the present invention may not be obtained, and even if it exceeds 1.5 g, the effect corresponding to the blending amount may not be obtained. In addition, in this extract, the said numerical value applies the conversion value as a dry extract powder.
[0028]
As a method for administering the hyaluronic acid degradation inhibitor, the therapeutic agent for abnormal degradation of hyaluronic acid, and the skin or dry skin prevention agent of the present invention, oral or parenteral administration is possible.
[0029]
Usually, the daily dose is preferably 1 μg to 1 g, particularly preferably 5 μg to 0.1 g, as the amount of terphenyl derivative for oral administration. For parenteral administration, 50 μg to 0.1 g is preferred. However, the dose can be appropriately changed depending on the purpose, the type and degree of the target disease, the age, weight, gender, etc. of the patient, and cannot be generally specified.
[0030]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples. Prior to the examples, an evaluation system for examining the effect of the hyaluronic acid degradation inhibitor will be described. Hereinafter, polyoxyethylene is abbreviated as POE.
[0031]
(1) Preparation method of MEM medium
Minium Essential Medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 10-101) 10.6 g each as a final concentration of 1% (V / V) Non Essential Amino Acid (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 16-810), 1 mmol / l pyruvic acid Sodium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 16-820), 1.2% (W / V) sodium hydrogen carbonate, distilled water was added to make 1 l, and then carbon dioxide was blown to adjust the pH to about 7 (hereinafter, (Abbreviated as MEM medium).
[0032]
(2) Inactivation of fetal bovine serum (FBS)
FBS (Irvine Scientific) was heat-treated at 56 ° C. for 30 minutes.
[0033]
(3) Preparation method of polymer tritium hyaluronic acid for cell addition
The number of normal human fibroblast cell line [Detroit 551 strain (ATCC CCL 110)] was 2 × 10 2 in MEM medium containing 10% (V / V) inactivated FBS. ^Five 225cm, adjusted to pieces / ml ² 50 ml of the flask was cultured for 3 days to be confluent. Thereafter, tritium glucosamine (American Radiolabeled Chemicals Inc.), which is a precursor of hyaluronic acid, was added to the culture system (10 μCi / ml), and further cultured for 3 days. After that, tritium-labeled hyaluronic acid was removed from the culture solution underhill. (J. Cell Biology, 82, 475, 1979), and a high molecular weight tritium hyaluronic acid (specific radioactivity 0.1 μCi / μg) having a molecular weight of 1 million or more was prepared by a gel filtration column. . This was designated as polymer tritium hyaluronic acid for addition to the cell culture system.
[0034]
(4) Addition culture of polymer tritium hyaluronic acid
The number of normal human fibroblast cell line [Detroit 551 strain (ATCC CCL 110)] is 1.5 × 10 5 in MEM medium containing 10% (V / V) inactivated FBS. ^Five Per ml / ml, seeded on a 12-well plate (manufactured by Falcon) at 0.8 ml each, and in an atmosphere of 95% (V / V) air-5% (V / V) carbon dioxide at 37 ° C. for 3 days After static culture, the medium was replaced with MEM medium alone and cultured for 1 day. Thereafter, a MEM medium containing high molecular tritium hyaluronic acid (14000 DPM / ml = 233.3 Bq) was prepared, the medium was changed, and culture was performed for 3 days. At the time of medium exchange, histamine (so as to be 10 μmol / l) and a drug (sample) for various evaluations were added.
[0035]
(5) Evaluation of degradation of polymeric tritium hyaluronic acid by cells
After completion of the culture, the culture solution is collected and heated at 100 ° C. for 5 minutes, and then 1 ml of the medium is applied to a Sepharose CL-2B column (inner diameter 1 cm, length 60 cm) and gel filtration is performed under the following conditions. It was.
Flow rate: 0.6 ml / min
Fraction: 4 ml / fraction
Total number of fractions: 25
Furthermore, 16 pieces of fractions 10 to 25 from which hyaluronic acid having a molecular weight of 100,000 or less is eluted are collected. ^Three H] Radioactivity was measured to determine the amount of degraded hyaluronic acid. Furthermore, the hyaluronic acid decomposition rate and the decomposition inhibition rate were determined by the following equations 1 and 2.
[0036]
[Expression 1]
Hyaluronic acid decomposition rate (%) = B / A × 100
A = Amount of hyaluronic acid decomposed by histamine addition
B = amount of hyaluronic acid decomposed by histamine + drug addition
[0037]
[Expression 2]
Hyaluronic acid degradation inhibition rate (%) = (1−B / A) × 100
A = Amount of hyaluronic acid decomposed by histamine addition
B = amount of hyaluronic acid decomposed by histamine + drug addition
[0038]
Example 1 (Preparation of Kurokawa extract)
After extraction with 4 kg 90% ethanol of Kurokawa fruiting body, it was dried under reduced pressure, and after extraction with acetone, acetone was distilled off under reduced pressure. After removing the hydrophobic fraction with chloroform, it was further solubilized with ethyl acetate to obtain an ethyl acetate soluble fraction (24 g).
[0039]
Example 2
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10 / 0,8 / 2) and chloroform / methanol (9 / 1,8 / 2) as developing solvents. 0/10) to obtain 10 fractions, and the ninth fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 4.8 g.
[0040]
Example 3
The above Example 2 (4.8 g) was donated to a silica gel column and developed with chloroform / methanol (8/2, 0/10) as a developing solvent to obtain 14 fractions, and the sixth fraction was concentrated under reduced pressure 710. A fraction containing 5 mg of a terphenyl derivative was obtained.
[0041]
Example 4
The above terphenyl derivative-containing fraction 710.5 mg was donated to MPLC (ODS column), fractionated with 70% methanol to obtain 5 fractions, the third fraction (17.2 mg) was concentrated under reduced pressure, and HPLC (ODS column), fractionated with 90% methanol for 5 fractions, 3 mg of terphenyl derivative was obtained from the third fraction, NMR signal (JEOL-LAMBDA, manufactured by JEOL Ltd.) and mass spectrum (Japan) It was confirmed that it was diacetate terphenyl derivatized 7 by JEOL-DX303HF manufactured by Denki Co., Ltd.
[0042]
[Formula 4]

(In the formula, Ac is an acetyl group)
[0043]
¹ H-NMR (CD _Three OD) δ; 1.97, 2.42, 6.86 (d, 8.6), 7.07 (s), 7.12 (s), 7.18 (d, 8.6)
[0044]
¹³ C-NMR (CD _Three OD) δ; 20.1, 20.3, 170.3, 170.6, 99.3, 107.3, 114.9, 115.9, 119.2, 122.0, 125.1, 129.5, 132.8, 137.2, 138.8, 143.6, 144.2, 147.9, 152.3, 157.8
[0045]
FAB-MS (Pos.): M / z 425
[0046]
Example 5
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 above was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10 / 0,8 / 2), chloroform / methanol (9 / 1,8 / 2, 0/10) to obtain 13 fractions, and the fourth fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 1.3 g. Among them, 101.1 mg was donated to HPLC (ODS column) and eluted with 70% methanol to obtain 9 fractions, and the second fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 17.8 mg of terphenyl derivative. The following NMR signal (JEOL Ltd., JEOL-LAMBDA) and mass spectrum (JEOL Ltd., JEOL-DX303HF) confirmed that it was tetraacetate terphenyl derivatized 8.
[0047]
[Chemical formula 5]

(In the formula, Ac is an acetyl group)
[0048]
¹ H-NMR (CDCl _Three ) Δ; 2.06, 2.21, 2.32, 2.43, 6.57 (s), 6.65 (s), 7.16 (d, 8.9), 7.29 (d, 8.9)
¹ H-NMR (CD _Three OD) δ; 1.99, 2.12, 2.29, 2.47, 7.02 (s), 7.16 (s), 7.18 (d, 8.3), 7.29 (d, 8.3)
[0049]
¹³ C-NMR (CDCl _Three ) Δ; 20.3, 20.5, 20.6, 21.3, 167.8, 169.3, 170.3, 171.1, 98.0, 106.1, 112.7, 120.5, 121.7, 125.7, 129.2, 130.3, 130.9,133.8, 135.8, 141.7, 145.6, 145.9, 150.9, 151.8
¹³ C-NMR (CD _Three OD) δ; 20.0, 20.0, 20.3, 20.9, 169.4, 169.8, 170.0, 171.0, 99.4, 107.4, 114.1, 121.1, 122.7, 127.2, 130.9, 131.9, 132.2, 135.1, 137.1, 144.4, 147.3, 149.0, 152.2, 152.8
[0050]
FAB-MS (Pos.): M / z 509
[0051]
Example 6
The above Example 2 (4.8 g) was donated to a silica gel column and developed with chloroform / methanol (8/2, 0/10) as a developing solvent to obtain 14 fractions. The 14th fraction was concentrated under reduced pressure and 454 A fraction containing 5 mg of a terphenyl derivative was obtained. 151.1 mg of the fraction was donated to HPLC (fluofix column), fractionated with 45% methanol to obtain 11 fraction, 10.4 mg terphenyl derivative was obtained from the sixth fraction, and the NMR signal shown below (JEOL Ltd., JEOL-LAMBDA) and mass spectrum (JEOL Ltd., JEOL-DX303HF) confirmed that it was terphenyl derivatized 9.
[0052]
[Chemical 6]

[0053]
¹ H-NMR (d-DMSO) δ; 6.67 (d, 8.3), 7.14 (s), 7.27 (s), 7.33 (d, 8.3)
¹ H-NMR (CD _Three OD) δ; 6.74 (d, 6.5) 7.04 (s), 7.25 (d, 6.5), 7.30 (s)
[0054]
¹³ C-NMR (d-DMSO) δ; 98.9, 105.2, 112.6, 113.3, 114.1, 115.2, 127.7, 132.0, 143.7, 144.7, 145.8, 153.7, 158.2,
¹³ C-NMR (CD _Three OD) δ; 99.4, 106.5, 115.3, 115.6, 116.8, 126.0, 133.6, 146.6, 148.5, 152.1, 156.7
[0055]
FAB-MS (Pos.): M / z 341
[0056]
Example 7
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10/0, 8/2), chloroform / methanol (9/1, 8/2, 0/10) to obtain 13 fractions, and the seventh fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 284.9 mg. It was supplied to preparative TLC and developed with chloroform / methanol (8/2) to obtain 6 fractions, and the second fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 120.5 mg, which was obtained by HPLC (ODS column And fractionated with 70% methanol to obtain 6 fractions, and 40.2 mg of terphenyl derivative was obtained from the third fraction. It was confirmed that it was triacetate terphenyl derivatized 10 by NMR signal (JEOL-LAMBDA, manufactured by JEOL Ltd.) and mass spectrum (JEOL-DX303HF, manufactured by JEOL Ltd.) shown below.
[0057]
[Chemical 7]

(In the formula, Ac is an acetyl group)
[0058]
¹ H-NMR (CD _Three OD) δ; 1.99, 2.11, 2.44, 6.86 (d, 8.6), 7.03 (s), 7.10 (d, 8.6), 7.14 (s)
[0059]
¹³ C-NMR (CD _Three OD) δ; 20.0, 20.1, 20.3, 169.7, 170.2, 170.4, 99.4, 107.4, 114.1, 116.1, 120.3, 124.0, 128.0, 131.8, 132.1, 134.9, 137.0,144.1, 147.1, 148.5, 152.6, 158.3
[0060]
FAB-MS (Pos.): M / z 467
[0061]
Example 8
24 g of the ethyl acetate fraction of Example 1 above was applied to a silica gel (silica gel 60N 775 g) column, and chloroform / acetone (10 / 0,8 / 2), chloroform / methanol (9 / 1,8 / 2, 0/10) to obtain 13 fractions, and the 10th fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 2.6 g. This was applied to a silica gel column and eluted with chloroform / methanol (8/2, 0/10) to obtain 9 fractions, and the fifth fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 785.8 mg. The fraction of 199.1 mg was donated to HPLC (ODS column) and fractionated with 50% methanol to obtain 9 fractions, and 47.9 mg of terphenyl derivative was obtained from the 5th fraction. The following NMR signal (JEOL Ltd., JEOL-LAMBDA) and mass spectrum (JEOL Ltd., JEOL-DX303HF) confirmed that it was tetraacetate terphenyl derivatized 11.
[0062]
[Chemical 8]

(However, R in the formula _Five , R ₆ Is either an acetyl group and the other is a hydroxyl group)
[0063]
¹ H-NMR (CD _Three OD) δ; 2.04, 6.85 (d, 8.3), 6.91 (s), 7.16 (d, 8.3), 7.49 (s)
¹ H-NMR (d-DMSO) δ; 2.13, 6.87 (d, 8.3), 7.03 (s), 7.14 (d, 8.3), 7.51 (s)
[0064]
¹³ C-NMR (CD _Three OD) δ; 20.2, 171.2, 99.0, 108.7, 115.0, 116.0, 116.3, 123.3, 125.4, 126.2, 132.7, 137.8, 139.4, 142.9, 143.8, 146.3, 151.8, 157.8
¹³ C-NMR (d-DMSO) δ; 20.2, 168.7, 98.3, 107.5, 113.7, 114.2, 114.7, 114.5, 114.7, 122.2, 123.8, 124.6, 131.3, 132.1, 141.7, 145.6, 149.5, 156.5
[0065]
FAB-MS (Pos.): M / z 383
[0066]
Examples 1-6, Comparative Example 3
50 mg of each of Examples 1 to 6 was dissolved in 1 ml of DMSO to prepare each DMSO solution. Further, 0.18 g of glycyrrhizin (inflammation, volume 4, NO4, 437 (1984)), an inhibitor of bovine testis-derived hyaluronidase conventionally known as Comparative Example 3, was dissolved in 10 g of water to prepare an aqueous solution (200 μM). did.
[0067]
Test example
Using Examples 1 to 6, Comparative Example 1 (aqueous solution), Comparative Example 2 (DMSO only) and Comparative Example 3 above, the decomposition of the polymer tritium hyaluronic acid was examined by the method of (5) described above. The degradation rate and the hyaluronic acid degradation inhibition rate were calculated from the above formulas 1 and 2. The results are shown in Table 1.
[0068]
[Table 1]

[0069]
As a result, Kurokawa extract containing the terphenyl derivative of Examples 1 to 6, terphenyl derivative fraction, terphenyl derivative, in any drug, in a state in which the degradation of hyaluronic acid was promoted more than when no histamine was added. Inhibition of hyaluronic acid degradation was also observed. Further, it was found that the addition of glycyrrhizin, which is an inhibitor of bovine testis-derived hyaluronidase shown in Comparative Example 3, has no effect in this evaluation system, which is a human cell culture system.
[0070]
From this result, it is clear that the terphenyl derivative is effective as a human hyaluronic acid degradation inhibitor. The hyaluronic acid degradation inhibitor of the present invention is considered to be effective for diseases in which hyaluronic acid degradation is abnormally enhanced.
[0071]
Examples 9 to 11 (tablets)
Hereinafter, all values in the tables in the examples are weight (mass)% unless otherwise specified.
[0072]
[Table 2]

[0073]
Each component shown in Table 2 above was uniformly mixed, and tableted to give 170 mg of one tablet according to a conventional method to prepare tablets.
[0074]
Examples 12 to 14 (capsules)
[0075]
[Table 3]

[0076]
Each component in the above Table 3 was uniformly mixed, and 150 mg of the mixture was filled into a No. 3 hard capsule according to a conventional method.
[0077]
Examples 15 to 17 (Liquid)
[0078]
[Table 4]

[0079]
Each component in Table 4 above was dissolved in purified water, and the mixture was stirred and homogenized to obtain a syrup.
[0080]
Examples 18-21 (cream)
[0081]
[Table 5]

[0082]
In Table 5 above, component (A) was uniformly mixed and dissolved at 80 ° C., and then component (B) was mixed and dissolved therein (mixed solution I). Separately, component (D) was uniformly mixed and dissolved at 80 ° C., and then component (C) was mixed and dissolved therein (mixed solution II). Next, the liquid mixture II was gradually added to the liquid mixture I, and it cooled to 30 degreeC, fully stirring, and obtained the cream.
[0083]
Examples 22-25 (Lotion)
[0084]
[Table 6]

[0085]
Each component in Table 6 was mixed and dissolved by a conventional method to prepare a lotion.
[0086]
Examples 26 to 27 (baths)
[0087]
[Table 7]

[0088]
Each component in Table 7 was mixed, and a bath agent was prepared by a conventional method. In addition, this bath agent is diluted about 3000 times before use.
[0089]
Examples 28-30 (medicinal toothpaste)
[0090]
[Table 8]

[0091]
According to a conventional method, water, glycerin, carrageenan, saccharin, butyl paraoxybenzoate, chlorhexidine diglyconate, fragrance and terphenyl derivative were weighed and mixed to swell the binder, and then dicalcium phosphate, sodium lauryl sulfate After further mixing and defoaming, the tube was filled to obtain a toothpaste.
[0092]
Examples 31-33 (mouth wash)
[0093]
[Table 9]

[0094]
According to a conventional method, a mouthwash having the composition shown in Table 9 was prepared.
[0095]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a hyaluronic acid degradation inhibitor that acts on cells existing in human connective tissue and inhibits hyaluronic acid degradation, psoriasis in which hyaluronic acid degradation is physiologically increased from normal, Hyaluronic acid abnormal decomposition disease therapeutic agent that exhibits excellent effects on diseases such as psoriasis, dry skin, dry skin, and that skin or dry skin prevention agent, that skin or dry skin prevention agent and wrinkle prevention and tension, flexibility It is clear that cosmetics effective for improvement can be provided.

Claims

A cosmetic comprising a terphenyl derivative represented by the following general formula (A).

(In the formula, R _{1 to} R ₄ are a hydroxyl group or an acetyl group)

The skin or dry skin inhibitor characterized by containing the terphenyl derivative shown by the following general formula (A).

(In the formula, R _{1 to} R ₄ are a hydroxyl group or an acetyl group)