JP3543196B2 - ６−エトキシ−２−［２’−（ジメチルアミノ）エチル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ジベンズ（ｄｅｈ）−イソキノリン−１，３−ジオン - Google Patents
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Description
本発明は、６−エトキシ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオン及び該化合物を有効成分とする抗癌剤に関する。
抗腫瘍活性を示す化合物の最近の研究には、アントラセン誘導体のような融合環構造、並びにイソキノリンおよびアクリジンのような複素環が含まれている。有望性を示す第１のアントラセン誘導体は2,2'−（9,10−アントラセン−ジメチレン）ビス−（２−チオプソイドウレア）−ジヒドロクロリドであり、この誘導体は残念にも光毒性を有していた（米国特許第3,190,795号およびCarter、Cancer Chemother.Rep.、１、153〜163、1968年）。フライー（Frei,E.III）他、Cancer Chemother.Rep.、55、91〜97（1971年）も参照。更に、ブラナ（Brana）等はCancer Chemother.Pharmacol.、４、61〜66（1980年）およびEur.J.Med.、16、207〜212（1981年）に式：
（式中、ＸはＨ、NO2、NH2、Cl、OH、NHCO2Et、OCH3、NHCOCH3またはｔ−Buであり、そしてＹはジ置換アミン、OH、OCH3、CH（CH3）２、SHまたはNHCOCH3であり、そしてｎは０から３までの範囲の整数である）を有する２−および５−置換ベンズ［de］−イソキノリン−1,3−ジオンを開示している。ここに開示された化合物はヒーラー細胞を阻害すると主張されている。
ミラー（Miller）他は米国特許第4,108,896号に式：
（式中、Ａは１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキレン鎖であり;R1とR2はそれぞれ水素、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキルおよび３〜６個の炭素原子を有するアルケニル（不飽和はアルケニル基の１位以外の位置にある）からなる群から選択されるかまたはR1とR2はそれらが結合している窒素原子と一緒になってピロリジニル、ピペリジノまたはモルホリノ基を表わし;R3は水素および基、
からなる群から選択される、但し上記Ｒ基の１つはそして１つだけが水素である）を有する化合物を開示している。
これら化合物は抗ウイルス剤としての用途を有していると開示されている。
しかし乍ら、上記で考察した参照文献の教示はアントラセンおよびイソキノリン誘導体に限定されている。これら参照文献のいずれも本願発明のジベンズイソキノリン1,3−ジオンが抗腫瘍剤として有用であることもまた有効であることも示唆していない。
アモナフィド（NSC 308847）は抗腫瘍活性を有するイソキノリンジオン誘導体である。更に詳細には、アモナフィド、アミノ−Ｎ−ジメチルアミノエチルベンズ［de］−イソキノリンはその抗腫瘍活性について広範に試験されている。米国立癌研究所は1984年にアモナフィドの抗腫瘍活性を要約したパンフレットを作成しそして配付した。アモナフィドに見い出された活性値は非常に重要であったしそして重要であり続けるが、この物質は重大な欠点を有しており、そして薬剤の特性が依然として改善されなければならないことを示している。先ず第１に、アモナフィドはかなりの骨髄毒性をもたらし、該薬品の１日投与量を５回投与すると患者によっては死に至ることがある。更に、この報告書はアモナフィドがマウスの白血病モデルで中程度の活性しか有していないことを示していた。また、この報告書はアモナフィドがマウスにおける結腸、肺および乳癌のヒト腫瘍異種移植片に活性を有していないことも示した。くして、アモナフィドはかなりの活性を示したが、ネズミ腫瘍モデルでは実質的に広範囲の活性を有していない。
他の研究グループは、インビトロで主要なヒト固形腫瘍で試験したときアモナフィドまたはアゾナフィドの活性が少ないことを示した。アジャニ（Ajani）J.A.等、Invest New Drugs、６、79〜83（1988年）参照。
これまでに入手できたこれらの種々の薬品の欠陥を考慮して、本発明者はより有効な抗癌剤である他の薬品を探索した。本発明者は次の特性を有する化合物を探索した：
１）腫瘍細胞に対する高い細胞毒性能力；
２）多剤耐性（MDR）腫瘍細胞に対して交差耐性が、あるとしても、最小限；
３）正常な心臓細胞における細胞毒性能力との低い相関性；
４）悪性腫瘍、特に固形腫瘍、血液学的腫瘍および白血病に対する活性。
本発明者の研究の結果、本発明者はこれらの目的を満たす化合物を開発した。本発明者は、ナフタレンではなくてアントラセンに基づく化合物が驚くべき抗腫瘍活性を示すことを見い出した。
本発明は抗腫瘍活性を示し、抗癌剤として有用な1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズイソキノリン−1,3−ジオン誘導体に関し、特に、該誘導体の中で薬理作用の優れた化合物、即ち６−エトキシ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオン又はその非毒性塩を提供するものである。また、本発明は該化合物を有効成分とする抗癌剤を提供する。
本発明は式Ｉ
の化合物を提供する。
本発明の化合物は当該技術分野で知られている技術で製造することができる。、本発明の化合物は、下記で示すようにして式IIのアントラセン−1,9−ジカルボン酸無水物、または対応するジカルボン酸とNH2−（CH2）2N（CH3）２のアミンとの縮合によって製造することができる：
反応は、反応物質と生成物の両方に不活性の不活性溶媒中で実施され、そして両反応物質は、例えばトルエン、ベンゼン、石油エーテル、ヘキサン、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、アルコール、例えばメタノール、エタノール等に溶解させる。反応は室温から溶媒の還流温度までの温度で行うことができる。好ましい溶媒はトルエンであり、そして反応は還流温度で縮合が生起するのに十分な時間、例えば２〜24時間実施することが好ましい。
式IIの化合物の４−位がハロゲンであるとき、上記ハロゲンをエトキシドのような強い求核試薬で求核置換して製造することができる。
アントラセン−1,9−ジカルボン酸無水物（II）はまた当該技術分野で知られている技術で製造することもできる。
典型的な方法を以下に示す：
アントラセン誘導体IIは、アントラセンを塩化オキサリルで処理し、続いてE.D.ベルグマン（Bergmann）およびR.イカン（Ikan）が記載した方法、J.Org.Chem.、23、907（1958年）に従って過酸化水素で酸化し；そしてその後無水酢酸で還流して製造する。
塩基性窒素を有する本発明の化合物は有機および無機酸の両方の酸と塩を形成する。特に水性系に基づく投与形態で製薬的に許容可能な酸との塩が特に重要であり、その際塩の水溶解度が高いことが最も有利である。製薬的に許容できない酸と形成した塩も本願発明の塩基性窒素含有新規化合物の単離および生成に有用である。塩には、塩酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、マロン酸、酒石酸およびこれらに類似する酸と形成した塩が含まれる。
本願発明の化合物は、選択した投与経路、即ち、経口、腹腔内、筋肉内または皮下に適応させた種々の形態で宿主に投与することができる。
活性化合物は、例えば、不活性希釈剤または同化性食用担体を用いて経口投与することができ、または硬質若しくは軟質外皮ゼラチンカプセルに封入することができ、または圧縮して錠剤にすることができ、または食餌の食品と共に直接加えることができる。経口的治療用投与では、活性化合物を賦形剤と共に加えることができ、そして経口摂取用錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセルの形態で使用することができる。このような組成物および製剤は少なくとも0.1％の活性化合物を含有していなければならない。勿論、組成物および製剤の割合は変動させることができ、そして好都合には単位重量の約２から約60％の間であることができる。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は適当な投与量が得られるようなものである。本願発明に従う好ましい組成物または製剤は、経口投与単位形態が約50から300mgの間の活性化合物を含有するように調製される。
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等は次のものも含有することができる；トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤を添加することができ、またはペパーミント、冬緑油またはチェリー風味のような香味剤を添加することができる。投与単位形態がカプセルであるとき、カプセルは上記タイプの材料に加えて液体担体を含有することができる。被覆物としてかまたはそうでない場合には投与単位の物理的形態を修正するために他の種々の材料が存在することができる。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルをセラック、糖またはその両方で被覆することができる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラペン、着色剤並びにチェリーまたはオレンジ風味のような香味剤を含有することができる。勿論、任意の投与単位形態を製造する際に使用される材料は製薬的に純粋で且つ使用される量で実質的に非毒性でなければならない。更に、活性化合物は放出持続製剤および処方剤中に加えることができる。
活性化合物はまた非経口または腹腔内投与することもできる。遊離塩基または製薬的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液はヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水中で製造することができる。分散液はグリセリン、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中並びに油中で製造することもできる。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を阻止するために保存剤を含有する。
注射用途に適する製薬形態には、注射用無菌溶液または分散液を即座に調製するための無菌水溶液または分散液および無菌粉末が含まれる。全ての場合において、上記形態は無菌でなければならずそして容易に注射できる程度に流体でなければならない。該形態は製造および貯蔵条件下で安定であり、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は溶媒または分散媒体であることができ、これらには例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、並びに植物油が含まれる。適当な流動性は、例えば、レシチンのような被覆物を使用し、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持し、そして界面活性剤を使用して維持することができる。微生物の作用の阻止は種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラペン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、メチロサール等によってもたらすことができる。多くの場合に、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含有することが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用して生じさせることができる。
注射用無菌溶液は、必要に応じて、上記で明記した種々の他の成分と共に必要量の活性化合物を適用な溶媒中に入れ、続いて無菌ろ過して調製する。一般に、分散液は種々の無菌活性成分を、基本的な分散媒体および上記で明記した他の必要成分を含有する無菌媒体中に入れて調製する。注射用無菌溶液調製用の無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、そしてこれらの技術によって、活性成分に所望の追加的成分を加え予め無菌ろ過した溶液からそれらの粉末が得られる。
以下の実施例及び参考例は本発明を更に説明するものである。これらの実施例及び参考例は単に説明するためだけに提供するものであり；それ故、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
以下の実施例及び参考例で、化合物の名称の後の番号は化合物番号である。
参考例１
２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−７−メトキシ−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオン（20）
25mlの無水メタノールに溶かした50mg（0.142mmol）の７−クロロ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオンと16.2mg（0.3mmol）の新規作製のナトリウムメトキシドとの混合液を室温で24時間撹はんした。反応混合物を数滴の氷酢酸で処理し、溶媒を40−50℃で蒸発乾燥させ、その残留物を溶媒としてトルエン−メタノール（9:1）混合物を使うシリカゲルの分取薄層クロマトグラフィーで分離して、トルエン−ヘキサン（1:5）の混合物から結晶化し冷蔵庫で一晩冷却後、融点147−149℃（分解）の赤色の針状晶に結晶化して43mg（87％）の標記化合物を得、下記分析値を示した：
1H NMR（CDCl3,TS）,ppm.δ値
δ2.40（s,6,NCH3）,2.62−2.78（t,2,CH2N）,4.22（s,3,OCH3）,4.33−4.48（t,2,CONCH2）,7.50−8.85（m,3,H−５＋Ｈ−９＋Ｈ−10）,8.36−8.44（d,1,H−８）,8.56−8.65（d,1,H−４）,8.65−8.74（d,1,H−６）,9.95−10.05（d,1,H−11）
実施例１
２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−６−エトキシ−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）イソキノリン−1,3−ジオン（56）
33mlの無水エタノール中の150mg（0.425mmol）の６−クロロ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）イソキノリン−1,3−ジオンと63mg（0.926mmol）の新たに作製したナトリウムエトキシドとの混合物を、還流下で６時間加熱した。溶媒を蒸発乾燥し、その残留物を、溶媒としてトルエン−メタノール（9:1）を使うシリカゲルの分取薄層クロマトグラフィーでクロマトグラフ分離して、93mg（60％）の標記化合物を得、ヘキサンから結晶化し、融点140−141℃及び下記分析値を与えた：
1H NMR（CDCl3,TS）,ppm.δ値
δ1.64−1.70（t,3,CH3）,2.41（s,6,NCH3）,2.68−2.74（t,2,CH2N）,4.32−4.43（m,4,CONCH2＋OCH2）,6.84−6.87（d,1,H−５）,7.56−7.62（t,1,H−９）,7.76−7.83（t,1,H−10）,8.06−8.09（d,1,H−８）,8.59−8.62（d,1,H−４）,9.08（s,1,H−７）,9.94−9.98（d,1,H−11）
本発明の化合物は抗腫瘍剤として有用である。例えば、本発明の化合物は、悪性腫瘍、特に固形腫瘍及び白血病に対して効き目がある。それらはまた、血液腫瘍にも効果がある。本発明の化合物は、乳癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、肺癌、悪性癌、肉腫、及び他の固形及び血液癌に効果がある。
本発明の化合物を、種々のモデル系において抗腫瘍活性について試験した。
それらのモデルには下記のものが含まれる：
１）ネズミとヒトの腫瘍細胞系及び発生したばかりの（fresh）ヒトの腫瘍に関するソフト寒天での生体外腫瘍コロニー形成検定。
２）MTT染料を利用する生体外腫瘍細胞の生存能力の検定。
３）SBS染料を使用する生体外腫瘍細胞の生存能力の検定。
４）固形の側腹部腫瘍もしくは腹膜に血液の悪性疾患をもつマウスでの生体内生き残り調査。
例えば、本願発明の化合物は、クローン化したヒトの結腸悪性癌における細胞毒活性について評価した。クローン原性の検定は、以降に記載の手順に従い実行した：
１）ソフト寒天でのコロニー形成検定：ヒト又はネズミの発生したばかりの腫瘍は、機械的、低浸透圧的及び／又は酵素的（トリプシン）方法を使って単一の細胞懸濁に成分分けする。単一細胞（約５×104−105）は、５−10％vol/volの熱不活性化したウシ胎児の血清、溶解した0.3％の寒天及び薬剤（100ug/mL）を含有する成長培地に溶解した0.3％寒天の1mlの「支持細胞層」上の35mmプラスチック製ペトリ皿で培養する。薬剤露出は、１時間もしくは連続的に実行してよい（薬剤は最終培養培地に添加）。腫瘍細胞のコロニー（サイズ＞60uM）は、37℃に維持され加湿された５−10％のCO2環境での10−20日の保温後、自動画像解析により計数する。コロニー形成の阻害率は、コントロール（未処理の）プレート（ここではプレート当たり数百のコロニー成長が典型的である）との比較に基づいて計算する。（Salmon SE,等、N Engl J Med 298（24）:1321−1327,1978）。
本発明の化合物は、腫瘍細胞の感受性に関するそれらの生体外活性及び標準抗癌剤に対する耐性について試験した。このプロトコルに用いた腫瘍細胞系は、8226ヒト骨髄腫1;8226/Dox−402、Ｌ−1210/ネズミ白血病、多重薬剤耐性Ｌ−210/3、2780ヒト卵巣癌及び2780/AD4。
これら耐性細胞系の各々は、多重薬剤耐性（multidrug resistant）の即ち“MDR"細胞系として知られている。これらの細胞系は、活性薬剤の流出ポンプとして作用するＰ−糖タンパク質（ｐ−glycoprotein）と呼ばれる分子量170,00の膜タンパク質を生成する。このように、細胞がＰ−糖タンパク質を一度生成してしまえば、それは細胞から多種多様の関連のない天然生成物を排出する能力を持つことになる。これらには、いくつかの我々の最も活性な標準抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビジン（アドリアマイシン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンとビンブラスチン）及びその他のDNA結合剤、例えば、アクチノマイシンＤとダウノマイシン、がある。本願発明の化合物を効き目を測定するプロトコルは、次の通りである：
２）MTT染料を使用する生体外腫瘍細胞の生存能力の検定：
検定は、Heo等によってCancer Research,1990,50,3681−3690に記述された手順に従い実行する。腫瘍は、上述のように、単一の細胞懸濁に加工する。細胞は、プラスチック製の96−ウエルのプレートに３−５×104/1mL wellの濃度でのせる。５−10％vol/volの熱不活性化したウシ胎児の血清と薬剤（100ug/mL）を含有する成長培地を添加して、37℃で６日間保温する。その後、薬剤含有の培地を除去し、その細胞を新規の培地もしくはリン酸塩緩衝塩水（pH7.4）で遠心分離して“洗浄”する。次いで、テトラゾリウム染料（3,4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニル テトラゾリウムの臭化物（MTT）を添加する。この染料は、生菌細胞中のミトコンドリアのレダクターゼによる活性化で着色したホルマザン生成物を形成する。典型的には、酸性プロパノールもしくはDMSOに可溶化される。色の強さは、生存能力のある細胞数に比例し、これは、微小ELISAの
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1Matsuoka,Y.等、Proc Soc Exptl.Biol.Med.,125,1246−1250（1967）．
2Dalton,W.S.等、Cancer Research,46,5125−5130（1986）．
3Doprr,等、Biochem.Pharmacol.,36,3115−3120（1980）．
4Rogan A.M.,等、Science,224,994−996（1984）．
プレートリーダ上の分光測光吸光度（570nM）で定量化される。試験結果は、未処理の腫瘍細胞によるコントロールの吸光度％で校正する（Mossman T:J.Immunol Meth 65:55−63,1983）。
この検定方法を用いて本発明の実施例１に記載する化合物（56）及び該化合物と構造式が最も類似する参考例１に記載する公知の化合物（20）に対する種々の腫瘍細胞系に関する細胞毒活性について試験した。その結果を下記の表に示す。
マウスネズミモデルにおける本発明の化合物の生体内抗腫瘍活性を検討した。
４）腫瘍をもつマウスの生き残り調査：
3.1 Ｐ−388白血病モデル：最初は米国菌培養採集所（Rockville,MD）から入手した1,000,000個の白血病細胞を成熟したDBA−2Jの雄のマウス（Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME）の腹膜に植え付ける。24時間後、生理的食塩水に希釈した薬剤を10g体重当たり0.1mLの分量で腹膜腔内注射により注入する。その後、マウス（10匹／グループ）の生存数を毎日追跡し、腫瘍をもつ未処理のマウスと比較する。生存数の結果は、未処理のコントロールに対する寿命増率に変換する（Geran RI等、Cancer Chemo Rep.,3,1−10,1972）。
Ｐ−388/アドリアマイシン耐性細胞:Dr.Randall Johnsonn（Johnson RK等、Cancer Treat Rep 62,1535−1547,1978）により生体内で発生させ且つ供給された多重薬剤耐性のＰ−388細胞に対するこれらの調査に関しては、上記と同じプロトコルを用いた。
コロン−38:新たに得た生存能力のあるコロン−38の悪性腺癌の試験片20−30mgをC57/B1の成熟マウスの左前側腹部に注入する。これらの腫瘍を３日間成長させる。接種後３日と６日に、薬剤を10g体重当たり0.1mLの分量で腹膜腔内注射により注入する。腫瘍の垂直幅を１週間毎にカリパスでスライスして測定し、次式に従って見積った腫瘍質量に変換する：
ｌ×W2/2＝腫瘍質量、
ここで、
Ｗ＝腫瘍幅
ｌ＝腫瘍の長さ。
腫瘍の成長遅延は、処理マウスの腫瘍が未処理のコントロールのそれに比べて見積質量750mgもしくは1.5gに到達する日数差として計算する：
750mgに到達する日数（処理済み−コントロール）＝腫瘍成長遅延日数
Corbett,T.H.等、Cancer Chemo Rep.,5（1975）。乳腺の−Ｃ悪性腺癌及びM5−76肉腫：腫瘍の塊（20−50mg）をB6C3F1の雌マウスの側腹部に植え付ける。薬剤（10−45mg/kg）を塩水に溶解し、腫瘍植え付け後１日から出発して４日毎に３回腹膜腔内注射により注入する。腫瘍は、上述のように２次元的に測定し、腫瘍成長遅延は、1.5と3.0に到達する時間で計算する。
生体外心臓毒性法
この検定は、Cancer Research,1988,48,5222−5227に記載されたDorr他の方法に従って実行する。１−２日老けたSprague−Dawleyラットからの心臓を、1mm2の断片に細かく刻む。それから、0.24％トリプシンによる連続的な加水分解によって細胞懸濁を作製した。加水分解物を採集し、プールし、LiebovitzのM3培地で２回洗浄し、高速繊維芽細胞付着用の150cm2培養フラスコ当たり３−４×107個の細胞をプレートにのせた。２時間後、得られたミオサイトの富んだ懸濁液を洗い流し、24ウエルのPrimariaプレートに約１×106細胞／ウエルの濃度でのせた。プレーティング後３日は、M3培地にある薬剤をミオサイトの培養に0.1乃至10ug/mL（0.18乃至18um）の濃度で６時間添加した。その時間の終了時、細胞をM3培地と共に３回濯ぎ、遊離薬剤を除去する。新鮮な培地を細胞に添加し、５％のCO2インキュベーター内で37℃−３日間保温する。
その後、単核細胞を収穫する。細胞をリン酸緩衝塩水で濯ぎ、５％トリクロロ酢酸を各ウエルに添加して細胞を溶解しATPを抽出する。沈澱したタンパク質を0.5N NaOHに溶かした0.1％トリトンＸ−100で可溶化した。ATPのレベルは、標準のホタルルシフェリン−ルシフェラーゼの生物発光検定を使って、測光的に測定した。
タンパク質含有量は、標準として細胞可溶化溶液に溶解したウシの血清アルブミンを用いるBio−Rad法を使って決定した。
薬剤処理で生ずるARP/タンパク質比を計算し、未処理の（コントロール）プレートと比較した。ミオサイトの細胞毒性（心臓毒性）は、薬剤処理で生ずるATP/タンパク質比についてのコントロールのパーセントと定義する。
その結果を下記に示す。
化合物 心臓毒性
20 10
56 2.2
上記記載の試験データから明らかなように、本発明の実施例１に記載する６−エトキシ化合物（56）は、該化合物と構造式が最も類似する参考例１に記載する公知のメトキシ化合物に比べて、哺乳動物に対する心臓毒性が約５倍も少ない。その上に、RL1210腫瘍セルラインに関しては、メトキシ化合物のIC50値の値はエトキシ化合物のIC50値の値の約1.5倍以上であり、L1210腫瘍セルラインに関しては、メトキシ化合物のIC50値の値はエトキシ化合物のIC50値の値の約２倍以上である。これら試験データは、エトキシとメトキシは同じ低級アルコキシ基であり、その炭素数も１しか違わないにもかかわらず、本発明の実施例１に記載するエトキシ誘導体が参考例１に記載する公知のメトキシ誘導体に比べて顕著に優れた薬理効果を奏し得たことを示し、これらの薬理効果が当業者の予測を越えた顕著に優れたものであることを立証している。
抗腫瘍活性を示す化合物の最近の研究には、アントラセン誘導体のような融合環構造、並びにイソキノリンおよびアクリジンのような複素環が含まれている。有望性を示す第１のアントラセン誘導体は2,2'−（9,10−アントラセン−ジメチレン）ビス−（２−チオプソイドウレア）−ジヒドロクロリドであり、この誘導体は残念にも光毒性を有していた（米国特許第3,190,795号およびCarter、Cancer Chemother.Rep.、１、153〜163、1968年）。フライー（Frei,E.III）他、Cancer Chemother.Rep.、55、91〜97（1971年）も参照。更に、ブラナ（Brana）等はCancer Chemother.Pharmacol.、４、61〜66（1980年）およびEur.J.Med.、16、207〜212（1981年）に式：
ミラー（Miller）他は米国特許第4,108,896号に式：
これら化合物は抗ウイルス剤としての用途を有していると開示されている。
しかし乍ら、上記で考察した参照文献の教示はアントラセンおよびイソキノリン誘導体に限定されている。これら参照文献のいずれも本願発明のジベンズイソキノリン1,3−ジオンが抗腫瘍剤として有用であることもまた有効であることも示唆していない。
アモナフィド（NSC 308847）は抗腫瘍活性を有するイソキノリンジオン誘導体である。更に詳細には、アモナフィド、アミノ−Ｎ−ジメチルアミノエチルベンズ［de］−イソキノリンはその抗腫瘍活性について広範に試験されている。米国立癌研究所は1984年にアモナフィドの抗腫瘍活性を要約したパンフレットを作成しそして配付した。アモナフィドに見い出された活性値は非常に重要であったしそして重要であり続けるが、この物質は重大な欠点を有しており、そして薬剤の特性が依然として改善されなければならないことを示している。先ず第１に、アモナフィドはかなりの骨髄毒性をもたらし、該薬品の１日投与量を５回投与すると患者によっては死に至ることがある。更に、この報告書はアモナフィドがマウスの白血病モデルで中程度の活性しか有していないことを示していた。また、この報告書はアモナフィドがマウスにおける結腸、肺および乳癌のヒト腫瘍異種移植片に活性を有していないことも示した。くして、アモナフィドはかなりの活性を示したが、ネズミ腫瘍モデルでは実質的に広範囲の活性を有していない。
他の研究グループは、インビトロで主要なヒト固形腫瘍で試験したときアモナフィドまたはアゾナフィドの活性が少ないことを示した。アジャニ（Ajani）J.A.等、Invest New Drugs、６、79〜83（1988年）参照。
これまでに入手できたこれらの種々の薬品の欠陥を考慮して、本発明者はより有効な抗癌剤である他の薬品を探索した。本発明者は次の特性を有する化合物を探索した：
１）腫瘍細胞に対する高い細胞毒性能力；
２）多剤耐性（MDR）腫瘍細胞に対して交差耐性が、あるとしても、最小限；
３）正常な心臓細胞における細胞毒性能力との低い相関性；
４）悪性腫瘍、特に固形腫瘍、血液学的腫瘍および白血病に対する活性。
本発明者の研究の結果、本発明者はこれらの目的を満たす化合物を開発した。本発明者は、ナフタレンではなくてアントラセンに基づく化合物が驚くべき抗腫瘍活性を示すことを見い出した。
本発明は抗腫瘍活性を示し、抗癌剤として有用な1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズイソキノリン−1,3−ジオン誘導体に関し、特に、該誘導体の中で薬理作用の優れた化合物、即ち６−エトキシ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオン又はその非毒性塩を提供するものである。また、本発明は該化合物を有効成分とする抗癌剤を提供する。
本発明は式Ｉ
本発明の化合物は当該技術分野で知られている技術で製造することができる。、本発明の化合物は、下記で示すようにして式IIのアントラセン−1,9−ジカルボン酸無水物、または対応するジカルボン酸とNH2−（CH2）2N（CH3）２のアミンとの縮合によって製造することができる：
式IIの化合物の４−位がハロゲンであるとき、上記ハロゲンをエトキシドのような強い求核試薬で求核置換して製造することができる。
アントラセン−1,9−ジカルボン酸無水物（II）はまた当該技術分野で知られている技術で製造することもできる。
典型的な方法を以下に示す：
塩基性窒素を有する本発明の化合物は有機および無機酸の両方の酸と塩を形成する。特に水性系に基づく投与形態で製薬的に許容可能な酸との塩が特に重要であり、その際塩の水溶解度が高いことが最も有利である。製薬的に許容できない酸と形成した塩も本願発明の塩基性窒素含有新規化合物の単離および生成に有用である。塩には、塩酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、マロン酸、酒石酸およびこれらに類似する酸と形成した塩が含まれる。
本願発明の化合物は、選択した投与経路、即ち、経口、腹腔内、筋肉内または皮下に適応させた種々の形態で宿主に投与することができる。
活性化合物は、例えば、不活性希釈剤または同化性食用担体を用いて経口投与することができ、または硬質若しくは軟質外皮ゼラチンカプセルに封入することができ、または圧縮して錠剤にすることができ、または食餌の食品と共に直接加えることができる。経口的治療用投与では、活性化合物を賦形剤と共に加えることができ、そして経口摂取用錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセルの形態で使用することができる。このような組成物および製剤は少なくとも0.1％の活性化合物を含有していなければならない。勿論、組成物および製剤の割合は変動させることができ、そして好都合には単位重量の約２から約60％の間であることができる。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は適当な投与量が得られるようなものである。本願発明に従う好ましい組成物または製剤は、経口投与単位形態が約50から300mgの間の活性化合物を含有するように調製される。
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等は次のものも含有することができる；トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤を添加することができ、またはペパーミント、冬緑油またはチェリー風味のような香味剤を添加することができる。投与単位形態がカプセルであるとき、カプセルは上記タイプの材料に加えて液体担体を含有することができる。被覆物としてかまたはそうでない場合には投与単位の物理的形態を修正するために他の種々の材料が存在することができる。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルをセラック、糖またはその両方で被覆することができる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラペン、着色剤並びにチェリーまたはオレンジ風味のような香味剤を含有することができる。勿論、任意の投与単位形態を製造する際に使用される材料は製薬的に純粋で且つ使用される量で実質的に非毒性でなければならない。更に、活性化合物は放出持続製剤および処方剤中に加えることができる。
活性化合物はまた非経口または腹腔内投与することもできる。遊離塩基または製薬的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液はヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水中で製造することができる。分散液はグリセリン、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中並びに油中で製造することもできる。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を阻止するために保存剤を含有する。
注射用途に適する製薬形態には、注射用無菌溶液または分散液を即座に調製するための無菌水溶液または分散液および無菌粉末が含まれる。全ての場合において、上記形態は無菌でなければならずそして容易に注射できる程度に流体でなければならない。該形態は製造および貯蔵条件下で安定であり、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は溶媒または分散媒体であることができ、これらには例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、並びに植物油が含まれる。適当な流動性は、例えば、レシチンのような被覆物を使用し、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持し、そして界面活性剤を使用して維持することができる。微生物の作用の阻止は種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラペン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、メチロサール等によってもたらすことができる。多くの場合に、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含有することが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用して生じさせることができる。
注射用無菌溶液は、必要に応じて、上記で明記した種々の他の成分と共に必要量の活性化合物を適用な溶媒中に入れ、続いて無菌ろ過して調製する。一般に、分散液は種々の無菌活性成分を、基本的な分散媒体および上記で明記した他の必要成分を含有する無菌媒体中に入れて調製する。注射用無菌溶液調製用の無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、そしてこれらの技術によって、活性成分に所望の追加的成分を加え予め無菌ろ過した溶液からそれらの粉末が得られる。
以下の実施例及び参考例は本発明を更に説明するものである。これらの実施例及び参考例は単に説明するためだけに提供するものであり；それ故、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
以下の実施例及び参考例で、化合物の名称の後の番号は化合物番号である。
参考例１
２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−７−メトキシ−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオン（20）
25mlの無水メタノールに溶かした50mg（0.142mmol）の７−クロロ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオンと16.2mg（0.3mmol）の新規作製のナトリウムメトキシドとの混合液を室温で24時間撹はんした。反応混合物を数滴の氷酢酸で処理し、溶媒を40−50℃で蒸発乾燥させ、その残留物を溶媒としてトルエン−メタノール（9:1）混合物を使うシリカゲルの分取薄層クロマトグラフィーで分離して、トルエン−ヘキサン（1:5）の混合物から結晶化し冷蔵庫で一晩冷却後、融点147−149℃（分解）の赤色の針状晶に結晶化して43mg（87％）の標記化合物を得、下記分析値を示した：
1H NMR（CDCl3,TS）,ppm.δ値
δ2.40（s,6,NCH3）,2.62−2.78（t,2,CH2N）,4.22（s,3,OCH3）,4.33−4.48（t,2,CONCH2）,7.50−8.85（m,3,H−５＋Ｈ−９＋Ｈ−10）,8.36−8.44（d,1,H−８）,8.56−8.65（d,1,H−４）,8.65−8.74（d,1,H−６）,9.95−10.05（d,1,H−11）
実施例１
２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−６−エトキシ−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）イソキノリン−1,3−ジオン（56）
33mlの無水エタノール中の150mg（0.425mmol）の６−クロロ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）イソキノリン−1,3−ジオンと63mg（0.926mmol）の新たに作製したナトリウムエトキシドとの混合物を、還流下で６時間加熱した。溶媒を蒸発乾燥し、その残留物を、溶媒としてトルエン−メタノール（9:1）を使うシリカゲルの分取薄層クロマトグラフィーでクロマトグラフ分離して、93mg（60％）の標記化合物を得、ヘキサンから結晶化し、融点140−141℃及び下記分析値を与えた：
1H NMR（CDCl3,TS）,ppm.δ値
δ1.64−1.70（t,3,CH3）,2.41（s,6,NCH3）,2.68−2.74（t,2,CH2N）,4.32−4.43（m,4,CONCH2＋OCH2）,6.84−6.87（d,1,H−５）,7.56−7.62（t,1,H−９）,7.76−7.83（t,1,H−10）,8.06−8.09（d,1,H−８）,8.59−8.62（d,1,H−４）,9.08（s,1,H−７）,9.94−9.98（d,1,H−11）
本発明の化合物は抗腫瘍剤として有用である。例えば、本発明の化合物は、悪性腫瘍、特に固形腫瘍及び白血病に対して効き目がある。それらはまた、血液腫瘍にも効果がある。本発明の化合物は、乳癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、肺癌、悪性癌、肉腫、及び他の固形及び血液癌に効果がある。
本発明の化合物を、種々のモデル系において抗腫瘍活性について試験した。
それらのモデルには下記のものが含まれる：
１）ネズミとヒトの腫瘍細胞系及び発生したばかりの（fresh）ヒトの腫瘍に関するソフト寒天での生体外腫瘍コロニー形成検定。
２）MTT染料を利用する生体外腫瘍細胞の生存能力の検定。
３）SBS染料を使用する生体外腫瘍細胞の生存能力の検定。
４）固形の側腹部腫瘍もしくは腹膜に血液の悪性疾患をもつマウスでの生体内生き残り調査。
例えば、本願発明の化合物は、クローン化したヒトの結腸悪性癌における細胞毒活性について評価した。クローン原性の検定は、以降に記載の手順に従い実行した：
１）ソフト寒天でのコロニー形成検定：ヒト又はネズミの発生したばかりの腫瘍は、機械的、低浸透圧的及び／又は酵素的（トリプシン）方法を使って単一の細胞懸濁に成分分けする。単一細胞（約５×104−105）は、５−10％vol/volの熱不活性化したウシ胎児の血清、溶解した0.3％の寒天及び薬剤（100ug/mL）を含有する成長培地に溶解した0.3％寒天の1mlの「支持細胞層」上の35mmプラスチック製ペトリ皿で培養する。薬剤露出は、１時間もしくは連続的に実行してよい（薬剤は最終培養培地に添加）。腫瘍細胞のコロニー（サイズ＞60uM）は、37℃に維持され加湿された５−10％のCO2環境での10−20日の保温後、自動画像解析により計数する。コロニー形成の阻害率は、コントロール（未処理の）プレート（ここではプレート当たり数百のコロニー成長が典型的である）との比較に基づいて計算する。（Salmon SE,等、N Engl J Med 298（24）:1321−1327,1978）。
本発明の化合物は、腫瘍細胞の感受性に関するそれらの生体外活性及び標準抗癌剤に対する耐性について試験した。このプロトコルに用いた腫瘍細胞系は、8226ヒト骨髄腫1;8226/Dox−402、Ｌ−1210/ネズミ白血病、多重薬剤耐性Ｌ−210/3、2780ヒト卵巣癌及び2780/AD4。
これら耐性細胞系の各々は、多重薬剤耐性（multidrug resistant）の即ち“MDR"細胞系として知られている。これらの細胞系は、活性薬剤の流出ポンプとして作用するＰ−糖タンパク質（ｐ−glycoprotein）と呼ばれる分子量170,00の膜タンパク質を生成する。このように、細胞がＰ−糖タンパク質を一度生成してしまえば、それは細胞から多種多様の関連のない天然生成物を排出する能力を持つことになる。これらには、いくつかの我々の最も活性な標準抗腫瘍剤、例えば、ドキソルビジン（アドリアマイシン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンとビンブラスチン）及びその他のDNA結合剤、例えば、アクチノマイシンＤとダウノマイシン、がある。本願発明の化合物を効き目を測定するプロトコルは、次の通りである：
２）MTT染料を使用する生体外腫瘍細胞の生存能力の検定：
検定は、Heo等によってCancer Research,1990,50,3681−3690に記述された手順に従い実行する。腫瘍は、上述のように、単一の細胞懸濁に加工する。細胞は、プラスチック製の96−ウエルのプレートに３−５×104/1mL wellの濃度でのせる。５−10％vol/volの熱不活性化したウシ胎児の血清と薬剤（100ug/mL）を含有する成長培地を添加して、37℃で６日間保温する。その後、薬剤含有の培地を除去し、その細胞を新規の培地もしくはリン酸塩緩衝塩水（pH7.4）で遠心分離して“洗浄”する。次いで、テトラゾリウム染料（3,4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニル テトラゾリウムの臭化物（MTT）を添加する。この染料は、生菌細胞中のミトコンドリアのレダクターゼによる活性化で着色したホルマザン生成物を形成する。典型的には、酸性プロパノールもしくはDMSOに可溶化される。色の強さは、生存能力のある細胞数に比例し、これは、微小ELISAの
−−−−−−−−−−
1Matsuoka,Y.等、Proc Soc Exptl.Biol.Med.,125,1246−1250（1967）．
2Dalton,W.S.等、Cancer Research,46,5125−5130（1986）．
3Doprr,等、Biochem.Pharmacol.,36,3115−3120（1980）．
4Rogan A.M.,等、Science,224,994−996（1984）．
プレートリーダ上の分光測光吸光度（570nM）で定量化される。試験結果は、未処理の腫瘍細胞によるコントロールの吸光度％で校正する（Mossman T:J.Immunol Meth 65:55−63,1983）。
この検定方法を用いて本発明の実施例１に記載する化合物（56）及び該化合物と構造式が最も類似する参考例１に記載する公知の化合物（20）に対する種々の腫瘍細胞系に関する細胞毒活性について試験した。その結果を下記の表に示す。
４）腫瘍をもつマウスの生き残り調査：
3.1 Ｐ−388白血病モデル：最初は米国菌培養採集所（Rockville,MD）から入手した1,000,000個の白血病細胞を成熟したDBA−2Jの雄のマウス（Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME）の腹膜に植え付ける。24時間後、生理的食塩水に希釈した薬剤を10g体重当たり0.1mLの分量で腹膜腔内注射により注入する。その後、マウス（10匹／グループ）の生存数を毎日追跡し、腫瘍をもつ未処理のマウスと比較する。生存数の結果は、未処理のコントロールに対する寿命増率に変換する（Geran RI等、Cancer Chemo Rep.,3,1−10,1972）。
Ｐ−388/アドリアマイシン耐性細胞:Dr.Randall Johnsonn（Johnson RK等、Cancer Treat Rep 62,1535−1547,1978）により生体内で発生させ且つ供給された多重薬剤耐性のＰ−388細胞に対するこれらの調査に関しては、上記と同じプロトコルを用いた。
コロン−38:新たに得た生存能力のあるコロン−38の悪性腺癌の試験片20−30mgをC57/B1の成熟マウスの左前側腹部に注入する。これらの腫瘍を３日間成長させる。接種後３日と６日に、薬剤を10g体重当たり0.1mLの分量で腹膜腔内注射により注入する。腫瘍の垂直幅を１週間毎にカリパスでスライスして測定し、次式に従って見積った腫瘍質量に変換する：
ｌ×W2/2＝腫瘍質量、
ここで、
Ｗ＝腫瘍幅
ｌ＝腫瘍の長さ。
腫瘍の成長遅延は、処理マウスの腫瘍が未処理のコントロールのそれに比べて見積質量750mgもしくは1.5gに到達する日数差として計算する：
750mgに到達する日数（処理済み−コントロール）＝腫瘍成長遅延日数
Corbett,T.H.等、Cancer Chemo Rep.,5（1975）。乳腺の−Ｃ悪性腺癌及びM5−76肉腫：腫瘍の塊（20−50mg）をB6C3F1の雌マウスの側腹部に植え付ける。薬剤（10−45mg/kg）を塩水に溶解し、腫瘍植え付け後１日から出発して４日毎に３回腹膜腔内注射により注入する。腫瘍は、上述のように２次元的に測定し、腫瘍成長遅延は、1.5と3.0に到達する時間で計算する。
生体外心臓毒性法
この検定は、Cancer Research,1988,48,5222−5227に記載されたDorr他の方法に従って実行する。１−２日老けたSprague−Dawleyラットからの心臓を、1mm2の断片に細かく刻む。それから、0.24％トリプシンによる連続的な加水分解によって細胞懸濁を作製した。加水分解物を採集し、プールし、LiebovitzのM3培地で２回洗浄し、高速繊維芽細胞付着用の150cm2培養フラスコ当たり３−４×107個の細胞をプレートにのせた。２時間後、得られたミオサイトの富んだ懸濁液を洗い流し、24ウエルのPrimariaプレートに約１×106細胞／ウエルの濃度でのせた。プレーティング後３日は、M3培地にある薬剤をミオサイトの培養に0.1乃至10ug/mL（0.18乃至18um）の濃度で６時間添加した。その時間の終了時、細胞をM3培地と共に３回濯ぎ、遊離薬剤を除去する。新鮮な培地を細胞に添加し、５％のCO2インキュベーター内で37℃−３日間保温する。
その後、単核細胞を収穫する。細胞をリン酸緩衝塩水で濯ぎ、５％トリクロロ酢酸を各ウエルに添加して細胞を溶解しATPを抽出する。沈澱したタンパク質を0.5N NaOHに溶かした0.1％トリトンＸ−100で可溶化した。ATPのレベルは、標準のホタルルシフェリン−ルシフェラーゼの生物発光検定を使って、測光的に測定した。
タンパク質含有量は、標準として細胞可溶化溶液に溶解したウシの血清アルブミンを用いるBio−Rad法を使って決定した。
薬剤処理で生ずるARP/タンパク質比を計算し、未処理の（コントロール）プレートと比較した。ミオサイトの細胞毒性（心臓毒性）は、薬剤処理で生ずるATP/タンパク質比についてのコントロールのパーセントと定義する。
その結果を下記に示す。
化合物 心臓毒性
20 10
56 2.2
上記記載の試験データから明らかなように、本発明の実施例１に記載する６−エトキシ化合物（56）は、該化合物と構造式が最も類似する参考例１に記載する公知のメトキシ化合物に比べて、哺乳動物に対する心臓毒性が約５倍も少ない。その上に、RL1210腫瘍セルラインに関しては、メトキシ化合物のIC50値の値はエトキシ化合物のIC50値の値の約1.5倍以上であり、L1210腫瘍セルラインに関しては、メトキシ化合物のIC50値の値はエトキシ化合物のIC50値の値の約２倍以上である。これら試験データは、エトキシとメトキシは同じ低級アルコキシ基であり、その炭素数も１しか違わないにもかかわらず、本発明の実施例１に記載するエトキシ誘導体が参考例１に記載する公知のメトキシ誘導体に比べて顕著に優れた薬理効果を奏し得たことを示し、これらの薬理効果が当業者の予測を越えた顕著に優れたものであることを立証している。
Claims (2)
- ６−エトキシ−２−［2'−（ジメチルアミノ）エチル］−1,2−ジヒドロ−3H−ジベンズ（deh）−イソキノリン−1,3−ジオン又はその非毒性塩。
- 請求項１記載の化合物を有効成分とする抗癌剤。
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