JP3415167B2 - 細菌を同定する方法および試薬 - Google Patents
細菌を同定する方法および試薬Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、主として、敗血症を引
き起こすグラム陽性およびグラム陰性細菌並びにその他
の細菌の同定および検出のための方法および試薬に関す
る。
き起こすグラム陽性およびグラム陰性細菌並びにその他
の細菌の同定および検出のための方法および試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】細菌によって引き起こされる疾病を治療
して回復させるためには、迅速で正確な病原菌の検出お
よび同定が必要となる。従来は、純粋培養単離と、その
後の、試料の起源、生育の要求性、目に見える生育の形
態 (コロニー) 、顕微鏡的形態学、染色反応および生化
学的性質の知見を用いた同定法によって、検出および同
定が行われてきた。
して回復させるためには、迅速で正確な病原菌の検出お
よび同定が必要となる。従来は、純粋培養単離と、その
後の、試料の起源、生育の要求性、目に見える生育の形
態 (コロニー) 、顕微鏡的形態学、染色反応および生化
学的性質の知見を用いた同定法によって、検出および同
定が行われてきた。
【０００３】細菌の正体を判定するための重要なステッ
プは、グラム染色である。この手順は、スライドガラス
上に熱固定した細菌塗沫標本を塩基性色素、クリスタル
バイオレットで処理することを包含する。あらゆる生物
は、この色素を吸収する。次にこの塗沫標本をグラム氏
のヨウ素液 (３パーセントヨウ素−ヨウ化カリウムを水
または弱いバッファー、pH8.０中に含む、バッファー使
用は、放置によってヨウ素から生じる酸度を中和するた
めである) で覆う。水ですすぎ、アセトンで脱色した
後、標本を水で十分に洗浄し、赤色色素、通常はサフラ
ニンで対比染色する。次に染色された標本を水ですす
ぎ、乾燥し、光学顕微鏡を用いて油浸で検鏡する。
プは、グラム染色である。この手順は、スライドガラス
上に熱固定した細菌塗沫標本を塩基性色素、クリスタル
バイオレットで処理することを包含する。あらゆる生物
は、この色素を吸収する。次にこの塗沫標本をグラム氏
のヨウ素液 (３パーセントヨウ素−ヨウ化カリウムを水
または弱いバッファー、pH8.０中に含む、バッファー使
用は、放置によってヨウ素から生じる酸度を中和するた
めである) で覆う。水ですすぎ、アセトンで脱色した
後、標本を水で十分に洗浄し、赤色色素、通常はサフラ
ニンで対比染色する。次に染色された標本を水ですす
ぎ、乾燥し、光学顕微鏡を用いて油浸で検鏡する。
【０００４】大半の細菌はこの染色によって二群に分け
られる。グラム陽性細菌は青色に染まり、他方、球菌の
約３分の１、桿菌の２分の１、および螺旋形生物のすべ
ては赤色に染まり、グラム陰性であると称される。この
方法は有効ではあるが、非常に時間がかかり、多くの様
々な手順を包含し、そのために多くのエラーの起こる可
能性がある。グラム染色および他の培養に基づく検出方
法は、純粋培養を得るために最低一晩の試料と培地との
インキュベーションを必要とする。
られる。グラム陽性細菌は青色に染まり、他方、球菌の
約３分の１、桿菌の２分の１、および螺旋形生物のすべ
ては赤色に染まり、グラム陰性であると称される。この
方法は有効ではあるが、非常に時間がかかり、多くの様
々な手順を包含し、そのために多くのエラーの起こる可
能性がある。グラム染色および他の培養に基づく検出方
法は、純粋培養を得るために最低一晩の試料と培地との
インキュベーションを必要とする。
【０００５】一般に敗血症と称される、血液中に細菌ま
たは真菌が存在する状態は、重大な、生命を脅かす臨床
結果をもたらす可能性がある。敗血症によって敗血症性
ショックが起こり得るが、これは以下の症状を包含する
−−−低血圧、乳酸アシドーシス、酸素欠乏症、乏尿、
昏蒙、播種性血管内凝固、胃腸管出血、代謝障害、およ
び敏感皮膚障害、１コロニー形成単位 (ＣＦＵ) 程度の
量は、敗血症患者の血液試料30ml中に存在し得る。培養
は、現在最も感度が高く、広く利用されている血液中の
細菌または真菌の検出方法であるので、敗血症の疑いの
ある症例の治療は、培養結果を待たず、経験的に始めら
れることもしばしばである。培養と同程度の感度をもつ
血液中の細菌検出のための迅速な診断法が現行法に比べ
て有意義な改良となることは明白である。
たは真菌が存在する状態は、重大な、生命を脅かす臨床
結果をもたらす可能性がある。敗血症によって敗血症性
ショックが起こり得るが、これは以下の症状を包含する
−−−低血圧、乳酸アシドーシス、酸素欠乏症、乏尿、
昏蒙、播種性血管内凝固、胃腸管出血、代謝障害、およ
び敏感皮膚障害、１コロニー形成単位 (ＣＦＵ) 程度の
量は、敗血症患者の血液試料30ml中に存在し得る。培養
は、現在最も感度が高く、広く利用されている血液中の
細菌または真菌の検出方法であるので、敗血症の疑いの
ある症例の治療は、培養結果を待たず、経験的に始めら
れることもしばしばである。培養と同程度の感度をもつ
血液中の細菌検出のための迅速な診断法が現行法に比べ
て有意義な改良となることは明白である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は
敗血症を引き起こす細菌の迅速な検出および同定のため
の方法および試薬を提供する。検出は、一定の種または
種のグループには存在するが、他には存在しないヌクレ
オチド配列、ならびにそのヌクレオチド配列からの転写
物と、ヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成に基
づく。
敗血症を引き起こす細菌の迅速な検出および同定のため
の方法および試薬を提供する。検出は、一定の種または
種のグループには存在するが、他には存在しないヌクレ
オチド配列、ならびにそのヌクレオチド配列からの転写
物と、ヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成に基
づく。
【０００７】望ましい実施態様に於て、ゲノムＤＮＡま
たは１６ＳｒＲＮＡ逆転写物由来の標的領域を増幅し、
その結果得られた増幅されたＤＮＡを、一定の細菌種ま
たは細菌種群のＤＮＡとはハイブリッド形成するが、他
とはしない一連のプローブで処理する。増幅されたＤＮ
Ａとうまくハイブリッド形成するプローブを判定し、ど
のプローブがその増幅されたＤＮＡとハイブリッド形成
するかに基づいて、細菌は、グラム陽性またはグラム陰
性のいずれかとして、あるいは特定の種または種のグル
ープとして分類される。
たは１６ＳｒＲＮＡ逆転写物由来の標的領域を増幅し、
その結果得られた増幅されたＤＮＡを、一定の細菌種ま
たは細菌種群のＤＮＡとはハイブリッド形成するが、他
とはしない一連のプローブで処理する。増幅されたＤＮ
Ａとうまくハイブリッド形成するプローブを判定し、ど
のプローブがその増幅されたＤＮＡとハイブリッド形成
するかに基づいて、細菌は、グラム陽性またはグラム陰
性のいずれかとして、あるいは特定の種または種のグル
ープとして分類される。
【０００８】また、敗血症を引き起こすグラム陽性、グ
ラム陰性、および他の細菌を同定するための特定のプロ
ーブおよびそれらに相補的なものも、本文中で定義し、
特許請求する。さらに、本発明は、すべての細菌に対し
て特異的なユニバーサル (普遍的) ＤＮＡ標的領域を増
幅するためのユニバーサル細菌プライマー、およびその
標的領域内の、一定の細菌種または細菌種群に特有のヌ
クレオチド配列とハイブリッド形成する一連のプローブ
を含有するポリメラーゼ・チェイン・リアクション (Ｐ
ＣＲ) キットの調剤および利用を意図する。
ラム陰性、および他の細菌を同定するための特定のプロ
ーブおよびそれらに相補的なものも、本文中で定義し、
特許請求する。さらに、本発明は、すべての細菌に対し
て特異的なユニバーサル (普遍的) ＤＮＡ標的領域を増
幅するためのユニバーサル細菌プライマー、およびその
標的領域内の、一定の細菌種または細菌種群に特有のヌ
クレオチド配列とハイブリッド形成する一連のプローブ
を含有するポリメラーゼ・チェイン・リアクション (Ｐ
ＣＲ) キットの調剤および利用を意図する。
【０００９】なお，添付の図において、図１は、グラム
陽性、グラム陰性および他の細菌に於て、ＰＣＲによる
標的領域の増幅に使用することのできる二つのユニバー
サル細菌プライマーＤＧ７４およびＲＷ０１を示す。図
２は、グラム陽性特異的プローブＲＷ０３を示す。
陽性、グラム陰性および他の細菌に於て、ＰＣＲによる
標的領域の増幅に使用することのできる二つのユニバー
サル細菌プライマーＤＧ７４およびＲＷ０１を示す。図
２は、グラム陽性特異的プローブＲＷ０３を示す。
【００１０】図３は、グラム陰性プローブの四つの候
補、ＰＷ０４，ＤＬ０４，ＤＬ０５およびＲＤＲ２７８
を示す。図４は，ユニバーサル細菌プローブの二つの候
補、ＲＤＲ２４４およびＲＤＲ２４５を示す。図５は、
大腸菌 (Escherichia coli) ／腸内細菌プローブを示
す。
補、ＰＷ０４，ＤＬ０４，ＤＬ０５およびＲＤＲ２７８
を示す。図４は，ユニバーサル細菌プローブの二つの候
補、ＲＤＲ２４４およびＲＤＲ２４５を示す。図５は、
大腸菌 (Escherichia coli) ／腸内細菌プローブを示
す。
【００１１】図６は、バイテロイデスプローブを示す。
また、表において、表１は、グラム陰性プローブＲＷ０
４およびＤＬ０４に関するハイブリッド形成データをま
とめたものである。表２は、グラム陰性プローブ、ＲＤ
Ｒ２７８およびＤＬ０４；ユニバーサルプローブの二候
補、ＲＤＲ２４４；およびＲＤＲ２４５；およびバクロ
テロイデスプローブのＲＤＲ２７９を調べた結果をまと
めたものである。
また、表において、表１は、グラム陰性プローブＲＷ０
４およびＤＬ０４に関するハイブリッド形成データをま
とめたものである。表２は、グラム陰性プローブ、ＲＤ
Ｒ２７８およびＤＬ０４；ユニバーサルプローブの二候
補、ＲＤＲ２４４；およびＲＤＲ２４５；およびバクロ
テロイデスプローブのＲＤＲ２７９を調べた結果をまと
めたものである。
【００１２】表３は、実施例６記載のようにＲＤＲ２４
４およびＲＤＲ２４５について調べた生物の一覧であ
る。表４は、大腸菌／腸内細菌プローブＲＤＲ１４０Ｋ
Ｇについて得られたデーターの一覧である。
４およびＲＤＲ２４５について調べた生物の一覧であ
る。表４は、大腸菌／腸内細菌プローブＲＤＲ１４０Ｋ
Ｇについて得られたデーターの一覧である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、グラム陽性ま
たはグラム陰性細菌のいずれか一方に特有のヌクレオチ
ド配列、または一定の細菌種または細菌種群に特有のヌ
クレオチド配列をプローブとハイブリッド形成させるこ
とによって、細菌の存在を判定し、これを同定するため
の方法に関する。
たはグラム陰性細菌のいずれか一方に特有のヌクレオチ
ド配列、または一定の細菌種または細菌種群に特有のヌ
クレオチド配列をプローブとハイブリッド形成させるこ
とによって、細菌の存在を判定し、これを同定するため
の方法に関する。
【００１４】感染の原因を知るためにプローブとして特
定のポリヌクレオチド配列を使用することは、疑問の余
地のある免疫学的同定アッセイに対する貴重な代替法と
なっている。例えば、1984年６月19日付ＰＣＴ第WO84/0
2721号公報は、標的核酸配列を検出するためのハイブリ
ッド形成法に於て、リボソームＲＮＡ、トランスファー
ＲＮＡ、または他のＲＮＡからなる標的核酸配列に相補
的な核酸プローブの使用を記載している。このアッセイ
は公知のＤＮＡハイブリッド形成アッセイよりも高い感
度と特異性を与えるが、相補的プローブの使用を必要と
するハイブリッド形成法は、一般に試験生物の培養に依
存し、それ故迅速な診断には適さない。標的ＤＮＡを増
幅する方法が利用可能であるならば、臨床検体について
直接プローブを使用することができる。
定のポリヌクレオチド配列を使用することは、疑問の余
地のある免疫学的同定アッセイに対する貴重な代替法と
なっている。例えば、1984年６月19日付ＰＣＴ第WO84/0
2721号公報は、標的核酸配列を検出するためのハイブリ
ッド形成法に於て、リボソームＲＮＡ、トランスファー
ＲＮＡ、または他のＲＮＡからなる標的核酸配列に相補
的な核酸プローブの使用を記載している。このアッセイ
は公知のＤＮＡハイブリッド形成アッセイよりも高い感
度と特異性を与えるが、相補的プローブの使用を必要と
するハイブリッド形成法は、一般に試験生物の培養に依
存し、それ故迅速な診断には適さない。標的ＤＮＡを増
幅する方法が利用可能であるならば、臨床検体について
直接プローブを使用することができる。
【００１５】本発明で使用するについて、敗血症を引き
起こす細菌種または細菌種群に関するプローブは以下を
包含するがそれらに限定されない： ユニバーサル細菌プローブ グラム陰性プローブ グラム陽性プローブ 大腸菌／腸内細菌プローブ バクテロイデスプローブ 上記プローブはポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(ＰＣＲ) によって増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡとの
ハイブリッド形成に有用であると考えられる。ＰＣＲ
は、インビトロの培養が困難であったりまたは長くかか
る小量の病原体の検出に使用できる有力な技法であり、
または検出のために生物検体の存在を必要とする他の方
法の代替として有力な技法である。そのもっとも簡単な
形において、ＰＣＲは、反対鎖とハイブリッド形成し、
且つ標的ＤＮＡ内の対象領域に隣接する、二つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、インビトロで特定の
ＤＮＡ配列を酵素合成するための方法である。鋳型の変
性、プライマーアニーリング、およびＤＮＡポリメラー
ゼによるアニールしたプライマーの伸長を包含するサイ
クルを何回も繰り返すことによって、プライマーの5'末
端によって限定される末端を有する特定のフラグメント
が指数的に蓄積される。報告によれば、ＰＣＲによって
特定のＤＮＡ配列を1012倍に選択的に濃縮することがで
きる。ＰＣＲ法は、 Saikiら、(1985) Science 230, 13
50-1354 に記載され、米国特許第4,683,195 、4,683,20
2 、および4,800,159号の主題である。このＰＣＲ法は
鎌状赤血球貧血 Saikiら、(1985)上記) およびヒト免疫
不全ウイルス (ＨＩＶ) ＲＮＡ(Byrneら、(1988) Nuc.
Acids Res. 16, 4165)に関わるベータ−グロビン遺伝子
中の異常な配列の存在を検出するために用いられた。し
かしながら、この方法が利用できるためには、それ以前
に、その疾病に関わるポリヌクレオチドのヌクレオチド
配列を十分明らかにして増幅のためのプライマーをデザ
インし、さらに増幅産物を検出するために十分特異的な
プローブをデザインしなければならない。
起こす細菌種または細菌種群に関するプローブは以下を
包含するがそれらに限定されない： ユニバーサル細菌プローブ グラム陰性プローブ グラム陽性プローブ 大腸菌／腸内細菌プローブ バクテロイデスプローブ 上記プローブはポリメラーゼ・チェイン・リアクション
(ＰＣＲ) によって増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡとの
ハイブリッド形成に有用であると考えられる。ＰＣＲ
は、インビトロの培養が困難であったりまたは長くかか
る小量の病原体の検出に使用できる有力な技法であり、
または検出のために生物検体の存在を必要とする他の方
法の代替として有力な技法である。そのもっとも簡単な
形において、ＰＣＲは、反対鎖とハイブリッド形成し、
且つ標的ＤＮＡ内の対象領域に隣接する、二つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、インビトロで特定の
ＤＮＡ配列を酵素合成するための方法である。鋳型の変
性、プライマーアニーリング、およびＤＮＡポリメラー
ゼによるアニールしたプライマーの伸長を包含するサイ
クルを何回も繰り返すことによって、プライマーの5'末
端によって限定される末端を有する特定のフラグメント
が指数的に蓄積される。報告によれば、ＰＣＲによって
特定のＤＮＡ配列を1012倍に選択的に濃縮することがで
きる。ＰＣＲ法は、 Saikiら、(1985) Science 230, 13
50-1354 に記載され、米国特許第4,683,195 、4,683,20
2 、および4,800,159号の主題である。このＰＣＲ法は
鎌状赤血球貧血 Saikiら、(1985)上記) およびヒト免疫
不全ウイルス (ＨＩＶ) ＲＮＡ(Byrneら、(1988) Nuc.
Acids Res. 16, 4165)に関わるベータ−グロビン遺伝子
中の異常な配列の存在を検出するために用いられた。し
かしながら、この方法が利用できるためには、それ以前
に、その疾病に関わるポリヌクレオチドのヌクレオチド
配列を十分明らかにして増幅のためのプライマーをデザ
インし、さらに増幅産物を検出するために十分特異的な
プローブをデザインしなければならない。
【００１６】本発明は、細菌ポリヌクレオチドの含有が
疑われる試料中の当該ポリヌクレオチドの存在を検出す
るための方法を与える。ここに於て、当該ポリヌクレオ
チドは選択された標的領域を含有し、該方法は以下を含
んでなる： (ａ) 標的領域があれば、これを検出可能レベルまで増
幅する； (ｂ) 増幅された標的領域があれば、これをプローブと
ともに、ハイブリッド二本鎖の特異性を許容する条件下
で、インキュベートする；および (ｃ) 増幅された標的領域があれば、これとプローブと
の間に形成されるハイブリッドを検出する。
疑われる試料中の当該ポリヌクレオチドの存在を検出す
るための方法を与える。ここに於て、当該ポリヌクレオ
チドは選択された標的領域を含有し、該方法は以下を含
んでなる： (ａ) 標的領域があれば、これを検出可能レベルまで増
幅する； (ｂ) 増幅された標的領域があれば、これをプローブと
ともに、ハイブリッド二本鎖の特異性を許容する条件下
で、インキュベートする；および (ｃ) 増幅された標的領域があれば、これとプローブと
の間に形成されるハイブリッドを検出する。
【００１７】上記方法に於て、また特別の実施態様とし
て、細菌は、敗血症を引き起こす、グラム陽性またはグ
ラム陰性または他の特定の細菌種または細菌種群であっ
てよい。プローブは、限定されることなく、ユニバーサ
ル細菌プローブ、大腸菌／腸内細菌プローブ、グラム陰
性プローブ、グラム陽性プローブ、またはバクテロイデ
スプローブ、あるいはこれらのプローブの組合せであっ
てよい。
て、細菌は、敗血症を引き起こす、グラム陽性またはグ
ラム陰性または他の特定の細菌種または細菌種群であっ
てよい。プローブは、限定されることなく、ユニバーサ
ル細菌プローブ、大腸菌／腸内細菌プローブ、グラム陰
性プローブ、グラム陽性プローブ、またはバクテロイデ
スプローブ、あるいはこれらのプローブの組合せであっ
てよい。
【００１８】このように、本発明の方法によって、先行
技術の検出方法でこれまで可能であった以上に迅速に細
菌の存在を検出することができる。基本的なＰＣＲの手
順は、以下のように行われる。対象となる特定の核酸配
列、すなわち「標的配列」、の含有が疑われる試料を用
意する。試料に含まれるその核酸を、まず必要に応じて
精製酵素としてＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤ
ＮＡに逆転写する。つぎに、当業者に公知の物理的、化
学的または酵素的方法を包含するなんらかの適当な変性
法を用いて変性させる。二本鎖を分離する望ましい物理
的方法は、完全に (＞99％) 変性するまでその核酸を加
熱することである。典型的な熱変性は、現行の技術によ
って約５秒から10分までの範囲の時間のあいだ、約80℃
から約150℃までの範囲の温度を必要とする。
技術の検出方法でこれまで可能であった以上に迅速に細
菌の存在を検出することができる。基本的なＰＣＲの手
順は、以下のように行われる。対象となる特定の核酸配
列、すなわち「標的配列」、の含有が疑われる試料を用
意する。試料に含まれるその核酸を、まず必要に応じて
精製酵素としてＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤ
ＮＡに逆転写する。つぎに、当業者に公知の物理的、化
学的または酵素的方法を包含するなんらかの適当な変性
法を用いて変性させる。二本鎖を分離する望ましい物理
的方法は、完全に (＞99％) 変性するまでその核酸を加
熱することである。典型的な熱変性は、現行の技術によ
って約５秒から10分までの範囲の時間のあいだ、約80℃
から約150℃までの範囲の温度を必要とする。
【００１９】次に変性したＤＮＡ鎖を、選択されたオリ
ゴヌクレオチドプライマーとともに、そのプライマーと
一本鎖オリゴヌクレオチドとが結合できるようにハイブ
リッド形成条件下でインキュベートする。当業者に公知
であるように、プライマーは、二本鎖配列に沿ったこれ
らのプライマーの相対的な位置が、一方のプライマーか
ら合成された伸長産物がその相補物から離れたときにも
う一方のプライマーの伸長のための鋳型として働き、一
定の長さの複製鎖を生じるような位置関係となるよう
に、選択される。
ゴヌクレオチドプライマーとともに、そのプライマーと
一本鎖オリゴヌクレオチドとが結合できるようにハイブ
リッド形成条件下でインキュベートする。当業者に公知
であるように、プライマーは、二本鎖配列に沿ったこれ
らのプライマーの相対的な位置が、一方のプライマーか
ら合成された伸長産物がその相補物から離れたときにも
う一方のプライマーの伸長のための鋳型として働き、一
定の長さの複製鎖を生じるような位置関係となるよう
に、選択される。
【００２０】プライマーは、ポリメラーゼ反応に必要な
試薬の存在下で伸長産物の合成を開始するに十分な長さ
を有していなければならない。プライマーの正確な長さ
は、温度、プライマーの起源、および当該方法の使用法
を包含する多数の要因によって決まるであろう。例え
ば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプ
ライマーは、それより多いことも少ないこともあるが、
典型的にはおよそ15−30ヌクレオチドを有する。短いプ
ライマーは一般に鋳型と十分安定なハイブリッド複合体
を形成するために低めの温度を必要とする。プライマー
は、その各鎖と選択的にハイブリッド形成するために十
分相補的でなければならない。
試薬の存在下で伸長産物の合成を開始するに十分な長さ
を有していなければならない。プライマーの正確な長さ
は、温度、プライマーの起源、および当該方法の使用法
を包含する多数の要因によって決まるであろう。例え
ば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプ
ライマーは、それより多いことも少ないこともあるが、
典型的にはおよそ15−30ヌクレオチドを有する。短いプ
ライマーは一般に鋳型と十分安定なハイブリッド複合体
を形成するために低めの温度を必要とする。プライマー
は、その各鎖と選択的にハイブリッド形成するために十
分相補的でなければならない。
【００２１】ここで用いられるプライマーは、増幅すべ
き個々の特定配列の各鎖に対して「実質的に」相補的で
あるように選択される。プライマーは鋳型の正確な配列
を反映している必要はないが、各鎖と選択的にハイブリ
ッド形成するに十分相補的でなければならない。プライ
マーが、増幅すべき核酸鎖の一方の配列と十分な相補性
を保持して、それとハイブリッド形成し、それによって
重合法で伸長することのできる二本鎖構造を形成する限
り、相補的でない塩基またはより長い配列をプライマー
のあちこちに挿入することができ、またはプライマーが
その特定配列に相補的なサブセットを含有することがで
きる。プライマーの非−相補的ヌクレオチド配列は、制
限酵素部位を包含することができる。制限酵素部位を標
的配列の末端に付加することは、後続の標的配列のクロ
ーニングに特に有用である。
き個々の特定配列の各鎖に対して「実質的に」相補的で
あるように選択される。プライマーは鋳型の正確な配列
を反映している必要はないが、各鎖と選択的にハイブリ
ッド形成するに十分相補的でなければならない。プライ
マーが、増幅すべき核酸鎖の一方の配列と十分な相補性
を保持して、それとハイブリッド形成し、それによって
重合法で伸長することのできる二本鎖構造を形成する限
り、相補的でない塩基またはより長い配列をプライマー
のあちこちに挿入することができ、またはプライマーが
その特定配列に相補的なサブセットを含有することがで
きる。プライマーの非−相補的ヌクレオチド配列は、制
限酵素部位を包含することができる。制限酵素部位を標
的配列の末端に付加することは、後続の標的配列のクロ
ーニングに特に有用である。
【００２２】本発明で用いられるオリゴヌクレオチドプ
ライマーおよびプローブを第１−６図に示す。なんらか
の適当な方法によって、これらを作製することができ
る。特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの作製方法
は当業者に公知であり、例えば、適当な配列のクローニ
ングおよび制限、および直接的な化学合成を包含する。
必要ならば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学
的、または化学的方法によって検出可能な標識取り込み
法を用いて、プライマーを標識することができる。
ライマーおよびプローブを第１−６図に示す。なんらか
の適当な方法によって、これらを作製することができ
る。特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの作製方法
は当業者に公知であり、例えば、適当な配列のクローニ
ングおよび制限、および直接的な化学合成を包含する。
必要ならば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学
的、または化学的方法によって検出可能な標識取り込み
法を用いて、プライマーを標識することができる。
【００２３】次に、鋳型に依存したオリゴヌクレオチド
プライマーの伸長が、十分量の４種のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸 (ｄＡＴＰ, ｄＧＴＰ, ｄＣＴＰおよ
びｄＴＴＰ) または類縁体の存在下で、適当な塩類、金
属カチオンおよびpH緩衝系からなる反応液中で、重合試
薬によって触媒される。好適な重合試薬は、プライマー
および鋳型に依存したＤＮＡ合成を触媒することで知ら
れる酵素である。公知のＤＮＡポリメラーゼは、例え
ば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノウフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、The-rmus thermophilus 由来ＴｔｈＤＮＡ
ポリメラーゼ、Thermococcus litoralis由来ＤＮＡポリ
メラーゼを包含する。これらのＤＮＡポリメラーゼを用
いてＤＮＡ合成を触媒するための反応条件は、当業者に
周知である。
プライマーの伸長が、十分量の４種のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸 (ｄＡＴＰ, ｄＧＴＰ, ｄＣＴＰおよ
びｄＴＴＰ) または類縁体の存在下で、適当な塩類、金
属カチオンおよびpH緩衝系からなる反応液中で、重合試
薬によって触媒される。好適な重合試薬は、プライマー
および鋳型に依存したＤＮＡ合成を触媒することで知ら
れる酵素である。公知のＤＮＡポリメラーゼは、例え
ば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノウフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、The-rmus thermophilus 由来ＴｔｈＤＮＡ
ポリメラーゼ、Thermococcus litoralis由来ＤＮＡポリ
メラーゼを包含する。これらのＤＮＡポリメラーゼを用
いてＤＮＡ合成を触媒するための反応条件は、当業者に
周知である。
【００２４】合成産物は、鋳型鎖およびプライマー伸長
鎖からなる二本鎖分子であり、標的配列を包含する。こ
れらの産物が引き続いて、別の複製のための鋳型として
働く。第二回目の複製に於て、第一回目のプライマー伸
長鎖をそれと相補的なプライマーとアニールする；合成
は、プライマー配列またはその相補物が5'および3'末端
の両方に結合した「短い」産物を生じる。変性、プライ
マーアニーリングおよび伸長のサイクルを繰り返すこと
によって、プライマーにより限定される標的領域の指数
的な蓄積をもたらす。十分な回数の繰り返しによって核
酸の標的領域を含有するポリヌクレオチドを必要な量だ
け得ることができる。必要量は様々ではあるが、その産
物ポリヌクレオチドが果たすべき作用によって決まる。
鎖からなる二本鎖分子であり、標的配列を包含する。こ
れらの産物が引き続いて、別の複製のための鋳型として
働く。第二回目の複製に於て、第一回目のプライマー伸
長鎖をそれと相補的なプライマーとアニールする；合成
は、プライマー配列またはその相補物が5'および3'末端
の両方に結合した「短い」産物を生じる。変性、プライ
マーアニーリングおよび伸長のサイクルを繰り返すこと
によって、プライマーにより限定される標的領域の指数
的な蓄積をもたらす。十分な回数の繰り返しによって核
酸の標的領域を含有するポリヌクレオチドを必要な量だ
け得ることができる。必要量は様々ではあるが、その産
物ポリヌクレオチドが果たすべき作用によって決まる。
【００２５】ＰＣＲ法を、様々な手順で順次行うことが
できる。例えば、ＰＣＲ法を段階的に行うことができ、
この場合、各段階の後で新試薬が添加される。またすべ
ての試薬を一度に添加する方法で行うこともできる。あ
るいは、一部を段階的に行うこともでき、この場合新試
薬は一定数の段階の後で添加される。望ましい方法に於
て、耐熱性酵素を利用する自動化されたプロセスとして
ＰＣＲ反応を行う。このプロセスに於て、反応混合液は
変性段階、プライマーアニーリング段階および合成段階
を通して繰り返して使用される。耐熱酵素を用いて行う
のに特に適したＤＮＡサーマルサイクラーを利用するこ
とができるが、これは液体の出入り無しに温度を繰り返
し変化させることを利用し、それによって各サイクルご
とに酵素を添加する必要を省いている。このタイプの機
械は市販されている。
できる。例えば、ＰＣＲ法を段階的に行うことができ、
この場合、各段階の後で新試薬が添加される。またすべ
ての試薬を一度に添加する方法で行うこともできる。あ
るいは、一部を段階的に行うこともでき、この場合新試
薬は一定数の段階の後で添加される。望ましい方法に於
て、耐熱性酵素を利用する自動化されたプロセスとして
ＰＣＲ反応を行う。このプロセスに於て、反応混合液は
変性段階、プライマーアニーリング段階および合成段階
を通して繰り返して使用される。耐熱酵素を用いて行う
のに特に適したＤＮＡサーマルサイクラーを利用するこ
とができるが、これは液体の出入り無しに温度を繰り返
し変化させることを利用し、それによって各サイクルご
とに酵素を添加する必要を省いている。このタイプの機
械は市販されている。
【００２６】ＰＣＲによる増幅後、標的ＤＮＡが効率的
に増幅され、プライマーが増幅すべき標的領域に対して
高度に特異的であるならば、標識ポリヌクレオチドを直
接ゲル分析によって検出することができる。ＰＣＲの有
効性を保証するために、グリセロールおよび他のジメチ
ルスルフォキシドのような関連の溶媒を用いて、増幅レ
ベルでＰＣＲの感度を増加させることができ、強固な二
次構造を有するＤＮＡ領域の配列決定に付随する問題を
克服することができる。この問題とは、 (１)重合試薬
によって完全には伸長されない鋳型が高頻度で現れるた
めに、ＰＣＲの効率が低いこと、または (２) ＧＣ含有
量が高いために高温での二本鎖ＤＮＡの変性が不完全で
あることを包含する。このような溶媒の使用は、増幅レ
ベルで、アッセイの感度を約数フェムト (10-15 ) グラ
ムＤＮＡ (単一の細菌細胞に対応すると考えられる) ま
で高めることができる。このような感度レベルは、増幅
された標的ＤＮＡをプローブを用いて検出する必要性を
排除し、それによって、放射性プローブ、ゲル電気泳
動、サザンブロッティング、フィルターハイブリッド形
成、洗浄およびオートラジオグフラフィーの必要性を省
く。グリセロールの濃度範囲は、約５％−20％(v/v) で
あり、ＤＭＳＯ濃度範囲は約３％−10％(v/v)である。
に増幅され、プライマーが増幅すべき標的領域に対して
高度に特異的であるならば、標識ポリヌクレオチドを直
接ゲル分析によって検出することができる。ＰＣＲの有
効性を保証するために、グリセロールおよび他のジメチ
ルスルフォキシドのような関連の溶媒を用いて、増幅レ
ベルでＰＣＲの感度を増加させることができ、強固な二
次構造を有するＤＮＡ領域の配列決定に付随する問題を
克服することができる。この問題とは、 (１)重合試薬
によって完全には伸長されない鋳型が高頻度で現れるた
めに、ＰＣＲの効率が低いこと、または (２) ＧＣ含有
量が高いために高温での二本鎖ＤＮＡの変性が不完全で
あることを包含する。このような溶媒の使用は、増幅レ
ベルで、アッセイの感度を約数フェムト (10-15 ) グラ
ムＤＮＡ (単一の細菌細胞に対応すると考えられる) ま
で高めることができる。このような感度レベルは、増幅
された標的ＤＮＡをプローブを用いて検出する必要性を
排除し、それによって、放射性プローブ、ゲル電気泳
動、サザンブロッティング、フィルターハイブリッド形
成、洗浄およびオートラジオグフラフィーの必要性を省
く。グリセロールの濃度範囲は、約５％−20％(v/v) で
あり、ＤＭＳＯ濃度範囲は約３％−10％(v/v)である。
【００２７】あるいはまた、本発明にしたがって、厳し
い条件から穏やかな条件までのハイブリッド形成および
洗浄条件のもとで、標的配列と安定なハイブリッドを形
成するプローブポリヌクレオチドとハイブリッド形成に
よって、標的ポリヌクレオチドを検出することができ
る。プローブが標的配列に対して完全に (すなわち約99
％またはそれ以上) 相補的であることが予想されるなら
ば、厳しい条件が用いられよう。いくつかのミスマッチ
が予想される場合、例えば、プローブが完全には相補的
でないような結果となった変異株が予想される場合に
は、ハイブリッド形成条件を弱くすることができる。し
かしながら、非特異的／偶発的結合を除外する条件が選
ばれる。ハイブリッド形成に影響を及ぼし、非特異的結
合に反して選択する条件は、当業者に公知である。一般
に、低い塩濃度および高温は結合のストリンジェンシー
を増加させる。例えば、ストリンジェント条件とは、約
65℃のインキュベーション／洗浄温度で、約0.１×ＳＳ
Ｃ、0.１％ＳＤＳを含有する溶液中でインキュベートす
ることであり、中程度のストリンジェント条件とは、約
50−65℃のインキュベーション／洗浄温度で、約１−２
×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳを含有する溶液中でインキュベ
ートすることであると通常考えられている。弱いストリ
ンジェント条件とは、30−50℃で、２×ＳＳＣである。
い条件から穏やかな条件までのハイブリッド形成および
洗浄条件のもとで、標的配列と安定なハイブリッドを形
成するプローブポリヌクレオチドとハイブリッド形成に
よって、標的ポリヌクレオチドを検出することができ
る。プローブが標的配列に対して完全に (すなわち約99
％またはそれ以上) 相補的であることが予想されるなら
ば、厳しい条件が用いられよう。いくつかのミスマッチ
が予想される場合、例えば、プローブが完全には相補的
でないような結果となった変異株が予想される場合に
は、ハイブリッド形成条件を弱くすることができる。し
かしながら、非特異的／偶発的結合を除外する条件が選
ばれる。ハイブリッド形成に影響を及ぼし、非特異的結
合に反して選択する条件は、当業者に公知である。一般
に、低い塩濃度および高温は結合のストリンジェンシー
を増加させる。例えば、ストリンジェント条件とは、約
65℃のインキュベーション／洗浄温度で、約0.１×ＳＳ
Ｃ、0.１％ＳＤＳを含有する溶液中でインキュベートす
ることであり、中程度のストリンジェント条件とは、約
50−65℃のインキュベーション／洗浄温度で、約１−２
×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳを含有する溶液中でインキュベ
ートすることであると通常考えられている。弱いストリ
ンジェント条件とは、30−50℃で、２×ＳＳＣである。
【００２８】ハイブリッド形成および洗浄の別法では、
弱いストリンジェント条件 (５×ＳＳＰＥ, 0.５％ＳＤ
Ｓ) でハイブリッド形成した後、３Ｍ塩化テトラメチル
アンモニウム (ＴＭＡＣｌ) の存在下で高ストリンジェ
ント条件で洗浄する。ＴＭＡＣｌの効果は、Ａ−Ｔおよ
びＧ−Ｃ塩基対の相対的結合を等しくして、一定温度で
のハイブリッド形成効率がポリヌクレオチドの長さの関
数となるようにする。ＴＭＡＣｌを用いて、ストリンジ
ェンシーを望ましいレベルとするように、洗浄温度を変
化させることができる。 (塩化テトラメチルアンモニウ
ム中での塩基組成依存性ハイブリッド形成：高度に複雑
な遺伝子ライブラリーのオリゴヌクレオチドスクリーニ
ング法；Woodら、(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
82, 1585-1588参照) 。
弱いストリンジェント条件 (５×ＳＳＰＥ, 0.５％ＳＤ
Ｓ) でハイブリッド形成した後、３Ｍ塩化テトラメチル
アンモニウム (ＴＭＡＣｌ) の存在下で高ストリンジェ
ント条件で洗浄する。ＴＭＡＣｌの効果は、Ａ−Ｔおよ
びＧ−Ｃ塩基対の相対的結合を等しくして、一定温度で
のハイブリッド形成効率がポリヌクレオチドの長さの関
数となるようにする。ＴＭＡＣｌを用いて、ストリンジ
ェンシーを望ましいレベルとするように、洗浄温度を変
化させることができる。 (塩化テトラメチルアンモニウ
ム中での塩基組成依存性ハイブリッド形成：高度に複雑
な遺伝子ライブラリーのオリゴヌクレオチドスクリーニ
ング法；Woodら、(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
82, 1585-1588参照) 。
【００２９】細菌の標的配列に関するプローブを１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子配列またはその相補物から誘導すること
ができる。プローブは、その標記領域をカバーするがプ
ライマーを排除し、そして標的領域に対して特異的なハ
イブリッド形成をもたらすような、あらゆる適当な長さ
を持つことができる。一般に、プローブは、相補的ＤＮ
Ａ鎖のいずれか一方の少なくとも14ヌクレオチド、望ま
しくは少なくとも18ヌクレオチド、さらに望ましくは少
なくとも20から30ヌクレオチドを有する。実際、標的の
配列は、相補的ＤＮＡ鎖のいずれか一方から由来するこ
とができる。もし完全な相補性が存在するならば、すな
わちその菌株がプローブと同一の配列を有するならば、
二本鎖はストリンジェント条件下でも比較的安定である
ので、プローブは短くてもよい。すなわち約10−30塩基
対の範囲であってよい。ある程度のミスマッチがプロー
ブについて予想されるならば、すなわちプローブが変異
した領域とハイブリッド形成することが疑われる場合に
は、プローブはもっと長くなる。その理由は長さがミス
マッチの影響の一部を相殺すると考えられるからであ
る。プローブを標的領域のサブセットから作製すること
ができ、したがって標的領域全体をカバーする必要はな
い。プローブが標的領域の当該部分とハイブリッド形成
することによって特異的に標的領域を同定するとすれ
ば、標的領域のあらゆるサブセットをプローブの構築に
用いることができる。必要ならば、プローブを標識する
こともできる。適当であると考えられる様々な標識、並
びにそれらをプローブに取り込むための方法が公知であ
り、標識は、例えば、32Ｐのような放射性元素、または
他の認識可能な機能を有する構造、例えばビオチン (ス
ペーサーアームの使用が望ましい) 、蛍光色素、高電子
密度試薬、検出の容易な反応産物を生じうる酵素 (例え
ば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキ
シダーゼ) 、または、対応する特異的抗血清またはモノ
クローナル抗体が入手可能な抗原、を包含する。
ｒＲＮＡ遺伝子配列またはその相補物から誘導すること
ができる。プローブは、その標記領域をカバーするがプ
ライマーを排除し、そして標的領域に対して特異的なハ
イブリッド形成をもたらすような、あらゆる適当な長さ
を持つことができる。一般に、プローブは、相補的ＤＮ
Ａ鎖のいずれか一方の少なくとも14ヌクレオチド、望ま
しくは少なくとも18ヌクレオチド、さらに望ましくは少
なくとも20から30ヌクレオチドを有する。実際、標的の
配列は、相補的ＤＮＡ鎖のいずれか一方から由来するこ
とができる。もし完全な相補性が存在するならば、すな
わちその菌株がプローブと同一の配列を有するならば、
二本鎖はストリンジェント条件下でも比較的安定である
ので、プローブは短くてもよい。すなわち約10−30塩基
対の範囲であってよい。ある程度のミスマッチがプロー
ブについて予想されるならば、すなわちプローブが変異
した領域とハイブリッド形成することが疑われる場合に
は、プローブはもっと長くなる。その理由は長さがミス
マッチの影響の一部を相殺すると考えられるからであ
る。プローブを標的領域のサブセットから作製すること
ができ、したがって標的領域全体をカバーする必要はな
い。プローブが標的領域の当該部分とハイブリッド形成
することによって特異的に標的領域を同定するとすれ
ば、標的領域のあらゆるサブセットをプローブの構築に
用いることができる。必要ならば、プローブを標識する
こともできる。適当であると考えられる様々な標識、並
びにそれらをプローブに取り込むための方法が公知であ
り、標識は、例えば、32Ｐのような放射性元素、または
他の認識可能な機能を有する構造、例えばビオチン (ス
ペーサーアームの使用が望ましい) 、蛍光色素、高電子
密度試薬、検出の容易な反応産物を生じうる酵素 (例え
ば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキ
シダーゼ) 、または、対応する特異的抗血清またはモノ
クローナル抗体が入手可能な抗原、を包含する。
【００３０】標的領域のヌクレオチド配列の分析を、Gy
llenstenおよびErlich, (1988)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 85, 7652-7656 に記載のように、ＰＣＲ増幅産物
の直接分析によって行うことができる。プローブによっ
て検出されたＰＣＲ産物の長さを決定することが望まし
いと思われる。変異した細菌菌株が標的領域内に欠失ま
たは挿入を有する場合、あるいは、ＰＣＲ産物の長さを
確認したいと思う場合には特にこのことが当てはまる。
このような状況では、産物にプローブとのハイブリッド
形成のみならず分子量分析を科すことが望ましい。核酸
の分子量を決定する方法は公知であり、例えば、ゲル電
気泳動、勾配沈降法及びゲル排除クロマトグラフィーを
包含する。
llenstenおよびErlich, (1988)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 85, 7652-7656 に記載のように、ＰＣＲ増幅産物
の直接分析によって行うことができる。プローブによっ
て検出されたＰＣＲ産物の長さを決定することが望まし
いと思われる。変異した細菌菌株が標的領域内に欠失ま
たは挿入を有する場合、あるいは、ＰＣＲ産物の長さを
確認したいと思う場合には特にこのことが当てはまる。
このような状況では、産物にプローブとのハイブリッド
形成のみならず分子量分析を科すことが望ましい。核酸
の分子量を決定する方法は公知であり、例えば、ゲル電
気泳動、勾配沈降法及びゲル排除クロマトグラフィーを
包含する。
【００３１】生物試料中の標的配列の存在は、ＰＣＲ増
幅技法を行った核酸とプローブとの間でハイブリッドが
形成されるかどうかを判定することによって検出され
る。プローブと核酸配列との間で形成されるハイブリッ
ドの検出方法は公知である。例えば、非標識試料をそれ
が結合する固相マトリックスに移し、結合した試料を、
標識プローブとの特異的ハイブリッド形成を可能にする
ような条件にさらす；次に標識プローブの存在について
固相マトリックスを試験する。あるいはまた、試料が標
識されている場合には、非標識プローブを固相に結合
し、適当なハイブリッド形成条件にさらした後、標識の
存在についてマトリックスを調べる。Saikiら、(1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 6230-6234は、多数
のプローブを固相支持体に固定化し、対象となる増幅さ
れた標的ポリヌクレオチドを検出するためにハイブリッ
ド形成を利用する方法を記載する。後者の方法は、必要
な情報のタイプに応じて、増幅された標的ＤＮＡを様々
なレベルで同定することができる一連のプローブの使用
によく適している。別法に於て、液相サンドイッチアッ
セイを標識ポリヌクレオチドプローブとともに用いるこ
とができ、このようなプローブの作製方法は1989年４月
11日付米国特許第4,820,630号に記載される。
幅技法を行った核酸とプローブとの間でハイブリッドが
形成されるかどうかを判定することによって検出され
る。プローブと核酸配列との間で形成されるハイブリッ
ドの検出方法は公知である。例えば、非標識試料をそれ
が結合する固相マトリックスに移し、結合した試料を、
標識プローブとの特異的ハイブリッド形成を可能にする
ような条件にさらす；次に標識プローブの存在について
固相マトリックスを試験する。あるいはまた、試料が標
識されている場合には、非標識プローブを固相に結合
し、適当なハイブリッド形成条件にさらした後、標識の
存在についてマトリックスを調べる。Saikiら、(1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 6230-6234は、多数
のプローブを固相支持体に固定化し、対象となる増幅さ
れた標的ポリヌクレオチドを検出するためにハイブリッ
ド形成を利用する方法を記載する。後者の方法は、必要
な情報のタイプに応じて、増幅された標的ＤＮＡを様々
なレベルで同定することができる一連のプローブの使用
によく適している。別法に於て、液相サンドイッチアッ
セイを標識ポリヌクレオチドプローブとともに用いるこ
とができ、このようなプローブの作製方法は1989年４月
11日付米国特許第4,820,630号に記載される。
【００３２】また、前記のあらゆるＰＣＲ法の実施に利
用されるＰＣＲキットも本発明の範囲内である。細菌検
出のためのＰＣＲキットは、第１の容器および第２の容
器を含んでなり、ここで第１の容器は細菌内のポリヌク
レオチド配列の標的領域を増幅することができるプライ
マーを含有し、第２の容器は増幅された標的核酸配列と
ハイブリッド形成することのできる一またはそれ以上の
プローブを含有する。望ましくは、用いられるプライマ
ーは図１に示すようなものであり、プローブは図２−図
６に示すプローブから選択される。これらはいずれも、
標識されていても、いなくともよい。標識されていない
ならば、標識するための成分もキット中に入れることが
できる。キットは、特定のハイブリッド形成プロトコー
ルに必要な、他の適当なパッケージされた試薬および材
料、例えば、標準物質、および／または重合試薬、並び
にテストを実施するための説明書、を含有することがで
きる。
用されるＰＣＲキットも本発明の範囲内である。細菌検
出のためのＰＣＲキットは、第１の容器および第２の容
器を含んでなり、ここで第１の容器は細菌内のポリヌク
レオチド配列の標的領域を増幅することができるプライ
マーを含有し、第２の容器は増幅された標的核酸配列と
ハイブリッド形成することのできる一またはそれ以上の
プローブを含有する。望ましくは、用いられるプライマ
ーは図１に示すようなものであり、プローブは図２−図
６に示すプローブから選択される。これらはいずれも、
標識されていても、いなくともよい。標識されていない
ならば、標識するための成分もキット中に入れることが
できる。キットは、特定のハイブリッド形成プロトコー
ルに必要な、他の適当なパッケージされた試薬および材
料、例えば、標準物質、および／または重合試薬、並び
にテストを実施するための説明書、を含有することがで
きる。
【００３３】使用に際して、ＰＣＲキットを構成する物
質を核酸試料に加えると、標的核酸配列の検出および増
幅を可能にする反応試薬混合物を生じる。したがって、
この反応試薬混合物は、キットの構成物質ならびに対象
となるポリヌクレオチドを含有する核酸試料を包含す
る。より明確にするために、以下のプローブおよびプラ
イマーヌクレオチド塩基対データを提示する：図４のプ
ローブＲＤＲ２４５は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ
遺伝子のヌクレオチド塩基番号1369−1395の相補物に相
当し、Neefs ら (下記) の文献に詳述される。
質を核酸試料に加えると、標的核酸配列の検出および増
幅を可能にする反応試薬混合物を生じる。したがって、
この反応試薬混合物は、キットの構成物質ならびに対象
となるポリヌクレオチドを含有する核酸試料を包含す
る。より明確にするために、以下のプローブおよびプラ
イマーヌクレオチド塩基対データを提示する：図４のプ
ローブＲＤＲ２４５は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ
遺伝子のヌクレオチド塩基番号1369−1395の相補物に相
当し、Neefs ら (下記) の文献に詳述される。
【００３４】図１のプライマーＲＷ０１は、大腸菌１６
ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド塩基番号1170
−1189に相当し、Neefs の文献に詳述される。図１のプ
ライマーＤ６７４は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺
伝子のヌクレオチド塩基番号1522−1540の相補物に相当
し、Neefs の文献に詳述される。図２のプローブＲＷ０
３は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオ
チド塩基番号1190−1217に相当し、Neefs の文献に詳述
される。
ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド塩基番号1170
−1189に相当し、Neefs の文献に詳述される。図１のプ
ライマーＤ６７４は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺
伝子のヌクレオチド塩基番号1522−1540の相補物に相当
し、Neefs の文献に詳述される。図２のプローブＲＷ０
３は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオ
チド塩基番号1190−1217に相当し、Neefs の文献に詳述
される。
【００３５】図３のプローブＤＬ０４およびＲＤＲ２７
８は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオ
チド塩基番号1190−1217の相補物に相当し、Neefs の文
献に詳述される。図５のプローブＲＤＲ１４０ＫＧは、
大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド塩
基番号1458−1482に相当し、Neefs の文献に詳述され
る。
８は、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオ
チド塩基番号1190−1217の相補物に相当し、Neefs の文
献に詳述される。図５のプローブＲＤＲ１４０ＫＧは、
大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド塩
基番号1458−1482に相当し、Neefs の文献に詳述され
る。
【００３６】図６のプローブＲＤＲ２７９は、大腸菌１
６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド塩基番号11
90−1217の相補物に相当し、Neefs の文献に詳述され
る。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に基づく、様々な微生物に由
来する核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブが、科学文献に記載されている。例えば、ユニバーサ
ル細菌プローブはWilsonら("ポリメラーゼ・チェイン・
リアクションによる細菌１６ＳリボソームＤＮＡの増
幅", Kenneth Wilson, Rhonda BlitchingtonおよびRona
ld Greene (1990), Journal of Clinical Microbiolog
y, 28, 1942-1946)およびChenら("真正細菌核酸を検出
・増幅するための広範囲ＤＮＡプローブ",Kui Chen, Ha
rold Neimark, Peter Rumore, および Charles Steinma
n, (1989)FEMS microbiology letters, 57, 19-24) に
よって記載されている。属−および種−特異的プローブ
の例は、Barry ら (“微生物のＤＮＡプローブを作製す
るための一般的方法", Tom Barry, Richard Powell, Fr
ank Gannon(1990), Biotech-nology 8, 233-236)、Atla
s およびBej ("ＰＣＲと遺伝子プローブを用いた環境水
試料中の細菌病原体の検出”Ronald Atlas and Asim Be
j, "PCR protocols :A guide to metheds and applicat
ions," (1990) p.399-406 (Jnis M.A., ed.),Academic
Press, Inc.) によって記載され、またGenprobeの国際
特許出願第WO88/03957号公報に記載されている。本出願
によって請求される発明は、検出される細菌の範囲に於
いて上記発明とは異なる。グラム陽性およびグラム陰性
プローブは一定範囲の異なる細菌属を検出し、したがっ
て、ユニバーサル細菌プローブより特異性が高く、属−
または種−特異的プローブよりは広範である。ユニバー
サル細菌プローブ、グラム陽性およびグラム陰性プロー
ブ、および種または群特異的プローブを包含する一連の
プローブを使用することにより、属−または種−特異的
プローブを集めて使用するよりも信頼性の高い細菌検出
を得ることができるが、これはユニバーサル細菌プロー
ブおよびグラム陰性またはグラム陽性プローブが、もっ
と特異的なプローブのいずれによっても検出されない細
菌を検出することができるためである。また、記載した
一連のプローブは、単一のユニバーサル細菌プローブよ
りも臨床上より有用な情報を提供する；これは、グラム
陰性対グラム陽性細菌の感染について、異なる抗生物質
治療が推奨されるためである。
６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド塩基番号11
90−1217の相補物に相当し、Neefs の文献に詳述され
る。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に基づく、様々な微生物に由
来する核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブが、科学文献に記載されている。例えば、ユニバーサ
ル細菌プローブはWilsonら("ポリメラーゼ・チェイン・
リアクションによる細菌１６ＳリボソームＤＮＡの増
幅", Kenneth Wilson, Rhonda BlitchingtonおよびRona
ld Greene (1990), Journal of Clinical Microbiolog
y, 28, 1942-1946)およびChenら("真正細菌核酸を検出
・増幅するための広範囲ＤＮＡプローブ",Kui Chen, Ha
rold Neimark, Peter Rumore, および Charles Steinma
n, (1989)FEMS microbiology letters, 57, 19-24) に
よって記載されている。属−および種−特異的プローブ
の例は、Barry ら (“微生物のＤＮＡプローブを作製す
るための一般的方法", Tom Barry, Richard Powell, Fr
ank Gannon(1990), Biotech-nology 8, 233-236)、Atla
s およびBej ("ＰＣＲと遺伝子プローブを用いた環境水
試料中の細菌病原体の検出”Ronald Atlas and Asim Be
j, "PCR protocols :A guide to metheds and applicat
ions," (1990) p.399-406 (Jnis M.A., ed.),Academic
Press, Inc.) によって記載され、またGenprobeの国際
特許出願第WO88/03957号公報に記載されている。本出願
によって請求される発明は、検出される細菌の範囲に於
いて上記発明とは異なる。グラム陽性およびグラム陰性
プローブは一定範囲の異なる細菌属を検出し、したがっ
て、ユニバーサル細菌プローブより特異性が高く、属−
または種−特異的プローブよりは広範である。ユニバー
サル細菌プローブ、グラム陽性およびグラム陰性プロー
ブ、および種または群特異的プローブを包含する一連の
プローブを使用することにより、属−または種−特異的
プローブを集めて使用するよりも信頼性の高い細菌検出
を得ることができるが、これはユニバーサル細菌プロー
ブおよびグラム陰性またはグラム陽性プローブが、もっ
と特異的なプローブのいずれによっても検出されない細
菌を検出することができるためである。また、記載した
一連のプローブは、単一のユニバーサル細菌プローブよ
りも臨床上より有用な情報を提供する；これは、グラム
陰性対グラム陽性細菌の感染について、異なる抗生物質
治療が推奨されるためである。
【００３７】以下の実施例は、本発明の様々な方法およ
び化合物の説明を意図するものである。
び化合物の説明を意図するものである。
【００３８】
【実施例】実施例１ 以下の実施例のプローブを設計するために使用する方法
候補となるグラム陰性プローブＲＷ０４, ＤＬ０４, Ｄ
Ｌ０５およびＲＤＲ２７８, グラム陽性プローブＲＷ０
３およびバクテロイドプローブＲＤＲ２７９はGenbank
またはＥＭＢＬのヌクレオチド配列ライブラリーのデー
タから設計した(Dams等「小型リボソームサブユニット
ＲＮＡ配列の編集」(1988), NucleicAcid Research, 1
6巻、補遺；Neefs 等「小型リボソームサブユニットＲ
ＮＡ配列の編集」 (1990), 18, 2237-2317, 補遺；およ
び、C. Woeseの報告文「細菌の進化」(1987), Microbio
logical Reviews, 51(2), 221-271)。
Ｌ０５およびＲＤＲ２７８, グラム陽性プローブＲＷ０
３およびバクテロイドプローブＲＤＲ２７９はGenbank
またはＥＭＢＬのヌクレオチド配列ライブラリーのデー
タから設計した(Dams等「小型リボソームサブユニット
ＲＮＡ配列の編集」(1988), NucleicAcid Research, 1
6巻、補遺；Neefs 等「小型リボソームサブユニットＲ
ＮＡ配列の編集」 (1990), 18, 2237-2317, 補遺；およ
び、C. Woeseの報告文「細菌の進化」(1987), Microbio
logical Reviews, 51(2), 221-271)。
【００３９】プローブの位置は種々の細菌群に独特の
「配列サイン」を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内の領域の
発見に基づいて選択した (Woese の文献) 。これらの６
プローブは全てこの遺伝子の同じ領域に位置している。
プローブのヌクレオチド配列は検出すべき細菌の各群に
対して有効な配列に基づいて設計し、そして除外すべき
細菌の群の相当する配列と比較した。例えばグラム陽性
プローブは、グラム陽性細菌の殆どでみとめられる配列
の大部分と合致し、そしてグラム陰性細菌の相当する配
列とは異なるよう設計した。
「配列サイン」を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内の領域の
発見に基づいて選択した (Woese の文献) 。これらの６
プローブは全てこの遺伝子の同じ領域に位置している。
プローブのヌクレオチド配列は検出すべき細菌の各群に
対して有効な配列に基づいて設計し、そして除外すべき
細菌の群の相当する配列と比較した。例えばグラム陽性
プローブは、グラム陽性細菌の殆どでみとめられる配列
の大部分と合致し、そしてグラム陰性細菌の相当する配
列とは異なるよう設計した。
【００４０】候補となるユニバーサル細菌プローブＲＤ
Ｒ２４４およびＲＤＲ２４５は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の
高度に保存された領域に相当する。この領域のプローブ
配列の殆どは、配列情報が入手できるような細菌種の殆
どに存在し、真核細胞種の核またはミトコンドリアのＤ
ＮＡには存在しない。更に、上記オリゴヌクレオチド各
々の自己相補性 (自身と塩基対を形成する能力) をウイ
スコンシン大学の一連のプログラムのうちのＦＯＬＤと
称されるコンピュータープログラムを用いて調べた。オ
リゴヌクレオチドプローブの位置は可能な場合は２次構
造の形成を最小限にしつつ所望の特異性が維持されるよ
うに選択した。
Ｒ２４４およびＲＤＲ２４５は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の
高度に保存された領域に相当する。この領域のプローブ
配列の殆どは、配列情報が入手できるような細菌種の殆
どに存在し、真核細胞種の核またはミトコンドリアのＤ
ＮＡには存在しない。更に、上記オリゴヌクレオチド各
々の自己相補性 (自身と塩基対を形成する能力) をウイ
スコンシン大学の一連のプログラムのうちのＦＯＬＤと
称されるコンピュータープログラムを用いて調べた。オ
リゴヌクレオチドプローブの位置は可能な場合は２次構
造の形成を最小限にしつつ所望の特異性が維持されるよ
うに選択した。
【００４１】E.coli／腸内細菌プローブはGenbank のデ
ータから設計した。プローブは以下の段階により設計し
た。第１に、E.coliおよび Proteus vulgaris に対する
bp1430〜1536のヌクレオチド配列 (Neefs の文献に記
載) (増幅プライマーＲＷ０１およびＤＧ７４により結
合される370bp 領域内) をNeisseria gonorrhoeae, Pse
udomonas aeruginosaおよびPseudomonas testosteroni
を含む非腸内細菌種のパネルの配列と比較した。配列に
差異の生じた領域を記録し、候補プローブの設計に用い
た。
ータから設計した。プローブは以下の段階により設計し
た。第１に、E.coliおよび Proteus vulgaris に対する
bp1430〜1536のヌクレオチド配列 (Neefs の文献に記
載) (増幅プライマーＲＷ０１およびＤＧ７４により結
合される370bp 領域内) をNeisseria gonorrhoeae, Pse
udomonas aeruginosaおよびPseudomonas testosteroni
を含む非腸内細菌種のパネルの配列と比較した。配列に
差異の生じた領域を記録し、候補プローブの設計に用い
た。
【００４２】第２に、候補プローブをGenbank またはＥ
ＭＢＬに記載されている系統学的に一層異なる種の対応
するヌクレオチド配列と比較して、候補オリゴヌクレオ
チドが別の種を検知しないことを確かめた。第３に、オ
リゴヌクレオチドの自己相補性 (自身と塩基対を形成す
る能力) をOLIGO と称されるコンピュータープログラム
(National Biosciences, Hamel, NN) を用いて調べた。
オリゴヌクレオチドプローブの位置は可能な場合は２次
構造の形成を最小限にしつつ所望の特異性が維持される
ように選択した。実施例２ ＰＣＲおよびプローブＤＬ０４を用いたグラム陰性細菌
の検知 グラム陰性細菌ＤＮＡのＰＣＲ増幅を以下のとおり行な
った。使用したプライマーは図１に示す。
ＭＢＬに記載されている系統学的に一層異なる種の対応
するヌクレオチド配列と比較して、候補オリゴヌクレオ
チドが別の種を検知しないことを確かめた。第３に、オ
リゴヌクレオチドの自己相補性 (自身と塩基対を形成す
る能力) をOLIGO と称されるコンピュータープログラム
(National Biosciences, Hamel, NN) を用いて調べた。
オリゴヌクレオチドプローブの位置は可能な場合は２次
構造の形成を最小限にしつつ所望の特異性が維持される
ように選択した。実施例２ ＰＣＲおよびプローブＤＬ０４を用いたグラム陰性細菌
の検知 グラム陰性細菌ＤＮＡのＰＣＲ増幅を以下のとおり行な
った。使用したプライマーは図１に示す。
【００４３】グラム陽性および陰性細菌の両方の標的配
列を増幅するために、下記に示す成分を含有する標準Ｐ
ＣＲ ２×ミックスを調製した。 10×標準ＰＣＲ緩衝液 10.0ml 50mM MgCl2 1.0ml dNTP's (2.5mM 総 dNTP's) 2.5ml プライマー RW01 (50mM) 1.0ml プライマー DG74 (50mM) 1.0ml H2O 35.0ml Taq DNA ポリメラーゼ (5U/ml) 0.5ml 10×標準ＰＣＲ緩衝液は以下の成分を含有する： 100mM トリス-HCl, pH8.3 500mM KCl 15mM MgCl Ａ. グラム陰性細菌ＤＮＡ試料50mlをＰＣＲ ２×ミッ
クス50mlと混合した。
列を増幅するために、下記に示す成分を含有する標準Ｐ
ＣＲ ２×ミックスを調製した。 10×標準ＰＣＲ緩衝液 10.0ml 50mM MgCl2 1.0ml dNTP's (2.5mM 総 dNTP's) 2.5ml プライマー RW01 (50mM) 1.0ml プライマー DG74 (50mM) 1.0ml H2O 35.0ml Taq DNA ポリメラーゼ (5U/ml) 0.5ml 10×標準ＰＣＲ緩衝液は以下の成分を含有する： 100mM トリス-HCl, pH8.3 500mM KCl 15mM MgCl Ａ. グラム陰性細菌ＤＮＡ試料50mlをＰＣＲ ２×ミッ
クス50mlと混合した。
【００４４】反応混合物を0.５mlマイクロ遠心管に入
れ、管をパーキンエルマー社製の熱サイクラーに入れ
た。２段階ＰＣＲサイクルを用い、サーモサイクラーは
以下のとおり設定した。 １. 時間遅延ファイル ：95℃５分 ２. サーモサイクルファイル：95℃２５秒；55℃25秒； 各インキュベーション25〜35サイクル ３. 時間遅延ファイル ：72℃10分 Ｂ. 増幅された生成物の検知 増幅反応終了後、ＰＣＲ反応液100ml 中５mlを10×ＤＮ
Ａ染料緩衝液１ml (50％スクロース、10mMトリス、pH7.
5,１mM EDTA, 1.0％ SDS, 0.05％ブロムフェノールブル
ー) と混合した。試料を２％ Nusieveアガロース, 0.５
％ Seakem アガロース, １×ＴＢＥ (45mMトリスホウ酸
塩, １mM EDTA)ゲル上に適用した。ブロモフェノールブ
ルー染料の前線がゲル底部まで泳動した後、ゲルをエチ
ジウムブロミド (５mg／ml) で染色し、水で洗浄し、ポ
ラロイドカメラとオレンジフィルターを用いてＵＶ光下
で撮影した。
れ、管をパーキンエルマー社製の熱サイクラーに入れ
た。２段階ＰＣＲサイクルを用い、サーモサイクラーは
以下のとおり設定した。 １. 時間遅延ファイル ：95℃５分 ２. サーモサイクルファイル：95℃２５秒；55℃25秒； 各インキュベーション25〜35サイクル ３. 時間遅延ファイル ：72℃10分 Ｂ. 増幅された生成物の検知 増幅反応終了後、ＰＣＲ反応液100ml 中５mlを10×ＤＮ
Ａ染料緩衝液１ml (50％スクロース、10mMトリス、pH7.
5,１mM EDTA, 1.0％ SDS, 0.05％ブロムフェノールブル
ー) と混合した。試料を２％ Nusieveアガロース, 0.５
％ Seakem アガロース, １×ＴＢＥ (45mMトリスホウ酸
塩, １mM EDTA)ゲル上に適用した。ブロモフェノールブ
ルー染料の前線がゲル底部まで泳動した後、ゲルをエチ
ジウムブロミド (５mg／ml) で染色し、水で洗浄し、ポ
ラロイドカメラとオレンジフィルターを用いてＵＶ光下
で撮影した。
【００４５】ＰＣＲ生成物の大きさは約370bp であっ
た。 Ｃ. 増幅ＤＮＡのナイロン膜への移行 ゲル撮影後、ゲルを室温で10分間 0.25N HClに浸漬し
た。ゲルを水で洗浄し、次に30分間 0.5N NaOH, 1.5M N
aCl の溶液に浸漬した。ゲルを水で洗浄し、30分間１M
トリス、pH7.5, 1.5M NaClの溶液に浸漬した。
た。 Ｃ. 増幅ＤＮＡのナイロン膜への移行 ゲル撮影後、ゲルを室温で10分間 0.25N HClに浸漬し
た。ゲルを水で洗浄し、次に30分間 0.5N NaOH, 1.5M N
aCl の溶液に浸漬した。ゲルを水で洗浄し、30分間１M
トリス、pH7.5, 1.5M NaClの溶液に浸漬した。
【００４６】以下の２つの方法、すなわち(1) Stratage
ne Staratavac 真空ブロッターを用いた真空移行、また
は(2) Southernの方法によるキャピラリー移行、の何れ
か一方により、予め水に浸漬したナイロン膜 (Pall Bio
dyne) にＤＮＡを移行させた。移行後Stratagene Stara
talinkerで、ＵＶ光を用いてＤＮＡを膜に固定化した。 Ｄ. オリゴヌクレオチドプローブＤＬ０４の放射標識
(図３) オリゴヌクレオチドＤＬ０４を以下の反応混合物中、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識した。
ne Staratavac 真空ブロッターを用いた真空移行、また
は(2) Southernの方法によるキャピラリー移行、の何れ
か一方により、予め水に浸漬したナイロン膜 (Pall Bio
dyne) にＤＮＡを移行させた。移行後Stratagene Stara
talinkerで、ＵＶ光を用いてＤＮＡを膜に固定化した。 Ｄ. オリゴヌクレオチドプローブＤＬ０４の放射標識
(図３) オリゴヌクレオチドＤＬ０４を以下の反応混合物中、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識した。
【００４７】γ-32-Ｐ ＡＴＰ 10ml
10×キナーゼ緩衝液 2.5ml
オリゴヌクレオチド (10mM) 2.0ml
H2O 8.5ml
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ 2.0ml
10×キナーゼ緩衝液は以下の成分を含有する。
【００４８】500mM トリス, pH８
100mM MgCl2
50mM DTT
キナーゼ反応混合物を37℃で30分間インキュベートし
た。0.25M EDTA 5.6mlおよび水169.4ml を添加して反応
を停止した。この混合物をBiogel P4 の1.0ml 容カラム
に適用し、5000rpm で５分間、卓上遠心分離器で回転し
て標識オリゴヌクレオチドを組み込まれなかった放射能
から分離した。カラム溶出液の１mlをシンチレーション
液を添加せずにシンチレーションカウンターで計数し
( Cerenkov計数) 、放射能の取込み量の概算値を得た。
各ブロットに対して約１×106 cpmを与えるような量を
用いて後のハイブリダイゼーションを行なった。 Ｅ. プローブとＤＮＡとのハイブリダイゼーション ＤＮＡブロットを60℃で、５×ＳＳＰＥ, 0.５％ＳＤＳ
の混合物中、予備ハイブリダイズした (１×SSPE＝0.18
M NaCl, 10mM NaPO4, pH 7.4, 1mM EDTA)。標識したオ
リゴヌクレオチドプローブを7.５mlの５×ＳＳＰＥ, 0.
５％ＳＤＳに添加して混合した。予備浸漬したブロット
の入ったプラスチック袋にこの溶液を入れた。ブロット
を１〜18時間60℃でインキュベートした。
た。0.25M EDTA 5.6mlおよび水169.4ml を添加して反応
を停止した。この混合物をBiogel P4 の1.0ml 容カラム
に適用し、5000rpm で５分間、卓上遠心分離器で回転し
て標識オリゴヌクレオチドを組み込まれなかった放射能
から分離した。カラム溶出液の１mlをシンチレーション
液を添加せずにシンチレーションカウンターで計数し
( Cerenkov計数) 、放射能の取込み量の概算値を得た。
各ブロットに対して約１×106 cpmを与えるような量を
用いて後のハイブリダイゼーションを行なった。 Ｅ. プローブとＤＮＡとのハイブリダイゼーション ＤＮＡブロットを60℃で、５×ＳＳＰＥ, 0.５％ＳＤＳ
の混合物中、予備ハイブリダイズした (１×SSPE＝0.18
M NaCl, 10mM NaPO4, pH 7.4, 1mM EDTA)。標識したオ
リゴヌクレオチドプローブを7.５mlの５×ＳＳＰＥ, 0.
５％ＳＤＳに添加して混合した。予備浸漬したブロット
の入ったプラスチック袋にこの溶液を入れた。ブロット
を１〜18時間60℃でインキュベートした。
【００４９】プラスチック袋からブロットを取出し、２
×ＳＳＰＥ, 0.１％ＳＤＳ溶液中に入れ、室温で10分間
洗浄した。次にグラム陰性プローブＤＬ０４の場合はブ
ロットを３M 塩化テトラメチルアンモニウム (ＴＭＡＣ
ｌ) , 50mMトリス, pH８,0.２％ＳＤＳの溶液中、10分
間64℃で洗浄した。ブロットを風乾し、Saran ラップに
包み、70℃で１〜72時間、増感スクリーンを用いるか用
いることなく、Kodak XAR-5 Ｘ線フィルムのシートと共
にＸ線フィルムホルダーに取付けた。実施例３ ＰＣＲおよびプローブＲＷ０３を用いたグラム陽性細菌
の検知 グラム陽性細菌は以下に示す以外は実施例２と同じ方法
および材料を用いて検知した。
×ＳＳＰＥ, 0.１％ＳＤＳ溶液中に入れ、室温で10分間
洗浄した。次にグラム陰性プローブＤＬ０４の場合はブ
ロットを３M 塩化テトラメチルアンモニウム (ＴＭＡＣ
ｌ) , 50mMトリス, pH８,0.２％ＳＤＳの溶液中、10分
間64℃で洗浄した。ブロットを風乾し、Saran ラップに
包み、70℃で１〜72時間、増感スクリーンを用いるか用
いることなく、Kodak XAR-5 Ｘ線フィルムのシートと共
にＸ線フィルムホルダーに取付けた。実施例３ ＰＣＲおよびプローブＲＷ０３を用いたグラム陽性細菌
の検知 グラム陽性細菌は以下に示す以外は実施例２と同じ方法
および材料を用いて検知した。
【００５０】グラム陽性菌ＤＮＡ含有試料50mlをＰＣＲ
２×ミックスに添加した。使用プローブはグラム陽性
特異的プローブＲＷ０３であった (図２) 。段階Ｅにお
いて、ブロットを３M ＴＭＡＣｌ, 50mMトリス, pH８,
0.２％ＳＤＳの溶液中で洗浄する際には、グラム陰性試
験で64℃の温度を用いたのとは異なり、62℃で行なっ
た。実施例４ グラム陰性細菌の検知−プローブＲＷ０４とＤＬ０４の
比較 候補のグラム陰性プローブＲＷ０４を32Ｐで標識し、Ｔ
ＭＡＣｌ中での洗浄を62℃で行なった以外は実施例２の
グラム陰性プローブＤＬ０４について記載したように、
種々の細菌ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブリダイズ
した。ハイブリダイゼーションのサザンブロット結果を
表１にまとめる。データによれば、２つのプローブで得
たハイブリダイゼーション結果は、たとえ両プローブと
もグラム陰性「ユニバーサル」プローブであるように設
計されても異なっている。ＲＷ０４はそれが検知する必
要のない多くのグラム陽性種に対して陽性のシグナルを
与えており、ＤＬ０４はそれが検知すべき陰性種のみに
対して陽性のシグナルを与えている (ただしヒト病原体
でない T. maritimaおよび T. thermophilusを除く) 。
従ってＤＬ０４をグラム陰性細菌の検知に有用なプロー
ブとして選択した。その後の試験 (表２) により、ＤＬ
０４は全グラム陰性種を検知するわけではないことが解
った。第２の候補グラム陰性プローブＲＤＲ２７８は実
施例５において以下に示すように試験した。実施例５ プローブＲＤＲ２７８を用いたグラム陰性細菌の検知 64℃で行なったＴＭＡＣｌ洗浄を含め、実施例２の方法
および材料を用いてグラム陰性細菌を検知した。
２×ミックスに添加した。使用プローブはグラム陽性
特異的プローブＲＷ０３であった (図２) 。段階Ｅにお
いて、ブロットを３M ＴＭＡＣｌ, 50mMトリス, pH８,
0.２％ＳＤＳの溶液中で洗浄する際には、グラム陰性試
験で64℃の温度を用いたのとは異なり、62℃で行なっ
た。実施例４ グラム陰性細菌の検知−プローブＲＷ０４とＤＬ０４の
比較 候補のグラム陰性プローブＲＷ０４を32Ｐで標識し、Ｔ
ＭＡＣｌ中での洗浄を62℃で行なった以外は実施例２の
グラム陰性プローブＤＬ０４について記載したように、
種々の細菌ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブリダイズ
した。ハイブリダイゼーションのサザンブロット結果を
表１にまとめる。データによれば、２つのプローブで得
たハイブリダイゼーション結果は、たとえ両プローブと
もグラム陰性「ユニバーサル」プローブであるように設
計されても異なっている。ＲＷ０４はそれが検知する必
要のない多くのグラム陽性種に対して陽性のシグナルを
与えており、ＤＬ０４はそれが検知すべき陰性種のみに
対して陽性のシグナルを与えている (ただしヒト病原体
でない T. maritimaおよび T. thermophilusを除く) 。
従ってＤＬ０４をグラム陰性細菌の検知に有用なプロー
ブとして選択した。その後の試験 (表２) により、ＤＬ
０４は全グラム陰性種を検知するわけではないことが解
った。第２の候補グラム陰性プローブＲＤＲ２７８は実
施例５において以下に示すように試験した。実施例５ プローブＲＤＲ２７８を用いたグラム陰性細菌の検知 64℃で行なったＴＭＡＣｌ洗浄を含め、実施例２の方法
および材料を用いてグラム陰性細菌を検知した。
【００５１】グラム陰性プローブＲＤＲ２７８を32Ｐで
標識し、種々の細菌ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブ
リダイズした。データを表２に示すＲＤＲ２７８はＤＬ
０４が検知しなかった種の殆どに対して陽性ハイブリダ
イゼーションシグナルを与えている。試験した種の内、
Bacteroides fragilisは例外であり、これに対しては、
別個のプローブを設計した。従って、グラム陰性プロー
ブＤＬ０４とＲＤＲ２７８の組合せにより、試験したグ
ラム陰性細菌の大部分が検知できることがわかる。実施例６ 「ユニバーサル」細菌プローブＲＤＲ２４４およびＲＤ
Ｒ２４５を用いた細菌の検知 64℃で行なったＴＭＡＣｌ洗浄を含めて、実施例２の方
法および材料を用いた。
標識し、種々の細菌ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブ
リダイズした。データを表２に示すＲＤＲ２７８はＤＬ
０４が検知しなかった種の殆どに対して陽性ハイブリダ
イゼーションシグナルを与えている。試験した種の内、
Bacteroides fragilisは例外であり、これに対しては、
別個のプローブを設計した。従って、グラム陰性プロー
ブＤＬ０４とＲＤＲ２７８の組合せにより、試験したグ
ラム陰性細菌の大部分が検知できることがわかる。実施例６ 「ユニバーサル」細菌プローブＲＤＲ２４４およびＲＤ
Ｒ２４５を用いた細菌の検知 64℃で行なったＴＭＡＣｌ洗浄を含めて、実施例２の方
法および材料を用いた。
【００５２】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の高度に保存された
領域に相当する候補のユニバーサル細菌プローブＲＤＲ
２４４およびＲＤＲ２４５を32Ｐで標識し、種々の細菌
ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブリダイズした。表３
にＲＤＲ２４４およびＲＤＲ２４５を用いたサザンブロ
ットハイブリダイゼーションにより試験した細菌ＤＮＡ
をまとめた。両プローブとも何れの細菌種も検知するよ
うに設計したにもかかわらず、両プローブは異なる挙動
を示した。試験した細菌種のうち、ＲＤＲ２４４はPept
ostreptococcus magnas (No.29) および P. anaerobius
(No.28)の２種を除く全ての細菌を検知したことがわか
った。ＲＤＲ２４５は試験した全細菌を検知した。従っ
て、ＲＤＲ２４５をユニバーサル細菌プローブとして選
択した。 実施例７ プローブＲＤＲ２７９を用いたBacteroides gragilisの
検知 64℃で行なったＴＭＡＣｌ洗浄を含めて、実施例２の方
法および材料を用いた。
領域に相当する候補のユニバーサル細菌プローブＲＤＲ
２４４およびＲＤＲ２４５を32Ｐで標識し、種々の細菌
ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブリダイズした。表３
にＲＤＲ２４４およびＲＤＲ２４５を用いたサザンブロ
ットハイブリダイゼーションにより試験した細菌ＤＮＡ
をまとめた。両プローブとも何れの細菌種も検知するよ
うに設計したにもかかわらず、両プローブは異なる挙動
を示した。試験した細菌種のうち、ＲＤＲ２４４はPept
ostreptococcus magnas (No.29) および P. anaerobius
(No.28)の２種を除く全ての細菌を検知したことがわか
った。ＲＤＲ２４５は試験した全細菌を検知した。従っ
て、ＲＤＲ２４５をユニバーサル細菌プローブとして選
択した。 実施例７ プローブＲＤＲ２７９を用いたBacteroides gragilisの
検知 64℃で行なったＴＭＡＣｌ洗浄を含めて、実施例２の方
法および材料を用いた。
【００５３】Bacteroidsの配列サインである領域に相当
するプローブＲＤＲ２７９ (図参照) を32Ｐで標識し、
種々の細菌ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブリダイズ
した。表２はその他の菌種に対して行なったＲＤＲ２７
９の試験の結果を示す。このプローブはBacteroides fr
agilisを検知したが、その他の試験した細菌種のいずれ
とも反応しなかった。実施例８ プローブＲＤＲ１４０ＫＧを用いた大腸菌／腸内細菌の
検知 E.coli／腸内細菌を66℃で行なったＴＭＡＴｌ洗浄の外
は実施例２の方法および材料を用いて検知した。E.coli
／腸内細菌プローブの結果を表４に示すが、これによれ
ば、このプローブを用いた場合には意図する種のみが検
知されたことが確認された。
するプローブＲＤＲ２７９ (図参照) を32Ｐで標識し、
種々の細菌ＤＮＡから得たＰＣＲ産物にハイブリダイズ
した。表２はその他の菌種に対して行なったＲＤＲ２７
９の試験の結果を示す。このプローブはBacteroides fr
agilisを検知したが、その他の試験した細菌種のいずれ
とも反応しなかった。実施例８ プローブＲＤＲ１４０ＫＧを用いた大腸菌／腸内細菌の
検知 E.coli／腸内細菌を66℃で行なったＴＭＡＴｌ洗浄の外
は実施例２の方法および材料を用いて検知した。E.coli
／腸内細菌プローブの結果を表４に示すが、これによれ
ば、このプローブを用いた場合には意図する種のみが検
知されたことが確認された。
【００５４】上記のプローブを組み合わせて使用してど
の細菌が血液試料中に存在するかを検知同定するため
に、これらプローブを敗血症の診断に適用する。上記の
全プローブならびに追加のプローブをSaiki 等の記載に
従って逆ドットブロットフォーマットに配置することが
できる。プローブをナイロン膜やマイクロタイタープレ
ートのような担体上に固定化する。増幅したＤＮＡを水
溶液中に、同時にプローブの各々にハイブリダイズす
る。プローブの各々から得られるシグナルのパターンが
標的ＤＮＡの特性を示す。例えばＤＮＡがグラム陰性細
菌のものである場合は、増幅されたＤＮＡはユニバーサ
ル細菌プローブおよびグラム陰性プローブの１つと反応
するのみである。ＤＮＡがグラム陽性種のものであれ
ば、それはユニバーサル細菌プローブおよびグラム陽性
プローブのみと陽性反応を示す。ＤＮＡがBacteroides
種のものである場合は、それはユニバーサル細菌プロー
ブおよびBacteroides プローブに対して陽性シグナルを
示す。ＤＮＡがグラム陰性でも陽性でもないような細菌
(例えば T. pallidum, スピロヘータ) のものである場
合、それはユニバーサル細菌プローブとのみ反応する。
細菌ＤＮＡが存在しない場合はいずれのプローブも陽性
シグナルを与えない。
の細菌が血液試料中に存在するかを検知同定するため
に、これらプローブを敗血症の診断に適用する。上記の
全プローブならびに追加のプローブをSaiki 等の記載に
従って逆ドットブロットフォーマットに配置することが
できる。プローブをナイロン膜やマイクロタイタープレ
ートのような担体上に固定化する。増幅したＤＮＡを水
溶液中に、同時にプローブの各々にハイブリダイズす
る。プローブの各々から得られるシグナルのパターンが
標的ＤＮＡの特性を示す。例えばＤＮＡがグラム陰性細
菌のものである場合は、増幅されたＤＮＡはユニバーサ
ル細菌プローブおよびグラム陰性プローブの１つと反応
するのみである。ＤＮＡがグラム陽性種のものであれ
ば、それはユニバーサル細菌プローブおよびグラム陽性
プローブのみと陽性反応を示す。ＤＮＡがBacteroides
種のものである場合は、それはユニバーサル細菌プロー
ブおよびBacteroides プローブに対して陽性シグナルを
示す。ＤＮＡがグラム陰性でも陽性でもないような細菌
(例えば T. pallidum, スピロヘータ) のものである場
合、それはユニバーサル細菌プローブとのみ反応する。
細菌ＤＮＡが存在しない場合はいずれのプローブも陽性
シグナルを与えない。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
【００６３】
【００６４】上記した本発明は説明を目的として詳述し
たものであるが、当業者は本発明の特許請求の範囲内で
種々の変更や修飾が可能なことが明らかであるだろう。
たものであるが、当業者は本発明の特許請求の範囲内で
種々の変更や修飾が可能なことが明らかであるだろう。
【図１】グラム陽性、グラム陰性および他の細菌に於
て、ＰＣＲによる標的領域の増幅に使用することのでき
る二つのユニバーサル細菌プライマーＤＧ７４およびＲ
Ｗ０１を示す。
て、ＰＣＲによる標的領域の増幅に使用することのでき
る二つのユニバーサル細菌プライマーＤＧ７４およびＲ
Ｗ０１を示す。
【図２】グラム陽性特異的プローブＲＷ０３を示す。
【図３】グラム陰性プローブの四つの候補、ＰＷ０４，
ＤＬ０４，ＤＬ０５およびＲＤＲ２７８を示す。
ＤＬ０４，ＤＬ０５およびＲＤＲ２７８を示す。
【図４】ユニバーサル細菌プローブの二つの候補、ＲＤ
Ｒ２４４およびＲＤＲ２４５を示す。
Ｒ２４４およびＲＤＲ２４５を示す。
【図５】大腸菌 (Escherichia coli) ／腸内細菌プロー
ブを示す。
ブを示す。
【図６】バイテロイデスプローブを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，1990，Ｖｏｌ．18，Ｓｕｐ
ｐｌｅｍｅｎｔ，ｐ．2237−2317
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ，1987，Ｖｏｌ．51，Ｎ
ｏ．２，ｐ．221−271
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/09
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】 下記配列： 5'-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3’（配列 DL04）、 5'-GACGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTC-3’（配列 RDR278）、 5'-GACGTAAGGGCCGTGCTGATTTGACGTC-3’（配列 RDR279）、 及び上記配列のいずれかに対して相補的なヌクレオチド
配列、からなる群から選択される配列の内、少なくとも
連続する14ヌクレオチドを有する断片から成り、グラム
陰性細菌又はバクテロイデス細菌に特異的なヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズすることのできるプローブであ
って、 配列DL04またはこの配列に対して相補的な配列の内、少
なくとも連続する14ヌクレオチドを有する断片から成る
プローブはアシネトバクター（Acinetobacter）、アク
ロモバクター（Achromobacter）、アエロモナス（Aerom
onas）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、ブラ
ンハメラ（Branhamella）、カンピロバクター（Campylo
bacter）、シトロバクター（Citrobacter）、エドワル
ドシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクター（Entero
bacter）、エセリヒア（Escherichia）、ヘモフィルス
（Haemophilus）、キンゲラ（Kingella）、レギオネラ
（Legionella）、モラキセラ（Moraxella）、パラコッ
カス（Paracoccus）、プロテウス（Proteus）、プロビ
デンシア（Providencia）、シュードモナス（Pseudomon
as）、ラーネラ（Rahnella）、サルモネラ（Salmonell
a）、セラチア（Seratia）又はイエルシニア（Yersini
a）属のグラム陰性細菌に特異的なヌクレオチド配列に
ハイブリダイズすることが出来、 配列RDR278またはこの配列に対して相補的な配列の内、
少なくとも連続する14ヌクレオチドを有する断片から成
るプローブはアシネトバクター（Acinetobacter）、ア
クロモバクター（Achromobacter）、アエロモナス（Aer
omonas）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、ア
ルカリゲネス（Alcaligenes）、ブランハメラ（Branham
ella）、カンピロバクター（Campylobacter）、クロモ
バクテリウム（Chromobacterium）、シトロバクター（C
itrobacter）、デルキシア（Derxia）、エドワルドシエ
ラ（Edwardsiella）、エイケネラ（Eikenella）、エン
テロバクター（Enterobacter）、エセリヒア（Escheric
hia）、ヘモフィルス（Haemophilus）、キンゲラ（King
ella）、レギオネラ（Legionella）、モラキセラ（Mora
xella）、ナイゼリア（Neisseria）、パラコッカス（Pa
racoccus）、プロテウス（Proteus）、プロビデンシア
（Providencia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ラ
ーネラ（Rahnella）、ロドスピリルム（Rhodospirillu
m）、セラチア（Seratia）又はイエルシニア（Yersini
a）属のグラム陰性細菌に特異的なヌクレオチド配列に
ハイブリダイズすることが出来、そして配列RDR279また
はこの配列に対して相補的な配列の内、少なくとも連続
する14ヌクレオチドを有する断片から成るプローブはバ
クテロイデス（Bacteroides）属の細菌に特異的なヌク
レオチド配列にハイブリダイズすることが出来る、 ことを特徴とするプローブ。 - 【請求項２】 ヌクレオチド配列が20〜28のヌクレオチ
ドよりなる請求項１に記載のプローブ。 - 【請求項３】 グラム陰性細菌に特異なヌクレオチド配
列にハイブリダイズすることができ、下記配列： 5'-GACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTC-3’（配列 DL04）、 5'-GACGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTC-3’（配列 RDR248） 及びこれらに相補的なヌクレオチド配列からなる群から
選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１または２
記載のプローブ。 - 【請求項４】 バクテロイデス（Bacteroides)属細菌に
特異なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることがで
き、下記配列： 5'-GACGTAAGGGCCGTGCTGATTTGACGTC-3’（配列 RDR249） 及びこれに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選
択されるヌクレオチド配列を有する請求項１または２記
載のプローブ。 - 【請求項５】 下記段階： （ａ）標的領域がある場合はこれを検知可能な水準まで
増幅すること； （ｂ）増幅された標的領域がある場合はこれをハイブリ
ッド２本鎖の特異的形成を許容する条件下で請求項１〜
４の何れか１項記載のプローブとともにインキュベート
すること；および （ｃ）増幅された標的領域がある場合はそれとプローブ
との間に形成されたハイブリッドを検知すること、 を含んで成る、選択された標的領域を有する細菌ポリヌ
クレオチドを含有する可能性のある試料中の細菌ポリヌ
クレオチドの存在を判定する方法。 - 【請求項６】 標的領域をポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション（PCR）により増幅する請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 １対のプライマーが標的領域を増幅する
ために使用され、少なくとも１つのプライマーが、約15
〜約30のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含
み、下記配列： 5’-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3’または 5’-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3’， またはこれに相補的なヌクレオチド配列を含んで成る、
細菌に特異なヌクレオチド配列にハイブリダイズするこ
とのできる、請求項５又は６記載の方法。 - 【請求項８】 細菌のポリヌクレオチド配列の標的領域
を増幅することのできるプライマーを収容した第１の容
器、および請求項１〜４の何れか１項記載のプローブの
１つ以上を収容した第２の容器を含んで成る細菌検知の
ためのPCRキット。 - 【請求項９】 前記第１の容器が請求項７記載のプライ
マー対を含む請求項８記載のPCRキット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59317690A | 1990-10-05 | 1990-10-05 | |
| US69644891A | 1991-05-06 | 1991-05-06 | |
| US07/593176 | 1991-05-06 | ||
| US07/696448 | 1991-05-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690799A JPH0690799A (ja) | 1994-04-05 |
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Family
ID=27081638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25818291A Expired - Lifetime JP3415167B2 (ja) | 1990-10-05 | 1991-10-04 | 細菌を同定する方法および試薬 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3415167B2 (ja) |
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| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US20030049636A1 (en) | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| DE19734940A1 (de) * | 1997-08-12 | 1999-02-18 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleinsäuremolekül-Satz für Salmonella-Nachweis, Nucleinsäuren, Kit und Verwendung |
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| EP2322666A3 (en) | 1999-09-28 | 2011-08-10 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Highly conserved gene and its use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes for microorganisms. |
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Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4717653A (en) * | 1981-09-25 | 1988-01-05 | Webster John A Jr | Method for identifying and characterizing organisms |
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| NL8900670A (nl) * | 1989-03-17 | 1990-10-16 | Stichting Tech Wetenschapp | Polynucleotide-probe, werkwijze en kit voor het identificeren en opsporen van gram-negatieve bacterien. |
| WO1990015157A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-13 | Gene-Trak Systems | Universal eubacteria nucleic acid probes and methods |
| CA2033718A1 (en) * | 1990-01-19 | 1991-07-20 | Ronald M. Atlas | Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor |
| CA2092317A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-03-29 | David H. Gelfand | Purified thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermosipho africanus |
-
1991
- 1991-09-26 ES ES91116396T patent/ES2168250T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-26 EP EP91116396A patent/EP0479117B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-26 DE DE1991632830 patent/DE69132830T2/de not_active Expired - Lifetime
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- 1991-10-04 JP JP25818291A patent/JP3415167B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-04 CA CA 2052822 patent/CA2052822C/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９８７，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．２，ｐ．２２１−２７１ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，Ｖｏｌ．１８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｐ．２２３７−２３１７ |
Also Published As
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