JP3323258B2 - 抗ヒトａｄｆモノクローナル抗体及びそれを用いたヒトａｄｆの測定方法 - Google Patents
抗ヒトａｄｆモノクローナル抗体及びそれを用いたヒトａｄｆの測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト成人Ｔ細胞白血病
細胞（Adult T Cell Leukemia, ATL) 由来因子（以下ヒ
トＡＤＦと略する）に特異的に反応するモノクローナル
抗体、及びそのモノクローナル抗体を用いたヒト体液中
等のヒトＡＤＦの測定・定量法、更にその測定・定量法
に基づく扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌等の癌、あるい
は膵炎、肝炎などの炎症性臓器障害、肝炎ウイルス、Ｈ
ＴＬＶ−１などのウイルス感染症等の疾患の診断法に関
する。
細胞（Adult T Cell Leukemia, ATL) 由来因子（以下ヒ
トＡＤＦと略する）に特異的に反応するモノクローナル
抗体、及びそのモノクローナル抗体を用いたヒト体液中
等のヒトＡＤＦの測定・定量法、更にその測定・定量法
に基づく扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌等の癌、あるい
は膵炎、肝炎などの炎症性臓器障害、肝炎ウイルス、Ｈ
ＴＬＶ−１などのウイルス感染症等の疾患の診断法に関
する。
【０００２】本発明の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
は、癌、臓器障害、ウイルス感染症等の診断薬のみなら
ず、治療薬としても利用し得る有用な物質である。
は、癌、臓器障害、ウイルス感染症等の診断薬のみなら
ず、治療薬としても利用し得る有用な物質である。
【０００３】
【従来の技術】現在、癌は本邦において死亡原因の第一
位を占める疾患である。発癌のメカニズムは完全には解
明されておらず、現時点での癌の予防を行うことは難し
い。しかし、近年外科手術の手技が向上し、早期に癌を
発見できた場合の治癒率は飛躍的に上昇してきている。
従って、癌を初期の段階で確実に診断できる方法があれ
ば、癌患者の治療のために非常に有用である。
位を占める疾患である。発癌のメカニズムは完全には解
明されておらず、現時点での癌の予防を行うことは難し
い。しかし、近年外科手術の手技が向上し、早期に癌を
発見できた場合の治癒率は飛躍的に上昇してきている。
従って、癌を初期の段階で確実に診断できる方法があれ
ば、癌患者の治療のために非常に有用である。
【０００４】現在の癌の診断法のほとんどは、癌細胞特
異的に産生されるいわゆる腫瘍マーカーを組織学的に、
あるいは生化学的に検出することにより行われている。
例えば、哺乳類の胎生期において卵黄嚢、及び肝臓で合
成される血清蛋白質として知られるαフェトプロテイン
（以下ＡＦＰと略する）は、通常出生後にはその合成が
ほとんど停止するが、肝癌等の発生により合成が再開さ
れ血中に出現するように成る。従って、このＡＦＰを抗
ＡＦＰ抗体を用いた免疫化学的測定法により定量するこ
とにより肝癌の診断が可能となる。腫瘍マーカーとして
は、ＡＦＰのほかにも、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェ
リチン、糖鎖抗原等が知られ臨床応用されている。
異的に産生されるいわゆる腫瘍マーカーを組織学的に、
あるいは生化学的に検出することにより行われている。
例えば、哺乳類の胎生期において卵黄嚢、及び肝臓で合
成される血清蛋白質として知られるαフェトプロテイン
（以下ＡＦＰと略する）は、通常出生後にはその合成が
ほとんど停止するが、肝癌等の発生により合成が再開さ
れ血中に出現するように成る。従って、このＡＦＰを抗
ＡＦＰ抗体を用いた免疫化学的測定法により定量するこ
とにより肝癌の診断が可能となる。腫瘍マーカーとして
は、ＡＦＰのほかにも、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェ
リチン、糖鎖抗原等が知られ臨床応用されている。
【０００５】しかし、これらの腫瘍マーカーはそれぞれ
ある一部の限定された癌にしか発現していないものが多
い。従って、癌が発生していても、これらの腫瘍マーカ
ーを発現していない場合には発見することが不可能であ
り、現在臨床応用されている腫瘍マーカーの測定のみで
は、種々の癌の早期発見は事実上困難を極めているた
め、新たな癌の診断法が待たれている。
ある一部の限定された癌にしか発現していないものが多
い。従って、癌が発生していても、これらの腫瘍マーカ
ーを発現していない場合には発見することが不可能であ
り、現在臨床応用されている腫瘍マーカーの測定のみで
は、種々の癌の早期発見は事実上困難を極めているた
め、新たな癌の診断法が待たれている。
【０００６】さて、ＩＬ−２レセプター誘導因子として
本発明者らの見いだしたヒトＡＤＦ（特開昭６４−８５
０９７）は、ヒトチオレドキシンとして生体内に広く存
在することが明らかとなった。またヒトＡＤＦは、活性
部位に２つのＳＨ基を有しており、活性酸素還元活性、
及び酸化により変性した蛋白質を賦活化する活性を有す
ることが明らかとなった（三井彰ら、生化学、６２巻、
１０４７頁、１９９０年）。更にヒトＡＤＦは、紫外線
や放射線照射により誘導され、ウイルス感染細胞や再生
肝にも強く発現がみられることから、ヒトＡＤＦは細胞
の活性化、増殖等に際して生ずるフリーラジカルなどの
種々の酸化ストレスに対する生体応答防御因子として働
いている可能性が示唆されてきている（中村肇ら、実験
医学、９巻、８月号、１９９１年）。
本発明者らの見いだしたヒトＡＤＦ（特開昭６４−８５
０９７）は、ヒトチオレドキシンとして生体内に広く存
在することが明らかとなった。またヒトＡＤＦは、活性
部位に２つのＳＨ基を有しており、活性酸素還元活性、
及び酸化により変性した蛋白質を賦活化する活性を有す
ることが明らかとなった（三井彰ら、生化学、６２巻、
１０４７頁、１９９０年）。更にヒトＡＤＦは、紫外線
や放射線照射により誘導され、ウイルス感染細胞や再生
肝にも強く発現がみられることから、ヒトＡＤＦは細胞
の活性化、増殖等に際して生ずるフリーラジカルなどの
種々の酸化ストレスに対する生体応答防御因子として働
いている可能性が示唆されてきている（中村肇ら、実験
医学、９巻、８月号、１９９１年）。
【０００７】この様にヒトＡＤＦは増殖の盛んな細胞や
組織において発現が亢進し、細胞の傷害を防御している
と考えられているが、一般に癌細胞は生体から逸脱して
増殖し続けるため、ヒトの癌細胞は自身の防御の為に特
に大量のヒトＡＤＦを発現、産生している可能性が考え
られる。実際、ヒトＡＤＦの部分ペプチドを免疫したウ
サギの抗血清より調製したポリクローナル抗体を用い
て、各種癌細胞を免疫組織化学的方法により染色してみ
ると、正常組織では全く染色されないのに対し、殆どす
べての扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌さらに前癌状態の
細胞などが染色されることが明らかとなり、ヒトＡＤＦ
を検出することは従来にない汎用性の高い癌の診断法と
なりうることが判明した（特願平１−２１６２６）。し
かし、本抗体は組織を免疫組織染色するというものであ
り、操作は煩雑な上に、患者の組織より標本を作る必要
がある。またヒトＡＤＦは、正常状態もしくは疾患状態
において、体液中に存在するか否かは全く不明であり、
まして体液中のヒトＡＤＦ濃度と癌などの各種疾患との
関係は不明であった。
組織において発現が亢進し、細胞の傷害を防御している
と考えられているが、一般に癌細胞は生体から逸脱して
増殖し続けるため、ヒトの癌細胞は自身の防御の為に特
に大量のヒトＡＤＦを発現、産生している可能性が考え
られる。実際、ヒトＡＤＦの部分ペプチドを免疫したウ
サギの抗血清より調製したポリクローナル抗体を用い
て、各種癌細胞を免疫組織化学的方法により染色してみ
ると、正常組織では全く染色されないのに対し、殆どす
べての扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌さらに前癌状態の
細胞などが染色されることが明らかとなり、ヒトＡＤＦ
を検出することは従来にない汎用性の高い癌の診断法と
なりうることが判明した（特願平１−２１６２６）。し
かし、本抗体は組織を免疫組織染色するというものであ
り、操作は煩雑な上に、患者の組織より標本を作る必要
がある。またヒトＡＤＦは、正常状態もしくは疾患状態
において、体液中に存在するか否かは全く不明であり、
まして体液中のヒトＡＤＦ濃度と癌などの各種疾患との
関係は不明であった。
【０００８】一般に微量の物質の定量は、抗原抗体反応
を応用した免疫化学的測定法により行われる。免疫化学
的測定法を行うためには、抗原に特異的でかつ認識エピ
トープの異なる複数のモノクローナル抗体が必要である
が、本発明以前にはヒトＡＤＦに対するモノクローナル
抗体については全く知られず、本発明者らも組換え体ヒ
トＡＤＦを得て以来、３年有余の間モノクローナル抗体
を作成することができなかった。
を応用した免疫化学的測定法により行われる。免疫化学
的測定法を行うためには、抗原に特異的でかつ認識エピ
トープの異なる複数のモノクローナル抗体が必要である
が、本発明以前にはヒトＡＤＦに対するモノクローナル
抗体については全く知られず、本発明者らも組換え体ヒ
トＡＤＦを得て以来、３年有余の間モノクローナル抗体
を作成することができなかった。
【０００９】一方、膵炎や肝炎等の重篤な臓器障害が起
こると、細胞や組織の破壊が生じるが、この破壊は主に
蛋白分解酵素とフリーラジカルによると考えられている
（肝胆膵、９巻、１１２７頁、１９８４年、Ｊ．Ａｃ
ｔ．Ｏｘｙｇ．Ｆｒｅｅ．Ｒａｄ．２巻、６２３頁、１
９９１年）。ヒトＡＤＦは生体内においてフリーラジカ
ルなどの酸化ストレスから組織を防御する働きを有して
いて、臓器障害時には、その障害を抑制するために、ヒ
トＡＤＦの発現が亢進するものと考えられる。更に障害
が持続した場合には重篤な炎症が発症し、細胞壊死や組
織破壊に至る。従ってヒトＡＤＦを測定、定量すること
ができれば、重篤な臓器障害の診断が可能となるものと
予想されるが、本発明以前には血中にヒトＡＤＦが存在
するか否かが不明であり、まだ測定手技も存在しなかっ
た。本発明で得られた抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を用いて、本発明による診断手技により血中のヒトＡＤ
Ｆ濃度を定量する方法が完成し、癌や臓器障害を起こし
ている患者の血清中では、正常人に比較して有意に異な
るヒトＡＤＦ動態が見られることを初めて見出し本発明
を完成した。
こると、細胞や組織の破壊が生じるが、この破壊は主に
蛋白分解酵素とフリーラジカルによると考えられている
（肝胆膵、９巻、１１２７頁、１９８４年、Ｊ．Ａｃ
ｔ．Ｏｘｙｇ．Ｆｒｅｅ．Ｒａｄ．２巻、６２３頁、１
９９１年）。ヒトＡＤＦは生体内においてフリーラジカ
ルなどの酸化ストレスから組織を防御する働きを有して
いて、臓器障害時には、その障害を抑制するために、ヒ
トＡＤＦの発現が亢進するものと考えられる。更に障害
が持続した場合には重篤な炎症が発症し、細胞壊死や組
織破壊に至る。従ってヒトＡＤＦを測定、定量すること
ができれば、重篤な臓器障害の診断が可能となるものと
予想されるが、本発明以前には血中にヒトＡＤＦが存在
するか否かが不明であり、まだ測定手技も存在しなかっ
た。本発明で得られた抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を用いて、本発明による診断手技により血中のヒトＡＤ
Ｆ濃度を定量する方法が完成し、癌や臓器障害を起こし
ている患者の血清中では、正常人に比較して有意に異な
るヒトＡＤＦ動態が見られることを初めて見出し本発明
を完成した。
【００１０】また、ＨＩＶウイルスの活性化に関与して
いる転写因子として知られているＮＦκＢの転写活性が
酸化剤添加で抑制されるのに対し、ヒトＡＤＦの添加で
回復すること（岡本尚ら、International Immunology,
４巻、８１１頁、１９９２年）、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞
を還元剤無添加で培養するとその増殖が抑制されるが、
ヒトＡＤＦを添加すると増殖亢進が見られること（山内
清明ら、Molecular Immunology, ２９巻、２６３頁、１
９９２年）などから、ウイルスの複製、ウイルス感染細
胞の増殖にヒトＡＤＦは必須であるものと推定される。
従って、ヒトＡＤＦの働きを抑制できれば、癌の防御機
構を破壊することによる癌の治療、ウイルスの複製の抑
制などによるウイルス感染症の治療が可能となるものと
考えられ、ＡＤＦ活性を中和する抗体は、新しいタイプ
の制癌剤、抗ウイルス感染症薬となるものと考えられ
る。従来このような考えに基づく癌やウイルス感染症の
治療法はなく、ヒトＡＤＦ活性を抑制する活性を持つ物
質も知られていない。
いる転写因子として知られているＮＦκＢの転写活性が
酸化剤添加で抑制されるのに対し、ヒトＡＤＦの添加で
回復すること（岡本尚ら、International Immunology,
４巻、８１１頁、１９９２年）、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞
を還元剤無添加で培養するとその増殖が抑制されるが、
ヒトＡＤＦを添加すると増殖亢進が見られること（山内
清明ら、Molecular Immunology, ２９巻、２６３頁、１
９９２年）などから、ウイルスの複製、ウイルス感染細
胞の増殖にヒトＡＤＦは必須であるものと推定される。
従って、ヒトＡＤＦの働きを抑制できれば、癌の防御機
構を破壊することによる癌の治療、ウイルスの複製の抑
制などによるウイルス感染症の治療が可能となるものと
考えられ、ＡＤＦ活性を中和する抗体は、新しいタイプ
の制癌剤、抗ウイルス感染症薬となるものと考えられ
る。従来このような考えに基づく癌やウイルス感染症の
治療法はなく、ヒトＡＤＦ活性を抑制する活性を持つ物
質も知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとしている課題】本発明の目的は、
血清などのヒト体液中のヒトＡＤＦの定量、それに基づ
く癌、臓器傷害、ウイルス感染症などの疾患の診断法の
提供、及びヒトＡＤＦの定量、癌、臓器傷害、ウイルス
感染症などの疾患の診断、及び治療に用いることのでき
るヒトＡＤＦに対して特異的モノクローナル抗体の提供
である。
血清などのヒト体液中のヒトＡＤＦの定量、それに基づ
く癌、臓器傷害、ウイルス感染症などの疾患の診断法の
提供、及びヒトＡＤＦの定量、癌、臓器傷害、ウイルス
感染症などの疾患の診断、及び治療に用いることのでき
るヒトＡＤＦに対して特異的モノクローナル抗体の提供
である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、ヒトＡＤＦに対
するモノクローナル抗体を得ることに成功し、得られた
モノクローナル抗体を用いてヒトＡＤＦを高感度に定量
する方法を開発し、癌、臓器傷害、ウイルス感染症など
の疾患の診断をすることを可能とせしめ本発明を完成し
た。以下、本発明を詳細に説明する。
解決するために鋭意研究を行った結果、ヒトＡＤＦに対
するモノクローナル抗体を得ることに成功し、得られた
モノクローナル抗体を用いてヒトＡＤＦを高感度に定量
する方法を開発し、癌、臓器傷害、ウイルス感染症など
の疾患の診断をすることを可能とせしめ本発明を完成し
た。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明の方法に用いられるモノクローナル
抗体は、常法に基づき、ヒトＡＤＦを動物に免疫し、そ
の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、得られ
るハイブリドーマから抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを選択し、これを培養して生
産されたモノクローナル抗体を回収することにより得る
ことができる。
抗体は、常法に基づき、ヒトＡＤＦを動物に免疫し、そ
の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、得られ
るハイブリドーマから抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを選択し、これを培養して生
産されたモノクローナル抗体を回収することにより得る
ことができる。
【００１４】抗原として用いるヒトＡＤＦは（１）遺伝
子組換え法により、ヒトＡＤＦのポリペプチドをコード
する遺伝子の上流に他のペプチドをコードする遺伝子を
接続し、大腸菌、酵母、高等動物細胞、植物細胞等の宿
主に導入し、宿主細胞内で融合蛋白質として発現させた
後、蛋白質分解酵素により、ペプチドとヒトＡＤＦとし
て切断し、クロマトグラフィー等一般に用いられる手法
により精製する方法（特開平１−８５０９７号）、
（２）遺伝子組換え法により、ヒトＡＤＦのポリペプチ
ドをコードする遺伝子を、大腸菌、酵母、高等動物細
胞、植物細胞等の宿主細胞に導入し、宿主細胞内で発現
させ、（１）と同様に精製する方法、または（３）化学
的に合成する方法等、いずれの方法により生産されたも
のをも用いることができる。
子組換え法により、ヒトＡＤＦのポリペプチドをコード
する遺伝子の上流に他のペプチドをコードする遺伝子を
接続し、大腸菌、酵母、高等動物細胞、植物細胞等の宿
主に導入し、宿主細胞内で融合蛋白質として発現させた
後、蛋白質分解酵素により、ペプチドとヒトＡＤＦとし
て切断し、クロマトグラフィー等一般に用いられる手法
により精製する方法（特開平１−８５０９７号）、
（２）遺伝子組換え法により、ヒトＡＤＦのポリペプチ
ドをコードする遺伝子を、大腸菌、酵母、高等動物細
胞、植物細胞等の宿主細胞に導入し、宿主細胞内で発現
させ、（１）と同様に精製する方法、または（３）化学
的に合成する方法等、いずれの方法により生産されたも
のをも用いることができる。
【００１５】下記実施例において詳述するように、上記
方法に基づき作成したヒトＡＤＦと特異的に反応するモ
ノクローナル抗体として、モノクローナル抗体ＡＤＦ１
１及びＡＤＦ２１がある。これらを生産するハイブリド
ーマは微工研に寄託されており、その受託番号はそれぞ
れ微工研菌寄第１３０２５号、及び第１３０２６号であ
る。これらのモノクローナル抗体のサブクラスをオクタ
ロニー法により調べたところ、いずれもＩｇＧＩ（κ）
であった。なおＡＤＦ１１とＡＤＦ２１は互いに認識す
るエピトープが異なっている。
方法に基づき作成したヒトＡＤＦと特異的に反応するモ
ノクローナル抗体として、モノクローナル抗体ＡＤＦ１
１及びＡＤＦ２１がある。これらを生産するハイブリド
ーマは微工研に寄託されており、その受託番号はそれぞ
れ微工研菌寄第１３０２５号、及び第１３０２６号であ
る。これらのモノクローナル抗体のサブクラスをオクタ
ロニー法により調べたところ、いずれもＩｇＧＩ（κ）
であった。なおＡＤＦ１１とＡＤＦ２１は互いに認識す
るエピトープが異なっている。
【００１６】更に本発明の免疫化学的測定法によるヒト
ＡＤＦの検出、及び定量は以下のようにして行えばよ
い。まず、上記のような方法により調製した２種類のエ
ピトープの異なるヒトＡＤＦに対するモノクローナル抗
体を用意する。第１の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を、例えばマイクロタイタープレートのウェルの内壁の
ような固相に結合し、非特異的吸着部位をウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）等でブロッキングした後、検体を反応
させ、洗浄し、第２の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を反応させ、洗浄後固相に結合している第２抗体の量を
測定することにより検体中のヒトＡＤＦを測定すること
ができる。第２抗体の量の測定は、従来より免疫分析の
分野において周知の種々の方法により行うことができ
る。例えば、第２抗体を酵素で標識しておき、発色性の
基質あるいは化学発光性の基質を用いて行うことができ
る。あるいは第２抗体にビオチンを結合しておき、この
ビオチンを標識化アビジンと反応させて該標識を測定す
ることによっても行うことができる。更には第２抗体に
特異的に反応する標識化抗体を更に反応させ、該標識を
測定することによっても行うことができる。
ＡＤＦの検出、及び定量は以下のようにして行えばよ
い。まず、上記のような方法により調製した２種類のエ
ピトープの異なるヒトＡＤＦに対するモノクローナル抗
体を用意する。第１の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を、例えばマイクロタイタープレートのウェルの内壁の
ような固相に結合し、非特異的吸着部位をウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）等でブロッキングした後、検体を反応
させ、洗浄し、第２の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体
を反応させ、洗浄後固相に結合している第２抗体の量を
測定することにより検体中のヒトＡＤＦを測定すること
ができる。第２抗体の量の測定は、従来より免疫分析の
分野において周知の種々の方法により行うことができ
る。例えば、第２抗体を酵素で標識しておき、発色性の
基質あるいは化学発光性の基質を用いて行うことができ
る。あるいは第２抗体にビオチンを結合しておき、この
ビオチンを標識化アビジンと反応させて該標識を測定す
ることによっても行うことができる。更には第２抗体に
特異的に反応する標識化抗体を更に反応させ、該標識を
測定することによっても行うことができる。
【００１７】第２抗体の標識には、酵素の代わりに蛍光
色素や放射性物質を用いてもよい。
色素や放射性物質を用いてもよい。
【００１８】なお、ここで用いることのできるモノクロ
ーナル抗体は、ヒトＡＤＦに特異的に反応する抗体で、
エピトープが異なっていさえすれば、いかなる抗体を用
いてもよいし、第２抗体としてポリクローナル抗体を用
いることも可能である。
ーナル抗体は、ヒトＡＤＦに特異的に反応する抗体で、
エピトープが異なっていさえすれば、いかなる抗体を用
いてもよいし、第２抗体としてポリクローナル抗体を用
いることも可能である。
【００１９】また、本発明の抗ヒトＡＤＦモノクローナ
ル抗体をラテックスや動物の赤血球のような粒子に結合
させ、これと検体を反応させて、粒子の凝集を吸光度測
定等により測定することにより、検体中のヒトＡＤＦを
検出または測定することができる。更に本発明の抗ヒト
ＡＤＦモノクローナル抗体を含む溶液と検体とを反応さ
せ、その濁度変化を測定することにより、検体中のヒト
ＡＤＦを検出または測定することもできる。
ル抗体をラテックスや動物の赤血球のような粒子に結合
させ、これと検体を反応させて、粒子の凝集を吸光度測
定等により測定することにより、検体中のヒトＡＤＦを
検出または測定することができる。更に本発明の抗ヒト
ＡＤＦモノクローナル抗体を含む溶液と検体とを反応さ
せ、その濁度変化を測定することにより、検体中のヒト
ＡＤＦを検出または測定することもできる。
【００２０】なお、検体としては、ヒト由来の種々の体
液を挙げることができ、例えば、血清及び尿等を挙げる
ことができる。
液を挙げることができ、例えば、血清及び尿等を挙げる
ことができる。
【００２１】更に、本発明のモノクローナル抗体は、常
法に基づき組織免疫染色に用いることもできる。すなわ
ち、癌細胞においてヒトＡＤＦの発現が増大するので、
本発明の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体を用いて組織
免疫染色を行えば、癌の診断を行うことが可能である。
この方法は、特に上皮性癌及び腺癌すなわち、例えば、
咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、皮膚癌及び乳癌のよう
な扁平上皮癌、腎盂癌及び膀胱癌のような移行上皮癌、
並びに胃癌、胆嚢癌、膵臓癌、大腸癌、甲状腺癌、肺
癌、乳癌及び前立腺癌のような腺癌の診断に有効であ
る。
法に基づき組織免疫染色に用いることもできる。すなわ
ち、癌細胞においてヒトＡＤＦの発現が増大するので、
本発明の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体を用いて組織
免疫染色を行えば、癌の診断を行うことが可能である。
この方法は、特に上皮性癌及び腺癌すなわち、例えば、
咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、皮膚癌及び乳癌のよう
な扁平上皮癌、腎盂癌及び膀胱癌のような移行上皮癌、
並びに胃癌、胆嚢癌、膵臓癌、大腸癌、甲状腺癌、肺
癌、乳癌及び前立腺癌のような腺癌の診断に有効であ
る。
【００２２】また、本発明のモノクローナル抗体は、癌
の治療薬、及びウイルス感染症の治療薬としても有効で
ある。
の治療薬、及びウイルス感染症の治療薬としても有効で
ある。
【００２３】なお、上記において用いることのできる抗
体は、本モノクローナル抗体そのものでもよいが、酵素
により切断したＦ（ab')2 フラグメントやＦabフラグメ
ント、あるいは遺伝子操作によりＨ鎖とＬ鎖のＣ領域を
ヒト型に変換した抗体、Ｈ鎖とＬ鎖のＣ領域を除去し、
ペプチドリンカーにより１本鎖にした抗体、遺伝子操作
により酵素を結合させた抗体などを用いても構わない。
体は、本モノクローナル抗体そのものでもよいが、酵素
により切断したＦ（ab')2 フラグメントやＦabフラグメ
ント、あるいは遺伝子操作によりＨ鎖とＬ鎖のＣ領域を
ヒト型に変換した抗体、Ｈ鎖とＬ鎖のＣ領域を除去し、
ペプチドリンカーにより１本鎖にした抗体、遺伝子操作
により酵素を結合させた抗体などを用いても構わない。
【００２４】以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に
説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるもの
ではない。
説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるもの
ではない。
【００２５】
１．組換え体ヒトＡＤＦの調製 公知の方法（特開昭６４−８５０９７）に従い、組換え
体ヒトＡＤＦを調製した。すなわち、ヒトＡＤＦｃＤＮ
Ａを組み込んだプラスミドＤＮＡで大腸菌をトランスフ
ォームし、菌体内にヒトＡＤＦを発現させた。この大腸
菌培養液より菌体を集め、破砕後遠心し、その上清を回
収した後、硫安を加え９０％飽和として４℃で一晩放置
した。これにより生じた沈澱を遠心して回収し、２０ｍ
Ｍピペラジン−Ｃ１、ｐＨ６．０の緩衝液に溶解し、同
緩衝液に対して透析を行った。透析された液に５ｍＭに
なるようにジチオスレイトールを加え、４℃で一晩反応
させた後、あらかじめ２０ｍＭピペラジン−Ｃ１で平衡
化されたＱセファロースカラム（ファルマシア社製）に
かけ、０から１００ｍＭのＮａＣｌの勾配をかけ、Ｎａ
Ｃｌ濃度５５から７５ｍＭの分画を回収し、組換え体ヒ
トＡＤＦ標品を得た。２０リットルの大腸菌培養液か
ら、約１ｇの精製標品が得られた。この標品をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析したところ、分子量１２ｋＤの単一バン
ドを示した。また、ヒトＡＤＦを特徴づけるＩＬ−２レ
セプター発現誘導活性、活性酸素還元活性、変性蛋白質
賦活化活性も確認された。
体ヒトＡＤＦを調製した。すなわち、ヒトＡＤＦｃＤＮ
Ａを組み込んだプラスミドＤＮＡで大腸菌をトランスフ
ォームし、菌体内にヒトＡＤＦを発現させた。この大腸
菌培養液より菌体を集め、破砕後遠心し、その上清を回
収した後、硫安を加え９０％飽和として４℃で一晩放置
した。これにより生じた沈澱を遠心して回収し、２０ｍ
Ｍピペラジン−Ｃ１、ｐＨ６．０の緩衝液に溶解し、同
緩衝液に対して透析を行った。透析された液に５ｍＭに
なるようにジチオスレイトールを加え、４℃で一晩反応
させた後、あらかじめ２０ｍＭピペラジン−Ｃ１で平衡
化されたＱセファロースカラム（ファルマシア社製）に
かけ、０から１００ｍＭのＮａＣｌの勾配をかけ、Ｎａ
Ｃｌ濃度５５から７５ｍＭの分画を回収し、組換え体ヒ
トＡＤＦ標品を得た。２０リットルの大腸菌培養液か
ら、約１ｇの精製標品が得られた。この標品をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析したところ、分子量１２ｋＤの単一バン
ドを示した。また、ヒトＡＤＦを特徴づけるＩＬ−２レ
セプター発現誘導活性、活性酸素還元活性、変性蛋白質
賦活化活性も確認された。
【００２６】上記の組換え体ヒトＡＤＦ標品を、リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して一晩透析し、以下の
実施例に用いた。
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して一晩透析し、以下の
実施例に用いた。
【００２７】２．抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマの作製 組換え体ヒトＡＤＦ１００μｇをフロインド・コンプリ
ートアジュバントを用いてエマルジョンにし、８〜１０
週令ＢＡＬＢ／ｃ雄マウスの腹腔内に投与した。２週間
の間隔をおいて、更に３回、フロインド・インコンプリ
ートアジュバントとともに投与を繰り返した。最終免疫
は生理食塩水で希釈した組換え体ヒトＡＤＦ２５μｇを
尾静脈より注射し、３日後に脾臓を摘出した。単離した
脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
Ｕ１とを３：１の細胞数で混合し、５０％ポリエチレン
グリコール１５００を用いて細胞融合を行った。細胞は
ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプリテン、チミジン）
及び、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４
０培地に懸濁し、９６ウェルマイクロカルチャープレー
トに分注し培養した。約１０日後、ハイブリドーマが増
殖した培養上清を以下の方法により調べ、特異的なモノ
クローナル抗体を産生するクローンを含むウェルを選択
した。すなわち、ヒト組換え体ＡＤＦ抗原２μｇ／ｍｌ
をＰＢＳにて調製し、マイクロアッセイプレートに分
注、室温１時間放置し吸着させた。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳにより洗浄後、ハイブリドーマ培養
上清を各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。洗浄
後、パーオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン
（ＤＡＫＯ社製）を、１０００倍に希釈し、分注し、室
温にて１時間反応後、洗浄して基質（０．１％ＡＢＴ
Ｓ，０．０３１％過酸化水素含有０．１Ｍリン酸クエン
酸緩衝液（ｐＨ４）を加えた。１％シュウ酸を添加して
反応を停止させ、４０５ｎｍの吸収を測定した。陽性ウ
ェルの細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを
行った。単一コロニーを含むウェルの培養上清の抗体活
性を上記の方法で調べ、選択、培養し、ヒトＡＤＦに特
異的な抗体を産生するハイブリドーマＡＤＦ１１、及び
ＡＤＦ２１を樹立した。これらのハイブリドーマは微工
研に寄託されており、その受託番号はそれぞれ微工研菌
寄第１３０２５号及び第１３０２６号である。
ハイブリドーマの作製 組換え体ヒトＡＤＦ１００μｇをフロインド・コンプリ
ートアジュバントを用いてエマルジョンにし、８〜１０
週令ＢＡＬＢ／ｃ雄マウスの腹腔内に投与した。２週間
の間隔をおいて、更に３回、フロインド・インコンプリ
ートアジュバントとともに投与を繰り返した。最終免疫
は生理食塩水で希釈した組換え体ヒトＡＤＦ２５μｇを
尾静脈より注射し、３日後に脾臓を摘出した。単離した
脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
Ｕ１とを３：１の細胞数で混合し、５０％ポリエチレン
グリコール１５００を用いて細胞融合を行った。細胞は
ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプリテン、チミジン）
及び、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４
０培地に懸濁し、９６ウェルマイクロカルチャープレー
トに分注し培養した。約１０日後、ハイブリドーマが増
殖した培養上清を以下の方法により調べ、特異的なモノ
クローナル抗体を産生するクローンを含むウェルを選択
した。すなわち、ヒト組換え体ＡＤＦ抗原２μｇ／ｍｌ
をＰＢＳにて調製し、マイクロアッセイプレートに分
注、室温１時間放置し吸着させた。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳにより洗浄後、ハイブリドーマ培養
上清を各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。洗浄
後、パーオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン
（ＤＡＫＯ社製）を、１０００倍に希釈し、分注し、室
温にて１時間反応後、洗浄して基質（０．１％ＡＢＴ
Ｓ，０．０３１％過酸化水素含有０．１Ｍリン酸クエン
酸緩衝液（ｐＨ４）を加えた。１％シュウ酸を添加して
反応を停止させ、４０５ｎｍの吸収を測定した。陽性ウ
ェルの細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを
行った。単一コロニーを含むウェルの培養上清の抗体活
性を上記の方法で調べ、選択、培養し、ヒトＡＤＦに特
異的な抗体を産生するハイブリドーマＡＤＦ１１、及び
ＡＤＦ２１を樹立した。これらのハイブリドーマは微工
研に寄託されており、その受託番号はそれぞれ微工研菌
寄第１３０２５号及び第１３０２６号である。
【００２８】３．抗体のサブクラスの決定 これらの抗体サブクラスをオクタロニー法により決定し
た。すなわち、ハイブリドーマの培養上清をアガロース
ゲル平板上にあけた穴に加え、隣接した穴に配置したマ
ウスサブクラスに特異的な各種ウサギ抗血清（ＩＣＮ社
製）と反応させて沈降線を調べたところ、いずれもＩｇ
Ｇｌ（κ）であった。
た。すなわち、ハイブリドーマの培養上清をアガロース
ゲル平板上にあけた穴に加え、隣接した穴に配置したマ
ウスサブクラスに特異的な各種ウサギ抗血清（ＩＣＮ社
製）と反応させて沈降線を調べたところ、いずれもＩｇ
Ｇｌ（κ）であった。
【００２９】４．抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体の調
製 実施例１で得られたハイブリドーマＡＤＦ１１及びＡＤ
Ｆ２１細胞１×１０7個を、プリスタン０．５ｍｌ投与
後２週間のＢＡＬＢ／ｃマウスにそれぞれ接種した。約
１週間後、抗体を高濃度に含む腹水が貯留してくるので
それを採取した。この腹水を、２５ｍＭモルフォリンエ
タンスルフォン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．０）で４
倍以上に希釈し、２０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５．６）で平衡
化したベーカーボンドＡＢｘカラムに吸着させ、５００
ｍＭ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）によるグラジエントで溶出し、モノクロ
ーナル抗体を調製した。
製 実施例１で得られたハイブリドーマＡＤＦ１１及びＡＤ
Ｆ２１細胞１×１０7個を、プリスタン０．５ｍｌ投与
後２週間のＢＡＬＢ／ｃマウスにそれぞれ接種した。約
１週間後、抗体を高濃度に含む腹水が貯留してくるので
それを採取した。この腹水を、２５ｍＭモルフォリンエ
タンスルフォン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．０）で４
倍以上に希釈し、２０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５．６）で平衡
化したベーカーボンドＡＢｘカラムに吸着させ、５００
ｍＭ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）によるグラジエントで溶出し、モノクロ
ーナル抗体を調製した。
【００３０】５．イムノブロッティングによる特異性の
確認 組換え体ヒトＡＤＦ試料を、当量の試料希釈液（４０％
グリセリン、２％ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノー
ル、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液）と混合し、沸騰水中で
加熱した後、５〜１５％グラジエントゲルによるＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行い、これを更にニトロセルロース膜に転
写した。この転写膜を３％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキン
グし、抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体ＡＤＦ１１、及
びＡＤＦ２１を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ２
０−ＰＢＳによる洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウス免疫グロ
ブリンを室温で１時間反応させ、洗浄後、ＰＯＤ不溶性
基質（４−クロロナフトールー過酸化水素系）を加えて
発色させた。その結果、分子量１２ｋＤ付近にバンドを
生じ、これは同時に行った、金コロイド染色による蛋白
質のバンドと一致し、このモノクローナル抗体がヒトＡ
ＤＦを特異的に認識することを確認した。なお、本モノ
クローナル抗体は、大腸菌成分には反応しないことを確
認した。
確認 組換え体ヒトＡＤＦ試料を、当量の試料希釈液（４０％
グリセリン、２％ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノー
ル、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液）と混合し、沸騰水中で
加熱した後、５〜１５％グラジエントゲルによるＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行い、これを更にニトロセルロース膜に転
写した。この転写膜を３％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキン
グし、抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体ＡＤＦ１１、及
びＡＤＦ２１を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ２
０−ＰＢＳによる洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウス免疫グロ
ブリンを室温で１時間反応させ、洗浄後、ＰＯＤ不溶性
基質（４−クロロナフトールー過酸化水素系）を加えて
発色させた。その結果、分子量１２ｋＤ付近にバンドを
生じ、これは同時に行った、金コロイド染色による蛋白
質のバンドと一致し、このモノクローナル抗体がヒトＡ
ＤＦを特異的に認識することを確認した。なお、本モノ
クローナル抗体は、大腸菌成分には反応しないことを確
認した。
【００３１】６．標識抗原の作製 組換え体 ヒトＡＤＦを吉武からの方法（Ｅｕｒ．Ｊ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５−３９９，１９７９）
を用いて西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼで標識した。
標識された組換え体ヒトＡＤＦの濃度は波長２８０ｎｍ
と４０３ｎｍにおける吸光度を測定することにより５
２．４μｇ／ｍｌと決定した。該組換え体ヒトＡＤＦ１
分子当たりに導入された酵素分子は２分子であった。
ｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５−３９９，１９７９）
を用いて西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼで標識した。
標識された組換え体ヒトＡＤＦの濃度は波長２８０ｎｍ
と４０３ｎｍにおける吸光度を測定することにより５
２．４μｇ／ｍｌと決定した。該組換え体ヒトＡＤＦ１
分子当たりに導入された酵素分子は２分子であった。
【００３２】７．至適抗体感作量の決定 上記のように作成した標識組換え体ヒトＡＤＦを１００
ｎｇ／ｍｌの濃度となるように緩衝液で希釈し、検出用
の抗原として用いた。９６ウェルプレートへの抗体の感
作量の決定は以下の方法で行った。すなわち、抗ヒトＡ
ＤＦモノクローナル抗体ＡＤＦ２１を２８０ｎｍにおけ
る吸光度で０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、
０．１６となる濃度になるようにクエン酸緩衝液で希釈
し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルの割合で
加えた。４℃で一晩放置後、ＰＢＳで２回ウェルを洗浄
した。この後１％ＢＳＡを３００μｌ／ウェル加えて３
７℃一晩ブロッキングした後、ＰＢＳで３回洗浄し、測
定に用いた。
ｎｇ／ｍｌの濃度となるように緩衝液で希釈し、検出用
の抗原として用いた。９６ウェルプレートへの抗体の感
作量の決定は以下の方法で行った。すなわち、抗ヒトＡ
ＤＦモノクローナル抗体ＡＤＦ２１を２８０ｎｍにおけ
る吸光度で０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、
０．１６となる濃度になるようにクエン酸緩衝液で希釈
し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルの割合で
加えた。４℃で一晩放置後、ＰＢＳで２回ウェルを洗浄
した。この後１％ＢＳＡを３００μｌ／ウェル加えて３
７℃一晩ブロッキングした後、ＰＢＳで３回洗浄し、測
定に用いた。
【００３３】緩衝液で１００ｎｇ／ｍｌの濃度となるよ
うに希釈した標識組換え体ヒトＡＤＦを２００μｌ／ウ
ェル加え、室温で２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで４回ウェルを洗浄後、基質溶液
（ＡＢＴＳ）を１００μｌ／ウェルで加えて５分後の吸
光度（波長４１５ｎｍ）を測定した。結果を図１に示
す。図１のように抗体の固相への感作量は２８０ｎｍに
おける吸光度で０．０４以上の濃度であればヒトＡＤＦ
を効率よく測定することができる。
うに希釈した標識組換え体ヒトＡＤＦを２００μｌ／ウ
ェル加え、室温で２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで４回ウェルを洗浄後、基質溶液
（ＡＢＴＳ）を１００μｌ／ウェルで加えて５分後の吸
光度（波長４１５ｎｍ）を測定した。結果を図１に示
す。図１のように抗体の固相への感作量は２８０ｎｍに
おける吸光度で０．０４以上の濃度であればヒトＡＤＦ
を効率よく測定することができる。
【００３４】８．酵素標識抗体の作成 抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体を実施例６の方法と同
様に西洋ワサビ来ペルオキシダーゼで標識した。標識抗
体の濃度は１５１．８μｇ／ｍｌと決定した。該抗体１
分子当たりに導入された酵素分子は１分子であった。
様に西洋ワサビ来ペルオキシダーゼで標識した。標識抗
体の濃度は１５１．８μｇ／ｍｌと決定した。該抗体１
分子当たりに導入された酵素分子は１分子であった。
【００３５】９．ヒトＡＤＦの測定 組換え体ヒトＡＤＦを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で希釈して、それぞれ３、６、１２、２５、５０、
１００、２００ｎｇ／ｍｌの標準組換え体ヒトＡＤＦ溶
液を調製した。これを試料として用い、以下の方法で測
定した。
０）で希釈して、それぞれ３、６、１２、２５、５０、
１００、２００ｎｇ／ｍｌの標準組換え体ヒトＡＤＦ溶
液を調製した。これを試料として用い、以下の方法で測
定した。
【００３６】抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体を感作し
たプレートに標準組換え体ヒトＡＤＦ溶液２２０μｌを
加え、室温で２時間放置した。ＰＢＳで３回ウェルを洗
浄後５０ｍＭリン酸緩衝液で８０ｎｇ／ｍｌに希釈した
酵素標識抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体を２００μｌ
加えて更に２時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳで４回ウェルを洗浄後、基質溶液（ＡＢＴ
Ｓ）を１００μｌ／ウェルで加えて１時間後に吸光度
（波長４１５ｎｍ）を測定した。このようにして得られ
た検量線を図２に示す。この図からわかるように３から
２００ｎｇ／ｍｌまで直線性を示した。なお、組換え体
ヒトＡＤＦの最低検出濃度は３ｎｇ／ｍｌであった。
たプレートに標準組換え体ヒトＡＤＦ溶液２２０μｌを
加え、室温で２時間放置した。ＰＢＳで３回ウェルを洗
浄後５０ｍＭリン酸緩衝液で８０ｎｇ／ｍｌに希釈した
酵素標識抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体を２００μｌ
加えて更に２時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳで４回ウェルを洗浄後、基質溶液（ＡＢＴ
Ｓ）を１００μｌ／ウェルで加えて１時間後に吸光度
（波長４１５ｎｍ）を測定した。このようにして得られ
た検量線を図２に示す。この図からわかるように３から
２００ｎｇ／ｍｌまで直線性を示した。なお、組換え体
ヒトＡＤＦの最低検出濃度は３ｎｇ／ｍｌであった。
【００３７】１０．交差性物質の測定 ヒトＡＤＦの活性中心Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ｃｙｓ−Ｌｙｓと近似した部位を有する甲状腺刺激ホ
ルモンと膵臓由来及びダイズ由来トリプシンインヒビタ
ーの本測定系に及ぼす影響を検討した。両交差性物質の
濃度が１６ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／
ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌとなるように適当
な緩衝液を用いて調製し、これを検体として実施例９に
記載した方法により測定した。結果を表１に示す。表１
に示されるように、これらの交差性物質は上記の濃度範
囲で交差反応性はない。
−Ｃｙｓ−Ｌｙｓと近似した部位を有する甲状腺刺激ホ
ルモンと膵臓由来及びダイズ由来トリプシンインヒビタ
ーの本測定系に及ぼす影響を検討した。両交差性物質の
濃度が１６ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／
ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌとなるように適当
な緩衝液を用いて調製し、これを検体として実施例９に
記載した方法により測定した。結果を表１に示す。表１
に示されるように、これらの交差性物質は上記の濃度範
囲で交差反応性はない。
【００３８】
【表１】
【００３９】１１．測定系の希釈直線性 検体を種々の濃度に希釈し、実施例９に記載した方法に
より測定した。結果を表２に示す。表２より、本測定系
は検体の希釈直線性に優れていることがわかる。したが
って、検体は適当な緩衝液及び生理食塩水を用いて希釈
することができる。
より測定した。結果を表２に示す。表２より、本測定系
は検体の希釈直線性に優れていることがわかる。したが
って、検体は適当な緩衝液及び生理食塩水を用いて希釈
することができる。
【００４０】
【表２】
【００４１】１２．血清中のヒトＡＤＦの測定 実施例９に記載した方法により、健常人及び各種疾患を
有する患者の血清中ヒトＡＤＦ濃度を測定した。結果を
表３に示す。表３に示されるように、健常人の血清中ヒ
トＡＤＦ濃度は、１０．０±７．０ｎｇ／ｍｌであった
のに対し、胃癌においては、３８．８±１１．１ｎｇ／
ｍｌと高値に分布した。このように、ヒトＡＤＦが血清
中に存在することが見いだされたのは本発明が初めてで
あり、その意義は高い。
有する患者の血清中ヒトＡＤＦ濃度を測定した。結果を
表３に示す。表３に示されるように、健常人の血清中ヒ
トＡＤＦ濃度は、１０．０±７．０ｎｇ／ｍｌであった
のに対し、胃癌においては、３８．８±１１．１ｎｇ／
ｍｌと高値に分布した。このように、ヒトＡＤＦが血清
中に存在することが見いだされたのは本発明が初めてで
あり、その意義は高い。
【００４２】
【表３】 表３ 健常人及び各種疾患を有する患者の血中ＡＤＦ濃度の測定 ────────────────────────────── 平均値 ＳＤ ──────────────── 検体 例数 ｎｇ／ｍｌ ｎｇ／ｍｌ ────────────────────────────── 胃癌 ３０ ３８．８ １１．１ 肺癌 １９ ２５．７ １１．０ 乳癌 ２０ １７．３ １１．０ 肝癌 １８ ２１．８ １３．２ 肺癌 ２０ ３６．９ ３１．８ 肝癌 ２０ ４６．０ ２１．９ 肝硬変 ５ ２６．８ １０．９ 膵炎 ８ ３８．６ １５．４ 健常者 ４０ １０．０ ７．０ ──────────────────────────────
【００４３】１３．抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体に
よるヒトＡＤＦ活性の中和 抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体のヒトＡＤＦ活性の中
和能の測定は、抗体によるヒトＡＤＦのインシュリン還
元活性の阻害能を指標にして行った。
よるヒトＡＤＦ活性の中和 抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体のヒトＡＤＦ活性の中
和能の測定は、抗体によるヒトＡＤＦのインシュリン還
元活性の阻害能を指標にして行った。
【００４４】すなわち、分光光度計用セル（光路長１ｃ
ｍ、日立製作所社製）に、それぞれ最終濃度で０．２ｍ
ＭのＮＡＤＰＨ、Ｌｕｔｈｍａｎらの方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、２１巻、６６２８頁、１９８２年）に
よりラット肝臓から調製した０．２８μＭのチオレドキ
シン還元酵素、０．０７μＭの組換え体ヒトＡＤＦ、
０．１４ｍＭのウシ膵臓インシュリン（シグマ社製）、
２ｍＭのＥＤＴＡ、及び各濃度の抗ヒトＡＤＦモノクロ
ーナル抗体を添加した０．１Ｍトリス塩酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を入れ、経時的に３４０ｎｍの吸光度を測定
した。
ｍ、日立製作所社製）に、それぞれ最終濃度で０．２ｍ
ＭのＮＡＤＰＨ、Ｌｕｔｈｍａｎらの方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、２１巻、６６２８頁、１９８２年）に
よりラット肝臓から調製した０．２８μＭのチオレドキ
シン還元酵素、０．０７μＭの組換え体ヒトＡＤＦ、
０．１４ｍＭのウシ膵臓インシュリン（シグマ社製）、
２ｍＭのＥＤＴＡ、及び各濃度の抗ヒトＡＤＦモノクロ
ーナル抗体を添加した０．１Ｍトリス塩酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を入れ、経時的に３４０ｎｍの吸光度を測定
した。
【００４５】この系においては、ＮＡＤＰＨの減少量、
すなわち３４０ｎｍの吸光度の減少速度がインシュリン
の還元速度と正の相関を示し、ヒトＡＤＦ活性として表
される。従って、抗体によるヒトＡＤＦ活性の阻害能
は、３４０ｎｍの吸光度の減少速度の抑制として示すこ
とができる。
すなわち３４０ｎｍの吸光度の減少速度がインシュリン
の還元速度と正の相関を示し、ヒトＡＤＦ活性として表
される。従って、抗体によるヒトＡＤＦ活性の阻害能
は、３４０ｎｍの吸光度の減少速度の抑制として示すこ
とができる。
【００４６】その結果、表４に示すようにＡＤＦ１１抗
体、ＡＤＦ２１抗体とも抗体濃度依存的にヒトＡＤＦの
インシュリン還元活性を抑制することが明らかとなり、
両抗体がヒトＡＤＦの活性の中和能を有していることが
示された。なお、対照として用いたヒトＡＤＦを認識し
ないマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｌ、κ）では、
ヒトＡＤＦ活性の抑制はみられなかった。
体、ＡＤＦ２１抗体とも抗体濃度依存的にヒトＡＤＦの
インシュリン還元活性を抑制することが明らかとなり、
両抗体がヒトＡＤＦの活性の中和能を有していることが
示された。なお、対照として用いたヒトＡＤＦを認識し
ないマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｌ、κ）では、
ヒトＡＤＦ活性の抑制はみられなかった。
【００４７】
【表４】 ───────────────────────────── 相対ヒトＡＤＦ活性（％） ──────────────────── 抗体濃度（μＭ） ＡＤＦ１１ ＡＤＦ２１ 対照抗体 ───────────────────────────── ０ １００ １００ １０１ ０．０３ ７８ ７２ ９９ ０．０６ ５５ ４９ １０２ ０．１８ ５０ ４２ ９７ ０．５６ ４７ ４０ ９８ １．８０ ４５ ３８ ９９ ─────────────────────────────
【００４８】
【発明の効果】本発明の抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗
体を用いた、免疫化学的ヒトＡＤＦの定量法により、ヒ
ト体液中等に存在するヒトＡＤＦを高感度に定量するこ
とが初めて可能となった。本方法により癌、臓器障害、
ウイルス感染症などの疾患の診断が可能となる。また、
本抗体がヒトＡＤＦ活性の中和能を有していることか
ら、本抗体は癌の治療、ウイルス感染症の治療、更にヒ
トＡＤＦの過剰産生が原因となって発症する疾患の治療
薬として用いることができる。
体を用いた、免疫化学的ヒトＡＤＦの定量法により、ヒ
ト体液中等に存在するヒトＡＤＦを高感度に定量するこ
とが初めて可能となった。本方法により癌、臓器障害、
ウイルス感染症などの疾患の診断が可能となる。また、
本抗体がヒトＡＤＦ活性の中和能を有していることか
ら、本抗体は癌の治療、ウイルス感染症の治療、更にヒ
トＡＤＦの過剰産生が原因となって発症する疾患の治療
薬として用いることができる。
【図１】至適抗体感作量を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明のヒトＡＤＦの免疫化学的測定法によ
り、組換え体ヒトＡＤＦ試料を免疫測定して得られた検
量線を示す図である。
り、組換え体ヒトＡＤＦ試料を免疫測定して得られた検
量線を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉識 あけみ 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富 士レビオ株式会社内 (72)発明者 ▲島▼村 俊朗 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１丁目１番 地 味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 平川 忠 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１丁目１番 地 味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 羽室 淳爾 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１丁目１番 地 味の素株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 平２−201266（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−94694（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/574 G01N 33/577 C12N 15/06 - 15/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体を用い
た免疫化学的方法、あるいは免疫組織化学的方法により
検体中のヒトＡＤＦを測定する方法。 - 【請求項２】 免疫化学的方法が二抗体法である請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 抗ヒトＡＤＦモノクローナル抗体が、受
託番号FERM P-13025のハイブリドーマＡＤＦ１１株が産
生する抗体ＡＤＦ１１、及び／又は受託番号FERM P-130
26のハイブリドーマＡＤＦ２１株が産生する抗体ＡＤＦ
２１である請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 血中のヒトＡＤＦを測定する請求項１な
いし３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 受託番号FERM P-13025のハイブリドーマ
ＡＤＦ１１株が産生するモノクローナル抗体ＡＤＦ１
１。 - 【請求項６】 受託番号FERM P-13026のハイブリドーマ
ＡＤＦ２１株が産生するモノクローナル抗体ＡＤＦ２
１。 - 【請求項７】 請求項５又は６記載のモノクローナル抗
体を含む、請求項１記載の方法を実施するための試薬キ
ット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33802892A JP3323258B2 (ja) | 1992-11-25 | 1992-11-25 | 抗ヒトａｄｆモノクローナル抗体及びそれを用いたヒトａｄｆの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33802892A JP3323258B2 (ja) | 1992-11-25 | 1992-11-25 | 抗ヒトａｄｆモノクローナル抗体及びそれを用いたヒトａｄｆの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153982A JPH06153982A (ja) | 1994-06-03 |
| JP3323258B2 true JP3323258B2 (ja) | 2002-09-09 |
Family
ID=18314258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33802892A Expired - Lifetime JP3323258B2 (ja) | 1992-11-25 | 1992-11-25 | 抗ヒトａｄｆモノクローナル抗体及びそれを用いたヒトａｄｆの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3323258B2 (ja) |
-
1992
- 1992-11-25 JP JP33802892A patent/JP3323258B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06153982A (ja) | 1994-06-03 |
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