JP3394256B2 - α２，８−シアリルトランスフェラーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、α2,8−シアリルトランスフェラーゼ、該
α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードするDNA、
該DNAがみ込まれた組換え体ベクターおよび該組換え体
ベクターを含有する細胞ならびにそれらの製造法に関す
る。さらに、該α2,8−シアリルトランスフェラーゼを
用いる糖鎖の製造法および該α2,8−シアリルトランス
フェラーゼを形質転換細胞内に発現させることによる糖
鎖の製造法に関する。さらには、本発明のα2,8−シア
リルトランスフェラーゼをコードするDNAを用いる該α
2,8−シアリルトランスフェラーゼの検出法およびその
生産の抑制法に関する。本発明のα2,8−シアリルトラ
ンスフェラーゼは、ガングリオシドGD3等の有用生理活
性を有する糖鎖とその修飾物の製造等に有用である。

背景技術 大腸菌などの原核生物によって生産されるタンパク質
が糖鎖を有していないのに対し、酵母、カビ、植物細
胞、動物細胞等の真核生物によって生産されるタンパク
質および脂質には糖鎖が結合している場合が多い。

動物細胞の糖鎖としては、タンパク質に付加するもの
として、タンパク質中のアスパラギン（Asn）残基に結
合するＮ−グリコシド結合型糖鎖（Ｎ−グリカンとも呼
ばれる）、およびセリン（Ser）またはスレオニン（Th
r）残基に結合するＯ−グリコシド結合型糖鎖（Ｏ−グ
リカンとも呼ばれる）が知られている。最近、数多くの
タンパク質には糖鎖を含むある種の脂質が共有結合して
おり、この脂質を介してそれらのタンパク質は細胞膜に
付着していることが明らかとなった。糖鎖を含むこの脂
質はグリコシル・ホスファチジルイノシトール・アンカ
ー（glycosyl phosphatidylinositol anchor）と呼ばれ
る。

他に、動物細胞の糖鎖としては、グリコサミノグリカ
ン（glycosaminoglycan）があげられる。タンパク質と
グリコサミノグリカンが共有結合している化合物はプロ
テオグリカン（proteoglycan）と呼ばれる。プロテオグ
リカンの糖鎖を構成するグリコサミノグリカンは、糖タ
ンパク質糖鎖であるＯ−グリカンと構造が類似している
が化学的には異なっている。グリコサミノグリカンは、
グリコサミン（glucosamine）またはガラクトサミン（g
alactosamine）とウロン酸〔但し、ケラタン硫酸（kera
tan sulfate）はウロン酸を有していない〕を含む２糖
単位の繰り返し構造から成り、硫酸基が共有結合してい
る〔但し、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）は硫酸基
を有していない〕という特徴を有している。

さらに、動物細胞の糖鎖として、糖脂質（glycolipi
d）と呼ばれる物質に含まれる糖鎖が挙げられる。動物
細胞の糖脂質としては、糖と長鎖脂肪酸と長鎖塩基であ
るスフィンゴシン（sphingosine）が共有結合したスフ
ィンゴ糖脂質（sphingoglycolipid）と、糖鎖がグリセ
ロールに共有結合したグリセロ糖脂質（glyceroglycoli
pid）とが知られている。

最近、糖鎖の機能については分子生物学や細胞生物学
の進歩とともに急速に解明が進んでおり、現在までに糖
鎖の多様な機能が明らかにされてきている。まず、血中
における糖タンパク質のクリアランスに糖鎖は重要な役
割を果たしている。大腸菌に遺伝子を移入して作られた
エリスロポイエチン（erythropoietin）は、生体外（in
vitro）では活性を示すが、生体内（in vivo）では急
速にクリアランス（clearance）されることが知られて
いる〔ドーダル（Dordal）ら：エンドクリノロジー（En
docrinology），116,2293（1985）およびブローネ（Bro
wne）ら：コールド・スプリング・ハーバー・シンポジ
ア・オン・クアンティテェイティブ・バイオロジー（Co
ld Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.），51,693（1986）〕。
ヒト顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（human
granulocyte−macrophage colony stimulating factor;
hGM−CSF）は、天然ではＮ−グリコシド結合型糖鎖を２
本持っているが、糖鎖の本数を減らすとそれに比例して
ラット血漿のクリアランス速度が速まることが知られて
いる〔ドナヒュー（Donohue）ら：コールド・スプリン
グ・ハーバー・シンポジア・オン・クアンティテェイテ
ィブ・バイオロジー（Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Bio
l.），51,685（1986）〕。クリアランスの速度およびク
リアランスされる部位は糖鎖の構造によっても変化し、
シアル酸がついたhGM−CSFは腎臓でクリアランスされる
のに対し、シアル酸を除去したhGM−CSFはクリアランス
速度が速まり、肝臓でクリアランスされることが知られ
ている。ラット肝初代培養の系で各種のＮ−グリコシド
型糖鎖生合成阻害剤存在下に生合成された、糖鎖構造の
異なるα１−acid glycoproteinについて、ラットの血
漿中のクリアランス速度及びラット灌流液からのクリア
ランス速度を調べたところ、どちらの場合も、高マンノ
ース型、糖鎖欠損型、ハイブリッド型、複合型（天然
型）の順でクリアランス速度が遅くなった。血栓溶解剤
としてすでに医薬品として用いられている組織型プラス
ミノーゲン活性化因子（ｔ−PA;tissue−type plasmino
gen activator）の血中でのクリアランスもその糖鎖の
構造が大きく影響を与えることが知られている。

糖鎖がタンパク質にプロテアーゼ抵抗性を付与するこ
とが知られており、例えば、フィブロネクチン（fibron
ectin）の糖鎖形成をツニカマイシンで阻害すると、得
られた糖鎖欠損フィブロネクチンの細胞内分解速度が増
進する。糖鎖の付加により、熱安定性や抗凍結性が増大
することも知られている。エリスロポイエチンやβ−イ
ンターフェロンなどにおいては、タンパク質の溶解性の
増大に糖鎖が寄与していることが知られている。

糖鎖は、タンパク質が正しい立体構造を保持するのに
も役立っている。水泡性口内炎ウイルスの膜結合糖タン
パク質の天然に存在する２本のＮ−グリコシド結合型糖
鎖を除去すると、タンパク質の細胞表面への輸送が阻害
されるが、そのタンパク質に新たな糖鎖が付加されると
それが回復することが知られている。この場合、糖鎖の
除去により、ジスルフィド結合によるタンパク質分子間
の会合が誘起され、その結果タンパク質の輸送が阻害さ
れることが明らかとなった。新たに糖鎖を付加すると、
この会合が阻害されることによりタンパク質の正しい立
体構造が保持されるため、タンパク質の輸送が可能にな
る。その際、新たな糖鎖が付加される位置については、
かなりの融通性があることが示されている。その反面、
糖鎖が導入される位置によっては天然の糖鎖を有するタ
ンパク質の輸送をも完全に阻害する場合があることも明
らかとなった。

糖鎖がポリペプチド上の抗原部位をマスクしている例
も知られている。hGM−CSF、プロラクチン（prolacti
n）、インターフェロン−γ、ラウシャー（Rauscher）
白血病ウィルスgp70およびインフルエンザヘマグルチニ
ン（influenza hemagglutinin）において、ポリクロー
ナル抗体またはペプチド上の特定の領域に対する単クロ
ーン抗体を用いた実験から、これらタンパク質の糖鎖
が、抗体との反応を阻害していると考えられている。糖
鎖自身が糖タンパク質の活性発現に直接かかわっている
場合があることも知られており、例えば、黄体形成ホル
モン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン等の
ような糖タンパク質ホルモンの活性発現に糖鎖が関与し
ていると考えられている。

糖鎖の重要な機能として、糖鎖が、細胞間、タンパク
質間または細胞とタンパク質間の認識現象に関与してい
ることが挙げられる。例えば、糖鎖の構造の違いにより
生体内でクリアランスされる場所が異なることが知られ
ている。最近、炎症反応に対して特異的に血管内皮細胞
上に発現し、好中球との接着を促すタンパク質ELAM−１
のリガンドがシアリルルイスｘ（Sialyl−Lewis x）と
呼ばれる糖鎖〔NeuAcα２−3Galβ１−４（Fucα１−
３）GlcNAc、NeuAc:シアル酸;Gal:ガラクトース;Fuc:フ
コース;GlcNAc:N−アセチルグルコサミン〕であること
が判明し、糖鎖自体あるいは糖鎖の修飾物が医薬品など
に利用できる可能性が出てきた〔フィリプス（Phillip
s）ら：サイエンス（Science），250,1130（1990）、ゲ
ルツ（Goelz）ら：トレンズ・イン・グライコサイエン
ス・アンド・グライコテクノロジー（Trends in Glycos
cience and Glycotechnology），４,14（1992）〕。一
部のＴリンパ球や好中球に発現しているＬ−セレクチン
（Ｌ−selectin）や炎症刺激によって血小板や血管内皮
細胞の膜表面に発現するGMP−140（Ｐ−セレクチンとも
呼ぶ）はELAM−１と同じく炎症反応に関係しており、そ
れらのリガンドもELAM−１のリガンドであるシアリルル
イスｘ（sialyl−Lewis x）糖鎖に類似した糖鎖である
ことが示唆されている〔ローゼン（Rosen）ら：トレン
ズ・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテク
ノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnolo
gy），４,1（1992）、ラーセン（Larsen）ら：トレンズ
・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノ
ロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnolog
y），４,25（1992）、アルフォ（Aruffo）ら：トレンズ
・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノ
ロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnolog
y），４,146（1992）〕。

炎症反応と同様に、癌の転移においても、ELAM−１や
GMP−140は癌細胞の血管内壁への接着や癌細胞と血小板
との凝集を引き起こすことにより癌転移を促進している
ことが示唆されている〔ゲルツ（Goelz）ら：トレンズ
・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノ
ロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnolog
y），４,14（1992）、ラーセン（Larsen）ら：トレンズ
・イン・グライコサイエンス・アンド・グライコテクノ
ロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnolog
y），４,25（1992）〕。このことは転移能の高い癌細胞
ではシアリルルイスｘ（Sialyl−Lewis x）糖鎖の発現
量が高いという知見とも符号する〔入村（irimura）
ら：実験医学（Experimental Medicine），６,33（198
8）〕。

ガングリオシドは細胞膜を構成している糖脂質の１種
で、親水性側鎖であるシアル酸を含む糖鎖と、疎水性側
鎖であるスフィンゴシン、脂肪酸から構成される分子で
ある。ガングリオシドの発現は、細胞、臓器、動物種に
よって異なるばかりでなく、細胞の分化や癌化の過程に
おいても発現しているガングリオシドが量的、質的変化
を起こすことが知られている〔箱守（Hakomori）：キャ
ンサー・リサーチ（Canser Res.），45,2405（198
5）〕。ガングリオシドには、多くの正常細胞に発現し
ているGM3を始めとして、極微量だけ存在するものまで
数十種類の存在が知られている〔ウィーガント（Wiegan
t）：ガングリオシド・アンド・キャンサー（Gangliosi
de and Cancer）、Verlagsgesellschaft、1989年刊、５
−15頁〕。その中で、GD3は、正常組織では微量にしか
存在しないのに対し、悪性黒色腫などの神経外胚葉系腫
瘍に高発現していることから、一種の癌抗原として考え
られている〔Tsuchidaら：ジャーナル・ナショナル・キ
ャンサー・インスティテュート（J.Natl.Cancer Ins
t.），78,45−54（1987）〕。また、最近、悪性黒色腫
の悪性度に応じてGD3とGM3の比率が変化することも報告
され〔Ravindranathら：キャンサー（Cancer），67,302
9（1991）〕、GD3が重要な癌抗原であることが広く知ら
れている。さらに、癌遺伝子を導入した細胞ではGD3の
発現が誘導されることも証明され、細胞の癌化とGD3の
発現が密接に関連していることが裏づけられている〔Sa
naiら：ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Bio
chem.），107,740−742（1990）〕。GD3の機能として
は、癌細胞が細胞外基質に接着するときに重要な役割を
果たすことが示唆されている〔Burnsら：ジャーナル・
セル・バイオロジー（J.Cell Biol.），107,1225−1230
（1988）〕。

GD3の発現異常は、GD3合成酵素であるα2,8−シアリ
ルトランスフェラーゼに起因することが示唆されている
〔Yusufら：バイオロジカル・ケミストリー・ホップセ
イラー（Biol.Chem.Hoppe−Seyler），368,455−462（1
987）〕。しかしながら、GD3合成酵素については、部分
精製が報告されているのみで〔Guら：バイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン（Biochem.Biophys.Res.Commun.），166,387−393
（1990）〕、GD3合成酵素は単離されていない。

GD3を抗原とした癌の免疫療法は、GD3に対するモノク
ローナル抗体を癌患者に投与する受動免疫療法が試みら
れているほか〔Houghtonら：プロシーディンウ・ナショ
ナル・アカデミー・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA），82,1242（1985）〕、GD3自身をワクチンとして癌
患者に免疫する能動免疫療法も試みられている〔Portou
kalianら：インターナショナル・ジャーナル・オブ・キ
ャンサー（Int.J.Cancer），49,893−899（1991）〕、
〔Ritterら：インターナショナル・ジャーナル・オブ・
キャンサー（Int.J.Cancer），48,379−385（199
1）〕。このように、GD3は癌抗原として応用価値の高い
ものであるが、GD3を得るには組織からの精製では量的
に限られており〔Takamizawaら：ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），261,56
25−5630（1986）〕、また化学合成法も高度な技術が必
要であり収率も極めて低い〔伊藤（Ito）ら：ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（J.A
m.Chem.Soc.），111,8508−8510（1989）〕。

これらの知見から、GD3は癌化や癌の転移と関連があ
るので、GD3合成酵素であるα2,8−シアリルトランスフ
ェラーゼの酵素活性を阻害したり、その遺伝子発現を抑
制することにより、癌を治療できることが期待される。
ある特定の遺伝子の発現を抑制するには、アンチセンス
RNA/アンチセンスDNA技術〔徳久（Tokuhisa）：バイオ
サイエンスとインダストリー，50,322（1992）、村上
（Murakami）：化学，46,681（1991）〕またはトリプル
・ヘリックス（Triple helix）技術〔チュブ（Chubb）
とホーガン（Hogan）：トレンズ・イン・バイオテクノ
ジー（Trends in Biotechnology），10,132（1992）〕
が有用である。このアンチセンスRNA/DNA技術を用いて
所望の糖転移酵素の発現を抑制するには、その遺伝子あ
るいは遺伝子の塩基配列情報が必要であるため、所望の
糖転移酵素の遺伝子をクローン化すること、およびその
塩基配列情報を解析することは重要である。

また、上述のように、GD3合成酵素であるα2,8−シア
リルトランスフェラーゼは癌化と深い関連があり、その
発現量を調べることにより、癌の診断に役に立つことが
期待される。GD3合成酵素であるα2,8−シアリルトラン
スフェラーゼの遺伝子発現を調べるには、該遺伝子また
は該遺伝子の部分断片を放射能などで標識したものをプ
ローブとするノーザンハイブリダイゼーション法〔サン
ブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsch）、マニア
チス（Maniatis）（モレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A labo
ratory manual）、第２版、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor L
aboratory Press）、1989年刊〕やポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション法（以下、PCR法と略記する）〔イ
ニス（Innis）ら:PCRプロトコールズ（PCR Protocol
s）、アカデミック・プレス（Academic Press）、1990
年刊〕が有用である。これらの手法を適用するには、GD
3合成酵素であるα2,8−シアリルトランスフェラーゼの
遺伝子あるいは遺伝子の塩基配列情報が必要である。こ
の点からも、GD3合成酵素であるα2,8−シアリルトラン
スフェラーゼの遺伝子をクローン化すること、およびそ
の塩基配列情報を解析することは重要である。

特開平２−227075に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CS
F;granulocyte colony−stimulating factor）やプロウ
ロキナーゼ（pro−UK;pro−urokinase）等の有用生理活
性タンパク質に、組換えDNA技術を用いて人為的に糖鎖
を導入することにより、これらのタンパク質の性質を改
善することができることが開示されている。

GD3合成酵素が持つα2,8−シアリルトランスフェラー
ゼ活性を利用して、糖タンパク質や糖脂質の糖鎖構造を
改変したり、特定の糖鎖あるいはその修飾物を大量に調
製することは産業上重要な課題である。

糖鎖の構造を改変する手段については近年著しく進展
している。特に糖鎖を逐次解離してゆく特異性の高い酵
素（エキソグリコシダーゼ）やペプチド鎖との結合点を
ペプチド鎖と糖鎖の双方を変化させずに解裂させるグリ
コペプチダーゼやエンド型グリコシダーゼによって、糖
鎖の構造を改変させることができ、糖鎖の生物学的な役
割についても詳細な研究ができるようになった。さら
に、最近、糖脂質の糖鎖とセラミドの間を開裂するエン
ドグリコセラミダーゼ（endoglycoceramidase）が見出
され〔伊東と山形：ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.），261,14278（198
6）〕、これにより、糖脂質の糖鎖の調製が容易になっ
ただけでなく、糖脂質、特に細胞表層糖脂質の機能を解
明する研究が進展した。また、糖転移酵素により、新た
な糖鎖を付加することも可能となってきた。例えば、シ
アリルトランスフェラーゼにより、糖鎖の末端にシアル
酸を新たに付加することができる〔サベサン（Sabesa
n）とポールソン（Paulson）：ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサエティー（J.Am.chem.Soc.），
108,2068（1986）〕。その他種々の糖転移酵素やグリコ
シダーゼの阻害剤〔アランら：アニュアル・レビュー・
オブ・バイオケミストリー（Annu.Rev.Biochem.），56,
497（1997）〕を用いることにより、付加する糖鎖を変
化させることも可能である。しかしながら、糖鎖の合成
に用いる糖転移酵素を大量に製造する方法はない。組換
えDNA技術を用いて糖転移酵素をクローン化し、糖転移
酵素を宿主細胞内で効率よく発現させることにより、糖
転移酵素を大量に製造することが望まれる。

シアリルトランスフェラーゼに関しては、βガラクト
シドα2,6−シアリルトランスフェラーゼ（βgalactosi
deα2,6−sialyltransferase）活性を有する酵素の遺伝
子が単離されており、その塩基配列も明らかになってい
る〔ワインスタイン（Weinstein）ら：ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），
262,17735（1987）〕。βガラクトシドα2,3−シアリル
トランスフェラーゼ（βgalactosideα2,3−sialyltran
sferase）活性を有する酵素に関しては、ギルスピー（G
illespie）らが、糖タンパク質のＯグリコシド結合型糖
鎖（セリンまたはスレオニン残基に付加する糖鎖）中の
ガラクトースにシアル酸を付加する酵素をコードする遺
伝子のクローン化を報告しているが、その塩基配列は明
らかにされていない〔ギルスピー（Gillespie）ら：グ
ライココンジュゲート・ジャーナル（Glycoconjugate
J.），７,469（1990）〕。また、ワインスタイン（Wein
stein）らは、ラット肝臓からβガラクトシドα2,3−シ
アリルトランスフェラーゼ（βgalactosideα2,3−sial
yltransferase）活性を有する酵素を精製する方法を報
告している〔ワインスタイン（Weinstein）ら：ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
ehm.），257,13835（1982）〕が、この方法では所望の
酵素を極めて少量しか得ることができない。このラット
肝臓のβガラクトシドα2,3−シアリルトランスフェラ
ーゼの遺伝子は、ウェンらによってクローン化されたが
〔ウェン（Wen）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），267,21011（199
2）〕、ヒトのガラクトシドα2,8−シアリルトランスフ
ェラーゼの遺伝子についての報告はない。α2,8−シア
リルトランスフェラーゼ活性を保有するシアリルトラン
スフェラーゼについては、これまでに大量に調製した例
や該活性を持つシアリルトランスフェラーゼ遺伝子のク
ローン化の報告はない。したがって、α2,8−シアリル
トランスフェラーゼ活性を保有するシアリルトランスフ
ェラーゼ、とくにヒトのガラクトシドα2,8−シアリル
トランスフェラーゼを大量に調製する手段はなく、該酵
素の発現を検出および抑制する方法も確立されていな
い。

本発明の目的は、ガングリオシドGD3の効率的生産を
行うことができる新規α2,8−シアリルトランスフェラ
ーゼおよび該α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコ
ードするcDNAおよび該cDNAを含有するベクターを提供す
ることにある。また、癌などの疾病を診断、治療するた
めに有用な該α2,8−シアリルトランスフェラーゼの活
性発現を検出する方法、および該α2,8−シアリルトラ
ンスフェラーゼの発現を抑制する方法を提供することに
ある。

発明の開示 本発明者らは、ヒト・メラノーマ細胞株WM266−４か
ら抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを発現クロー
ニングベクターに組み込むことによりcDNAライブラリー
を構築し、該cDNAライブラリーを細胞に導入し、得られ
る細胞をフローレッセンス・アクチベーテッド・セル・
ソーター（Fluorescence Activated Cell Sorter;以
下、FACSと略記する）を利用して、ガングリオシドGD3
に対する抗体と強く反応する細胞を選別することにより
新規α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子をクローン化した。さらに、該α2,8−シアリル
トランスフェラーゼをコードする遺伝子をナマルバ細胞
に導入して発現させたところ、新規なα2,8−シアリル
トランスフェラーゼを発現し、さらにガングリオシドGD
3の細胞表面での存在量が増加することを見い出し、本
発明を完成させた。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む
新規α2,8−シアリルトランスフェラーゼおよび該α2,8
−シアリルトランスフェラーゼをコードするcDNAおよび
該cDNAを含有する組換え体ベクターに関する。本発明の
α2,8−シアリルトランスフェラーゼは、受容体である
ガングリオシドGM3のシアル酸残基にα２→８の結合様
式でシアル酸を付加する活性を有する。

本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコー
ドするDNAとしては、（ａ）配列番号１で示される塩基
配列を含むDNA、（ｂ）一つのアミノ酸に対して複数種
の遺伝暗号が存在するため、あるいはヒトを含む動物個
々に起こる自然変異などのため配列番号１で示される塩
基配列とは異なる塩基配列を含むDNA、（ｃ）（ａ）お
よび（ｂ）で定義されるDNAに対して、本発明のα2,8−
シアリルトランスフェラーゼ活性を失わない範囲内で置
換変異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたDN
A、例えば、（ａ）または（ｂ）で定義されるDNAがコー
ドするα2,8−シアリルトランスフェラーゼに対して、
ハイブリダイゼーション法によって単離できる程度に相
同性を有するDNAなどを包含する。この相同性を有するD
NAとは、配列番号１で示される塩基配列またはその一部
の塩基配列を含むDNAをプローブとして、コロニー・ハ
イブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダ
イゼーション法を用いることにより得られるDNAを意味
し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNA
を固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaClの
存在下で65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.
1倍濃度から２倍濃度までの間の濃度のSSC溶液（１倍濃
度のSSC溶液の組成は、150mM NaCl、15mMクエン酸ナト
リウムである）の中、65℃でフィルターを洗浄すること
により同定できるDNAを意味する。なお、ハイブリダイ
ゼーションの実験法は、モレキュラー・クローニング：
ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A
laboratory manual）、第２版〔サンブルック（Sambroo
k）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）編
集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、198
9年刊〕に記載されている。本発明のα2,8−シアリルト
ランスフェラーゼは上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で
定義されるDNAによってコードされる全てのα2,8−シア
リルトランスフェラーゼを包含する。

以下に、本発明のα2,8−シアリルトランスフェラー
ゼをコードするDNAの製造法を上記（ａ）で定義されるD
NAの製造法を例にして示す。

動物細胞から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNA
を発現クローニングベクター（Expression Cloning Vec
tor）に組み込むことにより、cDNAライブラリーを構築
する。このcDNAライブラリーを動物細胞あるいは昆虫細
胞に導入した後、FACSを利用して、ガングリオシドGD3
に対する抗体と強く反応する細胞を濃縮・単離した後、
該細胞から所要のα2,8−シアリルトランスフェラーゼ
をコードするcDNAを得る。

上記の方法で用いられる動物細胞は、本発明のα2,8
−シアリルトランスフェラーゼを生産している動物細胞
であればいかなる細胞でも用いることができる。例え
ば、ヒト・メラノーマ細胞株WM266−４（ATCC CRL 167
6）などが用いられる。これらの細胞から抽出したmRNA
を鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該CD
NAを組み込み発現できるベクターであればいかなるもの
でも用いることができる。例えば、pAMoPRC3SC等が用い
られる。該ベクターにより構築されるcDNAライブラリー
を導入する動物細胞あるいは昆虫細胞は、該cDNAライブ
ラリーを導入し、発現できるものであればいかなるもの
でも用いることができる。例えば、ヒトナマルバ（Nama
lwa）細胞〔細井ら：サイトテクノロジ（Cytotechnolog
y），１,151（1988）〕などが用いられる。とくに、宿
主としてナマルバ細胞を用いる直接発現クローン化系
は、宿主であるナマルバ細胞へのcDNAライブラリーの導
入効率が極めて高く、しかも導入されたプラスミド（cD
NAライブラリー）は、染色体外で存在可能であり、糖鎖
特異的抗体とFACSを用いたスクリーニングにより取得し
た細胞からのプラスミドの回収が容易であるという利点
を有しているため、好適に用いられる。また、本発明で
用いられるガングリオシドGD3に対する抗体としては、
ガングリオシドGD3と反応する抗体であれば、いかなる
ものでも用いることができる。例えば、KM−643（EP−
Ａ−0493686）等が好適に用いられる。cDNAライブラリ
ーを導入した動物細胞を抗GD3抗体を用いて蛍光染色し
た後、FACSを用いて抗体の結合量が増加した細胞を分離
濃縮する。このようにして得られた細胞から公知の方
法、例えば、ハート法〔ロバート・エフ・マーゴルスキ
ー（Robert F.Margolskee）ら：モレキュラー・アンド
・セリュラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），８,2
837（1988）〕により、本発明のα2,8−シアリルトラン
スフェラーゼをコードするcDNAを有するプラスミドある
いは該cDNA部分を含むDNA断片を回収する。本発明の酵
素をコードするcDNAを有するプラスミドとしては、例え
ば、pUC119−WP1Rが挙げられる。pUC119−WP1Rを含む大
腸菌であるEscherichia coli JM105/pUC119−WP1Rは、
平成５年２月18日付で工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM BP−4192として寄託されている。

上記（ｂ）および（ｃ）で定義されるDNAは上記の製
造法で得られるα2,8−シアリルトランスフェラーゼを
コードするDNAをもとに、ハイブリダイゼーション法やD
NAに変異を導入する方法などの周知の組換えDNA技術
〔特開平２−227075;モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A La
boratory manual）、第２版、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor
laboratory Press）、1989年刊等〕を用いて製造する
ことができる。また、本発明のα2,8−シアリルトラン
スフェラーゼをコードするDNAは化学合成法を用いても
製造することができる。

上記の方法により得られる本発明のα2,8−シアリル
トランスフェラーゼをコードするDNAを適当なベクター
のプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成
し、それを宿主細胞に導入し、得られた細胞を培養する
ことにより、本発明のα2,8−シアリルトランスフェラ
ーゼを製造することができる。ここで、用いられる宿主
細胞としては、原核細胞、動物細胞、酵母、カビ、昆虫
細胞など、これまで組換えDNA技術で用いられた宿主細
胞ならば、いかなる細胞でも用いることができる。例え
ば、原核細胞としては大腸菌、動物細胞としてはチャイ
ニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、サルの細胞
であるCOS細胞、ヒトの細胞であるナマルバ細胞等が挙
げられる。

本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコー
ドするDNAを導入するベクターとしては、該α2,8−シア
リルトランスフェラーゼをコードするDNAを組み込むこ
とができ、宿主細胞で発現できるものであればいかなる
ベクターでも用いることができる。例えば、pAGE107
〔特開平３−22979、および宮地ら：サイトテクノロジ
ー（Cytotechnology），３,133（1990）〕、pAS3−３
（特開平２−227075）,pAMoERC3Sc,CDM8〔ブライアン・
シード（Brian Seed）ら：ネイチャー（Nature），329,
840（1987）〕等が挙げられる。また、大腸菌内で本発
明の酵素を発現するためには、trpプロモーターなどの
強力な転写活性を有するプロモーターの下流に外来DNA
を挿入することができ、しかもシャイン−ダルガノ（Sh
ine−Dalgarno）配列（以下、SD配列と略記する）と開
始コドンの間を適当な距離（例えば、６〜18塩基）に調
節したプラスミドを用いることが好ましい。具体的に
は、pKYP10（特開昭58−110600）、pLSA1〔宮地ら：ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー（Agric.Biol.Chem.），53,277（1989）〕、pGEL1
〔関根ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA），82,4306（1985）〕等が挙げられる。

本発明で用いる組換えDNA技術の一般的手法について
は、特開平２−227075あるいはサンブルック（Sambroo
k）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniatis）ら
の方法〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリ
ー・マニュアル（Molecular Cloning,A laboratory man
ual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory
Press）、1989年刊〕に記載されている方法を用いるこ
とができる。mRNAの単離およびcDNAライブラリーの合成
は、上記の方法の他、市販されている多くのキットを用
いて行うことができる。動物細胞へのDNAの導入法とて
は、現在までに知られているいかなる方法も用いること
ができる。例えば、エレクトロポーレーション法〔宮地
ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），３,133
（1990）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−22707
5）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェル
グナー（Philip L.Felgner）ら：プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），84,7413（1987）〕等を
用いることができる。形質転換株の取得および培養は、
特開平２−227075あるいは特開平２−257891に記載され
ている方法に準じて行うことができる。

クローン化したα2,8−シアリルトランスフェラーゼ
の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿
主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に
生産させる方法がある。生産させる部位は、使用する宿
主細胞の種類、生産させる糖転移酵素の形によって変わ
ってくる。糖転移酵素を天然に存在する形で動物細胞を
宿主細胞として生産させる場合は、一般的に、宿主細胞
内あるいは宿主細胞外膜上に生産され、一部は、プロテ
アーゼにより切断されて細胞外に分泌される。宿主細胞
外に積極的に分泌させる場合は、ポールソンらの方法
〔J.C.Paulsonら：ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），264,17619（198
9）〕およびロウらの方法〔John.B.Loweら：プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），86,8227（198
9）、John.B.Loweら：ジーンズ・アンド・ディベラプメ
ント（Genes Develop.），４,1288（1990）〕に準じて
遺伝子組換えの手法を用いて、糖転移酵素の活性部位を
含む部分にシグナルペプチドを付加した形で生産させ
る。

特開平２−227075に記載されている方法に準じて、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利
用して生産量を上昇させることもできる。

このようにして生産させた本発明のα2,8−シアリル
トランスフェラーゼは、通常の糖転移酵素の精製方法
〔J.Evan.Sadlerら：メソッド・イン・エンザイモロジ
ー（Methods of Enzymology）、83巻、458頁〕に準じて
精製できる。また、大腸菌内に生産させる場合は、上記
の方法と特開昭63−26729に記載された方法を組み合わ
せることにより効率的に精製することができる。また、
本発明の酵素を他のタンパク質との融合タンパク質とし
て生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用
いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製
することもできる。例えば、ロウらの方法〔John.B.Low
eら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A），86,8227（1989）、John.B.Loweら：ジーンズ・ア
ンド・ディベラプメント（Genes Develop.），４,1288
（1990）〕に準じて、本発明の酵素をプロテインＡとの
融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用
いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する
ことができる。また、該酵素自身に対する抗体を用いた
アフィニティークロマトグラフィーで精製することもで
きる。

シアリルトランスフェラーゼの活性は、公知の測定法
〔サドラー（J.Evan.Sadler）ら：メソッド・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology）、83巻、458
頁；サムエルソン（Bo E.Samuelson）：メソッド・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、138
巻、567頁；バス（Manju Basu）ら：メソッド・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、138巻、
575頁;Naoyuki Tanigutiら：メソッド・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology）、179巻、397頁〕
に準じて測定する。

本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼを用い
て、イン・ビトロ（in vitro）で、糖鎖を合成すること
ができる。例えば、オリゴ糖NeuAcα２→3 Galβ１→4
Glcの非還元末端にα２→８結合でシアル酸を付与する
ことができる。また、基質としてガングリオシドGM3を
用いれば、本発明のα2,8−シアリルトランスフェラー
ゼを作用させることにより、ガングリオシドGD3を製造
することができる。

本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコー
ドするDNAを用いて、該α2,8−シアリルトランスフェラ
ーゼの受容基質である糖鎖（糖タンパク質、糖脂質また
はオリゴ糖）を生産している動物細胞あるいは昆虫細胞
の中で、該α2,8−シアリルトランスフェラーゼと糖鎖
とを同時に生産させることにより、生産されたα2,8−
シアリルトランスフェラーゼを細胞の中で糖鎖に作用さ
せ、該糖鎖の非還元末端にシアル酸を付加することがで
きる。例えば、ガングリオシドGM3を生産している細胞
に本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼを同時
に生産させることにより、ガングリオシドGD3を生産さ
せることができる。

さらに、上記の方法により生産される糖鎖構造が変化
した糖タンパク質、糖脂質またはオリゴ糖から公知の酵
素的手法または化学的手法によりオリゴ糖の一部を切り
出すこともできる。

本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコー
ドするDNAは、タンパク質や糖脂質の糖鎖の改変および
特定の糖鎖の効率的生産に用いることができるだけでな
く、アンチセンスRNA/DNA技術を用いて悪性腫瘍などの
疾病の治療に利用すること、ならびにノーザンハイブリ
ダイゼーション法またはPCR法を用いてそれらの疾病の
診断に利用することもできる。

例えば、本発明のα2,8−シアリルトランスフェラー
ゼをコードするDNAを用いて、アンチセンスRNA/DNA技術
〔徳久（Tokuhisa）：バイオサイエンスとインダストリ
ー，50,322−326（1992）、村上（Murakami）：化学，4
6,681−684（1991）、ミラー（Miller）：バイオテクノ
ロジー（Biotechnology），９,358−362（1992）、コー
エン（Cohen）：トレンズ・イン・バイオテクノジー（T
rends in Biotechnology），10,87−91（1992）、アグ
ラワル（Agrawal）：トレンズ・イン・バイオテクノジ
ー（Trends in Biotechnology），10,152−158（199
2）〕あるいはトリプル・ヘリックス技術〔チュブ（Chu
bb）とホーガン（Hogan）：トレンズ・イン・バイオテ
クノジー（Trends in Biotechnology），10,132−136
（1992）〕により、該α2,8−シアリルトランスフェラ
ーゼの活性発現を抑制することができる。具体的には、
本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコード
するDNAの一部の塩基配列、好ましくは翻訳開始領域に
ある10〜50塩基の塩基配列を基にしてオリゴヌクレオチ
ドを設計・調製し、生体内に投与するにより、本発明の
α2,8−シアリルトランスフェラーゼの生産を抑制する
ことができる。合成オリゴヌクレオチドの塩基配列とし
ては、本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼを
コードするDNAのアンチセンス鎖の塩基配列の一部と一
致するもの、あるいは本発明のα2,8−シアリルトラン
スフェラーゼの活性発現を抑制する活性を失わない範囲
内で改変したものを利用することができる。トリプル・
ヘリックス技術を用いる場合、センス鎖およびアンチセ
ンス鎖の双方の塩基配列情報をもとに合成オリゴヌクレ
オチドの塩基配列を設計する。

また、ハイブリダイゼーション法またはPCR法を用い
て、本発明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼの生
産を検出することができる。ノーザンハイブリダイゼー
ション法またはPCR法を用いて、本発明のα2,8−シアリ
ルトランスフェラーゼの生産を検出するためには、本発
明のα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードするD
NAまたはそれらの塩基配列に基づいてDNAプローブまた
は合成オリゴヌクレオチドを調製する。ノーザンハイブ
リダイゼーション法およびPCR法は、それぞれ公知の方
法〔サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsc
h）、マニアチス（Maniatis）（モレキュラー・クロー
ニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cl
oning,A laboratory manual）、第２版、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press）、1989年刊およびイニ
ス（Innis）ら:PCRプロトコールズ（PCR Protocols）、
アカデミック・プレス（Academic Press）、1990年刊〕
に従って行う。

図面の簡単な説明 第１図は、プラスミドpAGEL106の造成工程を示す図で
ある。

第２図は、プラスミドpASLB3−３−１の造成工程を示
す図である。

第３図は、プラスミドpASLB3−３の造成工程を示す図
である。

第４図は、プラスミドpASLBE3−３の造成工程を示す
図である。

第５図は、プラスミドpASLBCの造成工程を示す図であ
る。

第６図は、プラスミドpASLBECの造成工程を示す図で
ある。

第７図は、プラスミドpASLBEC2の造成工程を示す図で
ある。

第８図は、プラスミドpAMoEC2の造成工程を示す図で
ある。

第９図は、プラスミドpAMoEC3の造成工程を示す図で
ある。

第10図は、プラスミドpAMoERC3の造成工程を示す図で
ある。

第11図は、プラスミドpAGE207の造成工程を示す図で
ある。

第12図は、プラスミドpAGE207ScNの造成工程を示す図
である。

第13図は、プラスミドpAMoC3Scの造成工程を示す図で
ある。

第14図は、プラスミドpAMoERC3Scの造成工程を示す図
である。

第15図は、プラスミドpAMoPRC3SCの造成工程を示す図
である。

第16図は、プラスミドpUC119−WP1およびpUC119−WP1
Rの造成工程を示す図である。

第17図は、pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミド）あ
るいはpAMoPRWP1（α2,8−シアリルトランスフェラーゼ
発現プラスミド）を導入したKJM−１株についてKM643を
用いて間接蛍光抗体染色後、エピックス・エリート・フ
ローサイトメーター〔EPICS Elite Flow Cytometer;コ
ールター（COULTER）社製〕で解析を行った結果を示す
図である。pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミド）を導
入したKJM−１株について、正常マウス血清を用いて間
接蛍光抗体染色を行った結果を対照として示した。

第18図は、プラスミドpAGE147の造成工程を示す図で
ある。

第19図は、プラスミドpAGE247の造成工程を示す図で
ある。

第20図は、プラスミドpAMN6hygの造成工程を示す図で
ある。

第21図は、プラスミドpAMoERSAの造成工程を示す図で
ある。

第22図は、プラスミドpAMoPRSAの造成工程を示す図で
ある。

第23図は、プラスミドpAMoPRSAWP1の造成工程を示す
図である。

第24図は、プラスミドpAMoPRSAWP1を導入したナマル
バ細胞の培養上清より、IgGセファロースを用いてα2,8
−シアリルトランスフェラーゼを精製した後、各種糖脂
質を基質としてシアリルトランスフェラーゼ活性を測定
した結果である。HPTLC処理後のHPTLCプレートをバイオ
・イメージング・モデルBAS2000アナライザー（FUJIX）
を用いて解析したときのパターンを示す。

各図における符号の意味は以下の通りである。

dhfr :ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 hG−CSF :ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子 bp :塩基対（base pairs） kb :キロ塩基対（kilobase pairs） G418/Km :トランスポゾン５（Tn5）由来G418、カナ
マイシン耐性遺伝子 hyg :ハイグロマイシン耐性遺伝子 Ap :pBR322アンピシリン耐性遺伝子 Tc :pBR322由来テトラサイクリン耐性遺伝子 P1 :pBR322由来P1プロモーター Ptk :ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（H
erpes simplex virus;HSV）チミジンキナーゼ（tk）遺
伝子プロモーター Sp.βG :ラビットβグロビン遺伝子スプライシン
グシグナル A.βＧ :ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シ
グナル A.SE :シミアン・ウィルス（simian virus）40
（SV40）初期遺伝子ポリＡ付加シグナル Atk :ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（H
erpessimplex virus;HSV）ミジンキナーゼ（tk）遺伝子
のポリＡ付加シグナル Pse :シミアン・ウィルス（simian virus）40
（SV40）初期遺伝子プロモーター Pmo :モロニー・マウス白血病ウイルスのロン
グ・ターミナル・リピート（long terminal repeat:LT
R）プロモーター HTLV−１ :ヒトＴ細胞白血病ウイルス（human T−ce
ll leukemia virus type−1:HTLV−１）遺伝子 EBNA−１ :エプシュタイン・バール・ウイルス（Eps
tein−Barr virus）のEBNA−１遺伝子 oriP :エプシュタイン・バール・ウイルス（Eps
tein−Barr virus）の複製開始点 ori :pUC119の複製開始点 lac'Z :大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子の一
部 IG :M13ファージDNAインタージェニック領域
（intergenic region） Ｇ−CSF der.:ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の遺
伝子 Ｓ :ヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル
ペプチドをコードする遺伝子部分 Ａ又はProA :黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusの
プロテインＡのIgGとの結合領域をコードする遺伝子部
分 WP1 :WM266−４細胞より取得したGD3合成酵素
遺伝子（全長あるいは活性領域部分の遺伝子） 発明を実施するための最良の形態 実施例１ ヒト・メラノーマ細胞株であるWM266−４細
胞からのα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコード
するDNA（WP1）のクローン化 1.直接発現クローニングベクター（Expression Cloning
Vector）pAMoERC3ScおよびpAMoPRC3Scの造成 pAMoERC3Scを以下に示す（１）〜（14）の工程に従っ
て造成した。

（１）pAGEL106の造成（第１図参照） シミアン・ウィルス（simian virus）40（SV40）初期
遺伝子プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス（huma
n T−cell leukemia virus type−1:HTLV−１）のロン
グ・ターミナル・リピート（long terminal repeat:LT
R）のＲ領域のU5領域の一部を融合したプロモーターを
有するプラスミドpAGEL106の造成を行った。Ｒ領域とU5
領域の一部を含むDNA断片〔Ban II−Sau3A断片（0.27k
b）〕をpATK03から切り出し、合成リンカーを介してpAG
E106のBgl I−BamH I間に挿入した。

pAGE106（特開平２−227075）の１μｇを10mMトリス
−塩酸（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナ
トリウム、6mM 2−メルカプトエタノールからなる緩衝
液（以下、Ｙ−100緩衝液と略記する）30μｌに溶解
し、10単位のBgl I（宝酒造社製、以下、とくに断らな
いかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを使用した）と10
単位のBamH Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.9kbのDNA断
片を回収した。

また、pATK03〔清水ら：プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA），80,3618（1983）〕１μｇをＹ−1
00緩衝液30μｌに溶解し、10単位のBan IIを加え、37℃
で２時間消化反応を行い、アガロースゲル電気泳動後、
約0.4kbのDNA断片を回収した。回収したDNA断片は30μ
ｌのＹ−100緩衝液に溶解し、10単位のSau3A Iを加え37
℃で２時間消化反応を行い、アガロースゲル電気泳動
後、約0.27kbのDNA断片を回収した。

また別に、Bgl I切断部位とBan II切断部位を連結す
るためのリンカーとして以下のDNAリンカーを合成し
た。

5'−CGGGCT−3'（6mer） 3'−GGAGC−5'（5mer） このDNAリンカーの5merと6merの１本鎖DNAはそれぞれ
アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）
社380A・DNA合成機を用いて合成した。合成したDNAはそ
れぞれ0.2μｇずつ、50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM
塩化マグネシウム、5mMジチオスレイトール（以下、DTT
と略記する）、0.1nM EDTAおよび1mMアデノシン３リン
酸（以下、ATPと略記する）を含む緩衝液（以下、T4キ
ナーゼ緩衝液と略記する）40μｌに溶解し、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造社製、以下同じ）30単位を加
えて、37℃で２時間リン酸化反応を行った。

上記で得られたpAGE106由来のBgl I−BamH I断片（4.
9kb）0.2μｇとpATK03由来のBan II−Sau3A I断片（0.2
7kb）0.01μｇを66mMトリス−塩酸（pH7.5）、6.6mM塩
化マグネシウム、10mM DTTおよび0.1mM ATPからなる液
（以下、T4DNAリガーゼ緩衝液と略記する）30μｌに溶
解し、上記DNAリンカーを0.01μｇとT4DNAリガーゼ（宝
酒造社製、以下同じ）175単位を加えて、12℃で16時間
結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株〔ボリバー（Boliva
r）ら：ジーン（Gene），２,75（1988）〕をコーエンら
の方法〔エス・エヌ・コーエン（S.N.Cohen）ら：プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）69,2110（1
972）〕（以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用い
た）によって形質転換し、カナマイシン耐性株を得た。
この形質転換株から公知の方法〔エイチ・シー・バーン
ボイム（H.C.Birnboim）ら：ヌクレイック・アシッド・
リサーチ（Nucleic Acids Res.），７,1513（1979）〕
（以下プラスミドの単離はこの方法を用いた）に従って
プラスミドを単離した。このプラスミドをpAGEL106と名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。

（２）pASLB3−３−１の造成（第２図参照） SV40初期遺伝子プロモーターとHTLV−１のロング・タ
ーミナル・リピート（LTR）のＲ領域とU5領域の一部を
融合したプロモーターを有する、ヒト顆粒球コロニー刺
激因子（hG−CSF）の発現プラスミドpASLB3−３−１の
造成を以下のようにして行った。

（１）で得られたpAGEL106の0.5μｇを10mMトリス−
塩酸（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、20mM塩化カリウ
ム、6mM 2−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以
下、Ｋ−20緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、10単位
のSma Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。エタ
ノール沈殿後、30μｌのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解
し、Sal Iリンカー（5'−pGGTCGACC−3':宝酒造社製）
を0.01μｇとT4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16
時間結合反応を行った。エタノール沈殿後、10mMトリス
−塩酸（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、175mM塩化ナ
トリウム、6mM 2−メルカプトエタノールからなる緩衝
液（以下、Ｙ−175緩衝液と略記する）30μｌに溶解
し、10単位のSal Iと10単位のMlu Iを加え、37℃で２時
間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約1.7kbのDNA断片を回収した。

一方、pAS3−３（特開平２−227075）の１μｇをＹ−
175緩衝液30μｌに溶解し、10単位のSal Iと10単位のMl
u Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、約6.7kbのDNA断片を回収
した。

上記で得られたpAGEL106由来のMlu I−Sal I断片（1.
7kb）0.1μｇとpAS3−３由来のMlu I−Sal I断片（6.7k
b）0.2μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、T4D
NAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を
行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンら
の方法によって形質転換し、カナマイシン耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。このプラスミドをpASLB3−３−１と名付
け、その構造を制限酵素消化により確認した。

（３）pASLB3−３の造成（第３図参照） pASLB3−３−１にアンピシリン耐性遺伝子を導入した
プラスミドpASLB3−３の造成を行うため、pAS3−３のア
ンピシリン耐性遺伝子を含むDNA断片〔Xho I−Mlu I断
片（7.26kb）〕をpASLB3−３−１のXho I−Mlu I間に導
入した。

（２）で得られたpASLB3−３−１の１μｇを10mMトリ
ス−塩酸（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、150mM塩化
ナトリウム、6mM 2−メルカプトエタノールからなる緩
衝液（以下、Ｙ−150緩衝液と略記する）30μｌに溶解
し、10単位のXho Iと10単位のMlu Iを加え、37℃で２時
間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約7.26kbのDNA断片を回収した。

一方、pAS3−３（特開平２−227075）の１μｇをＹ−
150緩衝液30μｌに溶解し、10単位のXho Iと10単位のMl
u Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、約2.58kbのDNA断片を回
収した。

上記で得られたpASLB3−３−１由来のXho I−Mlu I断
片（7.26kb）0.2μｇとpAS3−３由来のXho I−Mlu I断
片（2.58kb）0.1μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶
解し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結
合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコ
ーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性
株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラ
スミドを単離した。このプラスミドをpASLB3−３と名付
け、その構造を制限酵素消化により確認した。

（４）pASLBE3−３の造成（第４図参照） pASLB3−３中のジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）発現ユ
ニットを除去すると同時に、エプシュタイン・バール・
ウイルス（Epstein−Barr virus）の複製開始点（ori
P）とEBNA−１遺伝子（oriPにトランスに作用し複製を
引き起こす働きを持つ）を導入したプラスミドpASLBE3
−３の造成を以下のようにして行った。oriPとEBNA−１
遺伝子は、p201〔ビル・ズグデン（Bill Sugden）ら、
ネイチャー（Nature），313,812（1985）〕のNar I部位
にpUC12〔メッシング（Messing）ら：メソッド・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology），101,20
（1983）〕由来のマルチクローニングサイトを含むSma
I−Hae III断片が組み込まれたプラスミドであるp220.2
から切り出して使用した。

p220.2の１μｇをＹ−100緩衝液30μｌに溶解し、20
単位のEcoR Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。
エタノール沈殿後、30μｌのDNAポリメラーゼＩ緩衝液
〔50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウ
ム、0.1mM dATP（テオキシアデノシン３リン酸）、0.1m
M dCTP（デオキシシチジン３リン酸）、0.1mM dGTP（デ
オキシグアノシン３リン酸）、0.1mM TTP（チミジン３
リン酸）〕に溶解し、６単位の大腸菌DNAポリメラーゼ
Ｉ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、EcoR
I消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。
反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出
とエタノール沈殿の後、20μｌのT4DNAリガーゼ緩衝液
に溶解し、Xho Iリンカー（5'−pCCTCGAGG−3':宝酒造
社製）を0.05μｇとT4DNAリガーゼ175単位を加えて、12
℃で16時間結合反応を行った。エタノール沈殿後、Ｙ−
100緩衝液30μｌに溶解し、10単位のBamH Iを加え、37
℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿後、30μ
ｌのDNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸
菌DNAポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60
分間反応させ、BamH I消化によって生じた5'突出末端を
平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止
め、クロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、Ｙ−100
緩衝液30μｌに溶解し、10単位のXho Iを加え、37℃で
２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約4.9kbのDNA断片を回収した。

また、（３）で得られたpASLB3−３の１μｇをＹ−10
0緩衝液30μｌに溶解し、20単位Xho Iを加え、37℃で２
時間消化反応を行った。エタノール沈殿の後、30μｌの
DNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNA
ポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反
応させ、Xho I消化によって生じた5'突出末端を平滑末
端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロ
ロホルム抽出とエタノール沈殿の後、10mMトリス−塩酸
（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、6mM 2−メルカプト
エタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−０緩衝液と略記
する）30μｌに溶解し、20単位のKpn Iを加え、37℃で
２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約1.3kbのDNA断片を回収した。

また、pAGE107〔特開平３−22979、宮地（Miyaji）
ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），３,133
（1990）〕１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解し、20単
位のKpn Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。そ
の後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるように塩化ナ
トリウムを添加し、20単位のXho Iを加え、さらに37℃
で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル
電気泳動後、約6.0kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたp220.2由来のXho I−BamH I（平滑末
端）断片（4.9kb）0.2μｇとpASLB3−３由来のXho I
（平滑末端）−Kpn I断片（1.3kb）0.1μｇおよびpAGE1
07由来のKpn I−Xho I断片（6.0kb）0.2μｇをT4DNAリ
ガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を
加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用
いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転
換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをpASLBE3−３と名付け、その構造を制限酵素消化
により確認した。

（５）pASLBCの造成（第５図参照） pASLB3−３中のhG−CSF遺伝子を除去し、そのかわり
にマルチクローニングサイトを導入したプラスミドpASL
BCを造成した。マルチクローニングサイトは、合成DNA
を用いて作製した。

（３）で得られたpASLB3−３の１μｇをＹ−175緩衝
液30μｌに溶解し、20単位のSal Iと20単位のMlu Iを加
え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロ
ースゲル電気泳動後、約3.1kbのDNA断片を回収した。

また、同プラスミド１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶
解し、20単位のKpn Iを加え、37℃で２時間消化反応を
行った。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、20単位のMul Iを加え、
さらに37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、約6.0kbのDNA断片を回収した。

また別に、Sal I切断部位とKpn I切断部位を連結する
ためのリンカーとして以下のDNAリンカーを合成した。
なお、このリンカー中にはHind III、EcoR V、Sfi I、S
tu I、Not Iの各制限酵素切断部位が組み込まれてい
る。

このDNAリンカー52mer（配列番号３）と44mer（配列
番号４）の１本鎖DNAはそれぞれアプライド・バイオシ
ステムズ社380A・DNA合成機を用いて合成した。合成し
たDNAはそれぞれ0.2μｇずつ、T4キナーゼ緩衝液20μｌ
に溶解し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製、
以下同じ）30単位を加えて、37℃で２時間リン酸化反応
を行った。

上記で得られたpASLB3−３由来のSal I−Mlu I断片
（3.1kb）0.1μｇと同プラスミド由来のKpn I−Mlu I断
片（6.0kb）0.2μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶
解し、上記DNAリンカーを0.01μｇとT4DNAリガーゼ175
単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応
液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって
形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換
株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。この
プラスミドをpASLBCと名付け、その構造を制限酵素消化
により確認した。

（６）pASLBECの造成（第６図参照） pASLBC中のジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）発現ユニッ
トを除去し、oriPとEBNA−１遺伝子を導入したプラスミ
ドpASLBECを造成した。

（４）で得られたpASLBE3−３の１μｇをＹ−150緩衝
液30μｌに溶解し、20単位のMlu Iと20単位のXho Iを加
え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロ
ースゲル電気泳動後、約1.3kbのDNA断片を回収した。

また、同プラスミド１μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶
解し、20単位のKpn Iを加え、37℃で２時間消化反応を
行った。その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、５単位のMul Iを加え、
さらに37℃で20分間部分消化反応を行った。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約9.6kbのDNA断片を回収し
た。

また別に、（５）で得られたpSLBCの１μｇをＹ−０
緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpn Iを加え、37℃で
２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度
が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位
のXho Iを加え、さらに37度で２時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約0.6kbのD
NA断片を回収した。

上記で得られたpASLBE3−３由来のMlu I−Xho I断片
（1.3kb）0.2μｇと同プラスミド由来のKpn I−Mlu I断
片（9.6kb）0.2μｇ、およびpASLBC由来のKpn I−Xho I
断片（0.6kb）0.05μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに
溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間
結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株を
コーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐
性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプ
ラスミドを単離した。このプラスミドをpASLBECと名付
け、その構造を制限酵素消化により確認した。

（７）pASLBEC2の造成（第７図参照） pASLBECのマルチクローニングサイト中のStu Iサイト
にBamH Iリンカーを導入したプラスミドpASLBEC2を以下
のようにして造成した。pASLBEC2では、マルチクローニ
ングサイト中のStu Iサイトは消失している。

（６）で得られたpASLBECの１μｇをＹ−100緩衝液30
μｌに溶解し、５単位のStu Iを加え、37℃で20分間部
分消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、約11.5kbのDNA断片を回収した。回収したDNA断片
を30μｌのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、BamH Iリン
カー（5'−pCCGGATCCGG−3':宝酒造社製）を0.01μｇと
T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応
を行った。エタノール沈殿後、Ｙ−100緩衝液30μｌに
溶解し、20単位のBamH Iを加え、37℃で２時間消化反応
を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約1
1.5kbのDNA断片を回収した。回収したDNA断片を20μｌ
のT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、T4DNAリガーゼ175単
位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液
を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形
質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株
から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプ
ラスミドをpASLBEC2と名付け、その構造を制限酵素消化
により確認した。

（８）pAMoEC2の造成（第８図参照） pASLBEC2中のプロモーター〔SV40初期遺伝子プロモー
ターとHTLV−１のロング・ターミナル・リピート（long
terminal repeat:LTR）のＲ領域とU5領域の一部を融合
したプロモーター〕をモロニー・マウス白血病ウイルス
のロング・ターミナル・リピート（long terminal repe
at:LTR）のプロモーターにすげかえたプラスミドpAMoEC
2の造成を以下のようにして行った。モロニー・マウス
白血病ウイルスLTRのプロモーターは、プラスミドMolp
−１〔アキノリ・イシモト（Akinori Ishimoto）ら、ビ
ロロジー（Virology），141,30（1985）〕から切り出し
て使用した。

（７）で得られたpASLBEC2の１μｇを10mMトリス−塩
酸（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、5mM塩化カリウ
ム、6mM 2−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以
下、Ｋ−50緩衝液と略記する）30μｌに溶解し、20単位
のHind IIIと20単位のAat II（東洋紡績社製）を加え、
37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、約4.8kbのDNA断片を回収した。

また、同プラスミド１μｇをＫ−50緩衝液30μＬに溶
解し、20単位のAat IIを加え、37℃で２時間消化反応を
行った。その後、５単位のXho Iを加え、さらに37℃で2
0分間部分消化反応を行った。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約6.1kbのDNA断片を回収した。

次に、Xho I切断部位とCla I切断部位を連結するため
のリンカーとして以下のDNAリンカーを合成した。

上記DNAリンカー9merと7merの１本鎖DNAはそれぞれア
プライド・バイオシステムズ社380A・DNA合成機を用い
て合成した。合成したDNAはそれぞれ0.2μｇずつ、T4キ
ナーゼ緩衝液40μｌに溶解し、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ30単位を加えて、37℃で２時間リン酸化反応を行っ
た。

また別に、Molp−１〔アキノリ・イシモト（Akinori
Ishimoto）ら、ビロロジー（Virology），141,30（198
5）〕１μｇをＹ−50緩衝液30μｌに溶解し、20単位のC
la Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。エタノー
ル沈殿後、30μＬのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、上
記DNAリンカー0.01μｇとT4DNAリガーゼ175単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行った。エタノール沈殿
後、Ｋ−20緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSam Iを加
え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロ
ースゲル電気泳動後、約0.6kbのDNA断片を回収した。回
収したDNA断片を30μｌのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解
し、Hind IIIリンカー（5'−pCAAGCTTG−3':宝酒造社
製）を0.03μｇとT4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行った。エタノール沈殿後、10mMト
リス−塩酸（pH7.5）、6mM塩化マグネシウム、50mM塩化
ナトリウム、6mM 2−メルカプトエタノールからなる緩
衝液（以下、Ｙ−50緩衝液と略記する）30μｌに溶解
し、10単位のHind IIIを加え、37℃で２時間消化反応を
行った。その後、塩化ナトリウム濃度が100mMになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、10単位のXho Iを加え、
さらに37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、約0.6kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpASLBEC2由来のHind III−Aat II断片
（4.8kb）0.2μｇと同プラスミド由来のAat II−Xho I
断片（6.1kb）0.2μｇ、およびMolp−１由来のHind III
−Xho I断片（0.6kb）0.05μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液3
0μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃
で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB
101株をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピ
シリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に
従ってプラスミドを単離した。このプラスミドをpAMoEC
2と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。

（９）pAMoEC3の造成（第９図参照） pAMoEC2のマルチクローニングサイト中のBamH Iサイ
トに、詰め込みDNA（Stuffer DNA）として、pBR322のテ
トラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断片〔Dra I−Pvu
II断片（2.5kb）〕を以下のようにして挿入し、プラス
ミドpAMoEC3を造成した。

（８）で得られたpAMoEC2の１μｇをＹ−100緩衝液30
μｌに溶解し、20単位のBamH Iを加え、37℃で２時間消
化反応を行った。エタノール沈殿後、30μｌのDNAポリ
メラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNAポリメ
ラーゼＩ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応さ
せ、BamH I消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に
変えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約11.5
kbのDNA断片を回収した。

また、pBR322〔ボリバー（Bolivar）ら：ジー］（Gen
e），２,95（1977）〕１μｇをＹ−50緩衝液30μｌに溶
解し、20単位のDra Iと20単位のPvu IIを加え、37℃で
２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約2.5kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAMoEC2由来のBamH I（平滑末端）断
片（11.5kb）0.1μｇとpBR322由来のDra I−Pvu II断片
（2.5kb）0.2μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶解
し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合
反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコー
エンらの方法によって形質転換し、アンピシリンとテト
ラサイクリンに耐性である株を得た。この形質転換株か
ら公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラ
スミドをpAMoEC3と名付け、その構造を制限酵素消化に
より確認した。

（10）pAMoERC3の造成（第10図参照） pAMoEC3中のoriPとEBNA−１遺伝子のユニットの向き
を逆にしたプラスミドpAMoERC3を以下のようにして造成
した。

（９）で得られたpAMoEC3の１μｇをＹ−100緩衝液30
μｌに溶解し、20単位のXho Iを加え、37℃で２時間消
化反応を行った。その後、1Mトリス−塩酸（pH8.0）を3
0μｌと大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社
製）１単位を加え、37℃で２時間脱リン酸化反応を行っ
た。エタノール沈殿後、10mMトリス−塩酸（pH8.0）、1
mM EDTA（エチレンジアミン４酢酸ナトリウム）からな
る緩衝液（以下、TE緩衝液と略記する）30μｌに溶解
し、アガロースゲル電気泳動を行ない、約9.1kbのDNA断
片を回収した。

また、同プラスミド１μｇをＹ−100緩衝液30μｌに
溶解し、20単位のXho Iを加え、37℃で２時間消化反応
を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約4.
9kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAMoEC3由来のXho I断片（9.1kb）0.1
μｇと同プラスミド由来のXho I断片（4.9kb）0.2μｇ
をT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ
175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該
反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によ
って形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質
転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離した。
このプラスミドをpAMoERC3と名付け、その構造を制限酵
素消化により確認した。

（11）pAGE207の造成（第11図参照） pAGE107中のG418耐性遺伝子をハイグロマイシン（hy
g）耐性遺伝子にすげかえたプラスミドpAGE207を以下の
ようにして造成した。hyg耐性遺伝子は、p201〔ビル・
ズグデン（Bill Sugden）ら、ネイチャー（Nature），3
13,812（1985）〕より切り出して使用した。

pAGE107の１μｇをＹ−50緩衝液30μｌに溶解し、20
単位のCla Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。
その後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化
ナトリウムを添加し、20単位のMlu Iを加え、さらに37
℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動後、約4.6kbのDNA断片を回収した。

p201〔ビル・ズグデン（Bill Sugden）ら：ネイチャ
ー（Nature），313,812（1985）〕0.5μｇをＹ−50緩衝
液30μｌに溶解し、20単位のNar I（ニュー・イングラ
ンド・バイオラボ（New Englnad Biolab）社製）を加
え、37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿
後、30μｌのDNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単
位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、3
7℃で60分間反応させ、Nar I消化によって生じた5'突出
末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によっ
て止め、クロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、20μ
ｌのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶解し、Cla Iリンカー（5'
pCATCGATG3':宝酒造社製）を0.05μｇとT4DNAリガーゼ1
75単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行った。エタ
ノール沈殿後、Ｙ−50緩衝液30μｌに溶解し、10単位の
Cla Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。その
後、塩化ナトリウム濃度が150mMになるように塩化ナト
リウムを添加し、10単位のMlu Iを加え、さらに37℃で
２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約1.6kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAGE107由来のCla I−Mlu I断片（4.6
kb）0.2μｇとp201由来のCla I−Mlu I断片（1.6kb）0.
1μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、T4DNAリ
ガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合反応を行っ
た。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方
法によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。こ
の形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離
した。このプラスミドをpAGE207と名付け、その構造を
制限酵素消化により確認した。

（12）pAGE207ScNの造成（第12図参照） ラビットβグロビン遺伝子中に存在するSfi Iサイト
の類似配列を除去するため、pAGE207のBal IサイトにSc
a Iリンカーを挿入したプラスミドpAGE207ScNを以下の
ようにして造成した。pAGE207ScNにおいては、挿入され
たSca Iリンカーの数は明らかではない。

（11）で得られたpAGE207の0.5μｇをＹ−０緩衝液30
μｌに溶解し、10単位のBal Iを加え、37℃で２時間消
化反応を行った。エタノール沈殿後、20μｌのT4DNAリ
ガーゼ緩衝液に溶解しSca Iリンカー（5'pAAGTACTT3':
宝酒造社製）を0.01μｇとT4DNAリガーゼ175単位を加え
て、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用いて
大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転換
し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公
知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラスミ
ドをpAGE207ScNと名付け、その構造を制限酵素消化によ
り確認した。

（13）pAMoC3Scの造成（第13図参照） pAMoERC3中のラビットβグロビン遺伝子中に存在する
Sfi Iサイトの類似配列を除去するため、以下のように
してpAMoERC3中のラビットβグロビン遺伝子を、すでに
その類似配列を除去してあるpAGE207ScN中のラビットβ
グロビン遺伝子にすげかえ、プラスミドpAMoERC3Scを造
成した。造成の都合上、まずpAMoC3Scを造成し、次いで
pAMoERC3Scの造成を行った。前記のpAGE207ScNにおいて
は、Sfi Iサイトの類似配列を除去するために挿入され
たSca Iリンカーの数は明らかではないが、pAMoERC3Sc
の場合は、造成の際にpAGE207ScNを一度Sca Iで切断し
ているため、押入されたSca Iサイトの数は１つである
と推定される。

（12）で得られたpAGE207ScNの１μｇをＹ−０緩衝液
30μｌに溶解し、20単位のKpn Iを加え、37℃で２時間
消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度が100m
Mになるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のSca I
を加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約0.7kbのDNA断片を回
収した。

また、同プラスミド１μｇをＹ−100緩衝液30μｌに
溶解し、20単位のSca Iと20単位のCla Iを加え、37℃で
２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約0.9kbのDNA断片を回収した。

また、別に（10）で得られたpAMoERC3の１μｇをＹ−
０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpn Iを加え、37℃
で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃
度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単
位のXho Iを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.2kbのD
NA断片を回収した。

次に、pAGE107（特開平２−227075）の１μｇをＹ−1
00緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXho Iと20単位のCla
Iを加え、37℃で２時間消化反応を行った。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約4.3kbのDNA断片を回収し
た。

上記で得られたpAGE207ScN由来のKpn I−Sca I断片
（0.7kb）0.1μｇと同プラスミド由来のSca I−Cla I断
片（0.9kb）0.1μｇ、pAMoERC3由来のKpn I−Xho I断片
（3.2kb）0.3μｇ、およびpAGE107由来のXho I−Cla I
断片（43kb）0.3μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶
解し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結
合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株をコ
ーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐性
株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラ
スミドを単離した。このプラスミドをpAMoC3Scと名付
け、その構造を制限酵素消化により確認した。

（14）pAMoERC3Scの造成（第14図参照） （10）で得られたpAMoERC3の１μｇをＹ−０緩衝液30
μｌに溶解し、20単位のKpn Iを加え、37℃で２時間消
化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度が150mM
になるように塩化ナトリウムを添加し、20単位のMlu I
を加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。該反応
液をアガロースゲル電気泳動後、約6.8kbのDNA断片を回
収した。

また、同プラスミド１μｇをＹ−150緩衝液30μｌに
溶解し、20単位のXho Iと20単位のMlu Iを加え、37℃で
２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電
気泳動後、約1.3kbのDNA断片を回収した。

また別に，（13）で得られたpAMoC3Scの１μｇをＹ−
０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のKpn Iを加え、37℃
で２時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃
度が100mMになるように塩化ナトリウムを添加し、20単
位のXho Iを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約5.9kbのD
NA断片を回収した。

上記で得られたpAMoERC3由来のKpn I−Mlu I断片（6.
8kb）0.2μｇと同プラスミド由来のXho I−Mlu I断片
（1.3kb）0.05μｇ、およびpAMoC3Sc由来のKpn I−Xho
I断片（5.9kb）0.2μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに
溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間
結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株を
コーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン耐
性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってプ
ラスミドを単離した。このプラスミドをpAMoERC3Scと名
付け、その構造を制限酵素消化により確認した。

pAMoERC3Scは、異種遺伝子発現用のプロモーターとし
て、モロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミ
ナル・リピート（long terminal repeat）を有してい
る。また、異種遺伝子の効率良い発現のために、ラビッ
トβグロビン遺伝子スプラインシングシグナル、ラビッ
トβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグナルおよびSV40初期
遺伝子ポリＡ付加シグナルが、挿入した異種遺伝子の後
ろに付加するようにデザインされている。また、動物細
胞用の薬剤耐性マーカーとしてG418耐性遺伝子を、大腸
菌用の薬剤耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子
（G418耐性遺伝子と同じもの）とアンピシリン耐性遺伝
子を有している。さらに，エプシュタイン・バール・ウ
イルス（Epstein−Barr virus）の複製開始点（oriP）
とEBNA−１遺伝子（oriPにトランスに作用し複製を引き
起こす働きを有する）を有するため、ナマルバ細胞をは
じめとしてゲッ歯類を除く多くの細胞中で、染色体に組
み込まれることなくプラスミド状態で存在することがで
きる。

pAMoERC3Scを用いたcDNAライブラリーの造成は、cDNA
の両末端にSfi Iリンカーを付加した後、pAMoERC3Sc中
のSfi I部位に組み込むことにより行うことができる。

（15）pAMoPRC3Sc造成（第15図参照） ナマルバ細胞のようにEBNA−１遺伝子をもともと発現
している細胞を宿主として用いる際には、プラスミドpA
MoERC3Sc中のEBNA−１遺伝子がなくても、宿主に導入し
たプラスミドは染色体に組み込まれることなくプラスミ
ド状態で存在することができると考えられる。そこで、
pAMoERC3Sc中からEBNA−１遺伝子を除去したプラスミド
pAMoPRC3Scの造成を以下のようにして行った。pAMoPRC3
SCは、pAMoERC3Scと同様にして直接発現クローニングベ
クターとして使用することができる。

（14）で得られたpAMoERC3Scの２μｇをＹ−50緩衝液
30μｌに溶解し、20単位のNsi I〔ニュー・イングラン
ド・、バイオラブズ（New England Biolabs）社製〕を
加え、37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿
後、30μｌのDNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単
位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、3
7℃で60分間反応させ、Nsi I消化によって生じた3'突出
末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によっ
て止め、クロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、Ｙ−
100緩衝液30μｌに溶解し、20単位のNot Iを加え、37℃
で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル
電気泳動後、約8.1kbのDNA断片を回収した。

また、同プラスミド２μｇをＹ−100緩衝液30μｌに
溶解し、20単位のXho Iを加え、37℃で２時間消化反応
を行った。エタノール沈殿後、30μｌのDNAポリメラー
ゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の大腸菌DNAポリメラーゼ
Ｉ・クレノー断片を加え、37℃で60分間反応させ、Xho
I消化によって生じた5'突出末端を平滑末端に変えた。
反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム抽出
とエタノール沈殿の後、Ｙ−100緩衝液30μｌに溶解
し、20単位のNot Iを加え、37℃で２時間消化反応を行
った。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約3.2kb
のDNA断片を回収した。

上記で得られたpAMoERC3Sc由来のNsi I（平滑末端）
−Not I断片（8.1kb）0.1μｇと同プラスミド由来のXho
I（平滑末端）−Not I断片（3.2kb）0.1μｇをT4DNAリ
ガーゼ緩衝液30μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を
加えて、12℃で16時間結合反応を行った。該反応液を用
いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法によって形質転
換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から
公知の方法に従ってプラスミドを単離した。このプラス
ミドをpAMoPRC3Scと名付け、その構造を制限酵素消化に
より確認した。

2.α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードするcDN
A（WP1）のクローン化 （１）ヒト・メラノーマ細胞株WM266−４細胞からのmRN
Aの取得 １×10⁸個のWM266−４細胞（ATCC CRL 1676）より、
インビトロジェン（Invitrogen）社製のmRNA抽出キット
であるファーストトラック（Fast Track;商品番号K1593
−02）を用いて、約30μｇのmRNAを取得した。具体的試
薬および方法は、キットに付与されている説明書に従っ
た。

（２）cDNAライブラリーの作製 上記で得られたmRNA 8μｇから、GIBCO BRL社製のキ
ットであるcDNA合成システム（cDNA Synthesis Syste
m）を用いて、オリゴdTをプライマーとして２本鎖cDNA
を合成した。その際、逆転写酵素としてはキット中のMo
loney Murine Leukemia Virus（Ｍ−MLV）reverse tran
scriptaseの代わりに、同社のSuper Script^TM RNase H
−Reverse Transcriptaseを使用した。その後、cDNAの
両末端に以下に示すSfi Iリンカーを付与し、アガロー
スゲル電気泳動によりcDNAをサイズにより分画を行な
い、約1.6kb以上のcDNA断片を回収した。

上記11mer（配列番号５）と8merの１本鎖DNAはそれぞ
れアプライド・バイオシステムズ社380A・DNA合成機を
用いて合成した。合成したDNAはそれぞれ50μｇずつ、
別々にT4キナーゼ緩衝液50μｌに溶解し、T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）30単位を加えて、37℃で
16時間リン酸化反応を行った。上記で合成した２本鎖cD
NAおよび上記でリン酸化したリンカー（11merのものを
４μｇと8merのものを2.9μｇ）をT4DNAリガーゼ緩衝液
45μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ1050単位を加えて、16
℃で16時間結合反応を行った。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動に供した後、約1.6kb以上のcDNA断片を回収
した。

また、１項の（15）で造成した直接発現クローニング
ベクター（Expression Cloning Vector）であるpAMoPRC
3Scの24μｇをＹ−50緩衝液590μｌに溶解し、80単位の
Sfi Iを加え、37℃で16時間消化反応を行った。その
後、その一部（５μｌ）をアガロースゲル電気泳動にか
け、切断が完了したことを確認後、cDNAライブラリー造
成時のバックグラウンド（cDNAインサートが挿入されて
いないクローン）の量を減少させるため、40単位のBamH
Iを加え、さらに37℃で２時間消化反応を行った。その
後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約
8.8kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAMoPRC3Sc由来のSfi I断片（8.8kb）
２μｇと上記で精製したcDNAをT4DNAリガーゼ緩衝液250
μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ2000単位を加えて、16℃
で16時間結合反応を行った。その後、トランスファーRN
A（tRNA）５μｇを添加し、エタノール沈殿後、TE緩衝
液20μｌに溶解した。該反応液を用いて大腸菌LE392株
〔マニアティス（Maniatis）ら編集：モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）、第２版、Cold Spri
ng Harbor 1989年刊行〕をエレクトロポーレーション法
〔ウイリアム・ジェイ・ドゥワー（William J.Dower）
ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid
s Res.），16,6127（1988）〕により形質転換し、約26
万個のアンピシリン耐性株を得た。

（３）α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードす
るcDNA（WP1）のクローン化 上記で得られた約26万個のアンピシリン耐性化（cDNA
ライブラリー）を混合した後、キィアジェン（Qiagen）
社製のプラスミド調製キットである〉plasmid〈maxi ki
t（商品番号41031）を用いてプラスミドを調製した。取
得したプラスミドはエタノール沈殿後、１μg/μｌとな
るようにTE緩衝液に溶解した。

上記プラスミドは、エレクトロポーレーション法〔宮
地（Miyaji）ら：サイトテクノロジー（Cytotechnolog
y），３,133（1990）〕により、無血清培地馴化ナマル
バ細胞（KJM−１株）〔細井ら、サイトテクノロジー（C
ytotechnology），１,151（1988）〕に導入した。1.6×
10⁶細胞あたり４μｇのプラスミドを導入した後、8mlの
RPM1640・ITPSGF培地〔7.5％炭酸水素ナトリウムを1/40
量、200mM L−グルタミン溶液（GIBCO社製）を３％、ペ
ニシリン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO社製、5000u
nits/mlペニシリン、5000μg/mlストレプトマイシン）
を0.5％、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N'−
２−ヒドロキシプロパン−３−スルフォニック・アシッ
ド（Ｎ−２−hydroxyethylpiperazine−N'−２−hydrox
ypropane−３−sulfonic acid;HEPES）（10mM）、イン
シュリン（３μg/ml）、トランスフェリン（５μg/m
l）、ピルビン酸ナトリウム（5mM）、亜セレン酸ナトリ
ウム（125nM）、ガラクトース（1mg/ml）、プルロニッ
ク（Pluronic）F68（0.1％w/v）を添加したRPMI1640培
地（日水製薬社製）〕に縣濁し、炭酸ガスインキュベー
ターで37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社
製）を0.5mg/mlになるように添加して、さらに７日間培
養し、形質転換株を得た。得られた形質転換株は、0.5m
g/mlのG418を含むRPMI1640・ITPSGF培地で培養後、約３
×10⁷個の細胞を、ガングリオシドGD3に対する抗体であ
るKM−643（EP−Ａ−0493686）を用いた間接蛍光抗体染
色に供した。間接蛍光抗体染色の操作は以下のとおりで
ある。

約３×10⁷個の細胞を50mlの遠心チューブ（2059チュ
ーブ：ファルコン社製）にとり、遠心分離（130×ｇ、1
0分間）により細胞を集めた。ついで、0.1％のアジ化ナ
トリウムを含むリン酸緩衝液PBS（Ａ−PBS;8g/l塩化ナ
トリウム,0.2g/l塩化カリウム、1.15g/lリン酸水素２ナ
トリウム（無水）,0.2g/lリン酸２水素カリウム,0.1％
アジ化ナトリウム）20mlで細胞の洗浄を行った。集めた
細胞に対しKM−643を0.8ml（10μg/ml）加えて懸濁し、
４℃で１時間反応させた。ついで、細胞をＡ−PBSで２
回洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（FI
TC）で蛍光標識した抗マウスIgG抗体および抗マウスIgM
抗体〔キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ
（KIRKEGAAD ＆ PERRY LABORATORIES）社製;A−PBSで16
倍希釈して使用した〕を320μｌ加えて懸濁し、４℃で3
0分間反応させた。細胞をＡ−PBSで２回洗浄した後、Ａ
−PBS1mlに懸濁し、フルオレッセンス・アクティベーテ
ッド・セル・ソーター〔エピックス・エリート・フロー
サイトメーター（EPICS Elite Flow Cytometer）；コー
ルター（COULTER）社製〕を用いて、蛍光強度の高い細
胞（上位１％）を無菌的に分離回収した。回収した細胞
は、0.5mg/mlのG418を含むRPMI1640・ITPSGF培地で培養
し増殖させた。増殖した細胞について、再度同様の操作
を繰り返すことにより蛍光強度の高い細胞を分離濃縮し
た。２回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位1.5
％）を、３回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位３
％）を、４回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位３
％）を、５回目の操作では蛍光強度の高い細胞（上位８
％）を分離回収した。その結果、蛍光強度の増加した細
胞、すなわちガングリオシドGD3の発現量の増加した細
胞を取得することができた。そこで、その細胞を0.5mg/
mlのG418を含むRPMI1640・ITPSGF培地で培養後、約５×
10⁶の細胞からハート法〔ロバート・エフ・マーゴルス
キー（Robert F.Margolskee）ら：モレキュラー・アン
ド・セリュラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），
８,2837（1988）〕によりプラスミドを回収した。回収
したプラスミドは、エレクトロポーレーション法〔ウイ
リアム・ジェイ・ドゥワー（William J.Dower）ら：ヌ
クレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Re
s.），16,6127（1988）〕により大腸菌LE392株に導入
し、アンピシリン耐性株を取得した。その形質転換株よ
りキィアジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キット
を用いてプラスミドを調製し、その構造を各種制限酵素
で切断して調べたところ、約2.1kbのcDNAを含んでいる
ことが明らかとなった。このプラスミドをpAMoPRWP1と
名付け、これを上記と同様のの方法で再度KJM−１株に
導入し、KM−643を用いた間接蛍光抗体染色を行ったと
ころ、このプラスミドを有するKJM−１株では、コント
ロールプラスミド（pAMoPRC3Sc）を導入したKJM−１株
に比べ、ガングリオシドGD3の発現量が約30倍に増加し
ていることが判明した。

以上の結果から、このcDNAがガングリオシドGD3の生
産を促進する活性を有するα2,8−シアリルトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子であることが明らかとなっ
た。

3.α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードするCDN
A（WP1）の塩基配列の決定 （１）α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードす
るcDNA（WP1）のpUC119への組み込み（第16図参照） 上記２項（３）で得られたpAMoPRWP1の２μｇをＹ−8
0緩衝液50μｌに溶解し、30単位のHind IIIおよび30単
位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。エ
タノール沈殿後、30μｌのDNAポリメラーゼＩ緩衝液に
溶解し、６単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ・クレノー
断片を加え、37℃で60分間反応させ、Hind III消化によ
って生じた5'突出末端およびAsp718消化によって生じた
5'突出末端を平滑末端に変えた。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動に供した後、約2.2kbのDNA断片を回収し
た。

また、pUC119〔メッシング（Messing）ら：メソッド
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），153,3（1987）〕１μｇをＹ−100緩衝液30μｌに
溶解し、20単位のHinc IIを加え、37℃で２時間消化反
応を行った。その後、1Mトリス−塩酸（pH8.0）を30μ
ｌと大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１
単位を加え、37℃で２時間脱リン酸化反応を行った。エ
タノール沈殿後、TE緩衝液30μｌに溶解し、アガロース
ゲル電気泳動を行ない、約3.16kbのDNA断片を回収し
た。

上記で得られたpAMoPRWP1由来のHind III（平滑末
端）−Asp718（平滑末端）断片（2.2kb）0.05μｇとpUC
119由来のHinc II断片（3.16kb）0.05μｇをT4DNAリガ
ーゼ緩衝液30μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌JM105株〔ヤニッシュ−ペロ
ン（Yanisch−Perron）ら：ジーン（Gene），33,103（1
985）〕をコーエンらの方法によって形質転換し、アン
ピシリン耐性株を得た。これらの形質転換株から公知の
方法に従ってプラスミドを単離し、その構造を制限酵素
消化により確認した。pAMoPRWP1由来Hind III（平滑末
端）−Asp718（平滑末端）断片のpUC119中での向きが異
なる２種のプラスミドを単離し、それぞれのプラスミド
をpUC119−WP1およびpUC119−WP1Rと命名した。

（２）塩基配列決定用欠失変異プラスミドの造成 α2,8−シアリルトランスフェラーゼをコードするcDN
AであるWP1の全塩基配列は以下に示す手順に従って決定
した。

pUC119−WP1Rの２μｇをＹ−０緩衝液30μｌに溶解
し、40単位のSac Iを加え、37℃で16時間消化反応を行
った。その後、塩化ナトリウム濃度が80mMになるように
塩化ナトリウムを添加し、40単位のAsp718を加え、さら
に37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿後、
Exo III緩衝液（宝酒造社製のキロシークエンス用デレ
ーションキットに添付されている）100μｌに溶解し
た。

また、同プラスミドpUC119−WP1Rの２μｇをＹ−150
緩衝液30μｌに溶解し、40単位のSph Iおよび40単位のN
ot Iを加え、37℃で16時間消化反応を行った。エタノー
ル沈殿後、Exo III緩衝液（宝酒造社製のキロシークエ
ンス用デレーションキットに添付されている）100μＬ
に溶解した。

上記で得られたpUC119−WP1R由来のSac I−Asp718断
片およびpUC119−WP1R由来のSph I−Not I断片より、宝
酒造社製のキロシークエンス用デレーションキットを用
いて合計13種の欠失変異プラスミドを作製した。具体的
な試薬および方法は、キットに付与されている説明書に
従った。

上記で得られた欠失変異プラスミドの塩基配列は、ア
プライド・バイオシステムズ社の塩基配列決定キット
（Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit;
商標番号401113）を用いて決定した。上記欠失変異プラ
スミドを用いて決定できない部分の配列は、欠失変異プ
ラスミドを用いて決定された塩基配列を基に合成したDN
Aをプライマーとして用いることにより決定した。得ら
れたWP1の塩基配列を配列番号１に示した。その結果、W
P1は、356アミノ酸からなるタンパク質をコードしてい
ることが明らかになった。そのアミノ酸配列より、この
タンパク質がグリコシルトランスフェラーゼ（GT）に共
通な構造を有することが明らかになった。すなわち、Ｎ
末端の29アミノ酸を細胞質側に出し、それに続く19アミ
ノ酸からなる疎水製に富む領域で膜に結合し、残りの大
半のＣ末端部分（触媒部位を含む）をゴルジ体内腔に露
出するといった構造をとると考えられる。また、これま
でに構造が明らかになっているグリコシルトランスフェ
ラーゼとアミノ酸配列を比較したところ、２種のα2,3
−シアリルトランスフェラーゼ〔ウェン（Dawn X.Wen）
ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.），267,21011（1992）；ギレスピー（W
illiam Gillespie）ら：ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），267,21004（199
2）〕およびα2,6−シアリルトランスフェラーゼ〔ワイ
ンスタイン（Jasminder Weinstein）ら：ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.），262,17735（1987）〕と部分的に相同性があるこ
とが判明した。WP1をナマルバ細胞内で発現させるとガ
ングリオシドGD3の発現が増加すること、WP1のコードす
るタンパク質がシアリルトランスフェラーゼと相同性を
有すること、およびWP1のコードするタンパク質のアミ
ノ酸配列が公知のシアリルトランスフェラーゼと異なる
ことから、WP1は新規シアリルトランスフェラーゼをコ
ードしていると考えられる。

宿主として用いたナマルバ細胞は、ガングリオシドGM
3を発現しているが、ガングリオシドGD3は発現していな
い。ガングリオシドGD3は、ガングリオシドGM3の末端の
シアル酸にα2,8結合でさらにシアル酸が付加されるこ
とにより生成し、この反応を触媒する酵素がα2,8−シ
アリルトランスフェラーゼである。したがって、以上の
結果からWP1はα2,8−シアリルトランスフェラーゼをコ
ードしていると考えられる。

実施例２ α2,8−シアリルトランスフェラーゼ発現プ
ラスミドを導入したKJM−１株におけるガングリオシドG
D3の合成 プラスミドpAMoPRC3SC（直接発現クローニングベクタ
ー；コントロール）およびpAMoPRWP1（α2,8−シアリル
トランスフェラーゼ発現プラスミド）をキィアジェン
（Qiagen）社製のプラスミド調製キットである〉plasmi
d〈maxi kit（商品番号41031）を用いて調製した。取得
したプラスミドはエタノール沈殿後、１μg/μｌになる
ようにTE緩衝液に溶解した。その後、両プラスミドを、
エレクトロポーレーション法〔宮地（Miyaji）ら：サイ
トテクノロジー（Cytotechnology），３,133（1990）〕
により、それぞれナマルバKJM−１株に導入した。1.6×
10⁶細胞あたり４μｇのプラスミドを導入後、8mlのRPMI
1640・ITPSGF培地に懸濁し、炭酸ガスインキュベーター
で37℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）
を0.5mg/mlになるように添加して７日間培養した。その
後、22mlのRPMI1640・ITPSGF培地（0.5mg/mlのG418を含
む）を添加し、さらに５日間培養し形質転換株を得た。
取得した形質転換株を、G418を0.5mg/ml含むRPMI1640・
ITPSGF培地で培養した後、それぞれ約１×10⁶個の細胞
をマイクロチューブ（1.5ml:エッペンドルフ社製）にと
り、遠心分離（550×ｇ、７分間）により細胞を集め
た。ついで、0.1％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩
衝液PBS（Ａ−PBS;8g/l塩化ナトリウム,0.2g/l塩化カリ
ウム、1.15g/lリン酸水素２ナトリウム（無水）,0.2g/l
リン酸２水素カリウム,0.1％アジ化ナトリウム）1mlで
細胞の洗浄を行った。集めた細胞に対し、ガングリオシ
ドGD3に対する抗体であるKM−643（EP−Ａ−0493686）
を用いて間接蛍光抗体染色を行ない、これらの細胞にお
けるガングリオシドGD3の発現を調べた。即ち、集めた
細胞に対しKM−643をそれぞれ50μｌ（10μg/ml）加え
て懸濁し、４℃で１時間反応させた。細胞をＡ−PBSで
２回洗浄した後、フルオレッセインイソチオシアネート
（FITC）で蛍光標識した抗マウスIgG抗体およびIgM抗体
〔キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（KI
RKEGAAD ＆ PERRY LABORATORIES）社製;A−PBSで16倍希
釈して使用した〕20μｌを加えて懸濁し、４℃で30分間
反応させた。さらに、細胞をＡ−PBSで３回洗浄した
後、再度Ａ−PBSに懸濁し、エピックス・エリート・フ
ローサイトメーター〔EPICS Elite Flow Cytometer）；
コールター（COULTER）社製〕で解析を行った。対照と
して、KM−643の代わりに正常マウス血清（Ａ−PBSで50
0倍希釈して使用）を用いて上記と同様の実験を行っ
た。

結果を第17図に示す。直接発現クローニングベクター
pAMoPRC3Sc（コントロールプラスミド）を導入したKJM
−１株において、KM−643で染色した細胞の蛍光強度
は、対照の蛍光強度とほぼ同じであることから、KJM−
１株はガングリオシドGD3を発現していないことが確認
された。また、KM−643による染色処理を施したpAMoPRW
P1（α2,8−シアリルトランスフェラーゼ発現プラスミ
ド）を有するKJM−１株の蛍光強度は、KM−643による染
色処理を施したpAMoPRC3Sc（コントロールプラスミド）
を有するKJM−１株の蛍光強度に比べて約25倍強いこと
がわかった。

以上の結果から、WP1がコードするα2,8−シアリルト
ランスフェラーゼを細胞内で発現させることによりガン
グリオシドGD3を新たに合成できることが示された。

実施例3.α2,8−シアリルトランスフェラーゼの分泌生
産 1.分泌発現ベクターpAMoPRSAの造成： （１）pAGE147の造成（第18図参照） pAGE107のSV40初期遺伝子プロモーターをモロニー・
マウス白血病ウイルスのLTRのプロモーターにすげかえ
たプラスミドpAGE147の造成を行った。

プラスミドpPMOL1［特開平１−63394号］２μｇをＹ
−０緩衝液30μｌに溶解し、20単位のSma Iを加え、30
℃で３時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウム
を50mMになるように添加し、20単位のCla Iを加えて37
℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動に供した後、モロニー・マウス白血病ウイル
スのLTRプロモーターを含む約0.6kbのDNA断片を回収し
た。

次に、実施例１の１項（８）で合成した２種の合成DN
Aをそれぞれ25ピコモル（pmoles）ずつT4キナーゼ緩衝
液10μｌに溶解し、５単位のT4DNAキナーゼを加え、37
℃で30分間反応させることにより5'末端をリン酸化し
た。

上記で得られたpPMOL1由来のCla I−Sma I断片（0.6k
b）0.05μｇと5'リン酸化された２種の合成DNA（１ピコ
モルずつ）およびHind IIIリンカー（5'−pCAAGCTTG−
3';宝酒造社製）（１ピコモル）をT4DNAリガーゼ緩衝液
30μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で
16時間結合反応を行った。エタノール沈澱により該DNA
断片を回収した後、Ｙ−100緩衝液に溶解し、10単位のH
ind IIIおよび10単位のXho Iを加えて37℃で２時間消化
反応を行った。反応をフェノール−クロロホルム抽出に
より停止させ、エタノール沈澱により該DNA断片を回収
した。

一方、pAGE107［特開平３−22972、宮地ら：サイトテ
クノロジー（Cytotechnology），３,133（1990）］１μ
ｇを30μｌのＹ−100緩衝液に溶解し、10単位のHind II
Iと10単位のXho Iを加えて37℃で２時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、G4
18耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を含む約6.
0kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAGE107由来のHind III−Xho I断片
（6.0kb）0.3μｇとpPMOL1由来のHind III−Xho I断片
（0.6kb）0.01μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液20μｌに溶解
し、T4DNAリガーゼ200単位を加え、12℃で16時間結合反
応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法
によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この
形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し
た。このプラスミドをpAGE147と名付け、その構造を制
限酵素消化により確認した。

（２）pAGE247の造成（第19図参照） pAGE207のSV40初期遺伝子プロモーターをモロニー・
マイス白血病ウイルスのLTRのプロモーターにすげかえ
たプラスミドpAGE247の造成を以下のようにして行っ
た。

上記で得られたpAGE147（２μｇ）を30μｌのＹ−100
緩衝液に溶解し、10単位のHind IIIと10単位のXho Iを
加えて37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動に供した後、モロニー・マウス白血
病ウイルスのLTRプロモーターを含む約0.63kbのDNA断片
を回収した。

一方、実施例１の１項（11）で構築したpAGE207（２
μｇ）を30μｌのＹ−100緩衝液に溶解し、10単位のHin
d IIIと10単位のXho Iを加えて37℃で２時間消化反応を
行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した
後、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン耐
性遺伝子を含む約5.84kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAGE147由来のHind III−Xho I断片
（0.63kb）0.05μｇとpAGE207由来のHind III−Xho I断
片（5.84kb）0.1μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶
解し、T4DNAリガーゼ100単位を加え、12℃で16時間結合
反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法
によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この
形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し
た。このプラスミドをpAGE247と名付け、その構造を制
限酵素消化により確認した。

（３）pAMN6hygの造成（第20図参照） モロニー・マウス白血病ウイルスのLTRをプロモータ
ーとし、ハイグロマイシン耐性遺伝子をマーカーとして
有する、ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体の発現プラ
スミドpAMN6hygの造成を行った。

上記で得られたpAGE247（２μｇ）をＹ−50緩衝液30
μｌに溶解し、20単位のCal Iを加え、37℃で２時間消
化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを175mMにな
るように添加し、20単位のSal Iを加えて37℃で２時間
消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動
に供した後、モロニー・マウス白血病ウイルスのLTRプ
ロモーター、アンピシリン耐性遺伝子およびハイグロマ
イシン耐性遺伝子を含む約4.8kbのDNA断片を回収した。

一方、特開平２−227075記載の方法により得られたプ
ラスミドpASN6（２μｇ）をＹ−50緩衝液30μｌに溶解
し、20単位のCla Iを加え、37℃で２時間消化反応を行
った。その後、塩化ナトリウムを175mMになるように添
加し、20単位のSal Iと20単位のMlu Iを加えて37℃で２
時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気
泳動に供した後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子誘導体遺
伝子を含む約5.0kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAGE247由来のCla I−Sal I断片（4.8
kb）0.1μｇとpASN6由来のCla I−Sal I断片（5.0kb）
0.1μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液20μｌに溶解し、T4DNA
リガーゲ200単位を加え、12℃で16時間結合反応を行っ
た。

該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法
によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この
形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し
た。このプラスミドをpAMN6hygと名付け、その構造を制
限酵素消化により確認した。

（４）pAMoERSAの造成（第21図参照） α2,8−シアリルトランスフェラーゼを黄色ブドウ球
菌（Staphylococcus aureus）プロテインＡの免疫グロ
ブリンＧ（IgG）結合領域と融合させた形で分泌発現す
るためのベクターpAMoERSAの造成を以下のようにして行
った。

上記（３）で得られたpAMN6hyg（２μｇ）をＹ−50緩
衝液30μｌに溶解し、20単位のSnaB Iを加え、37℃で２
時間消化反応を行った。その後、塩化ナトリウムを100m
Mになるように添加し、20単位のXba Iを加えて37℃で２
時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電気
泳動に供した後、ヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナ
ル配列を含む約0.33kbのDNA断片を回収した。

また、pPrAS1［斉藤ら：プロテイン・エンジニアリン
グ（Protein Engineering），２,481（1989）］２μｇ
をＹ−50緩衝液30μｌに溶解し、20単位のCla Iを加
え、37℃で２時間消化反応を行った。エタノール沈殿の
後、30μｌのDNAポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単
位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ・クレノー断片を加え、3
7℃で60分間反応させ、Cla I消化によって生じた5'突出
末端を平滑末端に変えた。反応をフェノール抽出によっ
て止め、クロロホルム抽出とエタノール沈澱の後、Ｙ−
100緩衝液30μｌに溶解し、20単位のBamH Iを加え、37
℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動に供した後、プロテインＡのIgG結合領域を
含む約0.21kbのDNA断片を回収した。

また、実施例１の１項（14）で得られたpAMoERC3Scの
２μｇをＹ−100緩衝液30μｌに溶解し、20単位のXba I
と20単位のBamH Iを加え、37℃で２時間消化反応を行っ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約
12.1kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたpAMN6hyg由来のSnaB I−Xba I断片
（0.33kb）0.05μｇとpPrAS1由来のCla I（平滑末端）
−BamH I断片（0.21kb）0.05μｇ、およびpAMoERC3Sc由
来のXba I−BamH I断片（12.1kb）0.1μｇをT4DNAリガ
ーゼ緩衝液30μｌに溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を加
えて、12℃で16時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法
によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この
形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し
た。このプラスミドをpAMoERSAと名付け、その構造を制
限酵素消化により確認した。

（５）pAMoPRSAの造成（第22図参照） pAMoERSA中のEBNA−１遺伝子を除去したプラスミドpA
MoPRSAの造成を以下のようにして行った。pAMoPRSAは、
pAMoERSAと同様に分泌発現ベクターとして使用できる。

pAMoERSAの２μｇを10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM
MgCl₂、80mM NaCl、6mM 2−メルカプトエタノールから
なる緩衝液（以下、Ｙ−80緩衝液と略記する）30μｌに
溶解し、20単位のXba Iと20単位のAsp718［ベーリンガ
ー・マンハイム（Boehringer Manheim）社製］を加え、
37℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動後、約1.3kbのDNA断片を回収した。

また、pAMoPRC3SCの２μｇをＹ−100緩衝液30μｌに
溶解し、20単位のXba Iと20単位のAsp718を加え、37℃
で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル
電気泳動に供した後、約8.5kbのDNA断片を回収した。

上記で得た、pAMoERSA由来のXba I−Asp718断片（1.3
kb）0.05μｇとpAMoPRC3Sc由来のXba I−Asp718断片
（8.5kb）0.1μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌに溶解
し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時間結合
反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株をコーエンらの方法
によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この
形質転換株から公知の方法に従ってプラスミドを単離し
た。このプラスミドをpAMoPRSAと名付け、その構造を制
限酵素消化により確認した。

2.α2,8−シアリルトランスフェラーゼを分泌生産する
プラスミドpAMoPRSAWP1の造成（第23図参照） クローン化したα2,8−シアリルトランスフェラーゼ
はその一次配列から、Ｎ末端の29アミノ酸を細胞質側に
出し、それに19アミン酸からなる疎水製に富む領域で膜
に結合し、残りの大半のＣ末端部分（触媒部位を含む）
をゴルジ体内腔に露出するといった構造をとると推定さ
れる。そこで、膜結合領域を含むＮ末端部分を除去し、
かわりにヒト顆粒球コロニー刺激因子のシグナル配列お
よびプロテインＡのIgG結合領域を付加することにより
α2,8−シアリルトランスフェラーゼの分泌生産させ
た。触媒領域と推定される部分〔配列番号１の57番目の
イソロイシンから356番目のセリンまで〕をコードするD
NAをPCR法を用いて調製し、上記で造成した分泌発現ベ
クターpAMoPRSAに組み込んだ。

PCR用のプライマーとしては、以下に示す２種の合成D
NA〔P1−Ｎ（36mer）およびP1−Ｃ（37mer）〕をアプラ
イド・バイオシステムズ社380A・DNA合成機を用いて合
成した。

P1−Ｎ（36mer;配列番号６）には、Evo Vサイトが、P
1−Ｃ（37mer;配列番号７）にはAsp718サイトがされぞ
れ導入されるように構築されているため、PCRで増幅さ
れたDNA断片はEco VとAsp718で切断した後に、pAMoPRSA
のStu IサイトとAsp718サイト間に組み込むことができ
る。PCR反応は、宝酒造社製のキット（GeneAmp^TM DNA A
mplification Reagent Kit with AmpliTaq^TM Recombina
nt Taq DNA Polymerase）を用いて行った。反応液の調
製はキットに添付の説明書に従って行い、パーキン・エ
ルマー・シータス社のサーマル・サイクラー（PERKIN E
LMER CETUS DNA Thermal Cycler;宝酒造社が販売）を用
いて、94℃で１分間、65℃で１分間、72℃で３分間の反
応を20サイクル行った後、さらに72℃で７分間反応させ
た。鋳型としては、70ngのプラスミドpUC119−WP1Rを使
用した。反応終了後、クロロホルム抽出およびエタノー
ル沈澱を行った後、Ｙ−80緩衝液30μｌに溶解し、20単
位のAsp718を加え、37℃で２時間消化反応を行った。そ
の後、塩化ナトリウムを150mMになるように添加し、20
単位のEcoR Vを加えて37℃で２時間消化反応を行った。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、約0.9k
bのDNA断片を回収した。

また、pAMoPRSAの２μｇをＹ−100緩衝液30μｌに溶
解し、20単位のStu Iと20単位のAsp718を加え、37℃で
２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電
気泳動に供した後、約9.06kbのDNA断片を回収した。

上記で得られたPCRで増幅したDNA由来のEcoR V−Asp7
18断片（0.9kb）0.1μｇとpAMoPRSA由来のStu I−Asp71
8断片（9.06kb）0.1μｇをT4DNAリガーゼ緩衝液30μｌ
に溶解し、T4DNAリガーゼ175単位を加えて、12℃で16時
間結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株
をコーエンらの方法によって形質転換し、アンピシリン
耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従って
プラスミドを単離した。このプラスミドをpAMoPRSAWP1
と名付け、その構造を制限酵素消化により確認した。

3.ナマルバKJM−１細胞を宿主としたα2,8−シアリルト
ランスフェラーゼの分泌生産 上記で得られたプラスミドpAMoPRSA（分泌発現ベクタ
ー）および上記で造成したpAMoPRSAWP1（α2,8−シアリ
ルトランスフェラーゼ分泌発現用プラスミド）をキィア
ジェン（Qiagen）社製のプラスミド調製キット（〉plas
mid〈maxi kit;商標番号41031）を用いて調製した。取
得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μg/μｌに
なるようにTE緩衝液に溶解した。その後、エレクトロポ
ーレーション法［宮地ら：サイトテクノロジー（Cytote
chnology），３,133（1990）］により、両プラスミドを
それぞれナマルバKJM−１株に導入した。1.6×10⁶細胞
あたり４μｇのプラスミドを導入した後、8mlのRPMI164
0・IT0SGF培地に懸濁し、炭酸ガスインキュベーターで3
7℃で24時間培養した。その後、G418（ギブコ社製）を
0.5mg/mlになるように添加して７日間培養した。その
後、22mlのRPMI1640・ITPSGF培地（0.5mg/mlのG418を含
む）を添加し、さらに５日間培養し、形質転換株を得
た。取得した形質転換株は、それぞれG418を0.5mg/ml含
むRPMI1640・ITPSGF培地30mlに５×10⁴細胞/mlになるよ
うに懸濁し、炭酸ガスインキュベーターで37℃で８日間
培養した。その後、遠心分離（160×ｇ、10分間）によ
り細胞を除き上清を回収し、再度遠心分離（1500×ｇ、
10分間）の後、その上清を回収した。このようにして取
得した培養上清は、使用するまで−80℃で保存した。

プラスミドpAMoPRSAWP1のコードするα2,8−シアリル
トランスフェラーゼはプロテインＡのIgG結合領域との
融合蛋白質として分泌発現されるため、IgGセファロー
ス（Sehparose）を用いて、容易に精製することができ
る。そこで、上記のようにして取得した培養上清にアジ
化ナトリウムを最終濃度0.1％になるように添加した
後、製品説明書にしたがって前処理したIgGセファロー
ス［ファルマシア（Pharmacia製］を15μｌ添加し、４
℃で一晩ゆっくり攪拌した。その後、遠心分離（160×
ｇ、10分間）によりIgGセファロースを回収し、リン酸
緩衝液〔PBS;8g/l塩化ナトリウム、0.2g/l塩化カリウ
ム、1.15g/lリン酸水素２ナトリウム（無水）、0.2g/l
リン酸２水素カリウム、0.1％アジ化ナトリウム〕1mlで
３回洗浄後、20μｌのRPMI1640培地（無血清）に懸濁し
た。このIgGセファロース懸濁液を用いて常法〔サムエ
ルソン（Samuelson）：メソッド・イン・エンザイモロ
ジー（Method in Enzymology）,138巻、567頁；バス（B
asuら）：メソッド・イン・エンザイモロジー（Method
in Enzymology）、138巻、575頁）に従って、GD3合成酵
素活性を測定した。

活性測定は10μｌのアッセイ溶液〔0.1Mカコジル酸−
HCl（pH6.0）、20mM塩化マンガン、１％トライトン、12
0μMCMP−［¹⁴C］シアル酸〔アマーシャム（Amasham）
社製〕、10mg基質糖脂質、上記IgGセファロース懸濁液
（５μｌ）〕中、37℃で４時間反応を行った後、200μ
ｌのPBSを加え、Ｃ−18カラム〔100mg;ファットマン（W
hatman）社製〕に通した。3mlの水で洗浄後、カラムに
吸着した糖脂質を1mlのメタノールと1mlのクロロホルム
／メタノール（1:1）で溶出し、窒素ガスを用いて溶媒
を除去した。その後、糖脂質を10μｌのクロロホルムに
溶解し、クロロホルム／メタノール／塩化カリウム（5
5:45:10）を展開溶媒として用い、ハイ・パフォーマン
ス薄層クロマトグラフィー後のHPTLCプレートはバイオ
・イメージング・モデルBAS2000アナライザー（FUJIX）
を用いて解析し、放射性標識された生成物の同定および
定量を行った。基質としては、ラクトシルセラミド（以
下、LacCerと略記する）、ガングリオシドGM3、GM2、GM
1b、GD3、GD1a、GD1b、GT1bを用いた。GM3およびGD3は
常法〔花井ら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.），263,10915−10921（198
8）；花井ら：アンチ・キャンサー・リサーチ（Antican
cer Res.），10,1579−1586（1990）〕に従って調製し
た。LacCer,GM2,GM1b,GD1a,およびGD1bはシグマ（Sigm
a）社より購入した。GT1bはバイオシンスAG（Biosynth
AG）社より購入した。生成物の同定は、スタンダード糖
脂質と展開位置を比較することにより行った。スタンダ
ード糖脂質はオルシノール／硫酸を用いて検出した。そ
の結果を第24図に示す。

pAMoPRSAWP1を導入したナマルバ細胞の培養上清と混
和処理を行ったIgGセファロースを使用した際には、GD3
合成酵素活性（GM3からGD3を合成する活性）が検出され
た（培地1ml中に生産された分泌型酵素を用いて１時間
当たり0.1pmolのGD3を生産した）。一方、ベクターであ
るpAMoPRSAを導入したナマルバ細胞の培養上清由来のIg
Gセファロースを使用した際には、活性は検出されなか
った。また、pAMoPRSAWP1がコードするシアリルトラン
スフェラーゼは、GM3以外の糖脂質を基質としないこと
より、GM3に基質特性の高いα2,8−シアリルトランスフ
ェラーゼ（GD3合成酵素）であることが判明した（第24
図）。

以上の結果から、本発明のα2,8−シアリルトランス
フェラーゼが黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu
s）のプロテインＡのIgG結合領域との融合蛋白質として
培養上清中に分泌生産されること、およびその分泌生産
物がIgGセファロースを用いて、容易に回収、精製でき
ることが示された。

産業上の利用可能性 本発明により、ガングリオシドGD3等の有用生理活性
を有する糖鎖とその修飾物の製造等に有用なα2,8−シ
アリルトランスフェラーゼが提供される。

配列表 配列番号:1 配列の長さ:2117 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類:cDNA to mRNA 起源： 生物名：ヒト 株名:WM266−４細胞 細胞の種類：メラノーマ 配列： 配列番号:2 配列の長さ:356 配列の型：アミノ酸 鎖の数：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 株名:WM266−４細胞 細胞の種類：メラノーマ 配列： 配列番号:3 配列の長さ:52 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:4 配列の長さ:44 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:11 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:36 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： 配列番号:7 配列の長さ:37 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｒｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈ ｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏ ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（1990）, 166（１），ｐ．387−393 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (19)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からな
   る群より選ばれるポリペプチド。 （ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポりペプ
   チド （ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列の57〜356番目の
   アミノ酸配列を含むポリペプチド （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミ
   ノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換若し
   くは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα2,8−シ
   アリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
2. 【請求項２】以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）お
   よび（ｅ）からなる群より選ばれるDNA。 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするDNA （ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有するDNA （ｃ）配列番号１で表される塩基配列の483〜1550番目
   の塩基配列を有するDNA （ｄ）配列番号１で表される塩基配列の651〜1550番目
   の塩基配列を有するDNA （ｅ）（ａ）〜（ｄ）いずれかに記載のDNAとストリン
   ジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、か
   つα2,8−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポ
   リペプチドをコードするDNA
3. 【請求項３】請求項２記載のDNAが組み込まれた組換え
   体ベクター。
4. 【請求項４】動物細胞から抽出したmRNAを鋳型として合
   成したcDNAを発現クローニングベクターに組み込むこと
   によりcDNAライブラリーを構築し、該cDNAライブラリー
   を細胞に導入し、得られる細胞よりガングリオシドGD3
   に対する抗体と強く反応する細胞を選別し、該細胞より
   請求項１記載のポリペプチドをコードするcDNAを採取す
   ることを特徴とする請求項２記載のDNAの製造法。
5. 【請求項５】動物細胞から抽出したmRNAを鋳型として合
   成したcDNAを発現クローニングベクターに組み込むこと
   によりcDNAライブラリーを構築し、該cDNAライブラリー
   を細胞に導入し、得られる細胞よりガングリオシドGD3
   に対する抗体と強く反応する細胞を選別し、該細胞より
   請求項１記載のポリペプチドをコードするcDNAを単離
   し、該cDNAをベクター中のプロモーターの下流に導入す
   ることを特徴とする請求項３記載の組換え体DNAの製造
   法。
6. 【請求項６】請求項３記載の組換え体ベクターを保有す
   る細胞を培地に培養し、培養物中に請求項１記載のポリ
   ペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチド
   を採取することを特徴とする請求項１記載のポリペプチ
   ドの製造法。
7. 【請求項７】動物細胞が、ヒト・メラノーマWM266−４
   細胞である請求項４記載のDNAの製造法。
8. 【請求項８】動物細胞が、ヒト・メラノーマWM266−４
   細胞である請求項５記載の組換え体ベクターの製造法。
9. 【請求項９】組換え体ベクターが、プラスミドpUC119−
   WP1である請求項３記載の組換え体ベクター。
10. 【請求項１０】請求項３記載の組換え体ベクターを含有
    する細胞。
11. 【請求項１１】請求項３記載の組換え体ベクターを、ガ
    ングリオシドGM3を生産している細胞に導入して得られ
    る細胞を培地に培養し、培養物中にガングリオシドGD3
    を生成蓄積させ、該培養物からガンクリオシドGD3を採
    取することを特徴とするガングリオシドGD3の製造法。
12. 【請求項１２】請求項10記載の細胞を用いてガングリオ
    シドGM3をガングリオシドGD3に変換する方法。
13. 【請求項１３】請求項１記載のポリペプチドを用いてガ
    ングリオシドGM3をガングリオシドGD3に変換する方法。
14. 【請求項１４】請求項２記載のDNA中の連続した10〜50
    塩基からなるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチ
    ドの相補配列を有するオリゴヌクレオチド。
15. 【請求項１５】請求項２記載のDNA、または請求項14記
    載のオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーショ
    ン法により、請求項１記載のポリペプチドの生産を検出
    する方法。
16. 【請求項１６】請求項14記載のオリゴヌクレオチドを用
    いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、
    請求項１記載のポリペプチドの生産を検出する方法。
17. 【請求項１７】請求項２記載のDNAの翻訳開始領域内の1
    0〜50塩基からなるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌク
    レオチドの相補配列を有するオリゴヌクレオチドを含む
    DNAを用いて請求項１記載のポリペプチドの生産を抑制
    する方法。
18. 【請求項１８】請求項３または９に記載の組換え体ベク
    ターを含有する大腸菌。
19. 【請求項１９】大腸菌が、Escherichia coli JM105/pUC
    119−WP1R（FERMBP−4192）である請求項18記載の大腸
    菌。