JP3435574B2 - 外来ｄｎａを含有するウマのヘルペスウイルス（ｅｈｖ）、その調製方法およびワクチンにおけるその使用 - Google Patents

外来ｄｎａを含有するウマのヘルペスウイルス（ｅｈｖ）、その調製方法およびワクチンにおけるその使用

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、外来ＤＮＡ要素ならびにその複
製に必要なゲノム配列を含有するウマのヘルペスウイル
ス(equine herpesviruses)、その調製方法およびその方
法において使用する中間体、および感染に対するワクチ
ンにおけるその使用に関する。
【０００２】ヘルペスおよびインフルエンザならびにウ
マのライノウイルス、哺乳動物のレオウイルス、マイコ
プラズマおよびバクテリア、例えば、連鎖球菌およびコ
リネバクテリアは、馬の感染性呼吸器の障害の中の主要
な病因論的問題を表す。これらに加えて、前身の感染に
おいて、動脈、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）、大腸菌、クロストリジウムおよび、腸上のコロニ
ー化を伴って、ロタｖｉおよびコロナウイルスが存在す
る。目的は許容される有効なワクチンを展開することお
よび単にこれらの病原体に対して使用することである。
【０００３】ウマのヘルペスウイルスは、世界のすべて
の馬繁殖地域において地方病的に分布し、そして馬の感
染症において主に重要である。今日まで、合計４つのウ
マのヘルペスウイルスの血清型が同定されてきている。
【０００４】ＥＨＶ−１ （ウマ流産ウイルス）、従来
ＥＨＶ−１サブタイプ１（ライノ肺炎ウイルス）と呼ば
れるアルファ−ヘルペスウイルスに属する病原体、 ＥＨＶ−２ （ウマサイトメガロ様ウイルス）、ベータ
−ヘルペスウイルス、 ＥＨＶ−３ （ウマ交疹ウイルス）、アルファ−ヘルペ
スウイルスに属する、および ＥＨＶ−４ 同様に、従来ＥＨＶ−１サブタイプ２と呼
ばれるアルファ−ヘルペスウイルス。
【０００５】ウマのヘルペスウイルスは、世界を通じて
馬の繁殖における経済的損失を引き起こす。これらは、
とくに、流産、呼吸器の障害および、ある場合において
劇的な過程と伴って、脳炎の再発性流行病を生ずる。飼
育の間の損失、調教の欠如および芸の損失の経済的重要
性は低く評価すべきではない。
【０００６】ヘルペスウイルスは、一般に、わずかに免
疫原性であり、定量的に小さい体液の免疫応答を示すだ
けである。こうして、例えば、ＥＨＶ−４の感染後の呼
吸器の形態はしばしば血清学的に弱い体液の免疫応答の
みを生ずる。主として１価のＥＨＶ−１生ワクチンまた
は不活性化ＥＨＶ−１ワクチンが、ある場合において異
種抗原と組み合わせて、現在実際に使用されている。こ
れらのワクチンの使用にかかわらず、ウマのヘルペスウ
イルスによる感染ために臨床的疾患が反復して起こって
いる。これらは種々の血清型のヘルペスウイルスのため
にまたは前記病原体の他のものと相互作用する混合感染
の結果の１原因の（ｍｏｎｏｃａｕｓａｌ）疾患である
ことがある（因子の疾患）。
【０００７】全体として、現在使用することができるワ
クチンを使用する免疫予防はまだ満足すべきものでな
い。したがって、困難なく使用することができそしてで
きるだけ多くの病原体に対して弾力的な免疫保護を与え
ることができるウマのワクチンを得ることは望ましい。
【０００８】増殖に必須なそれらのゲノム配列の外に、
異種免疫原の遺伝情報を指定する外来ＤＮＡを含有する
非病原性病原体に基づくある種のベクターのワクチンは
知られている。また、ある場合において、病原性病原体
の抗原を非ビルレント病原体の中に、すなわち、ベクタ
ーの中に挿入されてきていることは知られている。
【０００９】外来ＤＮＡ、例えば、仮性狂犬病ウイルス
（アウエスキー病ウイルス）およびマレク病を含有する
アルファ−およびガンマ−ヘルペスウイルスおよびワク
チンにおけるそれらの使用は知られている（ＰＣＴ特許
出願ＷＯ８７／４４６３号；ＷＯ８９／１０４０号）。
しかしながら、ウマのヘルペスウイルス、詳しくはベー
タ−ヘルペスウイルス、例えば、ＥＨＶ−２を外来ＤＮ
Ａのためのベクター硫酸アンモニウム使用することは知
られていない。
【００１０】アルファ−およびガンマ−ヘルペスウイル
スは、基本的には、それらの生物学的挙動およびそれら
の構造的有機体においてベータ−ヘルペスウイルスと異
なる。したがって、アルファ−およびガンマ−ヘルペス
ウイルスの挙動からベータ−ヘルペスウイルスついてな
んらかの結論を引き出すことは不可能である。
【００１１】本発明は、次の事柄に関する： １、その複製に必要なゲノムの配列の外に、１または２
以上の外来ＤＮＡ要素を有するウマのヘルペスウイルス
（ＥＨＶ）、とくにＥＨＶ２型。
【００１２】２、その複製に必要なゲノムの配列の外
に、１または２以上の外来ＤＮＡ要素を有する、非ビル
レントのまたは弱毒化されたウマのヘルペスウイルス
（ＥＨＶ）、とくにＥＨＶ２型。
【００１３】３、その複製に必要なゲノムの配列の外
に、１または２以上の外来ＤＮＡ要素を有し、前記外来
ＤＮＡ要素はそれらの反復ＤＮＡ配列の中にまたはその
複製に必要ではない他のゲノムの配列の中に位置する、
非ビルレントのまたは弱毒化されたウマのヘルペスウイ
ルス（ＥＨＶ）、とくにＥＨＶ２型。
【００１４】４、その複製に必要ではないゲノムの配列
の中の１または２以上のセグメントは存在しない、１、
２または３（上の）のウマのヘルペスウイルス。
【００１５】５、１または２以上のＤＮＡセグメントを
含有し、前記ＤＮＡセグメントはタンパク質の遺伝情報
を指定しおよび／または、挿入のために、ＥＨＶのゲノ
ムの配列の機能を不活性化しおよび／またはＥＨＶのゲ
ノムを要求される位置において標識する、１、２、３お
よび４のウマのヘルペスウイルス。
【００１６】６、ａ）ＥＨＶ株のための遺伝子バンクを
このウイルスのゲノム断片から確立し、そしてその物理
的ゲノム地図を構成するか、あるいは、適当ならば、現
存する遺伝子バンクに、あるいは分離されたＥＨＶのＤ
ＮＡ断片に頼り、 ｂ）外来ＤＮＡの導入のための１または２以上の挿入部
位を、それ自体知られている方法において、このＥＨＶ
株のゲノムの中であるいは１または２以上のゲノムの断
片上で同定し、前記断片はプラスミドまたは他のベクタ
ーの中に含有されることができ、 ｃ）適当ならば、（ｂ）（上の）に従い同定された１ま
たは２以上の挿入部位をもつゲノムの中であるいは１ま
たは２以上のゲノム断片上で１または２以上の欠失を実
施し、ゲノム断片はプラスミドまたは他のベクターの中
に含有されることができ、 ｄ）外来ＤＮＡ要素を、それ自体知られている方法にお
いて、（ｂ）（上の）に従い同定された１または２以上
の挿入部位の中に挿入するか、あるいは欠失が（ｃ）
（上の）に従い実施された１または２以上の領域の中に
挿入して、いわゆるシャトルベクターを生成し、 ｅ）適当ならば、（ｄ）（上の）に従うシャトルベクタ
ーを、ウイルスの成長に適当な細胞の中でウマのヘルペ
スウイルスのゲノムと一緒に同時トランスフェクション
するか、あるいは別の工程においてトランスフェクショ
ンするか、あるいは前記細胞をシャトルベクターでトラ
ンスフェクションしそしてウマのヘルペスウイルスで感
染させ、 ｆ）外来ＤＮＡを含有しそして（ｄ）〜（ｅ）に従い得
ることができるＨＶウイルスの組み換え体をそれ自体知
られている方法において分離しそして成長させ、 部分の工程ｂ）、ｃ）、ｄ）を任意の所望の順序で実施
する、ことを特徴とする、１、２、３、４および５（上
の）のウマのヘルペスウイルスを調製する方法。
【００１７】７、６ｄ）（上の）の方法に従い得ること
ができるシャトルベクター。
【００１８】８、外来ＤＮＡ要素を導入するための１ま
たは２以上の挿入部位を、それ自体知られている方法に
おいて、ＥＨＶ株のゲノムの中にあるいは１または２以
上のゲノム断片上で同定し、前記断片はプラスミドまた
は他のベクターの中に含有されることができ、そして適
当ならば、同定された挿入部位を含有するゲノム断片を
既知のまたは新しく構成されたベクターの中に挿入し、
適当ならば、１または２以上の欠失または単一のヌクレ
オチドまたはヌクレオチド配列をゲノム断片の中に挿入
することができ、前記挿入はベクターの中へのその挿入
の前または後に実施し、そして外来ＤＮＡ要素、それ自
体知られている方法において、同定された挿入部位の中
に挿入するか、あるいは欠失がなされた１または２以上
の領域の中に挿入し、前述の部分の工程は任意の所望の
順序で実施する、ことを特徴とする、７（上の）のシャ
トルベクターを調製する方法。
【００１９】９、１、２、３、４および５のＥＨＶに基
づく遺伝子の発現。
【００２０】１０、１、２、３、４および５（上の）の
ＥＨＶに基づくワクチン。
【００２１】１１、１、２、３、４および５（上の）の
ＥＨＶを使用して試験管内または生体内で調製される、
抗原、免疫原、翻訳ユニットおよびエピトープ。
【００２２】１２、１１（上の）の抗原、免疫原、翻訳
ユニットおよびエピトープを含有するワクチン。
【００２３】１３、免疫化後の非ワクチン接種の感染し
た動物からのワクチン接種した動物の弁別を可能とする
ワクチンとしての１、２、３、４および５（上の）のＥ
ＨＶの使用。
【００２４】１４、抗原、免疫原、翻訳ユニット、その
分離物の試験管内または生体内の調製のための１、２、
３、４および５（上の）のＥＨＶの使用およびワクチン
または診断助剤におけるそれらの使用。
【００２５】１５、免疫血清の調製のための１１（上
の）の抗原、免疫原、翻訳ユニットおよびエピトープの
使用。
【００２６】１６、外来ＤＮＡ要素のためのベクターと
してのＥＨＶ、とくにＥＨＶ２型の使用。
【００２７】１７、６ｂ）（上の）の方法に従い調製さ
れそしてＥＨＶのＤＮＡ配列およびＥＨＶについて外来
のＤＮＡ要素を有するシャトルベクター、とくにこれら
のシャトルベクターの中に挿入されそして再び分離され
た外来ＤＮＡを、外来ＤＮＡ要素を含有する組み換えＥ
ＨＶのプローブ、ここでシャトルベクターおよび組み換
えＥＨＶの中の外来ＤＮＡは少なくとも部分的に同一で
ある、として使用すること。
【００２８】１８、６ａ）（上の）の方法に従い調製さ
れ、６ｂ）の方法に従い同定された挿入部位を含有する
遺伝子バンクを、可能な挿入部位を検出を含まないプロ
ーブとしてＥＨＶ株のゲノムの中へ外来ＤＮＡを挿入す
るために使用すること。
【００２９】１９、６ａ）の方法に従い調製された遺伝
子バンクを、生物学的試料の物質の中のＥＨＶの検出
（病原の診断）に使用すること。
【００３０】２０、ＥＨＶのゲノム断片のヌクレオチド
配列に基づいて化学的合成されたオリゴヌクレオチド
を、生物学的試料の物質の中のＥＨＶの検出（病原の診
断）に使用すること。
【００３１】前述の用語は次の意味を有する： − ＥＨＶの複製に必要なゲノム配列は、次の通りであ
る：ＥＨＶの成長、すなわち、ウイルスの子孫の産生、
に不可欠であるＥＨＶの完全なゲノムの部分。いくつか
の配列の局在化はわずかのヘルペスウイルスについての
み、およびなおより小さい程度にＥＨＶについて有効で
ある。本発明の実施において、複製に必要なこれらのゲ
ノム配列を不変化のままにし、修飾されたウイルスが感
染性子孫を産生することができるかどうかにより試験可
能としておくことは必要である。
【００３２】− 外来ＤＮＡ要素（外来ＤＮＡ）は、次
の通りである：使用するＥＨＶベクターの中に本来存在
しないＤＮＡ配列、例えば、外来遺伝子。
【００３３】外来ＤＮＡは次の理由でベクターのウイル
スの中に挿入される： １、外来ＤＮＡの発現のために ２、ベクターのウイルスのＤＮＡ配列の機能の不活性化
のために ３、ベクターのウイルスの標識付けのために 挿入された外来ＤＮＡはこれらの理由に依存して異な
る。（１）に従い外来ＤＮＡを発現しようとする場合、
挿入された外来ＤＮＡは要求される外来タンパク質の遺
伝情報を指定する少なくとも１つのオープンリーディン
グフレームもたなくてはならない。外来ＤＮＡは、適当
ならば、それ自身のまたは外来の調節配列をさらに含有
する。挿入された外来ＤＮＡの長さは、発現されたタン
パク質の要求される機能を保証することに依存する。一
般に、長さは１ヌクレオチド〜２０ｋＢ、好ましくは
０．５〜１５ｋＢである。
【００３４】述べることのできる例は、次の通りであ
る：１〜４型のウマのヘルペスウイルスの免疫原、ウマ
のインフルエンザウイルス、ライノウイルス、アデノウ
イルス、哺乳動物のレオウイルス、マイコプラズマおよ
びバクテリア、例えば、連鎖球菌およびコルネバクテリ
ア、さらに動脈炎ウイルス、リケッチア、サルモネラ、
クロストリジア、大腸菌、ロタ−およびコロナウイルス
の免疫原の遺伝子。１〜４型のウマのヘルペスウイルス
の免疫原は、次のものであることができる：ウイルスの
糖タンパク質ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ［Ｄ．Ｗ．ベル（Ｂ
ｅｌｌ）、Ｄ．Ｂ．ボイレ（Ｂｏｙｅ）、Ｊ．Ｍ．ワレ
イ（Ｗｈａｌｌｅｙ）（１９９０）ジャーナル・オブ・
ゼネラル・ビロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、
７１、１１１９−１１２９；ｐ−グオ（Ｇｕｏ）、Ｓ．
ゲベル（Ｇｏｅｂｅｌ）、Ｓ．デイビス（Ｄａｖｉ
ｓ）、Ｍ．Ｅ．パークス（Ｐｅｒｋｕｓ）、Ｂ．ラング
エット（Ｌａｎｇｕｅｔ）、Ｐ．デスメットレ（Ｄｅｓ
ｍｅｔｔｒｅ）、Ｇ．アレン（Ａｌｌｅｎ）、Ｅ．パオ
レッチ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）、６３、４１８９−４１９８；Ｐ．グオ
（Ｇｕｏ）（１９９０）遺伝子（Ｇｅｎｅ）８７、２４
９−２５５；Ｊ．Ｍ．ワレイ（Ｗｈａｌｌｅｙ）、Ｇ．
Ｒ．ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）、Ｍ．Ａ．ス
コット（Ｓｃｏｔｔ）、Ｇ．Ｃ．ハドソン（Ｈｕｄｓｏ
ｎ）、Ｃ．Ｗ．ベル（Ｂｅｌｌ）、Ｌ．Ｍ．ワードワー
ス（１９８９）ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジ
ー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、７０、３８３−３９
４］、それらの名称はＨＳＶ糖タンパク質の命名法から
採用した。前記病原体の免疫原はウイルスの糖タンパク
質または他の前記病原体の膜タンパク質であることがで
きる。
【００３５】（２）に従いＤＮＡ配列を不活性化しよう
とする場合、原理的には、少なくとも１つの外来ヌクレ
オチドにより、ベクターのウイルス自身のＤＮＡ配列を
中断することで十分である。不活性化のために挿入され
た外来ＤＮＡの最大長さは、外来ＤＮＡのためのベクタ
ーのウイルスの吸収能力に依存する。一般に、外来ＤＮ
Ａの長さは１ヌクレオチド〜２０ｋＢ、好ましくは０．
１〜１５ｋＢである。（３）に従い標識付けのためにＤ
ＮＡ配列を挿入しようとする場合、その長さは標識され
たウイルスを同定する検出法に依存する。一般に、外来
ＤＮＡの長さは１ヌクレオチド〜２０ｋＢ、好ましくは
２０ヌクレオチド〜１５ｋＢである。 − ベクターのウイルスは、次の通りである：外来ＤＮ
Ａの挿入に適当でありそしてそのゲノムの中の挿入され
た外来ＤＮＡを感染した細胞または有機体の中に輸送す
ることができ、こうしてその中で外来ＤＮＡの発現を可
能とするＥＨＶ、とくにＥＨＶ−２。
【００３６】− 非ビルレントＥＨＶは、次の通りであ
る： 馬の自然または実験の感染後の臨床的サインの発現に導
かないウイルス。
【００３７】− 弱毒化ＥＨＶは、次の通りである：そ
れらのゲノムの修飾のために、馬に対して低い病原性ま
たは非病原性または非ビルレントとなるウイルス。
【００３８】− 反復ＤＮＡ配列は、次の通りである：
ＥＨＶのゲノムにわたって反復して順番にまたは散乱し
て存在するヌクレオチド構成ブロックの配列。
【００３９】− ＥＨＶの複製に必要ではないゲノム配
列は、次の通りである：ＥＨＶの成長に必要ではないＥ
ＨＶの完全なゲノムの部分。
【００４０】これらは反復ＤＮＡ配列であることができ
る。これらは、また、それらが反復して存在しなかった
場合、複製に必須な配列であることができる。
【００４１】これらは、また、それらのヌクレオチド配
列において、タンパク質の遺伝情報を指定する「オープ
ンリーディングフレーム」もたない、および／または、
それらのヌクレオチド配列において、ウイルスの成長に
必須ではないタンパク質の遺伝情報を指定する、および
／または、それらのヌクレオチド配列において、ウイル
スの成長またはＤＮＡの複製に関係する配列をもたな
い、ＤＮＡ配列であることができる。
【００４２】− 欠失突然変異は、次の通りである：そ
れらのゲノムの中に欠失を含有するＥＨＶの変異型。
【００４３】− 挿入突然変異は、次の通りである：そ
れらのもとのゲノム配列の中に追加のＤＮＡ配列を含有
するＥＨＶの変異型。好ましい変異型は、追加のＤＮＡ
配列が実験的に挿入されたものである。
【００４４】− 遺伝子バンクは、次の通りである：ゲ
ノムの、複製可能なベクターの中に含有された、すべて
の断片。
【００４５】それはゲノムの断片化および断片のすべ
て、いくつかまたは大部分を複製可能なベクター、例え
ば、プラスミドの中に挿入することによって得られる。
【００４６】− ゲノム断片は、次の通りである：分離
において存在するか、あるいは複製可能なベクターの中
に挿入することができるゲノムの断片。
【００４７】− 物理的ゲノム地図は、次の通りであ
る：直線または円形の線図で描写される、ＤＮＡ配列に
対する制限酵素の認識部位の帰属。
【００４８】ＥＨＶ−２株の物理的ゲノム地図は、次の
文献から知られている：「ウマのヘルペスウイルス２の
ゲノムの物理的マッピング（ウマのサイトメガロウイル
ス）（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｅｑ
ｕｉｎｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ２（Ｅｑｕｉｎｅ
Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）」、ブロウニング
（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ）、Ｇ．Ｆ．およびスツッダート
（Ｓｔｕｄｄｅｒｔ）、Ｍ．Ｊ．（１９８９）、アーチ
ーブス・オブ・ビロロジー（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、１０４、７７−８６およびウイルス学（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）１７３（１９８９）、ｐｐ．５６６−５８
０、Ｊ．Ｍ．コラチノ（Ｃｏｌａｃｉｎｏ）ら。ＥＨＶ
−２株 Ｔｈｅｉｎ４００／３の物理的ゲノム地図を以
後記載する。
【００４９】− 適当な挿入部位は、次の通りである：
外来ＤＮＡの吸収に適当なウイルスのゲノムの中の部
位。
【００５０】それらはは、例えば、次の方法により同定
される： ａ） ウイルスのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列の決定
による、潜在的に非タンパク質解読性の配列の同定、 ｂ） ウイルスのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列の決定
による、そのタンパク質がウイルスの成長に必須ではな
い、潜在的にタンパク質を解読する領域の同定、 ｃ） ウイルスのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列の決定
による、ウイルスの成長またはそのＤＮＡの複製に必須
ではないＤＮＡ配列の同定、 ｄ） 例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ンおよび、適当ならば、ヌクレオチド配列の分析によ
る、反復配列の同定、 ｅ） 例えば、ヌクレオチドの交換、欠失または挿入ま
たはそれらの組み合わせによる、ゲノム配列の同定、 ｆ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）の任意の所望
の組み合わせ、および引き続く潜在的ベクターのウイル
スの複製性についての潜在的挿入部位の意味のチェッ
ク、同定された挿入部位という用語は、組み換えベクタ
ーのウイルスの成長が、この部位の中に外来ＤＮＡを挿
入した後、防止される場合、適当である。
【００５１】− 「オープンリーディングフレーム」
は、いかなる停止コドンにっても中断されないリーディ
ングフレームである。ＲＮＡ配列よりむしろＤＮＡ配列
に基づいて、オープンリーディングフレームが存在する
かどうかをチェックすることが通常である。クリック
（Ｃｒｉｃｋ）、Ｆ．Ｈ．Ｃ．、Ｌ．バーネット（Ｂｅ
ｒｎｅｔｔ）、Ｓ．ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）、お
よびＲ．Ｊ．ワッツ・トビン（Ｗａｔｔｓ Ｔｏｂｉ
ｎ）、１９６１、「タンパク質の遺伝暗号の一般的性質
（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）１９２：１２２７−１２３
２。
【００５２】− 挿入による不活性化は、次のことを意
味する：挿入された外来ＤＮＡはＥＨＶ固有のゲノム配
列の発現または機能を妨害する。
【００５３】− 挿入による標識付けは、次のことを意
味する：挿入された外来ＤＮＡは、引き続いて、修飾さ
れたＥＨＶの同定を可能とする。
【００５４】− ６ｂに従い使用することができるプラ
スミドは、次の通りである：例えば、バクテリアのプラ
スミド。これらはリングの形態の染色体外のＤＮＡ配列
であり、バクテリアの中で複製することができる。これ
らは次の文献から知られている：「分子クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、実験室の
マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、第２版、１９８９、Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）お
よびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ）。とくに適当な例は、ｐＢＲ３２２、
ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１
８４である。これらのプラスミドの操作は、前記文献に
示されている方法により実施する。
【００５５】− ６ｂ）に従い使用することができる他
のベクターは、次の通りである： 例えば、バクテリオファージ、例えば、バクテリオファ
ージラムダ。
【００５６】− シャトルベクターは、次の通りであ
る：ベクターのウイルスのＤＮＡ配列によりフランキン
グされた、挿入すべき外来ＤＮＡを含有するプラスミ
ド、とくにバクテリアのプラスミド。その調製、複製お
よび使用は以後記載する。
【００５７】− 調節配列は、次の通りである：遺伝子
の発現に影響を及ぼすＤＮＡ配列。これらは次の文献か
ら知られている：「遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅＧｅｎｅ）」、
ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｊ．Ｄ．；ホプキンス（Ｈ
ｏｐｋｉｎｓ）、Ｎ．Ｈ．；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ）、Ｊ．Ｗ．；ステイツ（Ｓｔｅｉｔｚ）、Ｊ．Ａ．
およびウェイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）、Ａ．Ｍ．１９８
７、ザ・ベンジャミン／クミングス・パブリッシング・
カンパニー（Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎ
ｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、メン
ロ・パーク。好ましいとして述べることのできるもの
は、次の通りである：プロモーター、例えば、ラウス肉
腫ウイルスのプロモーター［ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）
ら（１９８３）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２１、
５５１−５５３］、ＥＨＶ−１ ｇＢのプロモーター
［ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジー（Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．）（１９８９）、７０ ３８３−３９
４、ウマのヘルペスウイルス１における遺伝子の同定お
よびヌクレオチド配列、主要なエンベロープ糖タンパク
質ｇＢをエンコードする単純ヘルペスウイルスの遺伝子
に類似する、Ｊ．Ｍ．ワレイ（Ｗｈａｌｌｅｙ）、Ｇ．
Ｒ．ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）、Ａ．スコッ
ト（Ｓｃｏｔｔ）、グラント（Ｇｒａｎｄ）Ｃ．ハドソ
ン（Ｈｕｄｓｏｎ）、Ｃ．Ｗ．ベル（Ｂｅｌｌ）および
Ｌ．Ｍ．ウッドワース（Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ）、および
ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジー（Ｊｏｕｎａ
ｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）（１９
９０）、７１、１１１９−１１２９、ウマのヘルペスウ
イルス１の糖タンパク質Ｂ遺伝子の同族体の転写分析お
よび組み換えワクシニアウイルスによるその発現、Ｃ．
Ｗ．ベル（Ｂｅｌｌ）、Ｄ．Ｂ．ボイル（Ｂｏｙｌ
ｅ］）およびＪ．Ｍ．ワレイ（Ｗｈａｌｌｅｙ）または
ＨＳＶ−１のチミジンキナーゼのプロモーター［マクナ
イト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）（１９８０）核酸の研究（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）８、５９４９−
５９６３］。
【００５８】− トランスフェクションは、次の通りで
ある：外来ＤＮＡ配列を含有するウイルスの組み換え体
を誘発する目的で、シャトルベクターまたは精製したＥ
ＨＶのＤＮＡの中に含有されるＤＮＡ配列、例えば、外
来ＤＮＡを、ウイルスの成長に適当な細胞の中に、導入
すること。ウイルスの成長に適当な細胞は、また、ベク
ターのウイルスのトランスフェクションの前または後に
感染して、外来ＤＮＡを含有するウイルスの組み換え体
を発生させることができる。
【００５９】− 同時トランスフェクションは、次の通
りである：外来ＤＮＡ配列を含有するウイルスの組み換
え体を誘発する目的で、ウイルスの成長に適当な細胞の
中に、少なくとも２つの異なるＤＮＡ配列を同時に導入
すること。異なるＤＮＡ配列は、一方において、シャト
ルベクターの中に組み込むことができる外来ＤＮＡであ
り、そして、他方において、ベクターのウイルスの精製
した完全なゲノムである。
【００６０】トランスフェクションまたは同時トランス
フェクションを実施する方法は、次の文献から知られて
いる：「ウイルス学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＶｉｒｏｌｏｇｙ）Ｖｏｌ．ＶＩ」（１９７７）、
Ｋ．マラモロシュ（Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ）、Ｈ．コ
プロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）、アカデミック・
プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨー
ク、サンフランシスコ、ロンドン。いわゆるリン酸カル
シウム技術の方法は好ましい［「ウイルス学における方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）Ｖｏ
ｌ．ＶＩ」（１９７７）、Ｋ．マラモロシュ（Ｍａｒａ
ｍｏｒｏｓｃｈ）、Ｈ．コプロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗ
ｓｋｉ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、サンフランシスコ、ロン
ドン］。
【００６１】− 抗原は、次の通りである：その発現が
外来ＤＮＡによりベクターのウイルスの中でおよび／ま
たはベクターのウイルスのゲノムにより可能である、タ
ンパク質またはペプチド。
【００６２】− 免疫原は、次の通りである：免疫化さ
れた有機体において感染の臨床的結果から相同性保護
（ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）に
導き、そしてその発現が外来ＤＮＡおよび／またはベク
ターのウイルスのゲノムにより可能とされる、短鎖のペ
プチドまたはタンパク質。
【００６３】− 翻訳ユニットは、翻訳されたアミノ酸
配列、ペプチドまたはタンパク質である。
【００６４】− エピトープは、次の通りである：アミ
ノ酸配列に基づく抗体のための特異的結合部位。
【００６５】１、２、３、４または５（上の）に従う本
発明によりウマのヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、６
（上の）に示すように調製される。
【００６６】これは詳しくは次の工程の実施をを伴う： １、適当なＥＨＶ株の選択。
【００６７】２、適当なＥＨＶ株のウイルスの遺伝子バ
ンクの確立。
【００６８】３、適当なＥＨＶ株のウイルスのゲノムの
物理的地図の構成。
【００６９】４、適当なＥＨＶ株のゲノムの中の外来Ｄ
ＮＡのための潜在的な挿入部位の同定。
【００７０】５、適当なＥＨＶ株のゲノムの中への外来
遺伝子要素を転移するためのシャトルベクターの構成。
【００７１】６、外来ＤＮＡを含有しそして、例えば、
それが複製するとき、外来タンパク質を発現する、組み
換えＥＨＶのウイルスの構成。
【００７２】項目１。
【００７３】適当なＥＨＶ株の選択 すべての型のＥＨＶは、原理的には、本発明による方法
における使用に適当である。ＥＨＶ２型は好ましい。
【００７４】２型のとくに好ましい株は、組織培養にお
いて力価≧１０5ＰＦｕ（プラーク形成単位）に成長す
ることができるものであり、そして細胞外の感染性ウイ
ルスとして感染した細胞の培地から純粋に調製すること
ができる。
【００７５】ブダベスト条約の規定に従い１９９０年７
月２４日にパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐ
ａｓｔｅｕｒ）、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に登録Ｎｏ．Ｉ−９
８１で受託されたＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ−４００／
３およびその変異型および突然変異は、とくに適当であ
ることが証明された。
【００７６】ウイルスを慣用方法により動物細胞、例え
ば、馬の細胞、猿の細胞または兎の細胞、好ましくは馬
の皮膚細胞、例えば、永久的な馬の皮膚細胞ＥＤ（ＡＴ
ＣＣＣＣＬ５７またはその子孫）または兎の腎臓細胞、
例えば、兎の腎臓細胞ＲＫ−１３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ３
７またはその子孫）または猿の腎臓細胞の組織培養にお
いて成長させる。
【００７７】成長はそれ自体知られている方法で静止
的、ローラーまたはキャリヤーの培養において結合した
細胞のアセンブリーでまたは懸濁培養において実施す
る。細胞のための成長培地としてそれ自体知られている
すべての細胞培養を使用し、それらの例は次の通りであ
る：フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）ＧｍｂＨ Ｐｏｓｔ １２４９、メッケ
ンハイム（ｍｅｃｋｅｎｈｅｉｍ）、の製品のカタログ
に記載されているもの、例えば、とくに、最小必須培地
（ＭＥＭ）、これは、必須成分として、次のものを含有
する：アミノ酸、ビタミン、塩類および炭水化物、緩衝
化物質、例えば、重炭酸ナトリウムまたは（ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ヘルペ
ス）および、適当ならば、動物の血清、例えば、畜牛、
馬またはそれらの胎児からの血清。胎児仔ウシ血清を１
〜３０容量％、好ましくは２〜１０容量％の濃度で使用
することはとくに好ましい。
【００７８】ウイルスの成長に使用する細胞および細胞
の菌叢は、慣用方法において、ほとんど全面成長にまた
は最適な光学密度に成長させる。ウイルスで感染する前
に、好ましくは細胞の成長培地を取り出し、そして細胞
を好ましくはウイルス成長培地で洗浄する。ウイルス成
長培地として、すべてのそれ自体知られている細胞培
地、とくに、前述のＭＥＭを使用する。次いで、ウイル
ス懸濁液を使用する感染を実施する。感染が０．０１〜
５０、好ましくは０．１０〜１０のＭＯＩ（＝感染性ウ
イルス粒子／存在する細胞に相当する感染の多重度）で
実施されるような希釈で、ウイルスはウイルス成長培地
中のウイルス懸濁液の中に存在する。
【００７９】ウイルスは動物の血清を添加するか、ある
いは添加しないで成長させる。血清を使用する場合、こ
れは１〜３０容量％、好ましくは２〜１０容量％の濃度
で成長培地に添加する。
【００８０】感染およびウイルスの成長は、室温〜４０
℃、好ましくは３２〜３９℃、とくに好ましくは３７℃
において数日間、好ましくは感染した細胞の崩壊が完結
するまで、実施する。
【００８１】感染した細胞のウイルスを含有する培地
は、例えば、孔大きさ、例えば、０．１〜０．４５μｍ
の濾過によりおよび／または１０，０００ｇまでの遠心
により、細胞の破片を除去することによって、さらに処
理する。
【００８２】濾液または遠心上澄み液はウイルスの濃縮
および精製に使用することができる。このために、濾液
または上澄み液を、ウイルス粒子が沈降するまで、高速
度の遠心にかける。さらに、適当ならば、密度の勾配
で、例えば、遠心することによって精製工程を実施する
ことができる。
【００８３】項目２。
【００８４】ウイルスの遺伝子バンクの確立 明確な遺伝子バンクは、ＥＨＶ、例えば、ＥＨＶ−２株
Ｔｈｅｉｎ−４００／３のゲノムから、次の文献から
それ自体知られている方法により確立する：「分子クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、
実験室のマニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ）、第２版、１９８９、Ｊ．サムブルック（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ）およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００８５】ゲノムを、上の１）に従い調製および精製
したウイルスから出発して分離および精製する。
【００８６】自然ウイルスＤＮＡは、好ましくは、精製
したヴィリオンを洗浄剤およびプロテアーゼの水溶液で
処理することによって抽出する。
【００８７】述べることのできる洗浄剤は、次の通りで
ある：アニオン性、カチオン性、両性、非イオン性の洗
浄剤。好ましくは、イオン性洗浄剤を使用する。ドデシ
ル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムはとくに好
ましい。
【００８８】述べることのできるプロテアーゼは、洗浄
剤の存在下に働くすべてのプロテアーゼ、例えば、プロ
テイナーゼＫおよびプロナーゼである。プロテイナーゼ
Ｋを好ましいとして述べることができる。
【００８９】洗浄剤は０．１〜１０容量％、好ましくは
０．５〜３容量％の濃度で使用する。
【００９０】プロテアーゼは０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ
のウイルスリゼイト、好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ
／ｍｌのウイルスリゼイトの濃度で使用する。
【００９１】水性緩衝化溶液中でＤＮアーゼ阻害因子の
存在下に実施することは好ましい。述べることのできる
緩衝液物質は、次の通りである：弱酸と強塩基との塩
類、例えば、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタ
ン）、強酸と弱塩基との塩類、例えば、第１ホスフェー
トまたはそれらの混合物。
【００９２】次の緩衝剤系を好ましいとして述べること
ができる：トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）。
【００９３】緩衝剤物質または緩衝剤系は、ＤＮＡが変
性されないｐＨ値を保証する濃度で使用する。ｐＨ値は
好ましくは５〜９、とくに好ましくは６〜８．５、非常
にとくに好ましくは７〜８であり、中性の範囲における
操作をとくに述べることができる。
【００９４】ＤＮアーゼ阻害因子は、例えば、０．１〜
１０ミリモル、好ましくはほぼ１ミリモルの濃度のエチ
レンジアミン四酢酸である。
【００９５】ウイルスのリゼイトの親油性成分を引き続
いて抽出する。抽出剤として、溶媒、例えば、フェノー
ル、クロロホルム、イソアミルアルコールまたはそれら
の混合物を使用する。最初にフェノールおよびクロロホ
ルム／イソアミルアルコールの混合物を使用することは
好ましく、抽出は１または２以上の工程で実施する。ク
ロロホルム／イソアミルアルコールは好ましくは抽出の
最後の段階で使用する。あるいは、まずフェノールおよ
び引き続いてクロロホルム／イソアミルアルコールを使
用することができる。
【００９６】ウイルスのＤＮＡを分離する他の方法は、
例えば、ＣｓＣｌの密度勾配またはゲル電気泳動におけ
るウイルスのリゼイトの遠心である［シャープ（Ｓｈａ
ｒｐ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１
９７３（１２）ｐｐ．３０５５−３０６３］。
【００９７】核酸の抽出は、次の文献に記載されてい
る：「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）」、実験室のマニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１９８９、Ｊ．サ
ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリトシュ
（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００９８】このようにして抽出されたＤＮＡは、好ま
しくは、水溶液から、例えば、アルコール、好ましくは
エタノールまたはイソプロパノールでおよび１価の塩、
例えば、アルカリ金属の塩化物または酢酸塩、好ましく
は塩化リチウム、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウ
ム、酢酸カリウムを添加して沈澱させる。
【００９９】この場合におけるアルコールの濃度は、４
０〜１００容量％、好ましくは６０〜８０容量％、とく
に好ましくは約７０容量％である。
【０１００】塩化物または酢酸塩の濃度は０．０１〜１
モルである。ＬｉＣｌを使用する場合、その濃度は０．
１〜１モル、好ましくは０．４〜０．８モルである。
【０１０１】核酸の沈澱の方法は、前述の「分子クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」に詳
細に記載されている。沈澱したＤＮＡを水溶液から、例
えば、遠心により分離し、好ましくはアルコール、例え
ば、７０容量％のエタノールで洗浄し、そして最後に水
性緩衝液の中に再溶解する。
【０１０２】述べることのできる緩衝剤物質は、１〜１
００ミリモル、好ましくは１０〜５０ミリモルのトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。好ましいｐ
Ｈ値は６〜８．５、とくに好ましくは７〜８である。
【０１０３】述べることのできるそれ以上の添加剤は、
例えば、０．１〜１０ミリモル、好ましくは１〜１０ミ
リモルのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）である。
【０１０４】別の可能性は、また、沈澱したＤＮＡを
０．０１または０．１×ＳＳＣ緩衝液の中に再溶解する
［前述の「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）」］または炭酸アンモニウムの緩衝液の
中に再溶解する。
【０１０５】このようにして精製したウイルスのＤＮＡ
を、製造業者の指示に従い制限エンドヌクレアーゼで処
理する。適当な制限エンドヌクレアーゼは、ウイルスの
ゲノム上の制限エンドヌクレアーゼに対して特異的な少
なくとも１つの切断部位を認識するものである。制限エ
ンドヌクレアーゼ（制限酵素）の例は、ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ｓｍＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｘｂａ
Ｉ、ＡｆｌＩＩＩまたはＢｓｐＭＩＩである。生ずるＤ
ＮＡ断片を、次の文献に記載されている方法により、バ
クテリアのプラスミド、ファージまたはコスミドの対応
する認識配列の中に分子クローニングする：「分子クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、
実験室のマニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ）、第２版、１９８９、Ｊ．サムブルック（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ）およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。低分子量のＤＮＡ断片（約１
５ｋｂｐまでの）について、プラスミドのベクター、お
よび約１５ｋｂｐ〜約４５ｋｂｐのＤＮＡ断片につい
て、コスミドはとくに好ましい。
【０１０６】項目３。
【０１０７】ゲノムの物理的地図の構成 ウイルスのゲノム、例えば、ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ
−４００／３のゲノムの物理的地図を、引き続いて、そ
れ自体知られている方法、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡのハ
イブリダイゼーション、制限エンドヌクレアーゼを使用
する部分的消化または制限エンドヌクレアーゼを使用す
る二重制限（二重消化）により、好ましくはウイルスの
遺伝子バンク、およびＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリダイゼ
ーションを使用して構成する。
【０１０８】これらの方法は、前述の「分子クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」または
「分子クローニングへの実際のガイド（Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）」、第２版、Ｂ．パーバル（Ｐｅｒｂａ
ｌ）編、ウィリイ・インターサイエンス（ＷｉｌｅｙＩ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）１９８８から知られている。
【０１０９】項目４。
【０１１０】適当な挿入部位の同定は、ゲノムの中で、
あるいはウイルスのゲノム断片上で、例えば、次の方法
により、実施する： ａ） タンパク質の遺伝情報を指定しないＤＮＡ配列の
同定。例えば、ウイルスのゲノム配列のヌクレオチド配
列の決定により、タンパク質の遺伝情報を指定しない領
域を含有するヌクレオチド配列を探す。制限酵素のため
のこれらの領域に位置する認識部位は潜在的挿入部位を
表す。潜在的挿入部位がＥＨＶの完全なゲノムの中の適
当な挿入部位であるかどうかを確立するために、外来Ｄ
ＮＡを断片の中に挿入し、そして挿入をもつ断片をウイ
ルスのゲノムの中に挿入することが必要である。外来Ｄ
ＮＡを含有する組み換えウイルスを引き続いて複製可能
性について検査する。外来ＤＮＡを含有する組み換えウ
イルスを成長させる場合、上で同定した認識部位は挿入
部位として適当である。
【０１１１】ｂ） ウイルスの成長に必須ではないタン
パク質の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列の、例えば、ヌ
クレオチド配列の決定による同定および非必須タンパク
質のための「オープンリーディングフレーム」の同定。
非必須タンパク質として見なされるタンパク質は、ＥＨ
ＶおよびＥＨＶ以外のヘルペスウイルスから知られてお
りそしてその中の成長に必須ではないと証明されたもの
である。このようなタンパク質は、それらがＥＨＶの中
に存在する場合、また、ＥＨＶにおいて必須ではないと
仮定する。したがって、ＥＨＶのゲノム断片の前述のヌ
クレオチド配列を研究して、それが他のヘルペスウイル
スについて知られている非必須タンパク質の１つのため
の「オープンリーディングフレーム」を含有するかどう
かを見いだす。このようなタンパク質は多分チミジンキ
ナーゼ、糖タンパク質Ｃ、糖タンパク質Ｅ（ＨＳＶの名
称）である。これらの潜在的適当な挿入部位がＥＨＶの
完全なゲノムの中の適当な挿入部位であるかどうかを確
立するために、外来ＤＮＡを断片の中に挿入しそしてこ
のインサートをもつ断片をウイルスのゲノムの中に組み
込むことが必要である。外来ＤＮＡを含有する組み換え
ウイルスを引き続いて複製可能性について検査する。外
来ＤＮＡを含有する組み換えウイルスが成長する場合、
上で同定された認識部位は適当な挿入部位として適当で
ある。
【０１１２】ｃ） ＤＮＡの複製またはウイルスの成長
に必須ではないＤＮＡ配列の同定。このような配列は、
ＥＨＶおよび／またはＥＨＶ以外のヘルペスウイルスに
おいて必須でないことが知られている配列と見なされ
る。これは、例えば、ＥＨＶのゲノム断片の比較ヌクレ
オチド配列分析により実施する。潜在的挿入部位がＥＨ
Ｖの完全なゲノムにおいて適当な挿入部位であるかどう
かを確立するために、外来ＤＮＡを断片の中に挿入し、
そしてこのインサートをもつ断片をウイルスのゲノムの
中に組み込むことが必要である。断片を含有する組み換
えウイルスを引き続いて複製可能性について検査する。
外来ＤＮＡを含有する組み換えウイルスが成長する場
合、上で同定された認識部位は挿入部位として適当であ
る。
【０１１３】ｄ） 反復配列の、例えば、ＤＮＡ／ＤＮ
Ａのハイブリダイゼーションによる同定および、引き続
く、これらの反復配列の中の制限酵素の認識配列の、例
えば、ヌクレオチド配列の分析による同定。述べたＤＮ
Ａ／ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、例えば、ベク
ターの中に挿入された遺伝子バンクからのゲノム断片を
ハイブリダイゼーションすることによって実施し、ＥＨ
Ｖのゲノムは制限酵素により断片化する。この場合にお
いて、遺伝子バンクの構成および断片化は同一の制限酵
素を使用して実施しなくてはならない。ベクターの中に
挿入されそして完全なゲノムの１より多い断片とハイブ
リダイゼーションするゲノム断片は、１または２以上の
反復配列を含有する。ゲノム断片上の反復配列を局在化
するために、ヌクレオチド配列を決定しそして互いに比
較する。断片上の同一の配列は反復的である。潜在的挿
入部位がＥＨＶの完全なゲノムの中の適当な挿入部位で
あるかどうかを決定するために、外来ＤＮＡを断片の中
に挿入し、そしてそのインサートをもつ断片をウイルス
のゲノムの中に組み込むことが必要である。引き続い
て、外来ＤＮＡを含有する組み換えウイルスを複製可能
性について検査する。外来ＤＮＡを含有する組み換えウ
イルスが成長する場合、上で同定された認識部位は挿入
部位として適当である。
【０１１４】ｅ） ゲノム配列の、例えば、ヌクレオチ
ドの交換、欠失または挿入またはそれらの組み合わせに
よる、修飾。
【０１１５】ｆ） ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）
の任意の所望の組み合わせ。
【０１１６】反復配列は、好ましくは、ＤＮＡ／ＤＮＡ
のハイブリダイゼーションにより局在化し、そしてヌク
レオチド配列の分析により詳細に特性決定する。
【０１１７】挿入部位は、それらの前述の仕事に依存す
る長さの外来ＤＮＡ配列の吸収に適当でなくてはならな
い。
【０１１８】好ましい挿入部位は、１ヌクレオチド〜１
５ｋＢの長さの外来ＤＮＡを挿入することができる部位
である。
【０１１９】外来ＤＮＡの吸収の能力は、ウイルスのゲ
ノムの中に欠失を作ることによって増加することができ
る。欠失は１ヌクレオチド〜１５ｋＢ、好ましくは１〜
１０ｋＢの範囲の大きさを有する。
【０１２０】項目５。
【０１２１】外来遺伝子の遺伝子要素を転移するシャト
ルベクターの構成。
【０１２２】外来ＤＮＡをベクターのウイルスのＤＮＡ
配列をフランキングすることによって、外来ＤＮＡをベ
クターのウイルスの中に転移するためのシャトルベクタ
ーを調製する。この構成を次の段階において実施する： ａ）制限エンドヌクレアーゼを使用するウイルスのゲノ
ムからの挿入部位を有するＤＮＡ配列の分離およびプラ
スミドまたはファージのベクターの中へのその挿入。
【０１２３】このために、ＥＨＶを１に示すように成長
させ（適当なＥＨＶの選択）そして細胞外ウイルス粒子
として精製する。ウイルスのゲノムをこのウイルス粒子
から分離し、そして２に示すように断片化する（ウイル
スの遺伝子バンクの確立）。これから生ずるＤＮＡ断片
を、その分画化後、例えば、電気泳動により、分割用ゲ
ル（例えば、アガロースゲル）から分離し、そして同定
された挿入部位を有する断片をプラスミドまたはファー
ジのベクターの中に挿入する。
【０１２４】ＤＮＡ断片の分画化に適当な方法は電気泳
動およびクロマトグラフィーにかける。
【０１２５】ゲル濾過をクロマトグラフィーの例として
述べることができる。
【０１２６】エレクトロポレイションにおいて述べるこ
とのできる支持体は、アガロースまたはポリアクリルア
ミドである。述べることのできるエレクトロポレイショ
ンの緩衝液の例は、次の通りである：エチレンジアミン
四酢酸、ホスフェート／緩衝液（ＥＰＰ）、次の組成を
有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンボレー
トエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ＴＢＥ）： トリス １０〜１００ミリモル、好ましくは４０〜９
０ミリモル、とくに好ましくは８０〜９０ミリモル、 ホウ酸 １０〜１００ミリモル、好ましくは４０〜９
０ミリモル、とくに好ましくは８０〜９０ミリモル、 ＥＤＴＡ １〜１０ミリモル、好ましくは１〜２．５ミ
リモル、 ｐＨ ７〜９、好ましくは８〜８．５、または次の
組成を有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
アセテートエチレンジアミン四酢酸緩衝液（ＴＡＥ）： トリス １０〜１００ミリモル、好ましくは３０〜９
０ミリモル、とくに好ましくは４０ミリモル、 酢酸ナト リウム １〜１００ミリモル、好ましくは５〜５０ミ
リモル、 ＥＤＴＡ １〜１０ミリモル、好ましくは１〜２．５ミ
リモル、 ｐＨ ７〜９、好ましくは７．５〜８．５。
【０１２７】電気泳動の詳細なリストおよび記載は、次
の文献に記載されている： − 分子生物学的における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１９８７−１９８８、ウィリイ−
インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ）発行、１９８７、 − 分子クローニングに対する実際的ガイド（Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｂ．パーバル（Ｐｅｒｂａ
ｌ）、第２版、ウィリイ−インターサイエンス（Ｗｉｌ
ｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）発行、１９８８、 − 分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ． − ウイルス学における作業方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｉｓ
ｃｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ）、Ｖｏｌ．
ＩＩＩ、グスタフ・フィッシャー・フェルラーグ（Ｇｕ
ｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）、１９８
９。
【０１２８】この方法のための手順は、前述の「分子ク
ローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）」ま
たはウイルス学における作業方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｉｓ
ｃｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ）、Ｖｏｌ．
３に記載されている。
【０１２９】挿入部位をもつＤＮＡ断片を、例えば、そ
の断片を含有する支持体のエレクトロポレイションによ
り、その支持体から分離する。あるいは、低融点のアガ
ロース法［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．］またはガラス表面
へのＤＮＡ断片の吸着［ジーン−クリーン（Ｇｅｎｅ−
ｃｌｅａｎR）法］を使用する。
【０１３０】ＤＮＡ断片を分離するために、二本鎖プラ
スミドまたはファージのベクターのＤＮＡ分子を制限酵
素で処理して、挿入に適当な末端を生成する。
【０１３１】使用するプラスミドの例は、ｐＡＴ１５
３、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８／１９、ｐＢＲ３２
２、ｐＳＰ６４／６５である。
【０１３２】ファージのベクターとして、ラムダファー
ジの変異型、例えば、−ＺＡＰ、−ｇｔ１０／１１また
はファージＭ１３ｍｐ１８／１９を使用する。
【０１３３】使用できる制限酵素は、例えば、遺伝子
（Ｇｅｎｅ）Ｖｏｌ．９２（１９８９）エルセビーア・
サイエンス・パブリッシャーズ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）ＢＶアムステル
ダムからそれ自体知られている。
【０１３４】制限酵素で処理したプラスミド、またはフ
ァージのベクターを過剰の、例えば、ほぼ５対１の比
の、挿入すべきＤＮＡ断片と混合し、そしてＤＮＡリガ
ーゼで処理して、ベクターの中でＤＮＡ断片を末端対末
端で共有結合する。
【０１３５】リガーゼは２つのＤＮＡ分子を３’−ＯＨ
−５’基を経て連鎖することができる酵素である。
【０１３６】プラスミドの複製のために、結合混合物を
原核生物または真核生物、好ましくはバクテリアの細胞
の中に導入し、そしてその細胞を成長させる。
【０１３７】使用するバクテリアの例は、大腸菌株Ｋ−
１２およびその誘導体、例えば、Ｋ１２−６００である
［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．］。
【０１３８】結合混合物およびバクテリアの培養物の調
製は、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．に記載されているように
それ自体知られている方法で実施する。
【０１３９】挿入された外来ＤＮＡをもつプラスミドを
含有するバクテリアを選択する。
【０１４０】あるいは、２（上の）に従いベクターの中
に既に挿入されそして、４（上の）に従い、同定された
挿入部位を含有するＥＨＶのＤＮＡ断片を、シャトルベ
クターの調製のための出発物質として使用することがで
きる。
【０１４１】ｂ）適当ならば、いわゆる「ポリリンカ
ー」を同定された挿入部位の中に挿入する。このため
に、同定された挿入部位をもつＥＨＶのＤＮＡ断片を、
唯一の点でその断片を開く制限酵素で処理する。このよ
うにして開いた断片を、他の制限酵素の認識部位のター
ゲッティングした挿入のために、ポリリンカーおよびリ
ガーゼとインキュベーションする。
【０１４２】ポリリンカーは、順次に一緒に接続した少
なくとも２つの制限酵素の認識部位を有するＤＮＡ配列
である。
【０１４３】リガーゼとして、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを述べることができる。
【０１４４】ポリリンカーを遊離ＤＮＡ断片の中に挿入
するか、あるいはプラスミドまたはファージのベクター
の中に組み込まれたＤＮＡ断片の中に挿入する。
【０１４５】ポリリンカーを遊離の外来ＤＮＡの中に挿
入する場合、ポリリンカーを含有する断片を引き続いて
プラスミドの中に挿入し、これらのプラスミドを原核生
物または真核生物、好ましくはバクテリアの細胞の中で
複製させ、そして後者を選択する。
【０１４６】ポリリンカーをプラスミドの中に含有され
るＤＮＡ断片の中に挿入する場合、このようにして得ら
れるプラスミドを原核生物または真核生物、好ましくは
バクテリアの細胞の中で複製させ、そして選択する。
【０１４７】ｃ）同定された挿入部位をもつＤＮＡ断片
の部分配列の欠失。
【０１４８】このために、ＤＮＡ断片を制限酵素で処理
し、そして生ずる断片を分画化する。分画化は前述の方
法により実施する。
【０１４９】ｄ）挿入部位の中への外来ＤＮＡの挿入。
【０１５０】同定された挿入部位をもつＥＨＶのＤＮＡ
断片は、遊離の形態であるか、あるいはプラスミドの中
に挿入されており、その断片を挿入部位においてまたは
挿入されたポリリンカーの中で分画化する１または２以
上の制限酵素で処理する。
【０１５１】外来ＤＮＡを、リガーゼを使用する粘着末
端または平滑末端のそれ自体知られている方法により、
認識部位の中に挿入する。ＥＨＶ断片が、例えば、プラ
スミドの中に挿入された場合、リガーゼ反応後のインキ
ュベーション混合物を原核生物または真核生物、好まし
くはバクテリアの細胞の中に導入し、そして後者を選択
する。
【０１５２】ＤＮＡ断片の挿入の前のＥＨＶのＤＮＡ断
片が遊離の形態である場合、挿入をもつＤＮＡ断片をプ
ラスミドの中に挿入し、原核生物または真核生物、好ま
しくはバクテリアの細胞の中に導入し、そして後者を成
長させそして選択する。
【０１５３】シャトルベクターの調製に使用する前述の
方法は、次の文献にに詳細に記載されている：「分子ク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）」、実験室のマニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１９８９、Ｊ．サムブル
ック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１５４】項目６。
【０１５５】ベクターのウイルスのゲノムの中への外来
ＤＮＡの挿入 次の方法を使用して外来遺伝子の要素をベクターのウイ
ルスの中に組み込む： ａ）シャトルベクターのＤＮＡおよびベクターのウイル
スの自然ＤＮＡを適当な宿主細胞の中に同時トランスフ
ェクションする、 ｂ）シャトルベクターＤＮＡのトランスフェクションお
よび適当な宿主細胞の中へのベクターのウイルスの感
染、 ｃ）ベクターのウイルスを使用する感染およびシャトル
ベクターＤＮＡを使用する適当な宿主細胞の中へのトラ
ンスフェクション。
【０１５６】これに適当な方法は、次の文献に記載され
ている：「ウイルス学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」Ｖｏｌ．ＶＩ（１９７
７）、Ｋ．マラモロシュ（Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ）、
Ｈ．コプロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）編、アカデ
ミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニ
ューヨーク、サンフランシスコ、ロンドン。好ましい方
法はいわゆるリン酸カルシウム技術である［「ウイルス
学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ）」Ｖｏｌ．ＶＩ（１９７７）、Ｋ．マラモロシュ
（Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ）、Ｈ．コプロウスキー（Ｋ
ｏｐｒｏｗｓｋｉ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、サンフラン
シスコ、ロンドン］。好ましくは、方法ａ）を使用す
る。このために、次の工程を必要とする： １、前述の方法により得られそしてシャトルベクターを
含有する形質転換された細胞を成長させる、そしてシャ
トルベクターを細胞から分離し、そしてさらにそれ自体
知られている方法において精製する。精製は、例えば、
ＣｓＣｌの密度勾配の等比重遠心分離により実施する。
【０１５７】ベクターのウイルスを成長させそして精製
する。ウイルスのゲノムを抽出し、そしてさらに精製す
る。精製は、例えば、ＣｓＣｌの密度勾配の等比重遠心
分離により実施する。
【０１５８】２、円形のまたは直線化されたシャトルベ
クターのＤＮＡを同時トランスフェクションに使用でき
る。好ましくは、直線化された形態を使用する。
【０１５９】直線化は、例えば、１において精製された
シャトルベクターのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで
処理することによって実施する。好ましい制限エンドヌ
クレアーゼは外来ＤＮＡの全体の分離を可能とする。こ
のために、外来ＤＮＡの中に認識配列をもたないすべて
の制限エンドヌクレアーゼは原理的には適当である。 ３、ベクターのウイルスのＤＮＡおよびシャトルベクタ
ーのＤＮＡを、０．０１〜０．１×１０-12モルのベク
ターのウイルスのＤＮＡ／１〜３×１０-12モルのシャ
トルベクターのＤＮＡの比で混合する。シャトルベクタ
ーの分子比において最も適当なベクターのウイルスのＤ
ＮＡ／外来ＤＮＡのインサートは１：３０である。
【０１６０】４、ＤＮＡの混合後、ＤＮＡを、例えば、
リン酸カルシウムで同時に沈澱させ、そして適当な細胞
に移す（同時トランスフェクション）、参照、分子クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌ
ｏｃ．ｃｉｔ．。
【０１６１】適当な細胞は動物の細胞、好ましくは哺乳
動物の細胞、例えば、ウマまたはウサギの細胞であり、
永久的なウマの細胞系ＥＤはとくに好ましい（例えば、
ＡＴＣＣ ＣＣＬ５７またはその子孫）。
【０１６２】混合したＤＮＡは、また、細胞の中に他の
方法により導入することができる。ＤＥＡＥデキストラ
ン、またはリポソーム［例えば、リポフェクチン（Ｌｉ
ｐｏｆｅｃｔｉｎR）またはエレクトロポレイションを
使用するそれ自体知られている方法を述べることのでき
る。
【０１６３】５、細胞は前述の方法により培養する（適
当なＥＨＶ株の選択）。
【０１６４】６、細胞変性作用が起こるとき、培地を除
去し、細胞の破片を適当ならば遠心または濾過により除
去しそして、適当ならば、貯蔵しそしてウイルスの単一
プラークの精製の慣用方法により処理する。
【０１６５】７、外来ＤＮＡを含有する組み換えベクタ
ーのウイルスの選択を、挿入された外来ＤＮＡに依存し
て、例えば、次の方法により実施する： ａ）組み換えベクターのウイルスによる外来ＤＮＡの発
現、 ｂ）外来ＤＮＡの存在を、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡのハ
イブリダイゼーションにより、検出する。
【０１６６】項目ａ）。
【０１６７】外来ＤＮＡの発現はＲＮＡまたはタンパク
質レベルで実施することができる。タンパク質レベルに
おける外来ＤＮＡの発現は、例えば、細胞をベクターの
ウイルスで感染させ、引き続いて外来ＤＮＡによりエン
コードされるタンパク質に対する抗体を使用する免疫蛍
光分析によるか、あるいは外来ＤＮＡによりエンコード
されるタンパク質に対する抗体で感染細胞のリゼイトか
ら沈澱させることによって、検出することができる。
【０１６８】ＲＮＡレベルにおける外来ＤＮＡの発現
は、ベクターのウイルスで感染した細胞からのＲＮＡ
を、挿入された外来ＤＮＡに少なくとも一部分同一であ
るＤＮＡとハイブリダイゼーションすることによって、
検出することができる。
【０１６９】項目ｂ）。
【０１７０】この目的で、ＤＮＡを問題のウイルスから
獲得し、そして挿入された外来ＤＮＡに少なくとも一部
分同一であるＤＮＡとハイブリダイゼーションすること
ができる。
【０１７１】８、単一プラーク精製しそして組み換え体
として同定されたベクターのウイルスを、外来ＤＮＡの
存在および／または発現について再び検査する。外来Ｄ
ＮＡを安定にを含有するおよび／または発現する組み換
えベクターはそれ以上の使用のために利用することがで
きる。
【０１７２】
【実施例】ＥＨＶ−２ウイルスの組み換え体の構成 １、ＥＨＶ−２ＤＮＡの調製 １．１、ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３をウマ
皮膚細胞（ＥＤ）（１０）またはよりプラスチックの培
養びん、１５０ｃｍ、６５０ｍｌ［コスター（Ｃｏｓｔ
ａｒ）により供給される］上で３７℃において４〜６日
間培養した。培地：Ｅ−ＭＥＭ ２．０ｇ（イーグル最
小必須培地 ２．０ｇのＮＨ4ＨＣＯ3／ｌ）、１０％の
胎児仔ウシ血清［フロウ（Ｆｌｏｗ）により供給され
る］［ウイルス学の作業法（Ｖｉｒｏｌ．Ａｒｂｅｔｓ
ｍｅｔｈｄｅｎ）Ｖｏｌ．１、グスタフ−フィッシャー
・フェルラーグ（ｇｕｓｔａｖ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｖｅｒ
ｌａｇ）、スツッツガルト１９７４、Ａ．メイア（Ｍａ
ｙｒ）、Ｏ．Ａ．バチマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ］、Ｂ．
ビブラック（Ｂｉｂｒａｃｋ）およびＧ．ウィットマン
（Ｗｉｔｔｍａｎｎ）］。
【０１７３】１．２、次いで、感染した細胞からの上澄
み液を５，０００ｒｐｍで遠心して細胞の構成成分を除
去した。
【０１７４】１．３、細胞不含上澄み液を２５，０００
ｒｐｍで超遠心した［ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｓ
Ｗ−２７ローター、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）から
供給される］。
【０１７５】１．４、ヴィリオンのペレットをリン酸塩
緩衝液（ＰＢＳ）（８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＨ2Ｈ
ＰＯ4、１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２ｇのＫＣ
ｌ、蒸留水を添加して１リットルする）またはＴＮＥ
（０．５モルのトリス、０．１モルのＮａＣｌ、０．０
０１モルのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）の中に再懸濁し、そ
してスクロースのクッション（ＴＮＥまたはＰＢＳの中
に緩衝化した３０％の水性スクロース）の上で２５，０
００ｒｐｍにおいて１時間遠心した。
【０１７６】１．５、このようにして精製したヴィリオ
ンのペレットを２０ｍｌのＴＮＥの中に再懸濁し、そし
て２ｍｌの１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
で１％のＳＤＳの最終濃度に調節した。この処理はヴィ
リオンを溶菌する。
【０１７７】１．６、１００μｇ／ｍｌのプロテイナー
ゼＫ［ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により供
給される］を添加しそして３７℃において１時間インキ
ュベーションした［グロス−ベラード（Ｇｒｏｓｓ−Ｂ
ｅｌｌａｒｄ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）
３６：ｐ．３２］。
【０１７８】１．７、ＤＮＡをマームア（Ｍａｒｍｕ
ｒ）の方法［１９６１、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）３：ｐ．
２０８］によりフェノールで２回抽出し、引き続いてク
ロロホルム／イソアミルアルコールで抽出する。
【０１７９】１．８、上澄み液を８モルの酢酸カリウム
溶液で０．８モルの酢酸カリウムの濃度に調節し、次い
でその体積の３倍の無水エタノール（＜−２０℃）を添
加した。エタノールＤＮＡ抽出溶液を−２０℃において
一夜放置し、次いで−２０℃において６，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心した。
【０１８０】１．９、上澄み液のデカンテーション後、
ＤＮＡペレットを０．０１または０．１×ＳＳＣ（１×
ＳＳＣは０．１５モルのＮａＣｌ、０．０１５モルのク
エン酸ナトリウムから成る、ｐＨ７．２）中に溶解し
た。
【０１８１】１．１０、ＤＮＡの純度および濃度の決定
を、２６００ｎｍおよび２８０ｎｍの波長における吸収
の光測定法により実施した。
【０１８２】１．１１、ＤＮＡを４℃において貯蔵し
た。
【０１８３】２、ＥＨＶ−２遺伝子バンクの確立 全体のウイルスのＤＮＡ配列を収容するＥＨＶ−２株
Ｔｈｅｉｎ ４００／３の定義した遺伝子バンクを、制
限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢａｍＨＩについて確立した。
【０１８４】２．１、１０μｇのＥＨＶ−２のＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼＥＨＶ−１［ベーリンガー（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により供給される、２０Ｕ／μ
ｇ］で製造業者により特定された条件下に制限した。
【０１８５】２．２、生ずる断片をアガロース［ＢＲＬ
により供給される］ゲルの電気泳動［（８０Ｖ、２０時
間、４℃）、シャープ（Ｓｈａｒｐ）ら（１９７３）バ
イオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１２：
３０５５−３０６３の方法により］において分画化す
る。
【０１８６】２．３、ゲルを臭化エチジウム（５μｇ／
ｍｌ）で染色しそしてＤＮＡ断片を紫外線下に可視化し
た。アガロースゲルから１８の生ずるＤＮＡバンド（Ｅ
ＨＶ−２のＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ａ〜Ｒ）を切断する
ことによって、ＤＮＡ断片を調製した。
【０１８７】２．４、ＤＮＡ断片を次の文献に記載され
ているようにエレクトロポレイションにかけた：「分子
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）」、実験室のマニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１９８９、Ｊ．サムブル
ック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１８８】２．５、０．１ピコモル（６×１０10の分
子）のプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４［チャング
（Ｃｈａｎｇ）およびコウヘン（Ｃｏｈｅｎ）、１９８
７、Ｋ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３：１１４１］のＤ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで制限した。
引き続いて、次の文献に記載されているようにアルカリ
性ホスファターゼ［ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ）により供給される］で処理した：分子クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃ
ｉｔ．。
【０１８９】２．６、個々のＥＨＶ−２のＥｃｏＲＩの
ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４の
ＥｃｏＲＩおよびアルカリ性ホスファターゼで処理した
ＤＮＡと、２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ［ベーリンガー
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により供給される］を添加し
て、次の文献に記載されているように結合した：分子ク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、
ｌｏｃ．ｃｉｔ．。
【０１９０】２．７、能力Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００細胞
を、次の文献に記載されているように、結合混合物で形
質転換し、そして形質転換されたバクテリアのクローン
をテトラサイクリン抵抗性について選択した：分子クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌ
ｏｃ．ｃｉｔ．。
【０１９１】２．８、ＥＨＶ−２のＥｃｏＲＩのＤＮＡ
断片Ａ〜Ｒを含有する組み換えプラスミドを、次の文献
に記載されているように、培養し、精製し、そして特性
決定した：分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。
【０１９２】３、ウイルスのゲノムの物理的地図の構成 ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３のウイルスのゲ
ノムの物理的地図（図１）は、次の文献に記載されてい
るように、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼのＥｃｏＲ
Ｉで部分的に処理し、末端標識し、そしてウイルスの遺
伝子バンクを使用してＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリダイゼ
ーションすることによって構成した：グロスマン（Ｇｒ
ｏｓｓｍａｎｎ）およびモルデイブ（Ｍｏｌｄａｖｅ）
（１９８９）：メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、Ｓ．Ｐ．
コロウィック（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ）およびＮ．Ｏ．カプ
ラン（Ｋａｐｌａｎ）、アカデミック・プレス（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、および分子
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。ＤＮＡ断片の各々のゲノムの
座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を表１に記載する。
【０１９３】
【表１】
【０１９４】４、ウイルスのゲノムの反復ＤＮＡ配列の
特性決定 ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３のウイルスのゲ
ノムの反復ＤＮＡ配列を、次の文献に記載されているよ
うに、ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｌ
およびＭにおけるウイルスの遺伝子バンクを使用してＤ
ＮＡ／ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより局在化し
た：グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ）およびモルデイ
ブ（Ｍｏｌｄａｖｅ）（１９８０）：メソッズ・イン・
エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）、Ｓ．Ｐ．コロウィック（Ｃｏｌｏｗｉｃ
ｋ）およびＮ．Ｏ．カプラン（Ｋａｐｌａｎ）、アカデ
ミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニ
ューヨーク、および分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。メソッズ
・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。これらの反復
ＤＮＡ配列の位置を図１に描写する。
【０１９５】５、外来遺伝子要素をＥＨＶ−２ゲノムの
中に転移するためのシャトルベクターの構成 ２つのシャトルベクターｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ１（図２）
およびｐＥＨ２−ＥＢｔ−Ｘ２（図３）を構成して、外
来遺伝子の情報をＥＨＶ−２ゲノムの中に挿入した。２
つのシャトルベクターは、ｐＡＴ１５３［ツウィッグ
（Ｔｗｉｇｇ）およびシェラット（Ｓｈｅｒａｔｔ）
（１９８０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８３：２１
６−１９］のバクテリアのプラスミド部分および、それ
ぞれ、ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｃの３ｋｂｐのＤＮＡ配
列（ｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ１）およびＥｃｏＲＩのＤＮＡ
断片Ｂの１．６ｋｂｐのＤＮＡ配列（ｐＥＨ２−ＥＢｔ
−Ｘ２）のウイルスの部分を有する。
【０１９６】５．１、シャトルベクターｐＸ２−ＥＨ２
−Ｃ１：シャトルベクターｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ１のウイ
ルスのインサートは、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩ
Ｉの認識配列により結合された、ＥｃｏＲＩのｄｆの２
つの末端領域を含有する。制限エンドヌクレアーゼＢｇ
ｌＩＩは２つの末端領域を、それぞれ、１．４および
１．６ｋｂｐの大きさの２つの半分に分割する。ポリリ
ンカー（ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ−Ｂ
ｇｌＩＩ）をこのＢｇｌＩＩ切断部位に挿入して外来遺
伝子要素の挿入を可能とした（参照、図２）。シャトル
ベクターｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ１の構成は次の工程におい
て実施した。使用した方法は次の文献に詳細に記載され
ている：分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。
【０１９７】５．１．１、ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｃ
（２０ｋｂｐ；ゲノムの座標０．５３７−０．６４６）
をバクテリアのプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４の
中に分子クローニングし、そして組み換えプラスミドｐ
ｙＥＨ２−Ｅ−Ｃを確立した。５．１．２、組み換えプ
ラスミドｐｙＥＨ２−Ｅ−ＣのＤＮＡを制限エンドヌク
レアーゼＢｇｌＩＩで制限した。ＢｇｌＩＩ切断部位は
ｐＡＣＹＣ１８４のＤＮＡ配列内に存在しないので、こ
の処理は外側のＢｇｌＩＩ切断部位により境界されたＥ
ｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｃ内のＤＮＡ配列の欠失を生ず
る。引き続いて、欠失された組み換えプラスミドのＤＮ
Ａを結合した。
【０１９８】５．１．３、欠失されたプラスミドのイン
サートを分離し、そしてＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ
Ｉのための切断部位をもつＤＮＡリンカーがＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩの認識配列内に挿入され、ＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩのもとの切断部位は排除されている
（ｐＡＴ１５３ヌクレオチド位置３〜３７５）バクテリ
アのプラスミドベクターｐＡＴ１５３の中に分子クロー
ニングした。組み換えプラスミドｐＥＨ２−Ｅ−Ｃを確
立した。
【０１９９】５．１．４、組み換えプラスミドｐＥＨ２
−Ｅ−ＣのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ
で制限し、そしてＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ−ＢｇｌＩＩのための認識配列を含有するＤＮＡリ
ンカーを挿入した。組み換えプラスミドｐＸ２−ＥＨ２
−Ｃ１を制限した（図２）。
【０２００】５．２、シャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢ
ｔ−Ｘ２：シャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢｔ−Ｘ２の
ウイルスのインサートは、ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｂの
右のフランクのＤＮＡ配列（１５９６ｂｐ）を含有し、
このＤＮＡ配列はポリリンカー（ＭｓｔＩＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＭｓｔＩＩ）がヌクレオチド位置
４８８に挿入されておりそして同様に外来ＤＮＡ要素の
挿入を可能とする（参照、図３）。
【０２０１】シャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢｔ−Ｘ２
の構成を次の工程で実施する。この方法は次の文献に記
載されている：分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。
【０２０２】５．２．１、ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｂ
（ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ）の右手の末端（１５９６ｂ
ｐ）をバクテリアのプラスミドベクターｐＡＴ１５３の
中に分子クローニングし、このｐＡＴ１５３の中にはＸ
ｂａＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｃｙＩのための切断部位をもつ
ＤＮＡリンカーがＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩの認識配列
内に挿入されており（ｐＡＴ１５３ヌクレオチド位置３
〜６５０）、ｐＡＴ１５３の中のＥｃｏＲＩのためのも
との認識部位が排除されている。組み換えプラスミドｐ
ＥＨ２−ＥＢｔを確立された。
【０２０３】５．２．２、Ｍ１３ファージ系の中のＤＮ
Ａヌクレオチド配列の決定により、ＥｃｏＲＩのＤＮＡ
断片の右手の末端を特性決定した。ＥｃｏＲＩのＤＮＡ
断片Ｂの個々の組み換えＭ１３ｍｐ１８および１９の一
本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を、修飾されたＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼを使用するジデオキシ連鎖停止法により
決定した［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９７７、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．）ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７；テイバー
（Ｔａｂｏｒ）およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄ
ｓｏｎ）、１９８７、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７４：４７６
７−４７７１］。ＤＮＡのヌクレオチド配列を図４に描
写する。
【０２０４】５．２．３、組み換えプラスミドｐＥＨ２
−ＥＢｔのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｓｔＩで
制限した（ＥＨＶのＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｂのヌクレ
オチド位置４８８）。ｐＡＴ１５３内のＤＮＡ配列内に
存在するＭｓｔＩ切断部位が存在しないので、組み換え
プラスミドはこの処理により直線化される。引き続い
て、ＭｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＭｓｔＩ
のための認識配列を含有するＤＮＡリンカーを挿入す
る。組み換えプラスミドｐＥＨ２−ＥＢｔ−Ｘ２を確立
した（図３）。
【０２０５】６、バクテリアのβ−ガラクトシダーゼを
発現する組み換えウマのヘルペスウイルス２型の構成 バクテリアのβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）を外来
遺伝子の情報として選択して、ＥＨＶ−２ゲノムが真核
生物のベクターとして機能しそして外来遺伝子要素を発
現することができることを実証した。使用した方法は、
次の文献に記載されている：分子クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。
【０２０６】６．１、バクテリアのβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子［ＬａｃＺカセット；ハル（Ｈａｌｌ）ら、１
９８３、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・ア
プライド・ジェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．）、２：１０１−１０６；ゴーマン（Ｇｏｒ
ｍａｎ）、１９８３、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２２１：５５１−５５３］を、組み換えプラスミドｐＥ
Ｈ２−ＢＢ−ＬＺからのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断
片として分離した［レーゼウォルフ（ＲｏｅｓｅｂＷｏ
ｌｆｆ）ら、１９９１、ウイルスの研究（Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｃｅａｒｃｈ）、印刷中］。
【０２０７】６．２、ＬａｃＺカセットをシャトルベク
ターｐＣ２−ＥＨ２−Ｃ１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａ
ｍＨＩ認識配列の中に挿入した（図２）。組み換えプラ
スミドｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ−ＬＺ（図５）は、ＬａｃＺ
カセットをシャトルベクターｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ１の中
に挿入すると、生ずる。この構成体は、制限エンドヌク
レアーゼＸｂａＩで処理することによって、ＥＨＶ−２
フランクおよびＬａｃＺカセットをもつ組み換えプラス
ミドの完全なインサートの分離を可能とする。６．３、
ＬａｃＺカセットをシャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢｔ
−Ｘ２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの認識配列の
中に挿入した（図３）。組み換えプラスミドｐＥＨ２−
ＥＢｔ−ＬＺ（図６）は、ＬａｃＺカセットをシャトル
ベクターｐＥＨ２−ＥＢｔ−Ｘ２の中に挿入すると、生
ずる。この構成体は、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ
で処理することによって、ＥＨＶ−２フランクおよびＬ
ａｃＺカセットをもつ組み換えプラスミドの完全なイン
サートの分離を可能とする。
【０２０８】６．４、ＥＨＶ−２ゲノムの中へのＬａｃ
Ｚカセットの転移は、次の文献に記載されているよう
に、ＤＮＡの同時トランスフェクションにより実施し
た：分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。トランスフェクションの
ために、組み換えプラスミドｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ−ＬＺ
またはｐＥＨ２−Ｂｔ−ＬＺのインサートの１〜３ピコ
モルのＤＮＡを、リン酸カルシウム法により、０．０１
〜０．１ピコモルの自然ＥＨＶ−２ Ｔ４００／３のＤ
ＮＡで同時に沈澱させた［グラハム（Ｇｒａｈａｍ）お
よびヴァン・デル（ｖａｎ ｄｅｒ）Ｒｂ、１９７３、
ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２：４５６−４６
７］。
【０２０９】６．５、同時の沈澱をＥＤ細胞の培養物の
トランスフェクションのために使用した。トランスフェ
クションした細胞の培養物を３７℃においてインキュベ
ーションした。トランスフェクションした細胞を各日に
細胞変性作用の発生（ＣＰＥ）について研究した。
【０２１０】６．６、ＣＰＥが発生したとき、ウイルス
の組み換え体を選択した。β−ガラクトシダーゼを発現
するウイルスの組み換え体の選択は青色のプラークの方
法により実施した。トランスフェクション後に単一のウ
イルスのプラークを収容するトランスフェクションした
細胞の培養物を、２５０μｇ／ｍｌの発色性物質５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル ベータ−Ｄ−ガラ
クトシド［Ｘ−Ｇａｌ、ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ）により供給される］を含有するＰＢＳ中の１％
のアガロース」ＢＲＬにより供給される）でカバーし
た。β−ガラクトシダーゼ活性が存在する場合、Ｘ−Ｇ
ａｌは４〜８時間以内に関連するウイルスのプラークの
青色を生ずる。
【０２１１】６．７、個々の青色のプラークを無菌のガ
ラスのカニューレ（直径１ｍｍ）で取り出し、そしてＥ
Ｄ細胞上で培養した。この手順を３回反復して、組み換
えウイルス株を精製した。ウイルスの組み換え体のＥＨ
Ｖ−２ゲノムの中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＤＮ
Ａ配列を、次の文献に記載されているように、ＤＮＡ／
ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより検出した：分子
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。これは次の組み換えウイルス
株を確立することができた：６．７．１、ＥＨＶ−２ゲ
ノムのＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片ＣのＤＮＡ配列内のその
ゲノムの中にＬａｃＺカセットを収容しそしてこの外来
遺伝子を発現することができる、組み換えウイルスＥＨ
Ｖ−２−Ｃ−ＬａｃＺ−６５８。個々のウイルスのプラ
ークによるβ−ガラクトシダーゼの発現は、節６．６に
記載するように、Ｘ−Ｇａｌで処理後の青色の発生によ
り検出することができる。１例は図７Ｂに描写されてい
る。
【０２１２】６．７．２、ＥＨＶ−２ゲノムのＥｃｏＲ
ＩのＤＮＡ断片ＢのＤＮＡ配列内のそのゲノムの中にＬ
ａｃＺカセットを収容しそしてこの外来遺伝子を発現す
ることができる、組み換えウイルスＥＨＶ−２−Ｂ−Ｌ
ａｃＺ−２３１。個々のウイルスのプラークによるβ−
ガラクトシダーゼの発現は、節６．６に記載するよう
に、Ｘ−Ｇａｌで処理後の青色の発生により検出するこ
とができる。１例は図７Ａに描写されている。
【０２１３】７、ＥＨＶ−１の糖タンパク質ｇＢのため
の遺伝子を含有するＥＨＶ−２ウイルスの組み換え体の
構成 ７．１、ＥＨＶ−１株Ｍａｒ８７の成長および精製 株Ｍａｒ８７［１９９０年７月２４日に、パスツール研
究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ）Ｃ．Ｎ．
Ｃ．Ｍ．に番号Ｉ−９８０で受託された］をＥＨＶ−１
の表示として選択した。ウイルスを３７℃において組織
培養で永久的ウマの皮膚（ＥＤ）上で成長させた。使用
した培地は、２．０ｇ／ｌのＮａＨＣＯ3を補充しそし
て細胞の成長の間に１０％のＦＣＳ（胎児仔ウシ血清）
を添加したＥ−ＭＥＭ［ウイルス学の作業法（Ｖｉｒｏ
ｌ．Ａｒｂｅｔｓｍｅｔｈｄｅｎ）Ｖｏｌ．１、グスタ
フ−フィッシャー・フェルラーグ（ｇｕｓｔａｖ−Ｆｉ
ｓｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）、スツッツガルト１９７４、
Ａ．メイア（Ｍａｙｒ）、Ｏ．Ａ．バチマン（Ｂａｃｈ
ｍａｎｎ］、Ｂ．ビブラック（Ｂｉｂｒａｃｋ）および
Ｇ．ウィットマン（Ｗｉｔｔｍａｎｎ）］であった。ウ
イルスを含有する培地を１００％のＣＰＥで収穫し、そ
して５０００×ｇで遠心して細胞の破片を除去した。ウ
イルス粒子を遠心上澄み液から２２，０００ｒｐｍで超
遠心機内のＳＷ−２７ローター［ベックマン（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ）により供給される］中で１時間沈澱させた。ウ
イルスのペレットをＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ；０．２ｇ
のＫＨ2ＰＯ4；１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4；０．２ｇの
ＫＣｌ；蒸留水で１リットルとする）の中に、あるいは
１×ＴＥＮ（５０ミリモルのトリス；０．１モルのＮａ
Ｃｌ；１ミリモルのＥＤＴＡ；ｐＨ７．２］の中に再懸
濁し、そして再びＳＷ−２７ローター内で２５，０００
ｒｐｍにおいて１時間スクロースのクッション（ＰＢＳ
または１×ＴＥＮ中の３０％のスクロース）を通して超
遠心することによって再沈澱させ、そして１×ＴＥＮの
中に再懸濁させた。
【０２１４】７．２、ＥＨＶ−１のゲノムのＤＮＡの精
製およびＢａｍＨＩのＤＮＡ断片のクローニング １×ＴＥＮの中に再懸濁したウイルス粒子を、水性１０
％の強度のドデシル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ）を１
％の最終ＳＤＳ濃度に添加することによって溶菌し、そ
してウイルスのタンパク質はプロテイナーゼＫ［ベーリ
ンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により供給される、最
終濃度１００μｇ／ｍｌ］の添加後分解し、そして３７
℃において１時間インキュベーションさせた［グロス−
ベラード（Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ）ら、ヨーロピ
アン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）３６、３２ｆｆ］。ゲノム
のＤＮＡの抽出をフェノールで２回抽出し、次いでクロ
ロホルム−イソアミルアルコールで抽出した［マーマー
（Ｍａｒｍｕｒ）１９６１、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、
３、２０８ｆｆ］。水性上澄み液を０．８モルの酢酸カ
リウムに調節し、３倍の体積のエタノールを添加し、そ
してこの混合物を−２０℃において一夜貯蔵した。沈澱
したＤＮＡを１０，０００×ｇにおいて遠心することに
よって沈降させた後、ＤＮＡのペレットを０．０１×Ｓ
ＳＣまたは０．１×ＳＳＣ中に溶解した（１×ＳＳＣ：
０．１５モルのＮａＣｌ、０．０１５モルのクエン酸ナ
トリウム；ｐＨ７．２］。
【０２１５】ＥＨＶ−１の精製したＤＮＡを制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨＩで製造業者［ベーリンガー・マ
ンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）］の指示に従い制限し、生ずるＤＮＡ断片をアガロ
ースゲルの電気泳動により分割した（８０Ｖ；２０時
間；４℃］［シャープ（Ｓｈａｒｐ）ら、１９７３、バ
イオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１２、
３０５５−３０６３］。ＤＮＡ断片ＢａｍＨＩ−Ａ（２
２ｋｂ）および−Ｉ（７ｋｂ）をアガロースゲルからエ
レクトロポレイション［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．］によ
り分離し、そして２つの断片の各々をプラスミドベクタ
ーｐＡＴ１５３［ツウィッグ、Ａ．およびシェラット
（Ｓｈｅｒａｔｔ）、１９８０、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２８３、２１６−２１８］の中でそのベクターの
ＢａｍＨＩ切断部位の中に分子クローニング［分子クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌ
ｏｃ．ｃｉｔ．］した。
【０２１６】７．３、糖タンパク質ｇＢのためのＥＨＶ
−１からの遺伝子のｐＵＣ１９の中のクローニング ＥＨＶ−１の１３８８ｂｐのＢａｍＨＩ断片Ａをもつ末
端のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩのＤＮＡ断片を分離した。こ
のために、ＥＨＶ−１のＢａｍＨＩ−ＡのクローンのＤ
ＮＡをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで制限し、断片をアガ
ロースゲルの電気泳動により分離し、そして１３８８ｂ
ｐをもつＤＮＡ断片を電気溶離により得た［分子クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏ
ｃ．ｃｉｔ．］。同様に、ＥＨＶ−１の２９０１ｂｐの
ＢａｍＨＩ断片をもつ末端のＢａｍＨＩ／ＣｌａＩのＤ
ＮＡ断片は、ＥＨＶ−１のＢａｍＨＩ−Ｉのクローンの
ＤＮＡを制限酵素のＢａｍＨＩおよびＣｌａＩとインキ
ュベーションし（二重消化、分子クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉ
ｔ．］、アガロースゲルの中で生ずるＤＮＡ断片を電気
泳動で分画化し、引き続いて２９０１ｂｐをもつＤＮＡ
断片を電気溶離することによって分離した。
【０２１７】分離されたＤＮＡ断片をプラスミドのベク
ターｐＵＣ１９の中に挿入し、こうしてそれからの生成
した組み換えプラスミドはＥＨＶ−１のｇＢのための完
全な遺伝子を含有した。このために、ベクターｐＵＣ１
９のＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで開き（二重消
化）、そして末端のＥｃｏＲＩ認識配列、末端のＰｓｔ
Ｉ認識配列および内部のＣｌａＩ認識配列を有する、化
学的に合成したＤＮＡのアダプターを開いたベクターの
中にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩの切断に挿入した［分子
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．］。このようにして修飾したプ
ラスミドベクターのＤＮＡを引き続いてＰｓｔＩおよび
ＣｌａＩで制限し、そして引き続いて開いたプラスミド
のＤＮＡをＢａｍＨＩの断片Ａの分離したＢａｍＨＩ／
ＰｓｔＩのＤＮＡ断片（１３８８ｂｐ）、ＥＨＶ−１の
ＢａｍＨＩ断片Ｉの分離したＢａｍＨＩ／ＣｌａＩのＤ
ＮＡ断片（２９０１ｂｐ）および酵素Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼとインキュベーションして、２つのＥＨＶ−１のＤＮ
Ａ断片を挿入した［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．］。このよ
うにして調製され、４２８３ｂｐのインサートとしてＥ
ＨＶ−１のｇＢのための完全な遺伝子を含有する、組み
換えプラスミド（位置９１５におけるＡＴＧ、位置３８
９０におけるＴＡＡ）をｐ１９−ＥＨＶ−１−ＧｐＢと
呼んだ（参照、図８）。
【０２１８】引き続いて、次の塩基配列
【０２１９】
【化１】
【０２２０】をもつ二本鎖のデオキシリボヌクレオチド
配列、フランキングするＰｓｔＩ部位および内部のＢｓ
ｔＢＩ（ＡｕｓＩＩ）部位を有するＤＮＡアダプターを
組み換えｐ１９−ＥＨＶ−１−ＧｐＢの中に化学的合成
し、そしてプラスミドｐ１９−ＥＨＶ−１−ＧｐＢのＰ
ｓｔＩ認識配列の中に挿入した。このために、プラスミ
ドをＰｓｔＩで培養し、そして直線化したプラスミドを
二本鎖ＤＮＡアダプターおよびＴ４ＤＮＡリガーゼとイ
ンキュベーションした。
【０２２１】ヌクレオチド配列
【０２２２】
【化２】
【０２２３】をもち、フランキングするＣｌａＩ部位お
よび内部のＡｆｌＩＩ（ＢｆｒＩ）部位をもつ、第２の
二本鎖ＤＮＡアダプターを化学的に合成し、そしてｐ１
９−ＥＨＶ−１−ＧｐＢのＣｌａＩ部位の中に挿入し
た。このために、第１アダプターをもつプラスミドをＣ
ｌａＩで処理し、引き続いて第２二本鎖ＤＮＡアダプタ
ーおよびＴ４ＤＮＡリガーゼとインキュベーションし
た。新しく生成したプラスミドをｐ１９−ＥＨＶ−１−
ｇＢ−Ｍ４と呼んだ（図９）。
【０２２４】７．４、ＥＨＶ−１のｇＢの遺伝子をＥＨ
Ｖ−２のゲノムの中に挿入するためのシャトルベクター
の調製 塩基配列
【０２２５】
【化３】
【０２２６】をもち、フランキングＢａｍＨＩ部位およ
び内部のＢｓｔＢＩ（ＡｆｌＩＩ）およびＢｆｒＩ（Ａ
ｆｌＩＩ）部位をもつ二本鎖ＤＮＡ配列を化学的に合成
し、そして二本鎖ＤＮＡアダプターとしてシャトルベク
ターｐＥＨ２−ＥＢｔ−ＬＺ、これは実施例６．３に記
載しそして既にＬａｃＺのマーカー遺伝子を有する、の
中に、ＢａｍＨＩの認識配列の中に挿入した。このため
に、ｐＥＨ２−ＥＢｔ−ＬＺをＢａｍＨＩで処理し、引
き続いてここに記載するＴ４ＤＮＡリガーゼおよび二本
鎖ＤＮＡアダプターとインキュベーションした。プラス
ミドｐＥＨ２−ＥＢ−ＬＺが得られた（参照、図１
０）。
【０２２７】フランキングＢａｍＨＩ部位および内部の
ＢｓｔＢＩ（ＡｕｓＩＩ）およびＢｆｒＩ（ＡｆｌＩ
Ｉ）部位をもつ同一の二本鎖ＤＮＡアダプターを、二本
鎖ＤＮＡアダプターとして、ＬａｃＺのためのマーカー
遺伝子を既に収容する組み換えプラスミドｐＸ２−ＥＨ
２−Ｃ−ＬＺ（参照、上の実施例６．２）のＢａｍＨＩ
部位の中に、ｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ−ＬＺをＢａｍＨＩで
処理し、引き続いて切断したプラスミドのＤＮＡを合成
的に調製したＤＮＡ配列およびＴ４ＤＮＡリガーゼとイ
ンキュベーションすることによって挿入した。プラスミ
ドｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺが得られた（参照、図１１）。
【０２２８】ｐ１９−ＥＨＶ−１−ｇＢ−Ｍ４からのｇ
ＢのためのＥＨＶ−１の遺伝子を、シャトルベクターｐ
ＥＨ２−ＥＣ−ＬＺおよびｐＥＨ２−ＥＢ−ＬＺの中へ
の挿入のために分離した。このために、プラスミドｐ１
９−ＥＨＶ−１−ｇＢ−Ｍ４を二重消化において制限酵
素ＢｓｔＢＩおよびＢｆｒＩで処理し、そして生ずるＤ
ＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動により分割した
［シャープ（Ｓｈａｒｐ）ら、１９７３、バイオケミス
トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１２、３０５５−
３０６３］。ＥＨＶ−１のｇＢの遺伝子を含有する４２
８３ｂｐをもつＤＮＡ断片をゲルから電気溶離により分
離した［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．］。
【０２２９】ＥＨＶ−１のｇＢのための遺伝子をもつ４
２８３ｂｐのＤＮＡ断片を、ここで各場合において、２
つの組み換えプラスミドｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺおよびｐ
ＥＨ２−ＥＢ−ＬＺのＢｓｔＢＩおよびＢｆｒＩ認識配
列の中に挿入した。組み換えプラスミドｐＥＨ２−ＥＢ
−ＬＺのＤＮＡを、二重消化において、制限酵素Ｂｓｔ
ＢＩおよびＢｆｒＩで処理した。制限し、こうして直線
化したプラスミドのＤＮＡを４．２８ｋｂｐのＤＮＡ断
片およびＴ４ＤＮＡリガーゼとインキュベーションし、
こうしてＥＨＶ−１のｇＢのための遺伝子を挿入した。
シャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇＢが
得られた［ＥＨＶ−１のｇＢおよびＥ．ｃｏｌｉからの
ＬａｃＺの遺伝子のＥＨＶ−２のゲノムの中への転移に
ついて、図１２を参照］。
【０２３０】第２アプローチにおいて、組み換えプラス
ミドｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺのＤＮＡを二重消化において
制限酵素ＢｓｔＢＩおよびＢｆｒＩで処理した。制限
し、こうして直線化したプラスミドのＤＮＡを前述の
４．２８ｋｂｐのＤＮＡ断片およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
とインキュベーションし、こうしてＥＨＶ−１のｇＢの
遺伝子をまたこのプラスミドの中に挿入した。第２シャ
トルベクターｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇＢが得ら
れた［同様に、ＥＨＶ−１のｇＢおよびＥ．ｃｏｌｉか
らのＬａｃＺの遺伝子のＥＨＶ−２のゲノムの中への転
移について、図１３を参照］。
【０２３１】７．５、ＥＨＶ−１のｇＢおよびＥ．ｃｏ
ｌｉのＬａｃＺの遺伝子を有するＥＨＶ−２の組み換え
体の調製のためのＥＨＶ−２−Ｔ４００のＤＮＡおよび
シャトルベクターのＤＮＡを使用するトランスフェクシ
ョンの実験 ＥＨＶ−２のゲノムの中へのＬａｃＺ遺伝子およびＥＨ
Ｖ−１−ｇＢ遺伝子の転移をＤＮＡの同時トランスフェ
クションにより実施した。
【０２３２】このために、最初にプラスミドｐＥＨ２−
ＥＢ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇＢのＤＮＡをＸｂａＩで制限し、
そして生ずる断片をアガロースゲルの電気泳動により分
割した。インサートを発現した１５ｋｂをもつＤＮＡ断
片を電気溶離した［分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．］。
【０２３３】ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３の
ウイルスのＤＮＡを分離し、そしてＣｓＣｌ勾配で精製
した。
【０２３４】２４ウェルのプレートの中で培養物いた全
面成長のＥＤ細胞の単層を１回ＤＥＡＥ−デキストラン
を補充した培地（分子量２，０００，０００、濃度１ｍ
ｇ／ｍｌ）で、次いでＤＥＡＥ−デキストランを補充し
た培地（分子量２，０００，０００、濃度０．１ｍｇ／
ｍｌ）で、培地で２回洗浄し、引き続いて１００μｌ／
ウェルのＤＥＡＥ−デキストランを補充した培地（分子
量２，０００，０００、濃度０．０５ｍｇ／ｍｌ）と混
合した。
【０２３５】各場合において、１５μｌ中のプラスミド
ｐＥＨ２−ＥＢ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇＢのインサートの１〜
３ピコモルのＤＮＡをデキストラン処理したＥＤ細胞／
ウェルに添加した。さらに、各場合において５５μｌ中
のＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ４００／３の０．０１〜
０．１ピコモルのＤＮＡを各ウェルに添加した。
【０２３６】第２のアプローチにおいて、デキストラン
処理したＥＤ細胞を各場合において２５μｌ中のプラス
ミドｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇＢのインサートの
１〜３ピコモルのＤＮＡおよび各場合において５５μｌ
中のプラスミドｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇＢのイ
ンサートの０．０１〜０．１ピコモルのＤＮＡと混合し
た。
【０２３７】培養物を３７℃において６時間インキュベ
ーションした。
【０２３８】トランスフェクションした細胞培養物を、
ここで、５％のＦＣＳを補充した培地中で３７℃におい
てインキュベーションし、そして各日に細胞変性作用
（ＣＰＥ）の発生について試験した。
【０２３９】ＣＰＥが発生したとき、ウイルスの組み換
え体を選択した。β−ガラクトシダーゼを発現するウイ
ルスの組み換え体を青色のプラーク法により選択した。
トランスフェクション後に、ウイルスのプラークを散発
的に形成するトランスフェクションした細胞培養物を、
２５０μｇ／ｍｌの発色性物質の５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル ベータ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−
Ｇａｌ、ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により
供給される］を含有するＰＢＳ中の１％のアガロース
（ＢＲＬにより供給される］の層でカバーした。β−ガ
ラクトシダーゼ活性が存在するとき、Ｘ−Ｇａｌは４〜
８時間以内に関連するウイルスのプラークの青色を生ず
る。
【０２４０】単一の青色のプラークを無菌のカニューレ
（直径１ｍｍ）で突き刺し、そしてＥＤ細胞に移した。
この手順を反復して、組み換えウイルスの株を精製し
た。
【０２４１】ウイルスの組み換え体のＥＨＶ−２のゲノ
ム中のｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列をＤＮＡ／ＤＮＡのハイ
ブリダイゼーションにより検出した。このために、感染
した細胞をニトロセルロースのフィルターに移し、溶菌
し、そして固定した。
【０２４２】ＥＨＶ−１−ｇＢ特異的プローブを次の方
法で調製した：プラスミドｐ１９−ＥＨＶ−１−ｇＢ−
Ｍ４のＤＮＡを二重消化において酵素ＰｓｔＩおよびＣ
ｌａＩで制限し、生ずるＤＮＡ断片をアガロースゲルの
電気泳動により分割し、そして４．２８ｋｂｐをもつＤ
ＮＡ断片をゲルからの電気溶離により分離した。この分
離したＤＮＡを32Ｐで放射線標識し［リグバイ（Ｒｉｇ
ｂｙ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１１４、２３７−２
５６の方法］そしてハイブリダイゼーションにおいてＥ
ＨＶ−２組み換え体の中のＥＨＶ−１のｇＢの遺伝子の
ＤＮＡ配列の検出に使用した。
【０２４３】このようにして、マーカー遺伝子（ｌａｃ
Ｚ）の外に、また、ＥＨＶ−１のｇＢの遺伝子を収容す
る組み換えＥＨＶ−２株を確立することができる。例え
ば、シャトルベクターｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇ
Ｂの助けにより、ＥＨＶ−１のｇＢ遺伝子を含有する組
み換え体ＥＨ２ＬＺｇＢ４およびＥＨ２ＬＺｇＢ３を構
成することができた。
【０２４４】このようにして同定されそしてＤＮＡ配列
を含有し、ＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリダイゼーションに
より検出された、ＥＨＶ−１のｇＢ遺伝子のＥＨＶ−２
組み換え体を、再び、ＥＤ細胞上に接種して単一のプラ
ークを形成した。ＥＨＶ−２組み換え体ＥＨ２ＬＺｇＢ
４５およびＥＨ２ＬＺｇＢ１２３をこのようにして分離
した。
【０２４５】外来ＤＮＡの転写をＤＮＡ／ＤＮＡのハイ
ブリダイゼーションにより実施した。このために、ＥＤ
細胞を５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞の感染投
与量においてウイルスの組み換え体で感染させた。これ
らの感染した細胞からのＲＮＡを、グアニジンＨＣｌお
よび塩化カルシウムにより、グリシン（Ｇｌｉｓｉｎ）
ら［１９７４、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）１０６、４９２ｆｆ］およびウルリッチ（Ｕ
ｌｌｒｉｃｈ）ら［１９７７、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、１９６、１３１３ｆｆ］の方法に従い抽出し
た。引き続いて、前述のＥＨＶ−１−ｇＢ特異的ＤＮＡ
によりＥＨＶ−１−ｇＢ特異的ＲＮＡの含量を決定する
分析を、次の文献に記載されている方法により実施し
た：レーラッチ（Ｌｅｈｒａｃｈ）ら、バイオケミスト
リー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１６、４７４３−４
７５１、および分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｌｏｃ．ｃｉｔ．。
【０２４６】ＥＨＶ−１−ｇＢ特異的ＲＮＡを検出する
ために、プラスミドｐ１９−ＥＨＶ−１−ｇＢ−Ｍ４の
インサートをプローブとして使用した。この方法を使用
して、ウイルスの組み換え体ＥＨ２ＬＺｇＢ４５および
ＥＨ２ＬＺｇＢ１２３で感染させたＥＤ細胞の中の特異
的ＲＮＡを検出することができた。外来ＤＮＡの翻訳を
免疫学的に検出した。
【０２４７】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。
【０２４８】１、その複製に必要なゲノムの配列の外
に、１または２以上の外来ＤＮＡ要素を有するウマのヘ
ルペスウイルス（ＥＨＶ）。
【０２４９】２、その複製に必要なゲノム配列の外に、
１または２以上の外来ＤＮＡ要素を有する、非ビルレン
トのまたは弱毒化されたウマのヘルペスウイルス（ＥＨ
Ｖ）。
【０２５０】３、その複製に必要なゲノム配列の外に、
１または２以上の外来ＤＮＡ要素を有し、前記外来ＤＮ
Ａ要素はそれらの反復ＤＮＡ配列の中にまたはその複製
に必要ではない他のゲノム配列の中に位置する、非ビル
レントのまたは弱毒化されたウマのヘルペスウイルス
（ＥＨＶ）。
【０２５１】４、その複製に必要ではないゲノム配列の
中の１または２以上のセグメントは存在しない、上記第
１、２または３項記載のウマのヘルペスウイルス。
【０２５２】５、１または２以上のＤＮＡセグメントを
含有し、前記ＤＮＡセグメントはタンパク質の遺伝情報
を指定しおよび／または、挿入のために、ＥＨＶのゲノ
ムの配列の機能を不活性化しおよび／またはＥＨＶのゲ
ノムを要求される位置において標識する、上記第１、
２、３および４項記載のウマのヘルペスウイルス。
【０２５３】６、ａ）ＥＨＶ株のための遺伝子バンクを
このウイルスのゲノム断片から確立し、そしてその物理
的ゲノム地図を構成するか、あるいは、適当ならば、現
存する遺伝子バンクに、あるいは分離されたＥＨＶのＤ
ＮＡ断片に頼り、 ｂ）外来ＤＮＡの導入のための１または２以上の挿入部
位を、それ自体知られている方法において、このＥＨＶ
株のゲノムの中であるいは１または２以上のゲノムの断
片上で同定し、前記断片はプラスミドまたは他のベクタ
ーの中に含有されることができ、 ｃ）適当ならば、（ｂ）（上の）に従い同定された１ま
たは２以上の挿入部位をもつゲノムの中であるいは１ま
たは２以上のゲノム断片上で１または２以上の欠失を実
施し、ゲノム断片はプラスミドまたは他のベクターの中
に含有されることができ、 ｄ）外来ＤＮＡ要素を、それ自体知られている方法にお
いて、（ｂ）（上の）に従い同定された１または２以上
の挿入部位の中に挿入するか、あるいは欠失が（ｃ）
（上の）に従い実施された１または２以上の領域の中に
挿入して、いわゆるシャトルベクターを生成し、 ｅ）適当ならば、（ｄ）（上の）に従うシャトルベクタ
ーを、ウイルスの成長に適当な細胞の中でウマのヘルペ
スウイルスのゲノムと一緒に同時トランスフェクション
するか、あるいは別の工程においてトランスフェクショ
ンするか、あるいは前記細胞をシャトルベクターでトラ
ンスフェクションしそしてウマのヘルペスウイルスで感
染させ、 ｆ）外来ＤＮＡを含有しそして（ｄ）及び（ｅ）に従い
得ることができるＨＶウイルスの組み換え体をそれ自体
知られている方法において分離しそして成長させ、 部分工程ｂ）、ｃ）、ｄ）を任意の所望の順序で実施す
る、ことを特徴とする、上記第１、２、３、４および５
項記載のウマのヘルペスウイルスを調製する方法。
【０２５４】７、上記第６ｄ）（上の）項記載の方法に
従い得ることができるシャトルベクター。
【０２５５】８、外来ＤＮＡ要素を導入するための１ま
たは２以上の挿入部位を、それ自体知られている方法に
おいて、ＥＨＶ株のゲノムの中にあるいは１または２以
上のゲノム断片上で同定し、前記断片はプラスミドまた
は他のベクターの中に含有されることができ、そして適
当ならば、同定された挿入部位を含有するゲノム断片を
既知のまたは新しく構成されたベクターの中に挿入し、
適当ならば、１または２以上の欠失または単一のヌクレ
オチドまたはヌクレオチド配列をゲノム断片の中に挿入
することができ、前記挿入はベクターの中へのその挿入
の前または後に実施し、そして外来ＤＮＡ要素、それ自
体知られている方法において、同定された挿入部位の中
に挿入するか、あるいは欠失がなされた１または２以上
の領域の中に挿入し、前述の部分の工程は任意の所望の
順序で実施する、ことを特徴とする、上記第７項記載の
シャトルベクターを調製する方法。
【０２５６】９、上記第１、２、３、４および５項記載
のＥＨＶに基づく遺伝子の発現。
【０２５７】１０、上記第１、２、３、４および５項記
載のＥＨＶに基づくワクチン。
【０２５８】１１、上記第１、２、３、４および５項記
載のＥＨＶを使用して試験管内または生体内で調製され
る、抗原、免疫原、翻訳ユニットおよびエピトープ。
【０２５９】１２、上記第１１項記載の抗原、免疫原、
翻訳ユニットおよびエピトープを含有するワクチン。
【０２６０】１３、免疫化後の非ワクチン接種の感染し
た動物からのワクチン接種した動物の弁別を可能とする
ワクチンとしての上記第１、２、３、４および５項記載
のＥＨＶの使用。
【０２６１】１４、抗原、免疫原、翻訳ユニット、その
分離物の試験管内または生体内の調製のための上記第
１、２、３、４および５項記載のＥＨＶの使用およびワ
クチンまたは診断助剤におけるそれらの使用。
【０２６２】１５、免疫血清の調製のための上記第１１
項記載の抗原、免疫原、翻訳ユニットおよびエピトープ
の使用。
【０２６３】１６、外来ＤＮＡ要素のためのベクターと
してのＥＨＶの使用。
【０２６４】１７、上記第６ｂ）項記載の方法に従い調
製されそしてＥＨＶのＤＮＡ配列およびＥＨＶについて
外来のＤＮＡ要素を有するシャトルベクター、とくにこ
れらのシャトルベクターの中に挿入されそして再び分離
された外来ＤＮＡを、外来ＤＮＡ要素を含有する組み換
えＥＨＶのプローブ、ここでシャトルベクターおよび組
み換えＥＨＶの中の外来ＤＮＡは少なくとも部分的に同
一である、として使用すること。
【０２６５】１８、上記第６ａ）項記載の方法に従い調
製され、上記第６ｂ）項記載の方法に従い同定された挿
入部位を含有する遺伝子バンクを、可能な挿入部位を検
出を含まないプローブとしてＥＨＶ株のゲノムの中へ外
来ＤＮＡを挿入するために使用すること。
【０２６６】１９、上記第６ａ）項記載の方法に従い調
製された遺伝子バンクを、生物学的試料の物質の中のＥ
ＨＶの検出（病原の診断）に使用すること。
【０２６７】２０、ＥＨＶのゲノム断片のヌクレオチド
配列に基づいて化学的合成されたオリゴヌクレオチド
を、生物学的試料の物質の中のＥＨＶの検出（病原の診
断）に使用すること。
【図面の簡単な説明】
【図１】制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩについての
ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３のゲノムの物理
的地図である。ＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片Ｂ、Ｃ、Ｉ、
Ｊ、ＬおよびＭのＤＮＡ配列内に局在化した反復ＤＮＡ
配列の位置はブラックボックスにより示す。地図単位＝
ゲノムの座標；ｋｂｐ＝キロ塩基対。
【図２】ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３のＥｃ
ｏＲＩのＤＮＡ断片Ｃの２つの末端領域の３ｋｂｐを収
容するシャトルベクターｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ１（６．３
ｋｂｐ）の物理学的性質を表示する図である。
【図３】ＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３のＥｃ
ｏＲＩのＤＮＡ断片Ｂの２つの末端領域の１９５６ｂｐ
を収容するシャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢｔ−Ｘ２
（４．６ｋｂｐ）の物理学的性質を表示する図である。
【図４】ＥｃｏＲＩ（ゲノムの座標０．１９０；ヌクレ
オチド位置１）およびＢｇｌＩＩ（ゲノムの座標０．１
８９；ヌクレオチド位置１５９６）についての認識部位
の間のＥＨＶ−２株 Ｔｈｅｉｎ ４００／３のＥｃｏ
ＲＩのＤＮＡ断片の右のフランクのＤＮＡヌクレオチド
配列である。
【図５】シャトルベクターｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ１のＨｉ
ｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの切断部位の中にＬａｃＺ
カセット（４４４０ｂｐ）が挿入された、組み換えプラ
スミドｐＸ２−ＥＨ２−Ｃ−ＬＺの物理学的性質を表示
する図である。
【図６】シャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢｔ−Ｘ２のＨ
ｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの切断部位の中にＬａｃ
Ｚカセット（４４４０ｂｐ）が挿入された、組み換えプ
ラスミドｐＥＨ２−ＥＢｔ−ＬＺの物理学的性質を表示
する図である。
【図７】バクテリアのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発
現する組み換えウマのヘルペスウイルスで感染したＥＤ
−２細胞の培養物の顕微鏡写真である。細胞培養物を５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル ベータ−Ｄ−
ガラクトシド（Ｘ−ガル、２５０μｇ／ｍｌ）で処理す
ると、青色のプラークが発生した。このプラークの形態
学およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現の強度を、
組み換えウイルスＥＨＶ−２−Ｂ−Ｌａｃ−７−２３１
およびＥＨＶ−２−Ｃ−ＬａｃＺ−６５８について、そ
れぞれ、部ＡおよびＢに示す。
【図８】ｐＵＣ１９の中でクローニングしたＥＨＶ−１
のｇＢについての遺伝子（ｐ１９−ＥＨＶ−１−Ｇｐ
Ｂ）配列を示す図である。
【図９】２つのＤＮＡアダプターの挿入により挿入され
たｐｕＣ１９の中でクローニングしたＥＨＶ−１のｇＢ
についての遺伝子（ｐ１９−ＥＨＶ−１−ｇＢ−Ｍ４）
配列を示す図ある。
【図１０】実施例７．４に従い修飾されたシャトルベク
ターｐＥＨ２−ＥＢ−ＬＺの配列を示す図である。
【図１１】実施例７．４に従い修飾されたシャトルベク
ターｐＥＨ２−ＥＣ−ＬＺの配列を示す図である。
【図１２】挿入されたＥＨＶ−１遺伝子で修飾されたシ
ャトルベクターｐＥＨ２−ＥＢ−ＬＺ＋ＥＨ１ ｇＢの
配列を示す図である。
【図１３】挿入で修飾されたシャトルベクターｐＥＨ２
−ＥＣ−ＬＺ＋ＥＨ１ｇＢの配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バルター・シユトルベ ドイツ連邦共和国デー5000ケルン・アム メルテンスホフ44 (72)発明者 ハンス・ルートビヒ ドイツ連邦共和国デー1000ベルリン37・ ベーレンシユトラーセ41 (56)参考文献 特表 昭63−502482（ＪＰ，Ａ) Ａｕｓｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｃ ｏｎｆ．，（1989） ８ Ｍｅｅｔ．, ｐ．129−133 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 7/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 その複製に必要なゲノム配列の外に、少
    なくとも２０ヌクレオチドの長さを有し且つ血清型２の
    ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ−２）株Ｔhein ４００
    ／３、ＣＮＣＭＩ−９８１のＥcoＲＩ−Ｂ及び／又は−
    Ｃ断片に相当する断片に挿入されている少なくとも１つ
    の外来ＤＮＡ要素を保有する非ビルレント又は弱毒ＥＨ
    Ｖ−２。
  2. 【請求項２】 タンパク質をコードし及び／又は挿入に
    よりＥＨＶゲノム配列の機能を不活性化し及び／又は所
    望の位置でＥＨＶゲノムを標識する少なくとも１つの外
    来ＤＮＡ要素を含有する請求項１記載のウマヘルペスウ
    イルス。
  3. 【請求項３】 ａ） ＥＨＶ−２株Ｔhein ４００／
    ３、ＣＮＣＭＩ−９８１のゲノム断片ＥcoＲＩ−Ｂ又は
    ＥcoＲＩ−Ｃを所定の制限酵素を用いて開裂させること
    によってゲノム断片における外来ＤＮＡ配列の挿入部位
    を準備し； ｂ） 外来ＤＮＡ配列を該挿入部位に挿入し； ｃ） 該外来ＤＮＡ配列を含有する該ゲノム断片をシャ
    トルベクター中にクローニングし； ｄ１） ウイルス増殖に適する細胞を該シヤトルベクタ
    ーを用いてもとのウイルスと一緒にコトランスフェクシ
    ョンするか、 ｄ２） 該シヤトルベクターを適する宿主細胞中にトラ
    ンスフェクションしそして該宿主細胞にもとのウマヘル
    ペスウイルスを感染させるか、又は ｄ３） 適する宿主細胞にもとのウマヘルペスウイルス
    を感染させそして該シャトルベクターを該宿主細胞中に
    トランスフェクションし；そして ｅ） ｄ１）、ｄ２）又はｄ３）後に得られるウマヘル
    ペスウイルス−２組換え体を単離し増殖させることを特
    徴とする請求項１記載の複製−コンピテントウマヘルペ
    スウイルス−２の製造方法。
JP11223692A 1991-04-05 1992-04-03 外来ｄｎａを含有するウマのヘルペスウイルス（ｅｈｖ）、その調製方法およびワクチンにおけるその使用 Expired - Fee Related JP3435574B2 (ja)

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