JP3411116B2 - フローサイトメータ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】この発明は、シースフローセル内
を流れる細胞や粒子を撮像する機能を有するフローサイ
トメータに関するものである。 【０００２】 【従来の技術】蛍光染料等で試薬処理した細胞浮遊液を
細いガラス管に導き、その試料流にレーザ光を照射し、
細いガラス管内を流れる細胞や粒子について目的とする
大きさのものを撮像してその画像を記憶するフローサイ
トメータが知られている（例えば、特開昭６３−９４１
５６号公報参照）。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
このようなフローサイトメータでは、記憶した多数の画
像の中から所望の画像を選別して表示することが容易で
ないという問題点があった。この発明は、このような事
情を考慮してなされたもので、表示させたい画像を、分
布図上で指定することによって容易に表示することが可
能なフローサイトメータを提供するものである。 【０００４】 【課題を解決するための手段】この発明は、粒子を含む
試料流を形成するシースフローセルと、試料流の第１流
域において粒子からの信号を検出する検出手段と、試料
流の第２流域において粒子の像を撮像する撮像手段と、
表示手段と、検出手段の出力に基づいて各粒子の特徴を
表わす複数の特徴パラメータを算出する算出手段と、特
徴パラメータの分布図を作成し表示手段に表示する分布
図作成手段と、分布図内の任意の座標領域を指定する座
標指定手段と、この座標指定手段によって座標領域が指
定され第１流域で検出された粒子を表わす座標が指定さ
れた座標領域内に存在するときその粒子像を撮像手段に
撮像させる撮像制御手段と、撮像された粒子像をその座
標と関連づけて記憶する画像記憶手段と、分布図内の撮
像済み粒子を表わす座標が座標指定手段によって指定さ
れたとき、その座標に対応する粒子像を画像記憶手段か
ら読出して表示手段に表示させる読出し手段を備えてな
るフローサイトメータを提供するものである。 【０００５】この発明のシースフローセルは、粒子を含
む試料液をシース液で包んで流すことにより流体力学的
効果によって細い試料液の流れを形成させることのでき
るフローセルであり、これには、従来公知のものを用い
ることができる。 【０００６】この発明のフローサイトメータが対象とす
る粒子は、血液や尿に含まれる血球や細胞を主としてい
るが、酵母菌や乳酸菌等の微生物、あるいは工業用の粉
体等を測定対象としてもよい。血球や細胞の種類を分類
するために、細胞内の種類や核酸等を特異的な蛍光試薬
と反応させ、その蛍光強度を計測するようにすることが
ある。 【０００７】粒子信号を検出する検出手段としては電気
的検出によるもの、光学的検出によるものなどを用いる
ことができる。例えば、試料流の第１流域に光を照射す
る光源（例えばレーザやハロゲンランプ又はタングステ
ンランプのような連続的に光を照射する連続光源）と、
この光源によって照明された粒子からの散乱光や蛍光な
どの光の強度を出力する光検出器（例えばフォトダイオ
ード、フォトトランジスタ又はフォトマルチプライヤ）
とで構成することができる。 【０００８】撮像のために試料流の第２流域に光を照射
する光源を備えるのが好ましいが、これには、レーザ、
ハロゲンランプ又はタングステンランプのような連続的
に光を照射する連続光源、又はパルスレーザ（例えば、
Spectra-Physics 社製、7000シリーズ）やマルチストロ
ボ（例えば、（株）菅原研究所製、ＤＳＸシリーズ）の
ような断続的に光を照射する断続光源を用いることがで
きる。連続光源には、通常、光シャッターを組合せて断
続光源として用いることが好ましい。そして、光シャッ
ターとしては、公知の音響光学効果素子（acounsto-opt
ic modulator９又は電気光学効果素子（electro-optic
modulator）などを用いることができる。 【０００９】粒子の像を撮像する撮像手段には、一般的
な２次元画像を撮像するビデオカメラを使用してもよい
が、その場合には、微弱な光像を増強するイメージイン
テンシファイアを備えたものを用いることが好ましい。
さらに、そのイメージインテンシファイアにはシャッタ
ー手段を備えてもよい。第２流域は第１流域の下流にあ
ってもよいし、同じような位置にあってもよい。 【００１０】表示手段には、ＣＲＴや液晶ディスプレイ
などを用いることができる。特徴パラメータの分布図を
作成し表示手段に表示する分布図作成手段、撮像手段に
粒子像を撮像させる撮像制御手段、撮像された粒子像を
その座標と関連づけて記憶する画像記憶手段、および記
憶された粒子像を画像記録手段から読出して表示手段に
表示させる読出し手段は、ＣＰＵ、ＲＯＭおよびＲＡＭ
からなるマイクロコンピュータによって構成される。分
布図とは、特徴パラメータの分布状態を表すものの総称
であり、好適な例は２次元スキャッタグラムである。 【００１１】また、分布図内の任意の座標領域を指定す
る座標指定手段は、分布図内の任意のドットの座標およ
び任意の形状の座標領域を指定できるが、これには、キ
ーボードやマウスなどの入力手段を用いることが好まし
い。 【００１２】 【作用】この発明において、シースフローセルは、粒子
を含む試料流を形成し、光検出手段は、試料流の第１流
域において粒子からの信号を検出し、撮像手段は、第２
流域の粒子の像を撮像する。分布図作成手段は、検出手
段の出力に基づいて各粒子の特徴を表わす特徴パラメー
タの分布図を作成し表示手段に表示する。 【００１３】座標指定手段は、表示された分布図内の任
意の座標および座標領域を指定する。撮像制御手段は、
指定手段によって座標領域が指定され、第１流域で検出
された粒子を表わす座標がその指定領域内に存在すると
き撮像手段にその粒子像を撮像させ、画像記憶手段は、
撮像された粒子像をその座標と関連づけて記憶する。そ
して、読出し手段は、分布図内の撮像済み粒子を表わす
座標が座標指定手段によって指定されたとき、その座標
に対応する粒子像を画像記憶手段から読出して表示手段
に表示させる。 【００１４】 【実施例】この発明の実施例における光学系を図１およ
び図２に示す。この実施例では、散乱光や蛍光を検出す
るための連続発光レーザ光源１と、細胞像を撮像するた
めのパルス光源２との２つの光源を設けている。この２
つの光源１、２からの光Ｌ１、Ｌ２は、図２に示すよう
に角型のシースフローセル３（図１では紙面に直角方向
に試料流が流れる）に対して互に直交するように９０°
交差させて照射している。また、この実施例では、細胞
像を撮像するためのパルス光は、シースフローセル３内
の試料流に対して、連続発光レーザ光源１の照射位置よ
り下流側（例えば0.5mm程）に照射するようにしてい
る。このように照射位置をずらすことによって、細胞に
よる散乱光や蛍光に影響されない、より明瞭な細胞像を
撮像することができる。 【００１５】適当な試薬で処理された細胞浮遊液は、シ
ースフローセル３に導かれ、シース液によって細く絞ら
れた試料流が形成される。連続発光レーザ光は、コンデ
ンサレンズ４によって細く絞られて試料流に照射され
る。この照射領域に細胞Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３……Ｐｎが流
れてくると、各細胞による散乱光や蛍光が集光レンズ５
によって集められ、散乱光はダイクロイックミラー６に
よって反射され、フォトダイオード７で受光される。緑
色、赤色の蛍光は、それぞれダイクロイックミラー８、
ミラー９によって反射され、光電子増倍管１０、１１で
受光、増倍される。 【００１６】フォトダイオード７、光電子増倍管１０、
１１によって検出された散乱光強度信号Ｓ１および蛍光
強度信号Ｓ２、Ｓ３は、図３に示す信号処理装置１００
に渡され、各検出信号パルスの高さ、面積、巾等の情報
がＡ／Ｄ変換され各種特徴パラメータが算出される。 【００１７】図３はこの実施例の信号処理系の構成を示
し、この信号処理系ではデータ処理装置１００により、
散乱光強度ａ、信号パルス巾ｂ、緑蛍光強度ｃ、赤蛍光
強度ｄの４つの特徴パラメータを得るようにしている。
撮像制御回路２００では、それらのパラメータを用いて
各細胞の種類をリアルタイムで判定し、あらかじめ撮像
対象として指定された種類の細胞だけを選別して撮像で
きるように制御する。 【００１８】すなわち、ある細胞の特徴パラメータが、
撮像対象としている種類の細胞の特徴パラメータに合致
しているかどうかを実時間で比較し、その結果撮像対象
としている細胞であると判定されれば、その細胞を撮像
するための発光トリガ信号Ｔｓをパルス光源２に対して
供給する。 【００１９】パルス光源２は、発光トリガ信号Ｔｓによ
って一瞬だけ（数十ナノ秒程度）発光するタイプの光源
であり、試料流の流速が数ｍ／秒と高速であっても、流
れる細胞をブレ無く撮像することができる。パルス光は
図１に示すように、光ファイバー１２でフローセル３へ
導かれ、コンデンサレンズ１３によって細く絞られて試
料流に照射される。 【００２０】光ファイバー１２を介して照射することに
より、パルス光のコヒーレンシーを低下させ、回析縞の
少ない細胞像を撮像することができる。試料流を透過し
たパルス光は、投影レンズ１４によってビデオカメラ１
５の受光面に結像され、細胞の透過光像が撮像される。
ビデオカメラ１５からのビデオ信号Ｖｓは図３に示すデ
ータ処理装置３００に渡され、ディジタル画像として記
憶、保存される。 【００２１】散乱光強度や蛍光強度等の特徴パラメータ
ａ〜ｄは、データ処理装置３００に渡され、それらのパ
ラメータの組み合わせによるスキャッタグラム（２次元
頻度分布）の解析が行われる。なお、入力装置４００は
キーボードやマウスからなり、スキャッタグラムを形成
するための１組の特徴パラメータの指定や、スキャッタ
グラムにおける座標および座標領域の指定や、撮像回数
の設定などを行なう。５００はスキャッタグラムおよび
細胞像などを表示する表示装置、例えば、ＣＲＴであ
る。また、信号処理装置１００、撮像制御回路２００お
よびデータ処理装置３００は、ＣＰＵ、ＲＯＭおよびＲ
ＡＭからなるマイクロコンピュータにより構成される。 【００２２】このような構成における動作を図４に示す
フローチャートを用いて説明する。まず、使用者が、入
力装置４００により、スキャッタグラムのＸ軸およびＹ
軸に割当てるべき特徴パラメータとしてそれぞれａ，ｂ
を指定すると、図５に示すようにスキャッタグラムＳＧ
が表示装置５００に表示され、さらに、所望の座標領域
を入力装置４００で指定すると、それに対応してキャッ
タグラムＳＧの中に指定された座標領域Ａが図５のよう
に表示される（ステップＳ１，Ｓ２）。 【００２３】次に、図１および図２に示すようにシース
フローセル３の試料流中を細胞Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３……Ｐ
ｎが順次流れ、フォトダイオード７および光電子増倍管
１０、１１が、まず、細胞Ｐ１からの光を検出すると
（ステップＳ３）、各検出信号Ｓ１〜Ｓ３が、信号処理
装置１００においてＡ／Ｄ変換されて、特徴パラメータ
ａ１〜ｄ１が算出される（ステップＳ４、Ｓ５）。 【００２４】次に、細胞Ｐ１の座標（ａ１，ｂ１）が領
域Ａ内にあるか否かが判別され（ステップＳ６）、図５
のように、座標（ａ１，ｂ１）が領域Ａ内にある場合に
は、直ちに、細胞Ｐ１がビデオカメラ１５によって撮像
可能であるか否かが撮像制御回路２００により判定され
る（ステップＳ７）。 【００２５】撮像可能であると判定されると、撮像制御
回路２００よりパルス光源２を信号Ｔｓが出力され、パ
ルス光源２が発光して細胞Ｐ１がビデオカメラ１５で撮
像される（ステップＳ８）。 【００２６】なお、ステップＳ５において作成された特
徴パラメータａ，ｂ，ｃ，ｄを表すデータ（各８ビッ
ト）は、検出順に図８に示すように、データセットとし
てデータ処理装置３００内のメモリに格納される。ステ
ップＳ８において細胞Ｐ１の撮像が終了すると、図８に
示すように、細胞Ｐ１のデータの末尾のフラグビットが
１（ＯＮ）となり、細胞Ｐ１は撮像済みであることが記
録される（ステップＳ９）。 【００２７】細胞Ｐ１につづく細胞Ｐ２についても、ス
テップＳ３〜Ｓ５の処理が行われ、ステップＳ６におい
て、細胞Ｐ２の特徴パラメータの座標（ａ２，ｂ２）
が、図５のように指定座標領域Ａの外に存在すると判定
された場合あるいはステップＳ７において撮像可能状態
でない場合には、特徴パラメータのフラグビットは図８
に示すように、０（ＯＦＦ）となり、細胞Ｐ２は撮像さ
れなかったことが記録される（ステップＳ１０）。 【００２８】以下、細胞Ｐ３〜Ｐｎについても、順次、
同様の処理が行われ、細胞Ｐ１〜Ｐｎの特徴パラメータ
のデータセット（図８）が作成される（ステップＳ１
１）。 【００２９】次に、図８の細胞Ｐ１〜Ｐｎの各フラグビ
ットが検索され（ステップＳ１２）、フラッグビットが
１である細胞の特徴パラメータの座標は図６に示すよう
に黒の四角形のドットでスキャッタグラムＳＧに表示さ
れ（ステップＳ１３）、フラグビットが０の粒子の特徴
パラメータの座標は、図６に示すように小さい黒丸のド
ットでスキャッタグラムＳＧに表示される（ステップＳ
１４）。 【００３０】次に、使用者が、入力装置４００を用い
て、黒の四角形のドットで表示された座標の中から細胞
Ｐｋの座標を指定すると（ステップＳ１５）、スキャッ
タグラムＳＧの細胞Ｐｋの座標を表すドットが、図７に
示すように、大きい黒丸に変化し（ステップＳ１６）、
それと同時に、細胞Ｐｋの細胞像がデータ処理装置３０
０のメモリから読出され、表示装置５００の表示画面Ｄ
Ｐに表示される（ステップＳ１７）。 【００３１】また、この時、表示装置５００には、細胞
Ｐｋの特徴パラメータａｋ〜ｄｋの値が表示される。な
お、スキャッタグラム上のドットについて、この実施例
は、撮像された細胞の座標を黒の四角形のドットで表示
し、細胞像を表示中の細胞の座標を大きい黒丸で表示し
て、使用者の識別を容易にしたが、これらを他の形状の
ドットや色の異なるドットで表示してもよい。 【００３２】 【発明の効果】この発明によれば、粒子（細胞）と対応
づけて特徴パラメータと画像を記憶し、分布図の分布位
置と粒子画像とを両者の対応が明らかなように表示する
ことができるので、粒子の形態観察が可能となる。さら
に分布図の分布点を指定するごとに直ちにその粒子画像
を見ることができるので便利である。例えば通常の細胞
が分布しない領域に分布している粒子があればそれがど
の様な粒子であるかを画像で確認することができるので
異常粒子の発見に役立つ。また、特徴パラメータのデー
タのみでは分類不明な粒子については画像により使用者
の判断を加味することができるので分析精度が向上する
と共に、粒子分類結果の裏付けとしても粒子画像を容易
に利用することができる。

【図面の簡単な説明】 【図１】この発明の実施例の光学系の構成を示す説明図
である。 【図２】図１の要部斜視図である。 【図３】実施例の制御系の構成を示すブロッック図であ
る。 【図４】実施例の動作を示すフローチャートである。 【図５】実施例の表示例を示す説明図である。 【図６】実施例の表示例を示す説明図である。 【図７】実施例の表示例を示す説明図である。 【図８】実施例の特徴パラメータのデータセットを示す
説明図である。 【符号の説明】 １．連続発光レーザ ２．パルス光源 ３．シースフローセル ４．コンデンサレンズ ５．集光レンズ ６．ダイクロイックミラー ７．フォトダイオード ８．ダイクロイックミラー ９．ミラー １０．光電子増倍管 １１．光電子増倍管 １２．光ファイバー １３．コンデンサレンズ １４．投影レンズ １５．ビデオカメラ

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−79970（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−213799（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−43942（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−34556（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 15/02 G01N 15/14 G01N 33/49

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 粒子を含む試料流を形成するシースフロ
   ーセルと、試料流の第１流域において粒子からの信号を
   検出する検出手段と、試料流の第２流域において粒子の
   像を撮像する撮像手段と、表示手段と、検出手段の出力
   に基づいて各粒子の特徴を表わす複数の特徴パラメータ
   を算出する算出手段と、特徴パラメータの分布図を作成
   し表示手段に表示する分布図作成手段と、分布図内の任
   意の座標領域を指定する座標指定手段と、この座標指定
   手段によって座標領域が指定され第１流域で検出された
   粒子を表わす座標が指定された座標領域内に存在すると
   きその粒子像を撮像手段に撮像させる撮像制御手段と、
   撮像された粒子像をその座標と関連づけて記憶する画像
   記憶手段と、分布図内の撮像済み粒子を表わす座標が座
   標指定手段によって指定されたとき、その座標に対応す
   る粒子像を画像記憶手段から読出して表示手段に表示さ
   せる読出し手段を備えてなるフローサイトメータ。