JP3444946B2 - 微生物特性測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微生物を利用する反応場
における微生物数、微生物活性などの微生物特性の測定
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、微生物の活性を利用した有用物質
の生産、有害物質の分解等がさまざまな現場において数
多く用いられるようになってきている。例えばバイオリ
アクターによる食料、医薬品の生産、処理槽における各
種汚水の浄化といったこれまで良く扱われてきたものか
ら、最近では石油系炭化水素や有機塩素系化合物といっ
た有害かつ除去困難な物質による土壌汚染の深刻化にと
もない、バイオレメディエーションという微生物を用い
た土壌修復法が注目を浴びている。

【０００３】このように微生物の反応を期待する場が水
系から土壌系に広がっていく一方、各反応場の微生物
数、微生物活性等を測定することは以前にもまして重要
となってきている。微生物の数または活性の測定は、バ
イオリアクターにおいては培養環境の制御、汚水処理で
は汚水流入速度の調節等に不可欠な情報である。また、
土壌修復では対象とする土壌が極めて不均一で種々雑多
な物質を含む系であり、さらに、土壌の位置、層位によ
って分解微生物の生育菌数や活性状態は極端に異なった
ものになる。従って、むらなく汚染土壌を浄化するため
には、夾雑物を多量に含む汚染サイト各ポイントにおけ
る土壌の微生物数およびその活性を把握し、それをもと
に反応場の各部位に応じて、分解微生物や栄養素の追加
や酸素濃度の調整を検討する必要がある。

【０００４】従来、微生物の数や活性の測定方法とし
て、培養液や汚水処理水、汚染処理土壌、環境中の水や
土壌等を直接サンプリングし、そのサンプル中の微生物
の数を希釈平板法、希釈頻度法、蛍光抗体法、ＤＮＡプ
ローブ法など既知の手法によって計数する方法や、反応
場での微生物由来の酵素濃度の測定、微生物の働きによ
る有用生成物あるいは分解対象物質である有害物質の濃
度測定などが行われてきた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしこれらの方法だ
と、サンプル中の夾雑物、例えば培養液では微生物によ
って生産されたスライム、水や土壌では微生物以外の生
物やスラッジ、粘土鉱物などの微粒子、腐植酸などが微
生物の分離を妨げたり、上述の測定の精度を低下させる
ことから、それを回避するために取られる測定妨害物質
の分離操作などによって測定操作が煩雑化して、問題と
なっている。特に、特定微生物による土壌浄化、醸造、
薬品の合成などにおいては、反応場における特定微生物
数がその特定微生物の活性を評価する手段として重要で
あるが、この特定微生物の数を計数する手段として非常
に有効とされている蛍光抗体法、ＤＮＡプローブ法で
は、そのような夾雑物の影響がかなり大きく、十分な前
処理なしでは測定不可能な場合も多い。

【０００６】こうした状況の中、各反応場において微生
物の数および活性を評価する場合に測定の対象となる微
生物や関連物質と夾雑物との分離を容易にし、微生物活
性の測定を行う方法が強く求められている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上述の課題に
関し検討を加えた結果、反応場であるリアクター、汚
水、汚染土壌などの一部をサンプリングし、その中に含
まれる微生物の活性を評価する指標となる微生物などを
直接測定し、反応場の微生物活性を評価した結果と、反
応場に回収・分離が容易な測定用多孔性担体を添加し、
その担体を回収後、その担体の微生物数および活性を測
定した結果との間に強い相関があり、この相関がフェノ
ールの分解能を有するシュードモナス・セパシアＫＫ０
１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）の特性の評価に好適
に利用できることを見いだし、本発明に至ったものであ
る。

【０００８】すなわち本発明は、フェノールの分解能を
有するシュードモナス・セパシアＫＫ０１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４２３５）を利用する反応場での微生物特性の
測定法において、反応場にあらかじめ多孔性担体を添加
し、測定時にその担体を回収し、回収した担体に含まれ
る前記菌株由来の酵素、生成物質、分解性生物など（以
下、微生物関連物と称する）の指標物の測定による前記
菌株の活性の測定および／または微生物数の測定を行う
ことを特徴とする微生物特性の測定法を提供する。

【０００９】以下、各操作段階で、具体的な方法、材料
等について説明する。

【００１０】まず多孔性担体の材料としては微生物およ
び／または微生物関連物の吸着が容易なものであれば特
に限定はなく、例としてケイ砂、ベントナイト、ピート
モスなどの天然材料、アルミナ、合成ゼオライト、活性
炭、ガラスなどの無機物、ポリウレタン、ポリエステ
ル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸エステル
類、ポリアクリルアミド、ポリアミド、尿素・メラミン
・フェノールなどとホルムアルデヒドなどとの縮合体な
どの合成高分子、セルロース、セルロース誘導体、再生
セルロース、キトサン、コラーゲン、ゼラチンなどの天
然系高分子などの有機材料を挙げることができる。これ
らの材料は単体または２種以上の複合体で用いることが
できる。

【００１１】多孔性担体の形状は、特に限定するもので
はないが、反応場への添加および反応場からの回収を考
慮すると、粒子状、膜状、棒状あるいは糸状が好まし
い。

【００１２】また、多孔性担体はそのまま反応場に添加
されるほかに、図１（ａ）に示すように支持体３に多孔
性担体２を固定したサンプリング端子１を反応場に添加
・固定してもよい。

【００１３】また、多孔性担体は上述の材料のみから構
成される必要はなく、例えば粒子状担体の場合、金属な
どの粒子表面に高分子化合物の層を設けた粒子状担体や
棒状担体の場合、芯となるステンレス棒にバインダーと
ともにアルミナ粉を被覆させ、焼結処理することにより
得られる棒状担体などの複合体担体も用いることができ
る。

【００１４】さらに、多孔性担体には、上述の材料の他
にγ−Ｆｅ₂Ｏ₃、Ｃｏ含有のγ−Ｆｅ₂Ｏ₃、Ｆｅ₃Ｏ₄な
どの磁性体粉末や微生物に対する栄養素などを含有させ
ることもできる。また、多孔性担体は微生物関連物に対
し親和性の高い表面を有することが好ましく、上述の材
料の中でも親水性の高い材料、例えば合成系高分子では
ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドなどや天然
高分子類など、またイオン性がカチオン性の材料、例え
ば第四級アンモニウム塩などで変性されたカチオン化ポ
リアクリルアミド類、アルミニウム、マグネシウムなど
の多価金属塩などで処理された材料などが好適に用いら
れる。

【００１５】多孔性担体のポーラスな表面形状は、反応
場中の微生物が吸着されやすく、さらに、担体回収後、
多孔性担体表面に付着した反応場中の夾雑物と担体の分
離操作時に、担体に吸着された微生物を担体のポーラス
な空隙中に残留させるのに好適な形状である。

【００１６】その孔隙径としては微生物が入り込みやす
い数十〜数百μｍ程度の大きさが望ましい。

【００１７】粒子状担体の場合、反応場からの担体の回
収を考慮すると、粒子径としては、０．１ｍｍ〜数十ｍ
ｍ程度のものが好ましい。

【００１８】また特に反応場が水系の場合、多孔性担体
の比重を、好ましくは０．３以上０．９以下あるいは
１．１以上、さらに好ましくは０．３以上０．９以下あ
るいは１．１以上とする。これによって担体を反応場の
上層部に浮上または底層部に沈降させ、担体の回収操作
を容易にすることができる。また、非水系の反応場の場
合であっても、担体回収時に水を用いる場合には、反応
場の夾雑物との分離の容易さを考慮し、比重が０．３以
上０．９以下あるいは１．１以上の多孔性担体を用いる
ことが望ましい。

【００１９】次に反応場への担体の投与方法であるが、
膜状担体、棒状担体、糸状担体の場合は必要に応じて治
具などに取り付けられた測定用担体を反応場の任意の位
置に挿入すればよいが、粒子状担体の場合は、所定量を
所定の範囲に投与し、必要に応じて攪拌・分散させる。
土壌系の場合、反応場が表層に限られる時は投与した後
適度にすき込めば良い。深層部の場合では耕耘機、ある
いは簡易的なボーリングによって担体を添加する必要が
あるが、これらの手法は本発明の方法に特有の手段では
なく、土壌深層部の微生物添加には一般的に用いられる
ものである。

【００２０】反応場での微生物の多孔性担体への吸着
は、担体の形状、表面状態、物理・化学的性質などの諸
特性、反応場の水分含量、温度、流動性、微生物の特性
などさまざまな条件によって変化するため、これらを十
分勘案の上、適宜反応場への担体の挿入・添加を行な
う。一般的には、水系の反応場では数時間でほぼ平衡状
態に達するが、土壌系では平衡に達するのに土壌水分含
量が高い場合では数時間から数日間、水分含量が低い場
合では数か月を要する場合がある。

【００２１】反応場からの多孔性担体の回収は、膜状担
体、棒状担体、糸状担体など反応場に挿入した担体の場
合は、反応場からそのまま回収し、必要に応じて洗浄等
により反応場中の夾雑物を除去・分解すればよいが、粒
子状担体、棒状担体などで反応場に添加・分散された担
体の場合は、反応場からサンプリングした担体を含む反
応液、土壌などを篩、超音波処理、遠心などの分離操作
を適用しながら回収・分離する。また、磁性体粉末を包
含する担体の場合は、分離操作において磁力を利用する
ことによって簡便に回収することができる。

【００２２】回収された多孔性担体の微生物活性の測定
は、多孔性担体からの微生物および／または微生物関連
物の指標物質の脱離を行なって測定するか、あるいは回
収された担体そのものについて、バイアル瓶、フラスコ
などの実験室的な反応場で分解能、合成能などを評価す
ることによってなされる。

【００２３】回収した担体か微生物および／または微生
物関連物を脱離させる操作は、回収した担体の破砕処
理、溶解処理、超音波処理などの単独あるいは組み合わ
せ処理によって行なう。

【００２４】微生物活性の測定は、その指標となる微生
物の数、酵素濃度、生成物質、分解生成物などについて
行なわれるが、これらはとりわけ本発明に特別なもので
はなく、各々の測定項目、測定対象などにより最適なも
のを用いればよい。

【００２５】

【実施例】以下、本発明の実施例を示すが、これらは本
発明の範囲を何ら限定するものではない。

【００２６】なお、以下の実施例に用いるＫＫ０１菌株
は次の方法で取得したものである。タカサゴシロアリの
ハタラキシロアリを１０匹シャーレにとり、エチルアル
コール（９５％）をこれに注ぎシロアリ表面を殺菌し
た。次に、９５％フェノールを０．０５％含有する下記
の組成（１リットル中）のＭ９培地でシロアリを２回洗
い、その表面からエチルアルコールを除去した。

【００２７】 Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ６．２ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ ３．０ｇ ＮａＣｌ ０．５ｇ ＮＨ₄ Ｃｌ １．０ｇ 水 残部 （ｐＨ７．０） 洗浄後、シロアリの腸をピンセットで摘み出し、それを
フェノール０．０５％を含有するＭ９培地中ですり潰
し、腸破砕物を含む液状混合物を得た。この混合物の一
部を、フェノール０．０５％及び酵母エキストラクト
０．０５％を含有するＭ９培地に接種し、３０℃で好気
条件下に１５日間培養した。培養前後の培地中のフェノ
ール量を測定して、培地中でのフェノール分解性微生物
の存在を確認した。なお、フェノール量の変化の測定
は、培地を０．２２μｍのフィルターで濾過して菌体等
を除去し、その吸光度（２７０ｎｍ付近）を分光光度計
によって測定することにより行った。

【００２８】上記の培養により得られた培地（増殖菌体
を含む）を、フェノール含有Ｍ９寒天培地（フェノール
０．０５％及び寒天１．２％を含む）の表面に塗布し、
３０℃で培養した。寒天培地上に良好に生育してきたコ
ロニーを単離株として得た。単離株の１つについてその
菌学的性質を調べたところ下記の結果が得られ、この単
離株はPseudomonas cepaciaに属するものであることが
わかった。このフェノールの分解能を有する菌株をＫＫ
０１株と命名し、通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託（寄託日：平成４年３月１１日、受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１２８６９）した。なお、この寄託は、
平成５年３月９日付でブタペスト条約に基づく国際寄託
（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）に移管され
た。 Ａ．形態的性状 （１）グラム染色：陰性 （２）菌の大きさ及び形：長さ１．０〜２．０μｍ、幅
０．５μｍ前後の桿菌 （３）運動性：あり Ｂ．各種培地における生育状況

【００２９】

【表１】 Ｃ．生理的性質 （１）好気性、嫌気性の区別：偏性好気性 （２）糖の分解様式： 酸化型 （３）オキシダーゼの生成： ＋ （４）硝酸銀の還元： ＋ （５）硫化水素の生成： − （６）インドールの生成： − （７）ウレアーゼの生成： − （８）ゼラチンの液化： − （９）アルギニンの加水分解：− （１０）リジンの脱炭酸： ＋ （１１）オルニチンの脱炭酸：− （１２）クエン酸の利用： ＋ （１３）メチルカルビノールアセチル反応（ＶＰ反
応）：− （１４）トリプトファンデアミナーゼの検出：− （１５）ＯＮＰＧ：− （１６）炭水化物類の利用性： ブドウ糖： ＋ 果糖： ＋ 麦芽糖： ＋ ガラクトース：＋ キシロース： ＋ マンニット： ± 白糖： − 乳糖： ＋ エスクリン： − イノシット： − ソルビット： − ラムノース： − メリビオース：− アミグダリン：− Ｌ−（＋）−アラビノース：＋ （実施例１）平均粒子径約３ｍｍ、最大孔隙径１００μ
ｍのゼオライト１０ｇを分散させた未滅菌褐色森林土５
００ｇにフェノール分解菌Pseudomonas cepacia ＫＫ０
１の培養液５０ｍｌ（菌数として約８×１０⁸ 個）を添
加し、この土壌を透水カラムに入れ、フェノール濃度１
００ｐｐｍのＭ９培地（酵母エキストラクト０．０５％
含有）を３０℃にて０．６ｍｌ／分の流入速度で流しな
がら、流動培養した。同様のものを１０連用意し、２日
ごとに２連ずつこの土壌を透水カラムから取り出し、内
径１ｍｍの篩にあけ、ｐＨ７の０．１Ｍりん酸緩衝液で
軽く洗浄してゼオライトを土壌から分離した。このゼオ
ライトを同様のりん酸緩衝液５ｍｌに入れ、１０Ｋｃで
１分間超音波処理をし、ゼオライトに吸着した菌を脱離
させた。Pseudomonas cepacia ＫＫ０１は１００ｐｐｍ
のフェノールを単一の炭素源としたＭ９寒天培地上にコ
ロニーを形成することができるため、この培地を用いて
希釈平板法によりゼオライト１０ｇに吸着していた菌数
を求めた。またこの方法で求めた菌数と菌の活性（フェ
ノール分解活性）との相関を見るため、２日ごとに流出
培地のフェノール分解量を測定した。なお、これ以降の
フェノールの定量はアミノアンチピリン吸光光度法（Ｊ
ＩＳ規格２８の１に定める方法）によって行なった。

【００３０】各測定日の菌数及びフェノール分解活性は
菌数測定に供した２連の平均値によって求めた。その結
果を図２に示す。

【００３１】（参考例１） 実施例１と同様のゼオライト１０ｇを分散させた未滅菌
褐色森林土５００ｇにEscherichia coliの培養液５０ｍ
ｌ（菌数として約２．５×１０⁹ 個）を添加し、この土
壌を透水カラムに入れ、ＬＢ培地（バクトペプトン１０
ｇ／１、酵母エキストラクト５ｇ／１、塩化ナトリウム
１０ｇ／１、ｐＨ７．０）を３０℃にて１．２ｍｌ／分
の流入速度で流しながら、流動培養した。同様のものを
１０連用意し、２日ごとに２連ずつこの土壌を透水カラ
ムから取り出し、内径１ｍｍの篩いにあけ、ｐＨ７の
０．１Ｍりん酸緩衝液で軽く洗浄してゼオライトを土壌
から分離した。このゼオライトを同様のりん酸緩衝液５
ｍｌに入れ、１０Ｋｃにて１分間超音波処理をし、脱離
した菌数を蛍光抗体法によって求めた。

【００３２】菌の脱離したこの緩衝液１ｍｌをメンブレ
ンフィルター（ヌクレポア、孔径０．２μｍ、直径２５
ｍｍ、ポリカーボネート）を用いてろ過し、フィルター
上に菌体を捕えた。これをスライドグラスにのせ、その
上にゼラチン−ＲＩＴＣ結合体溶液３００μｌを乗せ、
６０℃で乾熱乾燥させた。冷却後、これを恒温槽に入
れ、ゼラチン−ＲＩＴＣ結合体上にＦＩＴＣ標識抗Ｅ．
coli抗体〔ウサギ〕（Diagnestics Pasteur 社製、０．
１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを注ぎ、５２℃で湿潤下４５
分間反応後、りん酸緩衝液で洗浄し、風乾後蛍光顕微鏡
観察によって計数した。２連の平均値として求めた菌数
はゼオライト１０ｇに吸着していた菌数に換算した。結
果は図３に示す。

【００３３】（比較例１） 一方、通常用いられている土壌中の菌の計数を比較実験
として行った。参考例１の流動培養後に透水カラムから
土壌をとり出した際、ゼオライトを含まない部分の土壌
１０ｇをサンプリングし、これに水１００ｍｌを加え懸
濁させた。この１０ｍｌを５００ｇで１０分間遠心後、
沈殿のみを０．５Ｍショ糖溶液１０ｍｌに懸濁させた。
これを３８０ｇで１０分間遠心後、沈殿のみを２Ｍショ
糖溶液１０ｍｌに懸濁させた。これを３８０ｇで１０分
間遠心後、上ずみ１ｍｌを前述のメンブランフィルター
を用いてろ過し、後は上記参考例１と同様の操作を行
い、蛍光抗体によって菌数を測定した。求めた菌数は土
壌１０ｇに吸着していた菌数に換算した。

【００３４】各測定日の菌数は２連の平均値によって求
めた。その結果を図３に示す。

【００３５】（参考例２） 底部にドレインを備えた断面積約３００ｃｍ² 、高さ７
０ｃｍの円筒形培養器に５ｍｍ角のポリウレタンフォー
ム１０ｇを下端から１０ｃｍずつ層状に分散させるよう
未滅菌褐色森林土約１５ｋｇを入れた。これにyeast AR
S1を含んだプラスミドを持つEscherichia coli HB101の
培養液１１（菌数として約４×１０¹⁰個）を上部から添
加し、ＬＢ培地（バクトペプトン１０ｇ／１、酵母エキ
ストラクト５ｇ／１、塩化ナトリウム１０ｇ／１、ｐＨ
７．０）１０１を上部から注入した。２日後上層から順
に土壌を掘り出し、各層のポリウレタンを取り出すと同
時にその近傍にある土壌１０ｇをサンプリングした。ポ
リウレタンは内径１ｍｍの篩いにあけ、ｐＨ７のりん酸
緩衝液で洗浄し、同様のりん酸緩衝液５ｍｌに入れ、１
０Ｋｃにて１分間超音波処理をした。次にこの緩衝液中
のＥ．coliの菌数をＤＮＡプローブ法を用いて以下のよ
うに求めた。

【００３６】ポリウレタンに付着してわずかに混入して
きた土壌中の腐植酸等、定量の精度を低下させる物質を
取り除くため、菌を分散した緩衝液にポリビニルポリピ
ロリドンを濃度１％となるように加え、良く懸濁させた
後、１０℃、１０００ｒｐｍにて３分間遠心し、上ずみ
を１０℃、９０００ｒｐｍにて２０分間遠心し、菌体を
沈殿として回収した。この沈殿を１０ｍＭピロリン酸ナ
トリウム５０ｍｌに懸濁させ、１０℃、９０００ｒｐｍ
にて２０分間遠心し、さらにこの沈殿をクロムバッハ緩
衝液５０ｍｌに懸濁させ、１０℃、９０００ｒｐｍにて
２０分間遠心し、菌体を洗浄の後、この沈殿をクロムバ
ッハ緩衝液８ｍｌに懸濁させた。これをリゾチーム、Ｓ
ＤＳで溶菌し、エタノール沈殿としてＤＮＡを回収し
た。目的とするＥ．coliのＤＮＡを定量するため、yeas
t ARS1の両端１８ｂｐをプライマーとしてＰＣＲ法を行
い、電気泳動を行った。求めた菌数はポリウレタン１０
ｇに吸着していた菌数に換算し、その結果は図４に示し
た。

【００３７】（比較例２） 一方、土壌サンプル中の菌数も比較対照として求めた。
土壌そのものは腐植酸等の阻害物質をかなり多量に含ん
でいるため、ＤＮＡの精製はかなり煩雑である。まずサ
ンプル土壌３０ｇに１％ポリビニルポリピロリドン溶液
１００ｍｌを加え、１０℃、１０００ｒｐｍにて３分間
遠心した。この沈殿について同様の操作を３回繰り返し
た上ずみをすべて合わせ、１０℃、９０００ｒｐｍにて
２０分間遠心し、この沈殿を１０ｍＭピロリン酸ナトリ
ウム５０ｍｌに懸濁させ、１０℃、９０００ｒｐｍにて
２０分間遠心した。この沈殿についても同様の操作を３
回行い、すべての沈殿をクロムバッハ緩衝液５０ｍｌに
懸濁させ、１０℃、９０００ｒｐｍにて２０分間遠心
し、この沈殿をクロムバッハ緩衝液８ｍｌに懸濁させ
た。この後のＤＮＡ抽出操作は前述の参考例２と同様で
あるが、得られたＤＮＡはまだ腐植酸等で汚れており、
ＰＣＲ反応が進まなかった。そこでさらにＤＮＡを精製
するため密度勾配遠心法を行った。ＤＮＡ溶液１ｍｌに
塩化セシウム０．８ｇとエチジウムブロマイド１６０μ
ｇを加え、１５℃、５００００ｒｐｍにて１８時間遠心
した。ＤＮＡのバンドを回収し、エチジウムブロマイド
を１−ブタノールで除去し、０．１２Ｍりん酸緩衝液で
透析し、ＤＮＡの精製を行った。その後のＤＮＡの定量
は前述の参考例２と同様に行った。

【００３８】求めた菌数は土壌１０ｇに吸着していた菌
数に換算した。各土壌層ごとに得られた結果について図
４に示す。

【００３９】（実施例２） 図１のように、多孔性担体（ポリウレタンフォーム）２
を先端に固定した、リアクター内への取り付け・取り出
しが容易な直径約３ｍｍの支持体（ステンレス棒）３か
ら成るサンプリング端子１を挿入した容量１リットルの
攪拌機６付ガラス製リアクター４（図１（ｂ））に、グ
ルタミン酸ナトリウム２０ｇおよびフェノール０．５ｇ
（５００ｐｐｍ）を含む水道水１リットルにフェノール
分解菌Pseudomonas cepacia ＫＫ０１の培養液を１０⁷
個／ｍｌの菌濃度となるように添加した。

【００４０】３０℃で攪拌しながら培養を行ない、１日
ごとに多孔性担体を取り出し、りん酸緩衝液で軽く洗浄
後、りん緩衝液２０ｍｌにそのポリウレタンフォーム部
を入れ、１０Ｋｃで１分間超音波処理し、ウレタンフォ
ームに吸着した菌を脱離させた（なお、菌脱離後の多孔
性担体は、直ちにリアクター内に再挿入し、培養液中に
固定した。）。

【００４１】脱離された菌の数は次の方法で測定した。

【００４２】得られた菌脱離液を孔径１０μｍのフィル
ターでろ過後したのち、ろ液も１０分間遠心分離（４０
００ｒｐｍ）して、上澄みを捨て、１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）含有りん酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）
２ｍｌに再懸濁し、１０分間遠心分離（４０００ｒｐ
ｍ）して、上澄み液を捨て、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液０．５
ｍｌに再懸濁した。

【００４３】そこにさらに、ＦＩＴＣ標識した抗P. cep
aciaモノクローナル抗体液（０．２ｍｇ／ｍｌ）を０．
５ｍｌ加え、０℃で１時間抗原抗体反応を行なった。抗
P. cepaciaモノクローナル抗体は、ＫＫ０１株を用い、
マウスの腹腔内、そして静脈内に免疫（Japan. J. Med.
Sci. Biolo., 37, 151-159（1984）参照）して得た。
また、標識化抗体の蛍光色素と蛋白（抗体）との結合比
（Ｆ／Ｐ比）は４．２であった。また、そのモノクロー
ナル抗体のＦＩＴＣ（最大蛍光波長５３０ｎｍ）標識化
は、ｐＨ９．５の炭酸緩衝液中にＦＩＴＣと抗体を加
え、１時間反応後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ・Ｇ−２５のカラ
ムで遊離のＦＩＴＣを分離して行なった（免疫化学実験
法」１９８６，ｐ１０３〜１０５参照）。

【００４４】抗原抗体反応を行なった後、遠心分離およ
びＢＳＡ／ＰＢＳ１ｍｌ再分散を２回繰り返した反応液
を５秒間超音波分散した後、フローサイトメーター（Fa
cs-can、ベクトンディッキンソン社製）を用いてウレタ
ンフォーム１０ｇ換算の菌数を測定した。なお、菌数は
蛍光強度（ＦＬＩ）と前方散乱光強度（ＦＳ）強度の組
み合わせから求めた。その結果を図５に示す。

【００４５】（実施例３）実施例２ における多孔性担体のかわりに厚さ約０．４ｍ
ｍ、大きさ１０×５０ｍｍの多孔質ウレタンフィルムを
支持体となる枠に固定した多孔性担体を挿入し、実施例
２と同様の実験を行なって、１日ごとの多孔性担体に吸
着した菌数の測定を行なった。求めた菌数は、多孔性担
体１０ｇに吸着していた菌数に換算し、その結果を図５
に示す。

【００４６】ここで用いた多孔質ウレタンフィルムは次
のようにして得た。

【００４７】ラッカー型ポリウレタン樹脂１５％ＤＭＦ
溶液をガラス板上に塗工後、水に浸漬して、溶媒水中置
換を行なった後、乾燥し、膜厚０．４ｍｍの多孔質ウレ
タンフィルムを得た。

【００４８】（実施例４）実施例３ と同様の条件で、多孔性担体である多孔質ウレ
タンフィルムを培養開始時に５点挿入・固定し、１日ご
との測定時に多孔性担体を１点ずつ回収した。回収した
多孔性担体をりん酸緩衝液で軽く洗浄後、グルタミン酸
ナトリウム３００ｍｇ、フェノール１．５ｍｇ（１００
ｐｐｍ）を含む水道水１５ｍｌの入った５０ｍｌバイア
ル瓶に添加し、３０℃で培養して、７２時間後のフェノ
ール分解率（％）を測定した。この値は、多孔性担体に
吸着されたフェノール分解菌の分解活性を示す。結果は
図５に示した。

【００４９】（実施例５）実施例３ における多孔性ウレタンフィルムのかわりに、
表面カチオン化多孔質ウレタンフィルムを用いて同様の
実験を行ない、１日ごとの多孔性担体に吸着した菌数を
測定した。結果は図５に示す。

【００５０】ここで用いた表面カチオン化多孔質ウレタ
ンフィルムは次のようにして得た。実施例３と同様にし
て得た多孔質ウレタンフィルムをカチオン化アクリルア
ミド樹脂１％水溶液に浸漬し、取り出した後に自然乾燥
した。

【００５１】（実施例６）実施例２ における多孔性担体を挿入するかわりに、粒子
径約６ｍｍ、比重約０．５の多孔性担体粒子１０ｇを添
加し、同様に攪拌しながら培養し、１日ごとに浮遊して
いる多孔性担体粒子約１ｇを取り出し、吸着した菌数を
測定した。

【００５２】求めた菌数は多孔性担体１０ｇに吸着して
いた菌数に換算して、その結果を図５に示す。

【００５３】なお、多孔性担体粒子は次のようにして得
た。

【００５４】直径約３ｍｍ、比重０．２の発泡ポリスチ
レン粒子の表面をブチル化メラミン樹脂（ｎ−ブチル１
０％溶液）で表面架橋処理後、実施例３で用いたラッカ
ー型ポリウレタン樹脂１０％ＤＭＦ溶液を表面塗布し、
水中置換した後、乾燥することによって、多孔性担体粒
子を得た。

【００５５】（実施例７） 実施例１のゼオライトのかわりに、粒子径約５ｍｍの多
孔性磁性粒子１０ｇを用いて同様に流動培養した。多孔
性磁性粒子は、土壌を水に分散しながら磁力によって捕
集後、内径１ｍｍの篩上でりん酸緩衝液５ｍｌに入れ、
実施例１と同様の方法で菌数と菌の活性（フェノール分
解活性）を測定した。結果は図６に示す。なお、多孔性
磁性粒子は、次のようにして得た。

【００５６】直径約２ｍｍのガラス球の表面を実施例３
で用いたラッカー型ポリウレタン樹脂１０％ＤＭＦ溶液
１００重量部に対して、磁性体であるγ−Ｆｅ₂Ｏ₃粉末
２０重量部を分散剤１重量部とともに分散させた分散液
を表面塗布し、水中置換したのち乾燥することによっ
て、多孔性磁性粒子を得た。

【００５７】

【発明の効果】本発明の多孔性担体を用いる測定によ
り、微生物を利用する反応場中の夾雑物から、微生物お
よび微生物関連物の分離を煩雑な操作なく実施し、微生
物数、微生物活性などの微生物特性を簡便に測定するこ
とが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法の１実施態様を示す模式図であ
り、（ａ）は多孔性担体、（ｂ）は微生物等の担体によ
る回収操作を表わす。

【図２】実施例１における菌数およびフェノール分解量
の経時変化のグラフである。

【図３】実施例２および比較例１の菌数の経時変化のグ
ラフである。

【図４】実施例３および比較例２における土壌層深さ対
菌数のグラフである。

【図５】実施例４、５、７および８の菌数ならびに実施
例６のフェノール残留率の経時変化のグラフである。

【図６】実施例９の菌数およびフェノール分解量の経時
変化を示すグラフである。

【符号の説明】

１ サンプリング端子 ２ 多孔性担体（ポリウレタンフォーム） ３ 支持体（ステンレス棒） ４ ガラス製リアクター ５ 水浴 ６ 攪拌機

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢野 哲哉 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (56)参考文献 特表 平３−503361（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/06 ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フェノールの分解能を有するシュードモ
   ナス・セパシアKK01株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）を
   利用する反応場での前記菌株の特性測定法であって、反
   応場にあらかじめ多孔性担体を添加し、該担体を回収
   し、回収した該担体の前記菌株の特性を測定することを
   特徴とする微生物特性測定法。
2. 【請求項２】 微生物特性が微生物数である請求項１記
   載の微生物特性測定法。
3. 【請求項３】 微生物特性が微生物の活性である請求項
   １記載の微生物特性測定法。
4. 【請求項４】 多孔性担体が粒子状である請求項１ない
   し３のいずれか１項に記載の微生物特性測定法。
5. 【請求項５】 多孔性担体の比重が０．３以上０．９以
   下である請求項４記載の微生物特性測定法。
6. 【請求項６】 多孔性担体の比重が１．１以上である請
   求項４記載の微生物特性測定法。
7. 【請求項７】 多孔性担体が膜状である請求項１ないし
   ３のいずれか１項に記載の微生物特性測定法。
8. 【請求項８】 多孔性担体が棒状である請求項１ないし
   ３のいずれか１項に記載の微生物特性測定法。
9. 【請求項９】 多孔性担体が糸状である請求項１ないし
   ３のいずれか１項に記載の微生物特性測定法。
10. 【請求項１０】 多孔性担体の表面がカチオン性である
    請求項１ないし９のいずれか１項に記載の微生物特性測
    定法。
11. 【請求項１１】 多孔性担体が磁性体を含んでいる請求
    項１ないし１０のいずれかに１項に記載の微生物特性測
    定法。
12. 【請求項１２】 微生物を利用する反応場が汚染土壌で
    ある請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の微生物
    特性測定法。