JP3285890B2 - プラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合体 - Google Patents
プラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合体Info
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- JP3285890B2 JP3285890B2 JP07720291A JP7720291A JP3285890B2 JP 3285890 B2 JP3285890 B2 JP 3285890B2 JP 07720291 A JP07720291 A JP 07720291A JP 7720291 A JP7720291 A JP 7720291A JP 3285890 B2 JP3285890 B2 JP 3285890B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プラスミノーゲン活性
化因子−多孔質体複合体に関する。
化因子−多孔質体複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術およびその課題】プラスミノーゲン活性化
因子は、プラスミノーゲンに作用してこれを活性化し、
血液成分の抗凝固因子の一つであるプラスミンに変換す
る因子である。このようなプラスミノーゲン活性化因子
は、例えば、血栓溶解剤として、脳血栓患者等に血中投
与されている。
因子は、プラスミノーゲンに作用してこれを活性化し、
血液成分の抗凝固因子の一つであるプラスミンに変換す
る因子である。このようなプラスミノーゲン活性化因子
は、例えば、血栓溶解剤として、脳血栓患者等に血中投
与されている。
【０００３】しかしながら、血中にプラスミノーゲン活
性化因子を投与した場合には、血液中のプラスミノーゲ
ン活性化因子阻害物質によって急速に活性を失う。ま
た、プラスミノーゲン活性化因子によって活性化された
プラスミンに対しても、血液中のプラスミン阻害物質の
作用により、血栓溶解活性が失われてしまう。従って、
十分な血栓溶解作用を得るためには、多量のプラスミノ
ーゲン活性化因子を投与する必要がある。しかし、プラ
スミノーゲンを多量に投与した場合、プラスミノーゲン
活性化因子の精製が完全に行われていないと、プラスミ
ノーゲン以外の異種たんぱく質やペプチド鎖のような不
純物質が混入して、重篤な副作用を起こす危険性が高ま
る等の問題があった。
性化因子を投与した場合には、血液中のプラスミノーゲ
ン活性化因子阻害物質によって急速に活性を失う。ま
た、プラスミノーゲン活性化因子によって活性化された
プラスミンに対しても、血液中のプラスミン阻害物質の
作用により、血栓溶解活性が失われてしまう。従って、
十分な血栓溶解作用を得るためには、多量のプラスミノ
ーゲン活性化因子を投与する必要がある。しかし、プラ
スミノーゲンを多量に投与した場合、プラスミノーゲン
活性化因子の精製が完全に行われていないと、プラスミ
ノーゲン以外の異種たんぱく質やペプチド鎖のような不
純物質が混入して、重篤な副作用を起こす危険性が高ま
る等の問題があった。
【０００４】本発明は、かかる課題に鑑み、プラスミノ
ーゲン活性化因子の活性を長期間にわたって維持するこ
とができるプラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合
体を提供することを目的とする。
ーゲン活性化因子の活性を長期間にわたって維持するこ
とができるプラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合
体を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、リン酸カルシ
ウムからなる多孔質体にプラスミノーゲン活性化因子を
共有結合したことを特徴とするプラスミノーゲン活性化
因子−多孔質体複合体である。
ウムからなる多孔質体にプラスミノーゲン活性化因子を
共有結合したことを特徴とするプラスミノーゲン活性化
因子−多孔質体複合体である。
【０００６】ここで、リン酸カルシウムからなる多孔質
体としては、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カ
ルシウム、水酸化アパタイトのうち少なくとも１種から
なる多孔質体を使用することができる。
体としては、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カ
ルシウム、水酸化アパタイトのうち少なくとも１種から
なる多孔質体を使用することができる。
【０００７】また、プラスミノーゲン活性化因子として
は、ウロキナーゼ、又は、組織プラスミノーゲン活性化
因子を使用することができる。
は、ウロキナーゼ、又は、組織プラスミノーゲン活性化
因子を使用することができる。
【０００８】
【作用】本発明のプラスミノーゲン活性化因子−多孔質
体複合体によれば、プラスミノーゲン活性化因子が、生
体適合性に優れたリン酸カルシウムからなる多孔質体に
固定化されている。これにより、この複合体を、血液中
に投与したり、生体内に埋入したり、バイオリアクター
として利用した場合に長期間安定にプラスミノーゲン活
性化因子活性を維持する。
体複合体によれば、プラスミノーゲン活性化因子が、生
体適合性に優れたリン酸カルシウムからなる多孔質体に
固定化されている。これにより、この複合体を、血液中
に投与したり、生体内に埋入したり、バイオリアクター
として利用した場合に長期間安定にプラスミノーゲン活
性化因子活性を維持する。
【０００９】
【実施例】以下、本発明の実施例を、詳細に説明する。
【００１０】［実施例１］プラスミノーゲン活性化因子
としてウロキナーゼを、β−リン酸三カルシウム多孔質
体に保持させたプラスミノーゲン活性化因子多孔体複合
体について説明する。
としてウロキナーゼを、β−リン酸三カルシウム多孔質
体に保持させたプラスミノーゲン活性化因子多孔体複合
体について説明する。
【００１１】本実施例で使用するβ−リン酸三カルシウ
ム多孔質体からなる担体（β−ＴＣＰ担体）の生体適合
性について、次のようにして、ヒト胎児腎由来細胞によ
る組織培養試験を行った。
ム多孔質体からなる担体（β−ＴＣＰ担体）の生体適合
性について、次のようにして、ヒト胎児腎由来細胞によ
る組織培養試験を行った。
【００１２】まず、１０％牛胎児血清を含むイーグルＭ
ＥＭ培地において、β−ＴＣＰ担体に付着させたヒト胎
児腎由来細胞（細胞名：２９３細胞、大日本製薬）を、
３７℃の炭酸ガス恒温器中（５％炭酸ガス濃度）で培養
する。シャーレから培地を吸引した後、リン酸緩衝液で
細胞が付着しているβ−ＴＣＰ担体を洗浄して、浮遊細
胞を除去する。次に、トリプシン溶液を加え、３分間反
応させた後、軽くピペティングすることにより、β−Ｔ
ＣＰ担体から細胞を剥離する。全細胞数は、血球計算盤
及びコールターカウンターで算定する。また、生細胞数
は、トリパンブルー染色法により求めた。さらに、比増
殖速度（μ）は、培養２日目から５日目にかけての対数
増殖における細胞数から、次の式（１）から算定され
る。
ＥＭ培地において、β−ＴＣＰ担体に付着させたヒト胎
児腎由来細胞（細胞名：２９３細胞、大日本製薬）を、
３７℃の炭酸ガス恒温器中（５％炭酸ガス濃度）で培養
する。シャーレから培地を吸引した後、リン酸緩衝液で
細胞が付着しているβ−ＴＣＰ担体を洗浄して、浮遊細
胞を除去する。次に、トリプシン溶液を加え、３分間反
応させた後、軽くピペティングすることにより、β−Ｔ
ＣＰ担体から細胞を剥離する。全細胞数は、血球計算盤
及びコールターカウンターで算定する。また、生細胞数
は、トリパンブルー染色法により求めた。さらに、比増
殖速度（μ）は、培養２日目から５日目にかけての対数
増殖における細胞数から、次の式（１）から算定され
る。
【００１３】 μ＝（１／Ｎa.cell）・ｄＮa.cell／ｄｔ ・・・（１） ここで、Ｎa.cellは、β−ＴＣＰ担体に付着した全細胞
数を示す。
数を示す。
【００１４】β−ＴＣＰ担体に付着した細胞たんぱく質
質量は、β−ＴＣＰ担体をリン酸緩衝液で洗浄した後、
０．５ＮＮａＯＨ２mlを添加し、付着細胞を溶解させ
た。この溶解液中のたんぱく質濃度を、牛血清アルブミ
ンを標準たんぱく質としてLowly 法で測定する。
質量は、β−ＴＣＰ担体をリン酸緩衝液で洗浄した後、
０．５ＮＮａＯＨ２mlを添加し、付着細胞を溶解させ
た。この溶解液中のたんぱく質濃度を、牛血清アルブミ
ンを標準たんぱく質としてLowly 法で測定する。
【００１５】上述の方法により、生育細胞数、細胞比増
殖速度及び細胞たんぱく質質量を測定した結果、プラス
チック培養皿（Ｌｕｘ）で培養した場合と比較して、い
ずれの点でも１０％以内の差異にとどまり、β−ＴＣＰ
担体が生体適合性に優れた担体であることが確認され
た。
殖速度及び細胞たんぱく質質量を測定した結果、プラス
チック培養皿（Ｌｕｘ）で培養した場合と比較して、い
ずれの点でも１０％以内の差異にとどまり、β−ＴＣＰ
担体が生体適合性に優れた担体であることが確認され
た。
【００１６】次に、ウロキナーゼを、グルタルアルデヒ
ド法により、β−ＴＣＰ担体に共有結合する例について
説明する。
ド法により、β−ＴＣＰ担体に共有結合する例について
説明する。
【００１７】まず、直径約１００〜５００μｍのβ−Ｔ
ＣＰ担体２〜５ｇ（乾燥重量）を秤量し、５００ml容量
の三角フラスコに入れる。この三角フラスコ中に、２容
量％のアミノプロピルトリエトキシシラン／トルエン溶
液１００mlを加える。次いで、この三角フラスコにリー
ビッヒ冷却管を装着して、油浴中で１１０℃、６時間還
流加熱する。
ＣＰ担体２〜５ｇ（乾燥重量）を秤量し、５００ml容量
の三角フラスコに入れる。この三角フラスコ中に、２容
量％のアミノプロピルトリエトキシシラン／トルエン溶
液１００mlを加える。次いで、この三角フラスコにリー
ビッヒ冷却管を装着して、油浴中で１１０℃、６時間還
流加熱する。
【００１８】次に、ガラスフィルター及びブフナーフラ
スコを使用して、β−ＴＣＰを担体約５０mlのトルエン
で洗浄した後、６０〜１００℃で乾燥する。
スコを使用して、β−ＴＣＰを担体約５０mlのトルエン
で洗浄した後、６０〜１００℃で乾燥する。
【００１９】乾燥したβ−ＴＣＰ担体１００mgをガラス
カラムに充填する。このガラスカラムには、パスツール
ピペット（内径５mm）を用いて、水晶ガラスウールをβ
−ＴＣＰ担体の上下に充填して、β−ＴＣＰ担体を保持
させる。
カラムに充填する。このガラスカラムには、パスツール
ピペット（内径５mm）を用いて、水晶ガラスウールをβ
−ＴＣＰ担体の上下に充填して、β−ＴＣＰ担体を保持
させる。
【００２０】このようにして作成したカラムに、２．５
重量％のグルタルアルデヒドを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７）１０mlを、ベリスタポンプを用いて４℃
で循環させる。さらに、０．０１Ｍリン酸緩衝液５０ml
を２４時間循環させて洗浄する。この際のポンプ流量は
６ml／分である。
重量％のグルタルアルデヒドを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７）１０mlを、ベリスタポンプを用いて４℃
で循環させる。さらに、０．０１Ｍリン酸緩衝液５０ml
を２４時間循環させて洗浄する。この際のポンプ流量は
６ml／分である。
【００２１】この後、ウロキナーゼ（０．０１mg／ml）
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液１０mlを、４℃で２４時
間、カラム内を循環させて、ウロキナーゼをβ−ＴＣＰ
担体に固定化する。
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液１０mlを、４℃で２４時
間、カラム内を循環させて、ウロキナーゼをβ−ＴＣＰ
担体に固定化する。
【００２２】このウロキナーゼを固定化したβ−ＴＣＰ
担体を、０．５Ｍ塩化ナトリウム／１Ｍリン酸緩衝液１
０ml及び０．０１Ｍリン酸緩衝液２０mlで順次洗浄し
て、未結合のウロキナーゼを除去する。
担体を、０．５Ｍ塩化ナトリウム／１Ｍリン酸緩衝液１
０ml及び０．０１Ｍリン酸緩衝液２０mlで順次洗浄し
て、未結合のウロキナーゼを除去する。
【００２３】なお、この実施例では、グルタルアルデヒ
ド法によるプラスミノーゲン活性化因子の固定化方法に
ついて説明したが、この他に、臭化シアン法、ジアゾ化
法、過ヨウ素酸法や、二官能試薬による担体と酵素の架
橋法としてグルタルアルデヒドの他にビスマレインイミ
ド類、ジハロゲン化アリール類、ジイソシアノート類を
使用することによっても行うことができる。
ド法によるプラスミノーゲン活性化因子の固定化方法に
ついて説明したが、この他に、臭化シアン法、ジアゾ化
法、過ヨウ素酸法や、二官能試薬による担体と酵素の架
橋法としてグルタルアルデヒドの他にビスマレインイミ
ド類、ジハロゲン化アリール類、ジイソシアノート類を
使用することによっても行うことができる。
【００２４】このようにして調製されたウロキナーゼ−
β−ＴＣＰ複合体を、カラムに充填し、１０％血清を含
む疑似生体液を連続的に供給したところ、流出液中のプ
ラスミン活性は１００時間以上高い活性を示した。
β−ＴＣＰ複合体を、カラムに充填し、１０％血清を含
む疑似生体液を連続的に供給したところ、流出液中のプ
ラスミン活性は１００時間以上高い活性を示した。
【００２５】また、細粒化したウロキナーゼ−β−ＴＣ
Ｐ複合体を血液中に投与して、血栓または血栓前駆体を
分解して除去することができる。この際に、ウロキナー
ゼは、β−ＴＣＰに固定化されているため、血液中のプ
ラスミノーゲン活性化因子阻害物質による失活を受け難
い。これにより、長期間にわたって血液中で血栓溶解作
用を維持することができる。さらに、β−ＴＣＰは、生
体適合性に優れているので、血液中に投与しても生体に
与える影響が少ない。
Ｐ複合体を血液中に投与して、血栓または血栓前駆体を
分解して除去することができる。この際に、ウロキナー
ゼは、β−ＴＣＰに固定化されているため、血液中のプ
ラスミノーゲン活性化因子阻害物質による失活を受け難
い。これにより、長期間にわたって血液中で血栓溶解作
用を維持することができる。さらに、β−ＴＣＰは、生
体適合性に優れているので、血液中に投与しても生体に
与える影響が少ない。
【００２６】また、ウロキナーゼ−β−ＴＣＰ複合体を
所定形状に成形したものを、生体内に埋入してウロキナ
ーゼを徐放させることもできる。
所定形状に成形したものを、生体内に埋入してウロキナ
ーゼを徐放させることもできる。
【００２７】［実施例２］水酸化アパタイト多孔質体か
らなる担体（ＨＡＰ担体）について、実施例１と同様
に、ヒト胎児腎由来細胞による組織培養試験を行った結
果、プラスチック培養皿（Ｌｕｘ）で培養した場合と比
較して、生育細胞数、細胞比増殖速度及び細胞たんぱく
質質量の点でいずれも１０％以内の差異にとどまり、Ｈ
ＡＰ担体が生体適合性に優れた担体であることが確認さ
れた。
らなる担体（ＨＡＰ担体）について、実施例１と同様
に、ヒト胎児腎由来細胞による組織培養試験を行った結
果、プラスチック培養皿（Ｌｕｘ）で培養した場合と比
較して、生育細胞数、細胞比増殖速度及び細胞たんぱく
質質量の点でいずれも１０％以内の差異にとどまり、Ｈ
ＡＰ担体が生体適合性に優れた担体であることが確認さ
れた。
【００２８】また、ＨＡＰ担体に、実施例１と同様に、
ウロキナーゼをグルタルアルデヒド法で共有結合し、ウ
ロキナーゼ−ＨＡＰ複合体を調製した。
ウロキナーゼをグルタルアルデヒド法で共有結合し、ウ
ロキナーゼ−ＨＡＰ複合体を調製した。
【００２９】このウロキナーゼ−ＨＡＰ複合体をカラム
に充填して、１０％血清を含む疑似生体液を連続的に供
給したところ、流出液中のプラスミン活性は、２００時
間以上高い活性を示した。
に充填して、１０％血清を含む疑似生体液を連続的に供
給したところ、流出液中のプラスミン活性は、２００時
間以上高い活性を示した。
【００３０】［実施例３］水酸化アパタイトを８ｗｔ％
含有したリン酸三カルシウム多孔質体からなる担体（Ｈ
ＡＰ／β−ＴＣＰ担体）について、実施例１と同様に、
ヒト胎児腎由来細胞による組織培養試験を行った結果、
プラスチック培養皿（Ｌｕｘ）で培養した場合と比較し
て、生育細胞数、細胞比増殖速度及び細胞たんぱく質質
量の点でいずれも１０％以内の差異にとどまり、ＨＡＰ
／β−ＴＣＰ担体が生体適合性に優れた担体であること
が確認された。
含有したリン酸三カルシウム多孔質体からなる担体（Ｈ
ＡＰ／β−ＴＣＰ担体）について、実施例１と同様に、
ヒト胎児腎由来細胞による組織培養試験を行った結果、
プラスチック培養皿（Ｌｕｘ）で培養した場合と比較し
て、生育細胞数、細胞比増殖速度及び細胞たんぱく質質
量の点でいずれも１０％以内の差異にとどまり、ＨＡＰ
／β−ＴＣＰ担体が生体適合性に優れた担体であること
が確認された。
【００３１】また、ＨＡＰ／β−ＴＣＰ担体に、実施例
１と同様に、ウロキナーゼをグルタルアルデヒド法で共
有結合し、ウロキナーゼ−ＨＡＰ／β−ＴＣＰ複合体を
調製した。
１と同様に、ウロキナーゼをグルタルアルデヒド法で共
有結合し、ウロキナーゼ−ＨＡＰ／β−ＴＣＰ複合体を
調製した。
【００３２】このウロキナーゼ−ＨＡＰ／β−ＴＣＰ複
合体をカラムに充填して、１０％血清を含む疑似生体液
を連続的に供給したところ、流出液中のプラスミン活性
は、１４０時間以上高い活性を示した。
合体をカラムに充填して、１０％血清を含む疑似生体液
を連続的に供給したところ、流出液中のプラスミン活性
は、１４０時間以上高い活性を示した。
【００３３】以上説明した実施例１〜３では、ウロキナ
ーゼを多孔質体に固定化した場合について説明したが、
組織プラスミノーゲン活性化因子を同様に固定化するこ
ともできる。
ーゼを多孔質体に固定化した場合について説明したが、
組織プラスミノーゲン活性化因子を同様に固定化するこ
ともできる。
【００３４】
【発明の効果】本発明のプラスミノーゲン活性化因子−
多孔質体複合体によれば、プラスミノーゲン活性化因子
を生体適合性に優れたリン酸カルシウムからなる多孔質
体に固定化することにより、プラスミノーゲン活性化因
子の活性を長期間にわたって維持することができると共
に、プラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合体をカ
ラム充填したバイオリアクターや細粒化したプラスミノ
ーゲン活性化因子−多孔質体複合体を血液中に投与する
等の新規な適用を可能にする等の効果を奏するものであ
る。
多孔質体複合体によれば、プラスミノーゲン活性化因子
を生体適合性に優れたリン酸カルシウムからなる多孔質
体に固定化することにより、プラスミノーゲン活性化因
子の活性を長期間にわたって維持することができると共
に、プラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合体をカ
ラム充填したバイオリアクターや細粒化したプラスミノ
ーゲン活性化因子−多孔質体複合体を血液中に投与する
等の新規な適用を可能にする等の効果を奏するものであ
る。
フロントページの続き (72)発明者 鳥山 素弘 愛知県名古屋市北区平手町１丁目１番地 名古屋工業技術試験所内 (72)発明者 横川 善之 愛知県名古屋市北区平手町１丁目１番地 名古屋工業技術試験所内 (72)発明者 河本 ゆかり 愛知県名古屋市北区平手町１丁目１番地 名古屋工業技術試験所内 (72)発明者 袴塚 康治 東京都渋谷区幡ケ谷２丁目43番２号 オ リンパス光学工業株式会社内 (72)発明者 入江 洋之 東京都渋谷区幡ケ谷２丁目43番２号 オ リンパス光学工業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭61−115493（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−248487（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−190082（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−69988（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−124383（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−179494（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 11/14 A61K 38/45 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 リン酸カルシウム系化合物からなるリン
酸カルシウム多孔質体と、 アミノ基を有し、前記リン酸カルシウム多孔質体の表面
に共有結合するシラン系化合物と、 前記リン酸カルシウム多孔質体の表面に共有結合した前
記シラン系化合物のアミノ基に対して共有結合する中間
体と、 前記リン酸カルシウム多孔質体に前記シラン系化合物を
介して共有結合で固定化された前記中間体に対して共有
結合するプラスミノーゲン活性化因子と、 を備えたことを特徴とするプラスミノーゲン活性化因子
−多孔質複合体。 - 【請求項２】 リン酸カルシウム系化合物からなるリン
酸カルシウム多孔質体と、 アミノ基を有し、前記リン酸カルシウム多孔質体の表面
に共有結合するシラン系化合物と、 前記リン酸カルシウム多孔質体の表面に共有結合した前
記シラン系化合物のアミノ基に対して共有結合するグル
タルアルデヒドと、 前記リン酸カルシウム多孔質体に前記シラン系化合物を
介して共有結合で固定化されたグルタルアルデヒドに対
して共有結合するプラスミノーゲン活性化因子と、 を備えたことを特徴とするプラスミノーゲン活性化因子
−多孔質複合体。 - 【請求項３】 リン酸カルシウム系化合物からなるリン
酸カルシウム多孔質体の表面にアミノ基を有するシラン
系化合物を共有結合するシラン系化合物結合工程と、 前記シラン系化合物結合工程により前記リン酸カルシウ
ム多孔質体の表面に共有結合した前記シラン系化合物の
アミノ基に対してグルタルアルデヒドを共有結合するグ
ルタルアルデヒド結合工程と、 前記グルタルアルデヒド結合工程により共有結合したグ
ルタルアルデヒドに対してプラスミノーゲン活性化因子
を共有結合するプラスミノーゲン活性化因子結合工程
と、 を備えたことを特徴とするプラスミノーゲン活性化因子
固定化方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07720291A JP3285890B2 (ja) | 1991-03-18 | 1991-03-18 | プラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合体 |
| US08/246,940 US5491082A (en) | 1991-03-18 | 1994-05-20 | Plasminogen activator covalently bonded to a porous body of β-tricalcium phosphate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07720291A JP3285890B2 (ja) | 1991-03-18 | 1991-03-18 | プラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05310595A JPH05310595A (ja) | 1993-11-22 |
| JP3285890B2 true JP3285890B2 (ja) | 2002-05-27 |
Family
ID=13627245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07720291A Expired - Fee Related JP3285890B2 (ja) | 1991-03-18 | 1991-03-18 | プラスミノーゲン活性化因子−多孔質体複合体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3285890B2 (ja) |
-
1991
- 1991-03-18 JP JP07720291A patent/JP3285890B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05310595A (ja) | 1993-11-22 |
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