JP3302695B2 - ラクトフェリン遺伝子で形質転換された抗ウイルス性植物体の製造方法 - Google Patents
ラクトフェリン遺伝子で形質転換された抗ウイルス性植物体の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ラクトフェリンを生産する抗ウイルス性植
物体およびその製造方法に関する。さらに詳細には、ラ
クトフェリン（Lf）遺伝子で形質転換されラクトフェリ
ンを生産する抗ウイルス性植物体、およびラクトフェリ
ン遺伝子を含む発現ベクトルで植物体を形質転換させ、
形質転換された植物体を培養することを含む抗ウイルス
性植物体の製造方法に関する。
物体およびその製造方法に関する。さらに詳細には、ラ
クトフェリン（Lf）遺伝子で形質転換されラクトフェリ
ンを生産する抗ウイルス性植物体、およびラクトフェリ
ン遺伝子を含む発現ベクトルで植物体を形質転換させ、
形質転換された植物体を培養することを含む抗ウイルス
性植物体の製造方法に関する。
発明の背景技術 これまで、組換えDNA技術を用いてウイルス性感染に
対して抵抗性を有する植物（以下、抗ウイルス性植物体
という）を開発するために色々な試しが行われてきた。
たとえば、パウェル・アベル（Powell Abel）らは、ウ
イルスのコート蛋白質をコードするcDNAを植物に導入し
ており（Infect Immun.,35,792−796（1986））、一
方、欠陥のあるウイルス複製酵素（replicase）を植物
に導入することがアンダーソン（Anderson）らによって
試された（P.N.A.S.,89,8759−8763（1992））。しか
し、前記方法は、多数のウイルスに対する抗ウイルス性
を植物体に与えるために、すべての目標ウイルス遺伝子
を植物体に導入しなければならないので実用的ではな
い。
対して抵抗性を有する植物（以下、抗ウイルス性植物体
という）を開発するために色々な試しが行われてきた。
たとえば、パウェル・アベル（Powell Abel）らは、ウ
イルスのコート蛋白質をコードするcDNAを植物に導入し
ており（Infect Immun.,35,792−796（1986））、一
方、欠陥のあるウイルス複製酵素（replicase）を植物
に導入することがアンダーソン（Anderson）らによって
試された（P.N.A.S.,89,8759−8763（1992））。しか
し、前記方法は、多数のウイルスに対する抗ウイルス性
を植物体に与えるために、すべての目標ウイルス遺伝子
を植物体に導入しなければならないので実用的ではな
い。
このような問題を解決するため、ロッジ（Lodge）ら
は、抗ウイルス性蛋白質、たとえば、RIP（ribosome in
hibiting protein）をコードする遺伝子を植物体に導入
することによって植物体に全般的な抗ウイルス性を与え
る方法を報告した（P.N.A.S.,90,7089−7093（199
3））。前記方法によって形質転換された植物体は種々
のウイルスに対して抗ウイルス活性を示すが、前記抗ウ
イルス性蛋白質が人体に有害であり得るため前記方法の
適用が制限され得るという問題がある。
は、抗ウイルス性蛋白質、たとえば、RIP（ribosome in
hibiting protein）をコードする遺伝子を植物体に導入
することによって植物体に全般的な抗ウイルス性を与え
る方法を報告した（P.N.A.S.,90,7089−7093（199
3））。前記方法によって形質転換された植物体は種々
のウイルスに対して抗ウイルス活性を示すが、前記抗ウ
イルス性蛋白質が人体に有害であり得るため前記方法の
適用が制限され得るという問題がある。
ラクトフェリンは、哺乳動物において、たとえば、ヒ
トの乳汁、唾、涙、精液、白血球などにおいて発見され
る複合蛋白質である。ラクトフェリンは細胞の成長と分
化に影響を与え、抗菌および免疫増進作用をする（Arol
d et al.,Science,197,263−265（1977））。また、ラ
クトフェリンはフレンドウイルス（Friend virus）（Lu
et al.,Cancer Res.,47,4184−4188（1987））、ヒト
免疫不全ウイルス（HIV）およびヒトサイトメガロウイ
ルス（HCMV）（Meijer et al.,J.Disease,172,380−388
（1995））に対して抗ウイルス活性を示す。
トの乳汁、唾、涙、精液、白血球などにおいて発見され
る複合蛋白質である。ラクトフェリンは細胞の成長と分
化に影響を与え、抗菌および免疫増進作用をする（Arol
d et al.,Science,197,263−265（1977））。また、ラ
クトフェリンはフレンドウイルス（Friend virus）（Lu
et al.,Cancer Res.,47,4184−4188（1987））、ヒト
免疫不全ウイルス（HIV）およびヒトサイトメガロウイ
ルス（HCMV）（Meijer et al.,J.Disease,172,380−388
（1995））に対して抗ウイルス活性を示す。
ミトラ（Mitra）とジャン（Zhang）は、ヒトラクトフ
ェリンをコードするcDNAを植物体に導入することによっ
て抗菌活性を有する植物を製造する方法を報告した（Pl
ant Physiol.,106,977−981（1994））。彼らは、ヒト
ラクトフェリンcDNAで形質転換されたタバコ細胞および
抗−ヒトラクトフェリン抗体をウエスタン・ブロッティ
ング（western blotting）で分析することによって、タ
バコ細胞でヒトラクトフェリンが生産されることを確認
した。また、形質転換されたタバコ細胞の抽出物をタバ
コの病原性細胞、たとえば、シュードモナス（Pseudomo
nas sp.）の培養物に加える際、細胞の増殖が著しく抑
制されたことを確認した。しかし、ミトラおよびジャン
は、形質転換されたタバコ細胞から形質転換されたタバ
コ植物体を生産することはできなかった。さらに、形質
転換されたタバコ細胞で生産されたヒトラクトフェリン
は、ラクトフェリンの相当な部分が欠けているという欠
陥を有し、抗菌活性は生体外（in vitro）でのみ確認さ
れた。したがって、先行技術においては、形質転換され
たタバコ細胞をもって抗ウイルス性植物体を生産するこ
とができるか否かについての解答は与えられていない。
ェリンをコードするcDNAを植物体に導入することによっ
て抗菌活性を有する植物を製造する方法を報告した（Pl
ant Physiol.,106,977−981（1994））。彼らは、ヒト
ラクトフェリンcDNAで形質転換されたタバコ細胞および
抗−ヒトラクトフェリン抗体をウエスタン・ブロッティ
ング（western blotting）で分析することによって、タ
バコ細胞でヒトラクトフェリンが生産されることを確認
した。また、形質転換されたタバコ細胞の抽出物をタバ
コの病原性細胞、たとえば、シュードモナス（Pseudomo
nas sp.）の培養物に加える際、細胞の増殖が著しく抑
制されたことを確認した。しかし、ミトラおよびジャン
は、形質転換されたタバコ細胞から形質転換されたタバ
コ植物体を生産することはできなかった。さらに、形質
転換されたタバコ細胞で生産されたヒトラクトフェリン
は、ラクトフェリンの相当な部分が欠けているという欠
陥を有し、抗菌活性は生体外（in vitro）でのみ確認さ
れた。したがって、先行技術においては、形質転換され
たタバコ細胞をもって抗ウイルス性植物体を生産するこ
とができるか否かについての解答は与えられていない。
発明の概要 したがって、本発明の目的は、ラクトフェリンを生産
する抗ウイルス性植物体を提供することである。
する抗ウイルス性植物体を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗ウイルス性植物体を製造
する方法を提供することである。
する方法を提供することである。
本発明のまた他の目的は、植物体においてラクトフェ
リンを生産する方法を提供することである。
リンを生産する方法を提供することである。
本発明の一実施態様によって、ラクトフェリン（Lf）
遺伝子を含む発現ベクトルで植物体を形質転換させるこ
とを含む、ラクトフェリンを生産する抗ウイルス性植物
体の製造方法が提供される。
遺伝子を含む発現ベクトルで植物体を形質転換させるこ
とを含む、ラクトフェリンを生産する抗ウイルス性植物
体の製造方法が提供される。
図面の簡単な説明 本発明の前記およびその他の目的と特徴は添付の図面
とともに下記説明から明らかになる。
とともに下記説明から明らかになる。
図１は、ヒトラクトフェリン（HLf）遺伝子を含むプ
ラスミドpLSM1の構造を示し、 図２は、プラスミドpGA748およびpLSM1の制限酵素分
析結果を示し、 図３は、形質転換されたタバコ芽でHLf遺伝子を存在
を確認したPCR分析結果を示し、 図４は、形質転換されたタバコ植物体でHLf遺伝子の
存在を確認したサザン・ブロット（southern blot）分
析結果を示し、 図５は、形質転換されたタバコ植物体でHLf遺伝子の
発現を確認したのノーザン・ブロット（northern blo
t）分析結果を示し、 図６は、形質転換されたタバコ植物体でHLf遺伝子の
発現を確認した免疫ブロット（immuno blot）分析結果
を示し、 図７は、ウイルス感染から４週後形質転換されたタバ
コ植物体の抗ウイルス性を示し、 図８は、形質転換されたタバコ植物体の第１世代子孫
の抗ウイルス性を示す。
ラスミドpLSM1の構造を示し、 図２は、プラスミドpGA748およびpLSM1の制限酵素分
析結果を示し、 図３は、形質転換されたタバコ芽でHLf遺伝子を存在
を確認したPCR分析結果を示し、 図４は、形質転換されたタバコ植物体でHLf遺伝子の
存在を確認したサザン・ブロット（southern blot）分
析結果を示し、 図５は、形質転換されたタバコ植物体でHLf遺伝子の
発現を確認したのノーザン・ブロット（northern blo
t）分析結果を示し、 図６は、形質転換されたタバコ植物体でHLf遺伝子の
発現を確認した免疫ブロット（immuno blot）分析結果
を示し、 図７は、ウイルス感染から４週後形質転換されたタバ
コ植物体の抗ウイルス性を示し、 図８は、形質転換されたタバコ植物体の第１世代子孫
の抗ウイルス性を示す。
発明の詳細な説明 本発明は、ラクトフェリンを生産する抗ウイルス性植
物体および、ラクトフェリン（Lf）遺伝子を含む発現ベ
クトルで植物体を形質転換させ、適当な培地を用いて形
質転換された植物体を培養することを含む、抗ウイルス
性植物体の製造方法を提供する。
物体および、ラクトフェリン（Lf）遺伝子を含む発現ベ
クトルで植物体を形質転換させ、適当な培地を用いて形
質転換された植物体を培養することを含む、抗ウイルス
性植物体の製造方法を提供する。
本発明のラクトフェリン遺伝子は、哺乳動物ラクトフ
ェリン遺伝子中のいずれか一つであり得、好ましくは、
ヒトラクトフェリン遺伝子（HLf）である。ラクトフェ
リン遺伝子は、ラクトフェリン遺伝子の公知のヌクレオ
チド配列を用いて通常の化学的DNA合成方法に従って製
造し得る。たとえば、HLf遺伝子はパルェルおよびオグ
デン（Powell and Ogden,Nucleic Acids Research,18,4
013（1990））によって開示されたHLf遺伝子のヌクレオ
チド配列を用いて化学的に合成できる。また、本発明の
ラクトフェリン遺伝子は、この遺伝子を含むプラスミド
を適切な制限酵素で切断することによって得られ、ヒト
ラクトフェリン遺伝子の場合は、たとえば、プラスミド
pBSKにHLf遺伝子が挿入されたプラスミドpBHL−１（Yon
g−Yeon Cho,Cloning of Human Lactoferrin Gene and
Its Polymorphism in Normal and Cancer Cells,August
1993,大韓民国忠南大学生物学科理学修士論文）を適切
な制限酵素で切断することによって得ることができる。
ェリン遺伝子中のいずれか一つであり得、好ましくは、
ヒトラクトフェリン遺伝子（HLf）である。ラクトフェ
リン遺伝子は、ラクトフェリン遺伝子の公知のヌクレオ
チド配列を用いて通常の化学的DNA合成方法に従って製
造し得る。たとえば、HLf遺伝子はパルェルおよびオグ
デン（Powell and Ogden,Nucleic Acids Research,18,4
013（1990））によって開示されたHLf遺伝子のヌクレオ
チド配列を用いて化学的に合成できる。また、本発明の
ラクトフェリン遺伝子は、この遺伝子を含むプラスミド
を適切な制限酵素で切断することによって得られ、ヒト
ラクトフェリン遺伝子の場合は、たとえば、プラスミド
pBSKにHLf遺伝子が挿入されたプラスミドpBHL−１（Yon
g−Yeon Cho,Cloning of Human Lactoferrin Gene and
Its Polymorphism in Normal and Cancer Cells,August
1993,大韓民国忠南大学生物学科理学修士論文）を適切
な制限酵素で切断することによって得ることができる。
ラクトフェリン遺伝子の特性および機能を実質的に同
一に維持する限り、ラクトフェリン遺伝子のヌクレオチ
ド配列において任意のヌクレオチド置換、または添加が
行われ得る。
一に維持する限り、ラクトフェリン遺伝子のヌクレオチ
ド配列において任意のヌクレオチド置換、または添加が
行われ得る。
一方、ラクトフェリン遺伝子を含む発現ベクトルは、
たとえば、目的とする宿主植物細胞の適合性に基づい
て、公知のベクトルから選ばれ得る適当なベクトルに遺
伝子を挿入することによって通常のDNA操作技術に従っ
て製造できる。たとえば、プラスミドpBHL−１をHind I
IIおよびBamH Iで切断して製造したHLf遺伝子を調節可
能なCaM V（cauliflower mosaic virus）35Sプロモータ
ーを含む植物ベクトル、たとえば、プラスミドpGA748
（Pap.Am.Chem.Soc.,205（1993））のHind III/Bgl II
切断部位に挿入してプラスミドpLSM1を製造できる。
たとえば、目的とする宿主植物細胞の適合性に基づい
て、公知のベクトルから選ばれ得る適当なベクトルに遺
伝子を挿入することによって通常のDNA操作技術に従っ
て製造できる。たとえば、プラスミドpBHL−１をHind I
IIおよびBamH Iで切断して製造したHLf遺伝子を調節可
能なCaM V（cauliflower mosaic virus）35Sプロモータ
ーを含む植物ベクトル、たとえば、プラスミドpGA748
（Pap.Am.Chem.Soc.,205（1993））のHind III/Bgl II
切断部位に挿入してプラスミドpLSM1を製造できる。
次いで、通常の方法、たとえば、ホルスタース（Hols
ters）らの凍結乾燥法（Mol.Gen.Genet.,163,181−187
（1978））に従って、前記で製造された発現ベクトルで
アグロバクター（Agrobacterium sp.）を形質転換させ
る。形質転換されたアグロバクターはさらに、たとえ
ば、ロバート（Robert,B.H.）らによって記述されたア
グロバクターが介在する形質転換方法（Plant Molecula
r Biology Manual,A42,1−９（1988））を用いて植物細
胞を形質転換させる。
ters）らの凍結乾燥法（Mol.Gen.Genet.,163,181−187
（1978））に従って、前記で製造された発現ベクトルで
アグロバクター（Agrobacterium sp.）を形質転換させ
る。形質転換されたアグロバクターはさらに、たとえ
ば、ロバート（Robert,B.H.）らによって記述されたア
グロバクターが介在する形質転換方法（Plant Molecula
r Biology Manual,A42,1−９（1988））を用いて植物細
胞を形質転換させる。
次いで、生成された形質転換細胞を適切な培地、たと
えば、BAP（６−ベンジルアミノプリン）、NAA（ナフタ
レン酢酸）およびカナマイシンを含有するMS（Murashig
e and Skoog）培地（Physiol,Plant.,15,473−497（196
2））を用いて培養できる。この培地は、形質転換され
た植物細胞から芽の成長を誘導する。次いで誘導された
芽をカナマイシンを含有するMS培地を用いてさらに培養
することによって根を誘導できる。根を有する、生成し
た形質転換植物体の芽の土壌に移植してウイルス感染に
対して抵抗性を有する完全な植物体を得る。
えば、BAP（６−ベンジルアミノプリン）、NAA（ナフタ
レン酢酸）およびカナマイシンを含有するMS（Murashig
e and Skoog）培地（Physiol,Plant.,15,473−497（196
2））を用いて培養できる。この培地は、形質転換され
た植物細胞から芽の成長を誘導する。次いで誘導された
芽をカナマイシンを含有するMS培地を用いてさらに培養
することによって根を誘導できる。根を有する、生成し
た形質転換植物体の芽の土壌に移植してウイルス感染に
対して抵抗性を有する完全な植物体を得る。
本発明に用いるに適当な植物はナス科（Solanaceae）
に属した植物、たとえば、タバコを含む。
に属した植物、たとえば、タバコを含む。
本発明で製造された抗ウイルス性植物は完全なラクト
フェリンを生産し、ククモウイルス（cucumovirus）、
たとえばCMV（タバコモザイクウイルス）に対して抗ウ
イルス活性を示す。
フェリンを生産し、ククモウイルス（cucumovirus）、
たとえばCMV（タバコモザイクウイルス）に対して抗ウ
イルス活性を示す。
したがって、本発明は、ラクトフェリン遺伝子を含む
発現ベクトルで形質転換された植物を培養することを含
む、植物体でラクトフェリンを生産する方法をさらに提
供する。
発現ベクトルで形質転換された植物を培養することを含
む、植物体でラクトフェリンを生産する方法をさらに提
供する。
たとえば、ヒトラクトフェリンは、ヒトラクトフェリ
ン遺伝子を含む発現ベクトル、たとえば、プラスミドpL
SM1で形質転換された植物体を培養することによって大
量に生産できる。
ン遺伝子を含む発現ベクトル、たとえば、プラスミドpL
SM1で形質転換された植物体を培養することによって大
量に生産できる。
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのも
のであり、本発明の範囲を制限しない。
のであり、本発明の範囲を制限しない。
また、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液
体中の固体に対して下記の百分率は、別に言及しない限
り、wt/wt、vol/vol、およびwt/Vol基準である。
体中の固体に対して下記の百分率は、別に言及しない限
り、wt/wt、vol/vol、およびwt/Vol基準である。
実施例1:ヒトラクトフェリンを生産する形質転換された
タバコの製造 （ステップ１） ヒト乳腺組織cDNAライブラリ（Clontech,U.S.A.）か
ら単離した、3'および5'UTRs（非翻訳領域）を含むヒト
ラクトフェリン（HLf）遺伝子（GenBank登録番号:UO764
2）をプラスミドpBluescript II SK（pBSK,Promega,U.
S.A.）のEcoR I部位にサブクローニングしてpBHL−１
（Yong−Yeon Cho,前記文献参照）と命名されたプラス
ミドを製造した。
タバコの製造 （ステップ１） ヒト乳腺組織cDNAライブラリ（Clontech,U.S.A.）か
ら単離した、3'および5'UTRs（非翻訳領域）を含むヒト
ラクトフェリン（HLf）遺伝子（GenBank登録番号:UO764
2）をプラスミドpBluescript II SK（pBSK,Promega,U.
S.A.）のEcoR I部位にサブクローニングしてpBHL−１
（Yong−Yeon Cho,前記文献参照）と命名されたプラス
ミドを製造した。
プラスミドpBHL−１を制限酵素Hind IIIおよびBamH I
で切断して2.4kb HLf遺伝子を得た。HLf遺伝子を、プラ
スミドpGA748（Pap,Am.Chem.Soc.,205（1993））のCaMV
（cauliflower mosaic virus）35Sプロモーター部位の
下流に位置したHind III/Bgl II切断部位に挿入した。
生成したプラスミドはpLSM1と命名し、その構造を図１
に示しているが、図１においてNPT IIはカナマイシン抵
抗性遺伝子を示し、35SはCaMV35Sプロモータを示し、HL
fはヒトラクトフェリン遺伝子を示す。
で切断して2.4kb HLf遺伝子を得た。HLf遺伝子を、プラ
スミドpGA748（Pap,Am.Chem.Soc.,205（1993））のCaMV
（cauliflower mosaic virus）35Sプロモーター部位の
下流に位置したHind III/Bgl II切断部位に挿入した。
生成したプラスミドはpLSM1と命名し、その構造を図１
に示しているが、図１においてNPT IIはカナマイシン抵
抗性遺伝子を示し、35SはCaMV35Sプロモータを示し、HL
fはヒトラクトフェリン遺伝子を示す。
プラスミドpLSM1を用いてCaCl2方法（Cohen et al.,
P.N.A.S.,69,2110（1972））に従って大腸菌DH5α（Clo
ntech）を形質転換させた。プラスミドpLSM1で形質転換
された大腸菌DH5αは特許手続上の微生物寄託の国際的
承認に関するブダペスト条約の規定下に1995年５月10日
付で韓国遺伝子銀行（KCTC）（住所：大韓民国305−306
大田広域市儒城区P.O.Box115,KIST,GERI）に寄託番号第
KCTC 0159BP号として寄託された。
P.N.A.S.,69,2110（1972））に従って大腸菌DH5α（Clo
ntech）を形質転換させた。プラスミドpLSM1で形質転換
された大腸菌DH5αは特許手続上の微生物寄託の国際的
承認に関するブダペスト条約の規定下に1995年５月10日
付で韓国遺伝子銀行（KCTC）（住所：大韓民国305−306
大田広域市儒城区P.O.Box115,KIST,GERI）に寄託番号第
KCTC 0159BP号として寄託された。
制限酵素の分析結果は図２に示すが、ここでプラスミ
ドpGA748をEcoR IとHind IIIで切断したとき、11.6kb D
NA断片が観察され（レイン１）、プラスミドpLSM1をEco
R IおよびHind IIIで切断したとき、11.8kb DNA断片お
よびさらに2.2kb DNAが観察され（レイン２）、プラス
ミドpLSM1をHLf遺伝子断片内に切断部位を有するBgl II
で切断したとき制限酵素地図から予想できるように、1
3.4kbおよび0.6kb DNA断片が観察される（レイン３）。
レインＭは標準DNAサイズ標識を示す。
ドpGA748をEcoR IとHind IIIで切断したとき、11.6kb D
NA断片が観察され（レイン１）、プラスミドpLSM1をEco
R IおよびHind IIIで切断したとき、11.8kb DNA断片お
よびさらに2.2kb DNAが観察され（レイン２）、プラス
ミドpLSM1をHLf遺伝子断片内に切断部位を有するBgl II
で切断したとき制限酵素地図から予想できるように、1
3.4kbおよび0.6kb DNA断片が観察される（レイン３）。
レインＭは標準DNAサイズ標識を示す。
（ステップ２） プラスミドpLSM1をアグロバクター（Agrobacterium）
LBA4404（Clontech,U.S.A.）にホルスタース（Holster
s）らの凍結−解凍方法（Mol.Gen.Genet.,163,181−187
（1978））に従って導入した。生成された形質転換され
たアグロバクターLBA4404をタバコ（Nicotiana tobacum
L.Wisconsin 38）の葉片とともに共同培養法（Horsch
et al.,Science,227,1229−1231（1985））に従って培
養してタバコ葉をHLf遺伝子で形質転換させた。
LBA4404（Clontech,U.S.A.）にホルスタース（Holster
s）らの凍結−解凍方法（Mol.Gen.Genet.,163,181−187
（1978））に従って導入した。生成された形質転換され
たアグロバクターLBA4404をタバコ（Nicotiana tobacum
L.Wisconsin 38）の葉片とともに共同培養法（Horsch
et al.,Science,227,1229−1231（1985））に従って培
養してタバコ葉をHLf遺伝子で形質転換させた。
形質転換された葉片を芽誘導培地、すなわち、BAP
（６−benzylaminopurine）0.1mg/l、NAA（naphthalene
acetic acid）1.0mg/lおよびカナマイシン150μg/mlを
含むMS（Murashige and Skoog）培地（Physiol.Plant,1
5,473−497（1962））で培養した。カナマイシンに抵抗
性を有する選別された芽をカナマイシン200μg/mlを含
有するMS培地でさらに培養して根を有するタバコ植物体
を得た。
（６−benzylaminopurine）0.1mg/l、NAA（naphthalene
acetic acid）1.0mg/lおよびカナマイシン150μg/mlを
含むMS（Murashige and Skoog）培地（Physiol.Plant,1
5,473−497（1962））で培養した。カナマイシンに抵抗
性を有する選別された芽をカナマイシン200μg/mlを含
有するMS培地でさらに培養して根を有するタバコ植物体
を得た。
（ステップ３） 前記で製造されたタバコ芽がHLf遺伝子を含むか否か
を調査するために、タバコの葉片各100mg、およびパウ
ェルおよびオグデン（前記文献参照）によって記述され
たヌクレオチド配列に基づいて合成したプライマー１
（5'−AGTGGCTTGAGCGAAGG−3'）と２（T'−GGCCGCGGTTT
TACTTCCTGAGG−3'）を用いて、エドワード（Edward）ら
によって記述された方法（Nucleic Acids Res.,19、134
9（1991））に従って重合酵素連鎖反応（PCR）を行っ
た。その結果を図３に示す。
を調査するために、タバコの葉片各100mg、およびパウ
ェルおよびオグデン（前記文献参照）によって記述され
たヌクレオチド配列に基づいて合成したプライマー１
（5'−AGTGGCTTGAGCGAAGG−3'）と２（T'−GGCCGCGGTTT
TACTTCCTGAGG−3'）を用いて、エドワード（Edward）ら
によって記述された方法（Nucleic Acids Res.,19、134
9（1991））に従って重合酵素連鎖反応（PCR）を行っ
た。その結果を図３に示す。
図３から分かるように、試験した植物体12個中のうち
９戸において1kbサイズのPCRバンドが確認され、ここ
で、レイン１ないしレイン12は形質転換されたタバコ植
物体を示し、レインＣは形質転換されていないタバコ植
物体を示し、＋はプラスミドpLSM1であり、レインＭは
標準DNAサイズ標識である。
９戸において1kbサイズのPCRバンドが確認され、ここ
で、レイン１ないしレイン12は形質転換されたタバコ植
物体を示し、レインＣは形質転換されていないタバコ植
物体を示し、＋はプラスミドpLSM1であり、レインＭは
標準DNAサイズ標識である。
（ステップ４） ステップ３で確認された形質転換体を土壌に移植し、
25℃、16時間／一日の光周期条件の下で２ないし４週間
成長させた。各植物体の葉試料1gを粉砕した後、変形し
たシュアー（Shure）の方法（Cell,35、225−233（198
5））に従ってそれからゲノムDNAを分離した。また、全
RNAは、CsClを用いる変形されたサムブルーク（Sambroo
k）の方法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2
nd Ed.,pp7.19−7.22,1989,Cold Spring Harbor Labora
tory Press,New York,U.S.A.）に従ってゲノムDNAから
分離した。
25℃、16時間／一日の光周期条件の下で２ないし４週間
成長させた。各植物体の葉試料1gを粉砕した後、変形し
たシュアー（Shure）の方法（Cell,35、225−233（198
5））に従ってそれからゲノムDNAを分離した。また、全
RNAは、CsClを用いる変形されたサムブルーク（Sambroo
k）の方法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2
nd Ed.,pp7.19−7.22,1989,Cold Spring Harbor Labora
tory Press,New York,U.S.A.）に従ってゲノムDNAから
分離した。
各タバコ植物体から得られた各々のゲノムDNA10μｇ
をHind IIIで切断した後、0.8％アガロースゲル上で電
気泳動した。各タバコ植物体から得られた全RNA40μｇ
をホルムアルデヒド（Formaldehyde）を含有１％アガロ
ースゲル（agarose gel）上で電気泳動した。
をHind IIIで切断した後、0.8％アガロースゲル上で電
気泳動した。各タバコ植物体から得られた全RNA40μｇ
をホルムアルデヒド（Formaldehyde）を含有１％アガロ
ースゲル（agarose gel）上で電気泳動した。
アガロースゲル上で分離されたゲノムDNAおよび全RNA
を各々ナイトラン膜（Nytran membrane,Schleicher ＆
Schuell,ドイツ）に移し、32P−標識されたHLf cDNAを
プローブ（probe）として用いてサザンおよびノーザン
・ブロット分析を行った。サザンブロット分析結果、HL
f遺伝子がタバコのゲノムDNAに挿入されたことが確認さ
れた（図４）。図４において、レイン１ないし14は形質
転換体に該当し、Coは形質転換されていないタバコに該
当する。また、ノーザン・ブロット分析結果によってHL
f遺伝子が形質転換体内で発現されることが確認された
が；総９個の形質転換体のうち８個において色々な量の
2.3kb転写物（Transcript）が観察された（図５）。図
５において、レイン１ないし９は形質転換体に該当し、
Coは形質転換されていないタバコに該当する。
を各々ナイトラン膜（Nytran membrane,Schleicher ＆
Schuell,ドイツ）に移し、32P−標識されたHLf cDNAを
プローブ（probe）として用いてサザンおよびノーザン
・ブロット分析を行った。サザンブロット分析結果、HL
f遺伝子がタバコのゲノムDNAに挿入されたことが確認さ
れた（図４）。図４において、レイン１ないし14は形質
転換体に該当し、Coは形質転換されていないタバコに該
当する。また、ノーザン・ブロット分析結果によってHL
f遺伝子が形質転換体内で発現されることが確認された
が；総９個の形質転換体のうち８個において色々な量の
2.3kb転写物（Transcript）が観察された（図５）。図
５において、レイン１ないし９は形質転換体に該当し、
Coは形質転換されていないタバコに該当する。
（ステップ５） 選別された形質転換タバコ植物体の葉試料100mgを粉
砕した後、1mMフェニルスルホニルフルオリド（PMSF）
を含有するリン酸塩緩衝食塩水（PBS）に懸濁した。生
成した懸濁液を12,000rpmで10分間遠心分離して水溶性
蛋白質を含有する上澄液を得た。
砕した後、1mMフェニルスルホニルフルオリド（PMSF）
を含有するリン酸塩緩衝食塩水（PBS）に懸濁した。生
成した懸濁液を12,000rpmで10分間遠心分離して水溶性
蛋白質を含有する上澄液を得た。
水溶性蛋白質各50μｇまたは100μｇを用いてラムリ
（Laemmli）の方法（Nature,227,680（1970））に従っ
て10％SDS−PAGEを行った。ゲル上でサイズ別に分離し
た蛋白質を電気泳動転写機（electrophoretic transfer
rer,Bio−Rad）を使ってニトロセルロース膜（Hoefer）
に移した。この膜を３％ウシ血清アルブミン（BSA）を
含有するトリス緩衝食塩水（Tris−buffered Saline、T
BS）に入れて膜の非結合部位を封鎖した。１％ウシ血清
アルブミン（BSA）を含有するTBS中の抗HLf抗体（Sigm
a）300ngを膜に加え、室温で２時間反応させて蛋白質を
抗体と結合させた。
（Laemmli）の方法（Nature,227,680（1970））に従っ
て10％SDS−PAGEを行った。ゲル上でサイズ別に分離し
た蛋白質を電気泳動転写機（electrophoretic transfer
rer,Bio−Rad）を使ってニトロセルロース膜（Hoefer）
に移した。この膜を３％ウシ血清アルブミン（BSA）を
含有するトリス緩衝食塩水（Tris−buffered Saline、T
BS）に入れて膜の非結合部位を封鎖した。１％ウシ血清
アルブミン（BSA）を含有するTBS中の抗HLf抗体（Sigm
a）300ngを膜に加え、室温で２時間反応させて蛋白質を
抗体と結合させた。
この膜をTBSで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ（a
lkaline posphatase）で示されたヤギ抗−ヒトIgG（Sig
ma Co.,U.S.A.）を10,000倍体積の１％BSAを含有するTB
Sで希釈して製造した抗−ヒト抗体溶液に入れ、室温で
1.5時間反応させた。膜をTBSで完全に洗浄し、これに、
BCIP/NBT（５−bromo−４−Chloro−３−indolylphosph
ate/nitro blue tetrozorium）溶液10mlを加えた。生成
物を室温で10分間反応させて発色反応を行った。
lkaline posphatase）で示されたヤギ抗−ヒトIgG（Sig
ma Co.,U.S.A.）を10,000倍体積の１％BSAを含有するTB
Sで希釈して製造した抗−ヒト抗体溶液に入れ、室温で
1.5時間反応させた。膜をTBSで完全に洗浄し、これに、
BCIP/NBT（５−bromo−４−Chloro−３−indolylphosph
ate/nitro blue tetrozorium）溶液10mlを加えた。生成
物を室温で10分間反応させて発色反応を行った。
図６の結果は、すべての形質転換体がラクトフェリン
を生産するが、形質転換されていないタバコではラクト
フェリンが生産されないことを示す。図６において、レ
イン１ないし３は100μｇの蛋白質試料を用いて得た結
果であり、レイン４ないし６は50μｇの蛋白質を用いて
得た結果である。さらに、レイン１および４は形質転換
されていないタバコに該当し、レイン２、３、５および
６は形質転換されたタバコを示す。形質転換されたタバ
コ植物体は、ヒトラクトフェリン（Sigma）と同じサイ
ズの80kDa蛋白質だけでなく、38または42kDaラクトフェ
リン断片も生産する。
を生産するが、形質転換されていないタバコではラクト
フェリンが生産されないことを示す。図６において、レ
イン１ないし３は100μｇの蛋白質試料を用いて得た結
果であり、レイン４ないし６は50μｇの蛋白質を用いて
得た結果である。さらに、レイン１および４は形質転換
されていないタバコに該当し、レイン２、３、５および
６は形質転換されたタバコを示す。形質転換されたタバ
コ植物体は、ヒトラクトフェリン（Sigma）と同じサイ
ズの80kDa蛋白質だけでなく、38または42kDaラクトフェ
リン断片も生産する。
実施例2:形質転換体の抗ウイルス活性 （ステップ１）:CMV−Ｙウイルスを用いた１次ウイルス
感染 形質転換されていない葉片から誘導された３個のタバ
コ植物体、pGA748で形質転換された１個のタバコ植物体
およびpLSM1で形質転換された３個のタバコ植物体を土
壌に移植し、実施例１のステップ４と同様な条件の下で
成長させた。
感染 形質転換されていない葉片から誘導された３個のタバ
コ植物体、pGA748で形質転換された１個のタバコ植物体
およびpLSM1で形質転換された３個のタバコ植物体を土
壌に移植し、実施例１のステップ４と同様な条件の下で
成長させた。
移植してから４週後、各植物体の幼葉１個をカーボラ
ンダム（caborundum）粉末で傷つけ、CMV−Ｙウイルス
（J.GEN.Virol.,74（１）319−322（1993））を含有す
るタバコ葉懸濁液を用いて葉脈に沿って感染させた後、
水で洗浄してカーボランダム粉末を除いた。ウイルス感
染から７日後、形質転換されていない植物体１個が褪緑
（chlorosis）、壊死（necrosis）および全身感染（sys
temic infection）のような病症を示したが、その他の
すべてのタバコ植物体はウイルス感染後４週以上健康で
あった。
ンダム（caborundum）粉末で傷つけ、CMV−Ｙウイルス
（J.GEN.Virol.,74（１）319−322（1993））を含有す
るタバコ葉懸濁液を用いて葉脈に沿って感染させた後、
水で洗浄してカーボランダム粉末を除いた。ウイルス感
染から７日後、形質転換されていない植物体１個が褪緑
（chlorosis）、壊死（necrosis）および全身感染（sys
temic infection）のような病症を示したが、その他の
すべてのタバコ植物体はウイルス感染後４週以上健康で
あった。
（ステップ２）:CMV−Ｙウイルスを用いた２次ウイルス
感染 ステップ１で健康な状態で残った６個のタバコ植物体
をステップ１と同様な手順に従ってCMV−Ｙウイルス10
μg/mlで２次感染させた。感染してから３日後、形質転
換されていないタバコ植物体２個のうち１個とプラスミ
ドpGA748で形質転換されたタバコ植物体において追加の
病症が観察されたが、形質転換されていないタバコ植物
体のうち残りの１個とプラスミドpLSM1で形質転換され
た３個のタバコ植物体は２次感染から２週後にもすべて
健康であった。
感染 ステップ１で健康な状態で残った６個のタバコ植物体
をステップ１と同様な手順に従ってCMV−Ｙウイルス10
μg/mlで２次感染させた。感染してから３日後、形質転
換されていないタバコ植物体２個のうち１個とプラスミ
ドpGA748で形質転換されたタバコ植物体において追加の
病症が観察されたが、形質転換されていないタバコ植物
体のうち残りの１個とプラスミドpLSM1で形質転換され
た３個のタバコ植物体は２次感染から２週後にもすべて
健康であった。
（ステップ３）:CMV−Ｙウイルスを用いた３次ウイルス
感染 ステップ２で健康な状態で残った形質転換されていな
いタバコ植物体１個とpLSM1で形質転換されたタバコ植
物体３個とを、ステップ１と同様な手順に従ってCMV−
Ｙウイルス10μg/mlで３次感染させた。ウイルスを感染
させてから３日後、形質転換されていないタバコ植物体
において追加の病症が観察されたが、pLSM1で形質転換
された３個のタバコ植物体は３次感染から２週後にも健
康であり、それらの成長速度は感染されていないタバコ
植物体と同様であった（図７）。図７において、１は形
質転換されていないタバコ植物体を示し、２はプラスミ
ドpGA748で形質転換されたタバコ植物体を示し、３はプ
ラスミドpLSM1で形質転換されたタバコ植物体を各々示
す。
感染 ステップ２で健康な状態で残った形質転換されていな
いタバコ植物体１個とpLSM1で形質転換されたタバコ植
物体３個とを、ステップ１と同様な手順に従ってCMV−
Ｙウイルス10μg/mlで３次感染させた。ウイルスを感染
させてから３日後、形質転換されていないタバコ植物体
において追加の病症が観察されたが、pLSM1で形質転換
された３個のタバコ植物体は３次感染から２週後にも健
康であり、それらの成長速度は感染されていないタバコ
植物体と同様であった（図７）。図７において、１は形
質転換されていないタバコ植物体を示し、２はプラスミ
ドpGA748で形質転換されたタバコ植物体を示し、３はプ
ラスミドpLSM1で形質転換されたタバコ植物体を各々示
す。
実施例3:形質転換体の１世代子孫の抗ウイルス活性 プラスミドpLSM1またはpGA748で形質転換されたタバ
コ植物体を自家受粉して種子を得た後、カナマイシン15
0μg/mlを含有するMS培地上で成長した形質転換体を選
別した。プラスミドpLSM1で形質転換され、図４の１列
および３列で現れたHLf遺伝子１コピーを有すると見な
されるタバコ植物体は、カナマイシン耐性およびカナマ
イシン感受性子孫を各々140:48および90:30の比率で生
産した。この結果は、抗ウイルス性がメンデルの法則に
よって3:1の比率で遺伝されることを示す。
コ植物体を自家受粉して種子を得た後、カナマイシン15
0μg/mlを含有するMS培地上で成長した形質転換体を選
別した。プラスミドpLSM1で形質転換され、図４の１列
および３列で現れたHLf遺伝子１コピーを有すると見な
されるタバコ植物体は、カナマイシン耐性およびカナマ
イシン感受性子孫を各々140:48および90:30の比率で生
産した。この結果は、抗ウイルス性がメンデルの法則に
よって3:1の比率で遺伝されることを示す。
カナマイシン耐性子孫を土壌に移植し、25℃、16時間
／一日の光周期の条件の下で２ないし４週間成長させた
後、実施例１のステップ６と同様な手順に従ってウイル
スで感染させた。pGA748で形質転換されたタバコ植物体
は感染後３日目に病症を示した。しかし、pLSM1で形質
転換されたタバコ植物体は、感染してから４週後にも感
染した葉でのみ局所的な軽い症状を示しただけで、全身
的感染は観察されなかった。また、この植物体は感染さ
れていないタバコ植物体と同じ成長速度を示した。この
結果を図８に示したが、ここで、１はプラスミドpGA748
で形質転換されたタバコ植物体を示し、２はプラスミド
pLSM1で形質転換されたタバコ植物体を示し、Coはプラ
スミドpGA748で形質転換された感染していないタバコ植
物体を示す。
／一日の光周期の条件の下で２ないし４週間成長させた
後、実施例１のステップ６と同様な手順に従ってウイル
スで感染させた。pGA748で形質転換されたタバコ植物体
は感染後３日目に病症を示した。しかし、pLSM1で形質
転換されたタバコ植物体は、感染してから４週後にも感
染した葉でのみ局所的な軽い症状を示しただけで、全身
的感染は観察されなかった。また、この植物体は感染さ
れていないタバコ植物体と同じ成長速度を示した。この
結果を図８に示したが、ここで、１はプラスミドpGA748
で形質転換されたタバコ植物体を示し、２はプラスミド
pLSM1で形質転換されたタバコ植物体を示し、Coはプラ
スミドpGA748で形質転換された感染していないタバコ植
物体を示す。
実施例4:形質転換されたタバコ植物体からカルスの製造 実施例３のpLSM1で形質転換されたタバコ子孫植物体
からドラバー（J.Draper）らの方法（Plant Genetic Tr
ansformation and Gene Expression,Chap.2,1988,Black
well）に従ってカルスを誘導した。
からドラバー（J.Draper）らの方法（Plant Genetic Tr
ansformation and Gene Expression,Chap.2,1988,Black
well）に従ってカルスを誘導した。
詳細には、プラスミドpLSM1で形質転換されたタバコ
子孫植物体から得た葉試を0.5−0.1％の次亜塩素酸塩で
処理し、滅菌水で数回洗浄して次亜過素酸を除いた。
子孫植物体から得た葉試を0.5−0.1％の次亜塩素酸塩で
処理し、滅菌水で数回洗浄して次亜過素酸を除いた。
一方、NAA2.0mg/lおよびBAP0.5mg/lをMS培地に加え、
混合物をオートクレーブした。カナマイシン150mg/lを
滅菌した培地に加え、生成された培地の分画をペトリ皿
に入れて凝固した。
混合物をオートクレーブした。カナマイシン150mg/lを
滅菌した培地に加え、生成された培地の分画をペトリ皿
に入れて凝固した。
前記製造の消毒した葉試料を0.5cm x 1cmサイズうで
切り、ペトリ皿に入れたNAA、BAPおよびカナマイシンを
含有するMS培地上に載せた。ペトリ皿を密封し、暗所で
25℃で保管した。２週後、葉の非分化（undifferentiat
ion）が観察された。すなわち、葉断片の縁においてカ
ルスが形成された。
切り、ペトリ皿に入れたNAA、BAPおよびカナマイシンを
含有するMS培地上に載せた。ペトリ皿を密封し、暗所で
25℃で保管した。２週後、葉の非分化（undifferentiat
ion）が観察された。すなわち、葉断片の縁においてカ
ルスが形成された。
カルスを毎月継代培養しながら同一な培地で保管し
た。
た。
プラスミドpLSM1で形質転換されたタバコ植物体のカ
ルス、すなわち、タバコ（Nicotiana tabacum）W38（pL
SM1）は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約の規定下に1996年５月16日付で韓国遺
伝子銀行（KCTC）（住所：大韓民国大田広域市305−333
儒城区魚隠洞＃52、KRIBB、KCTC）に寄託番号第KCTC 02
48BP号として寄託された。
ルス、すなわち、タバコ（Nicotiana tabacum）W38（pL
SM1）は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約の規定下に1996年５月16日付で韓国遺
伝子銀行（KCTC）（住所：大韓民国大田広域市305−333
儒城区魚隠洞＃52、KRIBB、KCTC）に寄託番号第KCTC 02
48BP号として寄託された。
抗ウイルス性タバコ植物体は、実施例１のステップ２
の手順に従って前記カルスから芽および根を誘導し、生
成した幼い植物体を土壌で培養して全植物体に発育させ
ることによって得られる（J.Draperら、前記文献参
照）。
の手順に従って前記カルスから芽および根を誘導し、生
成した幼い植物体を土壌で培養して全植物体に発育させ
ることによって得られる（J.Draperら、前記文献参
照）。
本発明を前記特定実施態様と関連させて記述したが、
添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲
内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変
化させ得ることは勿論である。
添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲
内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変
化させ得ることは勿論である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー、 キュン・クワァン 大韓民国、デジョン 300−200、ドン − グ、ヨンジョン − ドン ナンバ ー26−９ (72)発明者 ユ、 デ・ユール 大韓民国、デジョン 305−333、ユソン − グ、ヨユウン − ドン（番地無 し）、ハンビット・アパートメント 121−605 (72)発明者 リー、 ミ・ヒー 大韓民国、デジョン 302−172、ソ − グ、ウォルピュン − ドン（番地無 し）、ジュゴン・アパートメント 210 −1204 (56)参考文献 Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ Ｐ．Ｅ．ｅ ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ. 366，ｐｐ．469−472（1993) Ｔｒｕｖｅ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．, Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏ ｌ．11 ｐｐ．1048−1052（1993) Ｋｕｌａｅｖａ Ｏ．Ｎ．ｅｔ ａ ｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ．，ｖｏｌ．20，ｐｐ．383−393 （1992) Ｈａｓｅｇａｗａ Ｋ．ｅｔ ａ ｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂ ｉｏｌ．，Ｖｏｌ．47，ｐｐ．73−85 （1994) Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ．ｅｔ ａｌ．, 無菌生物，ｖｏｌ．24，ｐｐ．101−102 （1994) Ｋｎａｕｆ Ｖ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．, Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ. ６，ｐｐ．165−170（1995) Ｐｌａｔｅｎｂｕｒｇ Ｇ．Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３，ｐｐ．99− 108（1994) Ｍｉｔｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌ ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ. 106，ｐｐ．977−981（1994) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 1/00 A01H 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ
Claims (5)
- 【請求項１】プラスミドpLSM1（KCTC 0159 BP）でナス
科（Solanaceae）に属する植物体を形質転換させること
を含む、ラクトフェリンを生産し、ククモウイルス（cu
cumovirus）に対する抗ウイルス性を示す形質転換植物
体の製造方法。 - 【請求項２】前記植物がタバコである請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】前記ククモウイルスがキュウリモザイクウ
イルス（CMV）である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】プラスミドpLSM1（KCTC 0159 BP）でナス
科（Solanaceae）に属する植物体を形質転換させること
によって製造された、ラクトフェリンを生産し、ククモ
ウイルスに対する抗ウイルス性を示す形質転換植物体。 - 【請求項５】プラスミドpLSM1（KCTC 0159 BP）で形質
転換されたナス科（Solanaceae）に属する植物体を培養
することを含む、植物体において完全長ラクトフェリン
を生産する方法。
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