JP3505978B2

JP3505978B2 - バイオセンサ

Info

Publication number: JP3505978B2
Application number: JP27996097A
Authority: JP
Inventors: 正男後藤
Original assignee: Nok Corp
Current assignee: Nok Corp
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2004-03-15
Anticipated expiration: 2017-09-26
Also published as: JPH11101772A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バイオセンサに関
する。更に詳しくは、センサ感度を向上せしめたバイオ
センサに関する。

【０００２】

【従来の技術】バイオセンサ、特に使い捨てのバイオセ
ンサにおいては、電極部が基板貼付けタイプの金属箔、
例えばパラジウム箔であったり、スクリーン印刷法によ
りカーボンペーストから形成されたものであったりする
が、これらの電極を用いたバイオセンサは感度が低いと
いう問題がみられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、絶縁
性基板上に形成したスクリーン印刷法カーボン電極上に
酵素-電子伝達体混合物層を更に形成させたバイオセン
サにおいて、センサ感度を向上せしめたものを提供する
ことにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
上記バイオセンサのカーボン電極がアセチレンブラック
-グラファイト(重量比1:2.5〜5.5)混合物よりなるカー
ボンペーストから形成され、少くとも作用極がグルタル
アルデヒドで表面処理されたものよって達成される。

【０００５】

【発明の実施の形態】セラミックス、ガラス、プラスチ
ック、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリエス
テル等)などの絶縁性基板１上には、バイオセンサ用電
極を構成する作用極および対極あるいは作用極、対極お
よび参照極が設けられる。作用極２、対極３および参照
極リードは、スクリーン印刷法カーボン、好ましくは表
面研磨されたスクリーン印刷法カーボンから形成され、
参照極は参照極リード上にスクリーン印刷法、蒸着法、
スパッタリング法、フィルム貼付け法などによって一旦
銀電極を形成させた後、定電流電解する方法あるいは塩
化第２鉄水溶液中に浸漬する方法、更にはスクリーン印
刷法によって塩化銀を塗布、積層させる方法などによっ
て形成される。その後、各電極の中央部分が樹脂製絶縁
膜４などによって被覆される。なお、参照極を設けない
２電極構造のものとすることもできる。[図1(a)参照]

【０００６】一般に、作用極２上および対極上３には酸
化還元酵素および電子伝達体の混合物層５の形成が行わ
れ、参照極を設けた場合にはその上にも混合物層の形成
が行われる。酸化還元酵素としてはグルコースオキシダ
ーゼ(GOD)、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダー
ゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシ
ダーゼ等が、また電子伝達体としてはフェリシアン化カ
リウム、パラベンゾキノン、フェロセン等が一般に用い
られる。

【０００７】グルコースがGODの作用により酵素の存在
下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき
発生するH₂O₂を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値
を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求め
る方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希釈
されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素
濃度に律速されるため、グルコース濃度が約100mg/dl程
度迄しか直線検量範囲を示さない。そして、例えば使い
捨てグルコースバイオセンサなどにあっては、多くの場
合原液サンプルについての測定が行われる。

【０００８】そこで、溶液中濃度が有限である酸素の代
わりに、電子伝達体(メディエータ)がGOD等と共に用い
られる。メディエータがフェリシアン化カリウムK₃Fe(C
N)₆の場合、この反応は次のように進行する。この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化さ
れて酸化電流を生ずる。

【０００９】また、メディエータとしてフェリシアン化
カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合に
は、GOD存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの
反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキ
ノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値
が測定される。

【００１０】これらの各電極上への混合物層の形成は、
水１ml当りGOD約1〜50mg、好ましくは約1〜20mg(165800
単位の場合)およびパラベンゾキノン約1〜200mg、好ま
しくは約50〜180mgまたはフェリシアン化カリウム約1〜
100mg、好ましくは約10〜60mgを溶解させた水溶液約0.5
〜10μl、好ましくは約0.5〜3μlを滴下法、スピンコー
ト法などによって作用極上に滴下することによって行わ
れ、そこに約0.05〜10μm、好ましくは約0.1〜2μmの膜
厚の混合物層を形成させる。なお、この溶媒としてはア
ルコール、アルコール水溶液等も用いられる。

【００１１】酸化電流は、作用極上で発生するが、この
電流は作用極を通過して測定系に入り、対極を経由して
測定試験中をイオン電流として流れ、再び作用極に向
う。このとき、これら両電極を含めた測定系の抵抗が高
いと、当然電流は流れ難くなり、その結果としてセンサ
特性としては感度が低くなる。つまり、センサ感度の点
からは、電流の流れ易い電極の方が好ましく、それは電
極の組成の影響を受けることになる。

【００１２】電極をスクリーン印刷法で形成させる場
合、電極部およびそのリード部の形成材料としては、カ
ーボン、銀、銅、白金等が用いられている。銅は廉価で
はあるが酸化され易く、また溶解現象もあって使い難
い。白金は焼成温度が高く、従ってセラミックス、ガラ
ス等の耐熱性絶縁性基板しか用いることができず、更に
高価であるという欠点を有する。銀の場合には、酸化お
よび硫化という表面黒化現象やマイグレーションによっ
てひき起こされる寸法変化などがあり、また比較的割高
であるという問題もみられる。これに対して、カーボン
は廉価であり、焼成温度も低く、酸化され難いという長
所がみられる反面、電流が流れ難いという欠点がみられ
る。

【００１３】カーボンをバイオセンサ用電極材料もしく
はリード部材料として用いる場合には、センサとしての
感度の点から、カーボンの電流の流れ易さを改善する必
要がある。従来は、このような流れ難さを補うために、
電極材料をカーボン、電極およびコネクタと接触するリ
ード部材料を銀としたものもあるが、これでは上記各材
料の欠点が保持されたままであり、十分なる改善ではな
い。また、銀をリード部材料とした場合には、それを長
時間放置すると、銀は硫化および酸化される現象を生じ
る。

【００１４】本発明においては、カーボン電極を形成す
るためのスクリーン印刷カーボンペーストをアセチレン
ブラック-グラファイト混合物から形成させると共に、
リード部を電極形成材料と同じ材料で形成させ、更に少
くとも作用極部分をグルタルアルデヒドで表面処理する
ことにより、センサ感度の向上を図っている。

【００１５】カーボンペーストは、アセチレンブラック
1重量部に対してグラファイトを2.5〜5.5重量部、好ま
しくは3〜5重量部の割合で用い、それを有機溶媒、例え
ばイソホロン1重量部に対して好ましくは約8〜10重量部
のブチルセロソルブアセテートを混合した混合有機溶媒
中に分散させて調製される。アセチレンブラックに対す
るグラファイトの割合が上記範囲を外れると、センサ感
度の向上が望めなくなる。また、有機溶媒は、カーボン
の分散、バインダーの溶解および分散、インク材料とし
ての流動性の確保のために、カーボン混合物に対して約
1〜3、好ましくは約1.5〜2の重量比で用いられる。

【００１６】用いられた各カーボン成分の内、アセチレ
ンブラックは粒状であり、またグラファイトは平板状で
あって、これら両者が点接触することによって導通は確
保され、その一方のみでは点接触が円滑に行われず、導
通は確保され難い。バインダーは、これら両者の分散性
および電極の形成性を確保する役割があり、これを用い
ないとカーボン電極は形成後粉状となってしまう。バイ
ンダーとしては、飽和ポリエステル、エポキシ樹脂等
が、カーボン混合物に対して好ましくは約0.7〜0.9の重
量比で用いられる。

【００１７】カーボン混合物によって形成された電極部
の表面および/またはリード部のコネクタ接触部は、精
度確保の上からは研磨処理された上で用いられることが
好ましい。ここで電極部とは、図1に示される如く、混
合物層5で一部もしくは全部が接触被覆され、かつ絶縁
層4で覆われていない部分であり、リード部のコネクタ
接触部とは、絶縁層4で覆われていない部分を指してい
る。

【００１８】電極部および/またはそのリード部の表面
処理法としては、有機溶媒で処理するという方法もある
が、この場合には電極およびそのリード部形成に用いら
れたバインダーが有機溶媒で溶出し、それが電極および
そのリード部を覆ってしまい、バラツキの原因となるの
で好ましくなく、本発明においては不織布によって表面
研磨が行われる。

【００１９】このようにして表面研磨が行われたあるい
は行われない電極部、特に作用極は、その表面がグルタ
ルアルデヒドによって処理された上で用いられる。グル
タルアルデヒド処理は、濃度約0.05〜2重量%、好ましく
は約0.1〜0.5重量%のグルタルアルデヒド水溶液を室温
下で電極部表面に滴下し、室温乃至約50℃、好ましくは
約35〜45℃の温度条件下で約0.5〜120分間、好ましくは
約10〜60分間乾燥した後、水洗、乾燥させることによっ
て行われる。

【００２０】グルタルアルデヒド水溶液滴下法に代え
て、電極部表面をグルタルアルデヒド蒸気に暴露すると
いう表面処理方法をとることもできる。具体的には、濃
度約10〜50重量%、好ましくは約15〜45重量%という高濃
度のグルタルアルデヒド水溶液を開放容器中に入れ、そ
れと電極部を形成させた基板とを密閉容器中に収納し、
約2〜30℃、好ましくは約3〜10℃の温度条件下に約10分
乃至約8時間、好ましくは約1〜3時間放置し、これを取
り出した後、今度は約20〜50℃、好ましくは約35〜45℃
の温度条件下に約0.5〜120分間、好ましくは約10〜60分
間放置するという方法がとられる。

【００２１】カーボン混合物によって形成され、グルタ
ルアルデヒドで表面処理された電極およびそのリード部
を有するバイオセンサは、酵素-電子伝達体混合物層の
上に空間部を介して網状体を配置して、測定精度を向上
せしめることが望ましい。かかる態様の一例が、図1〜2
に示されている。

【００２２】前記のようにして混合物層が形成された
バイオセンサ［図１の(a)]には、混合物層５にほぼ相当
する大きさの孔部６を穿設したスペーサ７を接着剤８に
よって接着し［図１の(b)]、次いでスペーサの孔部６を
十分に覆う面積の網状体９を重ね［図１の(c)]、更に孔
部10を穿設したカバー11を接着剤12によって接着し［図
１の(d)］、図２に示される如くに一体化する。なお、
接着剤層は、スペーサ７の両面側に設けることもでき
る。スペーサおよびカバーとしては、いずれもポリエチ
レンテレフタレートフィルム等が好んで用いられる。

【００２３】網状体としては、織物または編物が好まし
い。織物としては、タテ糸とヨコ糸とで織った平織が好
ましく、平織の中でもポリエステル、ポリアミド等の化
学繊維のみを用いたものが好ましいが、これら以外にも
化学繊維と綿等の天然繊維との混紡あるいは天然繊維の
みの織物も用いることができる。編物としては、タテメ
リヤス、ヨコメリヤスのいずれをも用いることができ、
糸の材質としては化学繊維、天然繊維あるいはこれらの
混合繊維が、また糸の形態としてはフィラメント糸、加
捻糸のいずれであってもよい。

【００２４】これらの網状体は、好ましくは親水化処理
された上で用いられる。網状体の親水化処理は、界面活
性剤、タンパク質、カップリング剤等の有機物質を用い
る化学的処理方法、プラズマ放電処理、グロー放電処
理、コロナ放電処理、火炎処理、紫外線照射処理等の物
理的処理方法が、用いられる網状体の材質に応じて適宜
用いられる。

【００２５】界面活性剤としては、両性、カチオン系、
アニオン系、ノニオン系のいずれも用いることができる
が、これらの内酵素活性に与える影響の少ないオクチル
フェノキシポリエトキシエタノール、イソノニルフェノ
キシポリグリシドール等が好ましい。また、測定試料が
血液の場合には、それの溶血を防ぐため、ノニオン系界
面活性剤の内のソルビタンエステル、ポリオキシエチレ
ンまたはポリグリセリンのアルキルアリルエーテルまた
は脂肪酸エステルが好んで用いられる。更に、タンパク
質としてはレシチン等が、またカップリング剤としては
シラン系またはチタン系のものが用いられる

【００２６】これらを用いての化学的親水化処理は、そ
れの溶液中に網状体を浸漬する方法あるいはその溶液を
スプレー塗布する方法などによって行われる。また、物
理的親水化処理は、温度、圧力、電力、時間等を適当に
選択することにより、適当な条件下で行われる。

【００２７】例えば、グルコース濃度の測定では、この
ようにして作製されたグルコースバイオセンサに所定濃
度のグルコース水溶液を滴下して約5〜180秒間程度反応
させた後、そこに約0.1〜2.0V、好ましくは約0.5〜1.0V
の電圧を印加し、例えば印加10秒後の電流値をグルコー
ス濃度依存出力電流値とした。測定には、ポテンショガ
ルバノスタットおよびファンクションジェネレータが用
いられる。

【００２８】

【発明の効果】金属電極部表面をチオール系化合物によ
って処理する技術は公知であるが、この方法はカーボン
電極表面には適用できない。本発明に係るバイオセンサ
は、カーボン電極表面をグルタルアルデヒドで処理する
ことにより、測定感度の向上という本来の目的を十分に
達成させる。

【００２９】即ち、カーボン電極部表面の官能性基とグ
ルタルアルデヒドとをまず結合させ、次いで酵素の官能
性基と結合させることにより、酵素の一部をカーボン電
極表面に固定化することを可能とし、それによってバイ
オセンサの感度を向上せしめている。また、網状体を配
置した場合には、それの存在により、操作時に混合物層
に誤って手が触れてそれを損傷させるなどの危惧もなく
なり、操作性の改善も図られる。

【００３０】

【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。

【００３１】実施例１ (カーボンペーストの調製) アセチレンブラック-グラファイト(重量比1:4)混合物1
重量部、イソホロン-ブチルセロソルブアセテート(重量
比1:9)混合有機溶媒2重量部および飽和ポリエステル(日
立化成製品エスペル1312)バインダー0.8重量部を混合し
て、カーボンペーストを調製した。

【００３２】(バイオセンサの作製)図示された態様に従
って、バイオセンサが作製された。まず、ポリエチレン
テレフタレート製基板上に、上記カーボンペーストを用
いてスクリーン印刷法によってカーボン製作用極および
カーボン製対極を形成させ、各電極の中央部分をスクリ
ーン印刷法熱硬化性ポリエステル樹脂製絶縁膜で覆っ
た。次いで、電極リード部を不織布で研磨すると共に、
作用極上および対極上に0.2重量%グルタルアルデヒド水
溶液2.5μlを滴下し、40℃で30分間乾燥させた後、水洗
した。

【００３３】このようにしてアルデヒドで表面処理され
た各電極上には、水１mlに対してグルコースオキシダー
ゼ（165800単位／g)10mgおよびフェリシアン化カリウム
48mgを溶解させたドープ液1.5μlを滴下し、室温で乾燥
させた混合物層が形成されている。

【００３４】このように構成されるバイオセンサには、
ポリエチレンテレフタレート製穿孔スペーサ、ノニオン
系界面活性剤（UCC社製Triton X-100）で親水化処理さ
れたポリエチレンテレフタレート製加捻糸平織の網およ
びポリエチレンテレフタレート製カバーフィルムを順次
接着し、バイオセンサが作製された。

【００３５】(測定)このバイオセンサを用いての測定に
は、ポテンショガルバノスタット（北斗電工製HA-501）
およびファンクションジェネレータ（同社製HB-104）が
用いられた。測定は、濃度250mg/dlのグルコース水溶液
20μlをセンサの網状体部分に滴下し、80秒間静置した
後、２電極間に0.9Vの電圧を印加し、印加10秒後の電流
値を測定した。測定は３回行われ、その平均値を算出し
た。

【００３６】実施例２実施例1において、グルタルアルデヒド処理が20重量%グ
ルタルアルデヒド水溶液を入れた開放シャーレを入れた
密閉容器中に4℃で2時間放置した後、40℃のオーブン中
に30分間放置することによって行われた。

【００３７】比較例実施例1において、グルタルアルデヒド処理が行われな
かった。

【００３８】以上の各実施例および比較例における測定
結果は、以下に示される。実施例1 29 30 30 平均値 30 実施例2 29 30 31 平均値 30 比較例 25 24 26 平均値 25

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るバイオセンサの組立て状況を示す
斜視図である。

【図２】本発明に係るバイオセンサの斜視図である。

【符号の説明】

１絶縁性基板２カーボン製作用極３カーボン製対極５混合物層６孔部７スペーサ９網状体 11 カバー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/327

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】絶縁性基板上に形成したスクリーン印刷
法カーボン電極上に酵素-電子伝達体混合物層を更に形
成させたバイオセンサにおいて、カーボン電極がアセチ
レンブラック-グラファイト(重量比1:2.5〜5.5)混合物
よりなるカーボンペーストから形成され、少くとも作用
極がグルタルアルデヒドで表面処理されたものであるこ
とを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】グルタルアルデヒドによる表面処理がグ
ルタルアルデヒド水溶液の滴下によって行われた請求項
1記載のバイオセンサ。
【請求項３】グルタルアルデヒドによる表面処理がグ
ルタルアルデヒド水溶液を収納した密閉容器中での暴露
によって行われた請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項４】リード部を電極形成材料と同じ材料で形
成させた請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項５】酵素-電子伝達体混合物層の上に空間部
を介して網状体が配置されている請求項1または2記載の
バイオセンサ。