JP3236293B2 - ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの増進 - Google Patents

ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの増進

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は２種の相補的ポリヌクレオチドセグメント間
のハイブリダイゼーションに関するものであり、特にハ
イブリダイゼーションの速度および生成するハイブリッ
ドの全量を増大させる物質に関するものである。
DNAハイブリダイゼーション速度を高めるために硫酸
デキストランを用いることが、多数の研究者により報告
されている。米国特許第4,302,204号明細書には、ハイ
ブリダイゼーション反応を促進するために硫酸デキスト
ランおよび他の帯電した多糖類を用いることが記載さ
れ、その場合ポリヌクレオチドのうち１種は固相に共有
結合している。
ポリエチレングリコールがペルオキシダーゼ標識核酸
とのハイブリダイゼーションに関して硫酸デキストラン
より優れていることが、レンツおよびクルツ（Renz,Kur
z）により見出された：（1984）Nucleic Acid Resear
ch 12,3435−3444。しかしその後本発明者らがハイブ
リダイゼーション緩衝液中の他の成分の条件および濃度
を変化させて行った実験は、それらを唯一のハイブリダ
イゼーション速度増進剤として用いた場合、硫酸デキス
トランの方がポリエチレングリコールより優れているこ
とを示した。
米国特許第4,689,294号明細書には、ハイブリダイゼ
ーション緩衝液中にポリアクリレートおよびポリメタク
リレートを用いることを示し、これら２種のポリマーが
下記の特性を有すると述べている： ａ）硫酸デキストランと同じ率のハイブリダイゼーショ
ン増進、 ｂ）微生物分解に対する抵抗性、 ｃ）一般的に用いられるニトロセルロース系支持体に対
するプローブの非特異的結合が、硫酸デキストランの使
用と比較して低い、 ｄ）ポリアクリレートは低濃度で有効であり、硫酸デキ
ストランより著しく安価である。
本発明者らは、溶液からのペルオキシダーゼ標識核酸
プローブを、帯電したナイロン固体支持体に結合した核
酸とハイブリダイズさせることを意図した実験を行っ
た。ハイブリダイゼーション緩衝液中５％濃度のポリア
クリレートを用いると、固体支持体に結合した相補的核
酸のプローブのハイブリダイゼーションが阻止されるこ
とが見出された。従ってポリアクリレートは少なくと
も、ペルオキシダーゼ標識プローブを用いるメンブレン
ハイブリダイゼーション、および帯電したナイロン固体
支持体を用いて作成されたサザンブロットには不適当で
ある。
従って本発明者らは、ハイブリダイゼーション緩衝液
中に５％（w/v）以下の濃度で用いた場合の硫酸デキス
トランと同様な性能をもつ他の速度増進剤を見出しうる
か否かを調べる研究を行った。今回、ポリビニルアルコ
ールおよびポリスチレンスルホン酸も相補的ポリヌクレ
オチドセグメントのハイブリダイゼーションの速度およ
び／または程度を増大させることが見出された。従って
１観点においては本発明は、相補的ポリヌクレオチドを
緩衝化された水性媒質中でハイブリダイゼーション条件
下に保持することよりなる相補的ポリヌクレオチドのハ
イブリダイゼーション法であって、緩衝化された水性媒
質が、検知しうるほどのハイブリダイゼーション速度お
よび／または程度の増大を生じる濃度でポリビニルアル
コールおよび／またはポリスチレンスルホン酸を含有す
ることを特徴とする方法を提供する。
他の観点においては本発明は、検知しうるほどの相補
的ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション速度および
／または程度の増大を生じるのに有効な濃度でポリビニ
ルアルコールおよび／またはポリスチレンスルホン酸を
含有することを特徴とするハイブリダイゼーション緩衝
液を提供する。
２種のポリマー、すなわちポリビニルアルコールおよ
びポリスチレンスルホン酸は、緩衝化された水性媒質中
にアニオン形で存在することができ、これはインサイチ
ューで、またはポリマーの塩類、たとえばNa、Ｋもしく
はNH4塩を用いて形成しうる。好ましい塩はNa塩であ
る。従ってポリスチレンスルホン酸という語は、本明細
書にいてはポリスチレンスルホン酸塩を含むものとして
用いられる。
ハイブリダイゼーション緩衝液は通常の組成のもので
あり、またハイブリダイゼーション媒質中に通常用いら
れる他の成分、たとえば界面活性剤および他のポリマー
を含有してもよい。
ポリビニルアルコールおよびポリスチレンスルホン酸
は、普通はハイブリダイゼーション緩衝液中に最高10％
の濃度で存在するであろうが、これより高くてもよく、
好ましい濃度は１−10％、たとえば約５％である。普通
はこれらのポリマーの分子量は約1,000−1,000,000ダル
トンであろう。ポリビニルアルコールについては、好ま
しい分子量は約1,000−20,000、好ましくは約5,000−1
5,000、特に約10,000である。ポリビニルアルコールは
好ましくは50−100％、特に約80％程度加水分解された
ポリ酢酸ビニルである。ポリスチレンスルホン酸につい
ては、好ましい分子量は約60,000−80,000ダルトン、特
に約70,000である。
これらのポリマーが存在する唯一のハイブリダイゼー
ション速度増進剤でなくてもよい。それらを硫酸デキス
トランまたはポリエチレングリコールと併用することも
できる。分子量1,000−10,000,000の硫酸デキストラン
を用いることができ、特に500,000が好ましい。分子量
1,000−20,000,000のポリエチレングリコールを用いる
ことができ、6,000が好ましい。
相補的ポリヌクレオチドセグメントは、それぞれポリ
ヌクレオチド鎖のすべてまたは一部であってもよく、比
較的短い長さのオリゴヌクレオチドを含む。ポリヌムレ
オチドセグメントにはDNAおよびRNA、ならびにそれらの
誘導体が含まれ、DNA/DNA、RNA/RNA、またはDNA/RNAセ
グメント間でハイブリッドが形成されてもよく、そのハ
イブリダイゼーションはすべて本発明によるポリマー類
の使用によって促進される。
本発明は、水性媒質中での２種の相補的ポリヌクレオ
チドセグメント間のハイブリダイゼーションの速度およ
び／または程度を増大させたい場合に常に有用である。
本発明は、相補鎖が双方とも溶解しているハイブリダイ
ゼーション法に適用しうる。本発明は、相補的ポリヌク
レオチドセグメントのうち一方が固体支持体に固定化さ
れているハイブリダイゼーション法に、特に有用であ
る。これらの系は、特定のターゲット配列に相補的な標
識ポリヌクレオチドプローブを水性媒質中で、ターゲッ
ト配列を含むポリヌクレオチドを含有する、または含有
する疑いのある核酸試料と接触させるポリヌクレオチド
アッセイ系に一般に用いられる。次いで、ハイブリダイ
スしたプローブの量または存在を、用いた標識に応じた
適切なアッセイ系により測定することができる。一般に
用いられる標識には、放射能、ビオチン、蛍光、酵素お
よびハプテンが含まれる。酵素がDNAプローブに共有結
合する酵素（直接）標識法は、色または化学発光信号を
生じる検出工程を採用しうる。ハプテン標識（間接）、
たとえばフルオレセインは、プローブDNAに共有結合す
る。これらのプローブ分子は場合により蛍光によって検
出しうるが、色の沈着または化学発光反応による検出を
可能にするために、普通は第２標識部分、たとえば特異
的抗体−酵素コンジュゲートを必要とする。
これらのアッセイ法において、プローブを含むアッセ
イ媒質の形成前に試料核酸を固定化するか、またはプロ
ーブが固定化成分であってもよい。核酸試料が固定化さ
れ、それに本発明が特に有用であるこのような系の例
は、サザンブロッティング法である。
このような固相法に慣用される固体支持体はいずれも
使用することができ、これにはニトロセルロース、ナイ
ロン、帯電したナイロン、たとえばアメルシャム・イン
ターナショナルplcから商標ハイボンド（Hybond）で市
販されているもの、またはポリビニルジフルオリドが含
まれる。固体支持体はシートまたは膜の形で用いられる
場合が多いが、本発明の作業にとって厳密な形状は重要
でない。
本発明はインサイチューで実施されるハイブリダイゼ
ーション、すなわちポリヌクレオチドセグメントのうち
一方が細胞または組織標本内に固定化された核酸の一部
である場合にも適用しうる。
本発明のポリマーは他のハイブリダイゼーション速度
増進剤、特にポリエチレングリコールまたは硫酸デキス
トランと併用することが有利である。ある種のハイブリ
ダイゼーション速度増進剤は、ハイブリダイゼーション
速度を促進してより多量のプローブ核酸をターゲット核
酸に結合させるだけでなく、他の相互作用も促進してよ
り多量のプローブ核酸を固体支持体に非特異的に結合さ
せることが認められた。
本明細書においてポリエチレングリコールおよびポリ
ビニルアルコールはこのプローブ核酸の固体支持体への
非特異的結合を起こさせる顕著な例である。本発明は、
この非特異的結合を減少させるために硫酸デキストラン
またはポリスチレンスルホン酸ナトリウムを他の２種の
速度増進剤と併用しうることを示す。固体支持体へのプ
ローブの非特異的結合を防止するために、蛋白質性遮断
剤を媒質中に含有させてもよい。
一般に硫酸デキストランは約10％の濃度で用いられて
いる。硫酸デキストランを＞５％濃度で含有する緩衝剤
配合物の多くは、２相に分離する。これはハイブリダイ
ゼーション媒質としての緩衝剤の性能に不利な影響を及
ぼす。本明細書に述べる最適緩衝剤配合物中のポリスチ
レンスルホン酸ナトリウム（PSSA）は、ポリエチレング
リコールを含有する場合も含有しない場合も、このよう
な問題を伴わない。従ってこれは硫酸デキストランに優
る利点であると考えることができる。
ポリビニルアルコールおよびポリスチレンスルホン酸
は、このように一般的濃度で用いられる硫酸デキストラ
ンと共に含有させることができる。硫酸デキストランが
これよりはるかに低い量、たとえば約0.5％含有される
場合にも有意の改良が得られることが認められたが、た
だし0.1−10％であろう。
ポリエチレングリコールは、ポリビニルアルコールお
よびポリスチレンスルホン酸と有利に併用しうる他のハ
イブリダイゼーション速度増進剤である。好ましいポリ
エチレングリコール濃度は１−25％、特に５−10％であ
る。
固体支持体への非特異的結合の減少は、ハイブリダイ
ゼーション緩衝液にカチオン界面活性剤を、好ましくは
0.02−２％の濃度で添加することにより達成しうる。適
切なカチオン界面活性剤には、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリドが含
まれる。
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであ
る。
６種の標識法をそれらに対応する検出法と共に用い
た。詳細なプロトコールはアメルシャム・インターナシ
ョナルplcからの各種製品中に見出される。Ｘ印はアマ
シャムインターナショナル社（Amersham International
plc）の商標である。
方法１ XECL直接核酸標識用および検出系RPN3000。
方法２ Ｘメガプライム（Megaprime）DNA標識用系RPN1606。
方法2a 迅速ハイブリダイゼーション系−Ｘマルチプライム
（Multiprime）RPN1517。
方法３ ECLランダムプライム標識用および検出系RPN3030。
方法４ ３′−末端標識用キットN4020。
方法５ Ｘペアード（Paired）プロモーターSP6系RPN2006。
実施例において、標準食塩−クエン酸緩衝液をSSCと
略記し、ドデシル硫酸ナトリウムをSDSと略記する。
結果は下記により記録された： ａ）ルミノグラフもしくはＸ線フィルム上でのオートラ
ジオグラフ、または ｂ）電荷結合素子（CCD）カメラによる画像。
ルミノグラフおよびオートラジオグラフは特許明細書
においては十分に再現できないので、本明細書には採用
しない。
CCD）カメラによる画像をコンピューターにより翻訳
／分析して、非放射能（発光）検出に際して放出された
光を精確に測定することができる。
濃度は％w/vで示される。
図１、２および３は、それぞれ実施例１、11および12
において得たハイブリダイゼーション反応速度を示すグ
ラフである。
実施例１−３は優先権出願の実施例１−３に報告した
実験の改良された記載である。
実施例１ 異なる速度増進剤を用いた場合のハイブリダイゼーショ
ン速度およびハイブリダイズしたDNA全量の相異の測定 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 6M尿素,120mM Tris/HCl pH8.0,0.4％SDS,0.5M NaC
l,5％遮断剤 10ng/mlのペルオキシダーゼ標識ラムダHind III DN
Aプローブをハイボンド−H+上のラムダHind III DNA
サザンブロットにハイブリダイズさせるためのハイブリ
ダイゼーション媒質として、下記の緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝コア緩衝液＋５％硫酸デキストラン 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋５％ポリスチレンスルホン酸
ナトリウム 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋５％ポリビニルアルコール＋
0.5％硫酸デキストラン 緩衝液Ｄ＝コア緩衝液＋速度増進剤無添加 ブロット上に１、100および1000pgを装填した。
方法１を採用した。
ハイブリダイゼーションは異なる期間実施された。
結果／結論 結果をCCDカメラにより５分間露光として記録した。
ブロットにおける1ngのラムダHind III装填の4kbバン
ドからの発せられる光を分析した。固体支持体に非特異
的に結合したプローブによる発光を差し引いた。結果を
図１にグラフで示す。
異なる速度増進剤を含有する緩衝液すべてが、速度増
進剤を含有しない緩衝液を用いて得られたものより有意
に高いハイブリダイゼーション速度増大を示す。
ポリビニルアルコールを含有する緩衝液に添加された
0.5％硫酸デキストランは、固体支持体に非特異的に結
合するプローブの量を減少させるという利点をもつこと
が見出された。
速度増進剤を含有するすべての緩衝液が、速度増進剤
を含有しない緩衝液より多量にプローブをターゲットに
結合させることができ、従ってより大きな信号強度を与
える。
実施例２ 異なる支持体材料を用いて調製したサザンブロットと共
に異なるハイブリダイゼーション速度増進剤を用いた効
果、および単一コピー遺伝子検出への利用 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 6M尿素,120mM Tris/HCl pH8.0,0.4％SDS,0.5M NaC
l,5％遮断剤 10ng/mlのペルオキシダーゼ標識Ｎ−ras−挿入DNAプ
ローブをハイボンド膜上のヒトゲノムDNAサザンブロッ
トにハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーショ
ン媒質として、下記の緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝コア緩衝液＋５％硫酸デキストラン 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋５％ポリビニルアルコール 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋５％ポリスチレンスルホン酸
ナトリウム ブロット上に５、２および１μｇを装填した。
方法１を採用した。
ハイブリダイゼーションは16時間実施された。
結果／結論 結果をルミノグラフとして記録した（30分間露光）。
硫酸デキストランおよびポリスチレンスルホン酸ナト
リウムを含有する緩衝液を用いて得られた結果は、ハイ
ボンド−Ｎ（非帯電ナイロン膜）およびハイボンド−EC
L（純ニトロセルロース膜）上でのこの用途において比
較に値するものである。しかしＸハイボンド−N+（正に
帯電したナイロン膜）上では、硫酸デキストランおよび
ポリビニルアルコール緩衝液を用いたハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーは、ポリスチレンスルホン
酸ナトリウム緩衝液を用いたハイブリダイゼーションの
場合と比較して劣っている。従ってポリスチレンスルホ
ン酸ナトリウム緩衝液は、他の２種の緩衝液より良好な
ストリンジェンシーを示す結果を与えるという利点をも
つ。
実施例３ ポリスチレンスルホン酸ナトリウムおよびポリビニルア
ルコールを含有する緩衝液を用いた場合に起こるハイブ
リダイゼーションの量における相異の測定 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 6M尿素,120mM Tris/HCl pH8.0,0.4％SDS,0.5M NaC
l,5％遮断剤 20ng/mlのペルオキシダーゼ標識ラムダHind III DN
Aプローブをハイボンド−H+上のラムダHind III DNA
サザンブロットにハイブリダイズさせるためのハイブリ
ダイゼーション媒質として、下記の緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝コア緩衝液＋12.5％グリセリン＋１％ポリ
ビニルピロリドン＋4mM EDTA＋0.02％ファイコル（Fic
oll）400＋0.02％BSA（フラクションＶ）＋６％ポリエ
チレングリコール 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋５％ポリスチレンスルホン酸
ナトリウム 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋５％ポリビニルアルコール ブロット上に10、100pgを装填した。
方法１を採用した。
ハイブリダイゼーションは２時間実施された。
結果／結論 結果をルミノグラフとして記録した（30分間露光）。
ポリスチレンスルホン酸ナトリウムおよびポリビニル
アルコール緩衝剤を用いた２時間のハイブリダイゼーシ
ョン後に形成されたハイブリッドの全量は同等であるこ
とが認められ、他の緩衝剤を用いて形成された量よりか
なり多い。しかしポリビニルアルコール緩衝剤はより多
量のプローブを帯電ナイロン膜に非特異的に結合させ
た。
実施例４ ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリエチレングリ
コールおよび硫酸デキストランを用いて配合されたハイ
ブリダイゼーション緩衝液の比較 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： ５×SSC,0.1％SDS 約2ng/mlの32P−標識Ｎ−ras−挿入DNAプローブをハ
イボンド−N+上のHind III ヒトゲノムDNAサザンブロ
ットにハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーシ
ョン媒質として、下記の緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝コア緩衝液＋５％ポリスチレンスルホン酸
ナトリウム 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋10％ポリスチレンスルホン酸
ナトリウム 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋５％ポリスチレンスルホン酸
ナトリウム＋５％ポリエチレングリコール 緩衝液Ｄ＝コア緩衝液＋５％硫酸デキストラン 緩衝液Ｅ＝コア緩衝液＋10％硫酸デキストラン 緩衝液Ｆ＝コア緩衝液＋５％硫酸デキストラン＋５％
ポリエチレングリコール ブロット上に５、２および１μｇを装填した。
方法２を採用した。
ハイブリダイゼーションは１時間実施された。
結果／結論 結果をオートラジオグラフとして記録した（17時間露
光）。
それぞれの緩衝液を用いて起こったハイブリダイゼー
ションの全量は下記のとおりまとめられる：− 緩衝液Ａは緩衝液Ｄと同等であったが、緩衝液Ｂより
少ないハイブリダイゼーションを示し、後者は緩衝液Ｅ
および緩衝液Ｆと同等であった。ポリエチレングリコー
ルとポリスチレンスルホン酸ナトリウムを含有する緩衝
液である緩衝液Ｃは、最も多量のハイブリダイゼーショ
ンを起こした。
緩衝液Ｂ 緩衝液Ａ 緩衝液Ｃ ＞＞ または ＞＞ または 緩衝液Ｅ 緩衝液Ｄ または 緩衝液Ｆ ポリスチレンスルホン酸ナトリウムまたは硫酸デキス
トランはハイブリダイゼーションに際して形成されるハ
イブリッドの全量を増加させるためにポリエチレングリ
コールと併用しうるが、ポリスチレンスルホン酸ナトリ
ウムはポリエチレングリコールと併用した場合に硫酸デ
キストランより良好に作動すると結論することができ
る。
実施例５ ポリスチレンスルホン酸ナトリウムおよびポリエチレン
グリコールを速度増進剤として併用した場合に、それら
の濃度の変化が及ぼす影響 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： ５×SSC,0.1％SDS、１％ポリエチレングリコール 約2ng/mlの32P−標識Ｎ−ras−挿入DNAプローブをハ
イボンド−N+上のHind III ヒトゲノムDNAサザンブロ
ットにハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーシ
ョン媒質として、下記の緩衝液を用いた：− PSSA＝ポリスチレンスルホン酸ナトリウム 緩衝液Ａ＝コア緩衝液 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋２％PSSA 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋４％PSSA 緩衝液Ｄ＝コア緩衝液＋５％PSSA 緩衝液Ｅ＝コア緩衝液＋６％PSSA 緩衝液Ｆ＝コア緩衝液＋８％PSSA 緩衝液Ｇ＝コア緩衝液＋５％PSSA＋2.5％ポリエチレ
ングリコール 緩衝液Ｈ＝コア緩衝液＋５％PSSA＋５％ポリエチレン
グリコール ブロット上に５、２および１μｇを装填した。
方法２を採用した。
ハイブリダイゼーションは１時間実施された。
結果／結論 結果をオートラジオグラフとして記録した（17時間露
光および５日間露光）。
10％ポリエチレングリコール濃度を維持した場合、ハ
イブリダイゼーションの量はポリスチレンスルホン酸ナ
トリウム濃度の増大に伴って増加する。10％ポリエチレ
ングリコール＋５％ポリスチレンスルホン酸ナトリウム
（緩衝液Ｄ）を用いた場合に最大量のハイブリダイゼー
ションが起こる。これらの速度増進剤のうちいずれかの
濃度がより高い場合（緩衝液E,F,GまたはＨ）、ターゲ
ットにハイブリダイズするプローブの最終量が減少し、
ただしこれと同時に固体支持体に非特異的にハイブリダ
イズするプローブの最終量も減少する。
実施例６ SSC濃度の変化が、10％ポリエチレングリコールおよび
５％ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを含有するハイ
ブリダイゼーション緩衝液の性能に及ぼす影響 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 10％ポリエチレングリコール,5％ポリスチレンスルホ
ン酸ナトリウム 約2ng/mlの32P−標識Ｎ−ras−挿入DNAプローブをハ
イボンド−N+上のHind III ヒトゲノムDNAサザンブロ
ットにハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーシ
ョン媒質として、下記の緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝コア緩衝液 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋５×SSC 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋６×SSC ブロット上に５、２および１μｇを装填した。
方法２を採用した。
ハイブリダイゼーションは１時間実施された。
結果／結論 結果をオートラジオグラフとして記録した（17時間露
光）。
緩衝液Ｂは最大量のハイブリダイゼーションを起こさ
せる。緩衝液Ａは固体支持体へのプローブの最大量の非
特異的結合を起こさせるので不良である。緩衝液Ｃは固
体支持体への非特異的結合が実質的に無いが、この緩衝
液配合物はハイブリダイゼーションが起こるのを阻止す
るので不良である。
実施例７ 異なる速度増進剤が、非放射性レポーター分子で標識さ
れたプローブのハイブリダイゼーションに及ぼす影響 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： ５×SSC,0.1％SDS 10ng/mlのフルオレセイン−dUMP標識ラムダHind III
DNAプローブをハイボンド−N+上のラムダHind III
DNAドットブロットにハイブリダイズさせるためのハイ
ブリダイゼーション媒質として、下記の緩衝液を用い
た：− PSSA＝ポリスチレンスルホン酸ナトリウム 緩衝液Ａ＝コア緩衝液＋５％PSSA＋0.5％遮断剤 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋５％PSSA＋５％硫酸デキスト
ラン＋0.5遮断剤 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋５％硫酸デキストラン＋0.5
％遮断剤 緩衝液Ｄ＝コア緩衝液＋５％PSSA＋10％ポリエチレン
グリコール 緩衝液Ｅ＝コア緩衝液＋５％PSSA＋10％ポリエチレン
グリコール＋0.5％遮断剤 緩衝液Ｆ＝コア緩衝液＋10％PSSA＋10％ポリエチレン
グリコール 緩衝液Ｇ＝コア緩衝液＋10％PSSA＋10％ポリエチレン
グリコール＋0.5％遮断剤 ブロット上に 100、250、500、1000、5000fg 0、 1、 5、 10、 50fg を装填した。
方法３を採用した。
ハイブリダイゼーションは16時間実施された。
結果／結論 結果をルミノグラフとして記録した（30分間露光）。
５％硫酸デキストランを含有する緩衝液Ｃは、この型
のプローブと共に用いるために至適化されていた緩衝液
であった。これは緩衝液Ａと同等であることが分かっ
た。これは本質的に同じ組成であるが、硫酸デキストラ
ンの代わりに５％ポリスチレンスルホン酸ナトリウムが
用いられている。硫酸デキストランおよびポリスチレン
スルホン酸ナトリウムの両方をそれぞれ５％濃度で含有
する緩衝液Ｂを用いることによって、より良好な感度が
達成される。
最大量のハイブリダイゼーションを起こさせる緩衝液
配合物は、緩衝液ＤおよびＥの配合物である。これらの
緩衝液は両方とも５％ポリスチレンスルホン酸ナトリウ
ムおよび10％ポリエチレングリコールを含有する。緩衝
液Ｅに遮断剤を添加すると、膜に非特異的に結合するプ
ローブの量が増加することが分かった。
ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを10％という最大
濃度で含有する緩衝液Ｆは、より少ないプローブハイブ
リダイゼーションを起こさせることが分かった。しかし
緩衝液Ｇにおいて0.5％遮断剤を含有させることによ
り、ハイブリダイゼーションの減少は制限されることが
分かった。
実施例８ カチオン界面活性剤の添加による、ナイロン固体支持体
への標識プローブの非特異的結合の減少 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 10％ポリエチレングリコール、５％ポリスチレンスル
ホン酸ナトリウム、５×SSC 約2ng/mlの32P−標識Ｎ−ras−挿入DNAプローブをハ
イボンド−N+上のHind IIIヒトゲノムDNAサザンブロッ
トにハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーショ
ン媒質として、下記の緩衝液を用いた：− CTAB＝セチルトリメチルアンモニウムブロミド 緩衝液Ａ＝コア緩衝液 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋0.05％CTAB 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋0.1％CTAB 緩衝液Ｄ＝コア緩衝液＋0.5％CTAB 緩衝液Ｅ＝コア緩衝液＋1.0％CTAB ブロット上に５、２および１μｇを装填した。
方法２を採用した。
ハイブリダイゼーションは１時間実施された。
結果／結論 結果を２種のオートラジオグラフとして記録した（３
日および７日間露光）。
CTABは0.05％以上の濃度で固体支持体への非特異的結
合の量を減少させる。最も著しい減少は0.1−0.5％濃度
で起こる。1.0％濃度ではそれ以上の非特異的結合の減
少は起こらない。最適なカチオン界面活性剤濃度は0.1
−0.5％であると思われる。0.5％CTABは非特異的結合を
有意に減少させるが、これはプローブのハイブリダイゼ
ーションが起こるのを0.1％CTAB含有緩衝液の場合と同
程度に阻止するからである。
実施例９ カチオン界面活性剤の添加による、ナイロン固体支持体
への標識プローブの非特異的結合の減少 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 10％ポリエチレングリコール、５％ポリスチレンスル
ホン酸ナトリウム、５×SSC 約2ng/mlの32P−標識Ｎ−ras−挿入DNAプローブをハ
イボンド−N+上のHind IIIヒトゲノムDNAサザンブロッ
トにハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーショ
ン媒質として、下記の緩衝液を用いた：− CTAB＝セチルトリメチルアンモニウムブロミド CPC＝セチルピリジニウムクロリド 緩衝液Ａ＝コア緩衝液 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋0.2％CTAB 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋0.2％CPC ブロット上に５、２および１μｇを装填した。
方法２を採用した。同様に他のプローブ標識法を採用
し（方法2a）、その場合標識すべきDNAをプライマー添
加前に別個に変性し、その方法の他の部分は方法２と同
じである。
６種のハイブリダイゼーションを１時間実施した。
（上記の各方法により標識されたプローブを上記３種
の緩衝液それぞれに添加した）。
結果／結論 結果を２種のオートラジオグラフとして記録した（５
日間露光）。
この例においては、方法２により標識したプローブを
用いた場合、３種の緩衝液すべてについて、固体支持体
への有意量の非特異的結合は見られなかった（図9a）。
しかし界面活性剤が存在しないを含有しない緩衝液にお
いては、固体支持体への方法２により標識したプローブ
の非特異的結合はこれより有意に多かった（緩衝液Ａ）
（図9b）。緩衝液ＢおよびＣ中の0.2％濃度のカチオン
界面活性剤は、ターゲットDNAへのハイブリダイゼーシ
ョンの程度に影響を及ぼすことなく、ナイロン固体支持
体に非特異的に結合するプローブの量を有意に減少させ
た。
この例は、0.2％カチオン界面活性剤の存否は、それ
がCTABまたはCPCのいずれであってもサザンブロットへ
のハイブリダイゼーションの程度に明らかな相異はない
が、カチオン界面活性剤は固体支持体への非特異的結合
の量を減少させうることを示す。
実施例10 ノーザンハイブリダイゼーションへの速度増進剤含有緩
衝液の利用 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 10％ポリエチレングリコール、５％ポリスチレンスル
ホン酸ナトリウム、５×SSC 約2ng/mlの32P−標識した線状HSP70 DNAプローブを
ハイボンド−N+上のHeLa細胞RNAノーザンブロットにハ
イブリダイズさせるためのハイブリダイゼーション媒質
として、下記の緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝コア緩衝液 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋0.2％セチルトリメチルアン
モニウムブロミド 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋0.2％セチルピリジニウムク
ロリド ブロット上に500および1000ngのRNAを装填した。
方法２を採用した。
ハイブリダイゼーションは１時間実施された。
結果／結論 結果を２種のオートラジオグラフとして記録した（16
時間露光）。
３種の緩衝液すべてがこのノーザンハイブリダイゼー
ション用途において良好に作動した。膜に非特異的に結
合したプローブの量には有意差がない。セチルピリジニ
ウムクロリドの使用はこの例においては有利であると思
われる。セチルトリメチルアンモニウムブロミドはター
ゲットRNAにハイブリダイズするプローブの量をわずか
に減少させたと思われるからである。
実施例11 異なる緩衝液配合物を32P−標識プローブと共に用いた
場合のハイブリダイゼーション速度およびハイブリダイ
ズしたDNA全量の相異の測定 材料／方法 この例のコア緩衝液は下記のものである： 10％ポリエチレングリコール、５％ポリスチレンスル
ホン酸ナトリウム、５×SSC 約2ng/mlの32P−標識Ｎ−ras−挿入DNAプローブをハ
イボンド−N+上のHind IIIヒトゲノムDNAサザンブロッ
トにハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーショ
ン媒質として、下記の緩衝液を用いた：− CTAB＝セチルトリメチルアンモニウムブロミド CPC＝セチルピリジニウムクロリド 緩衝液Ａ＝10％ポリエチレングリコールを含有する２
時間迅速ハイブリダイゼーション緩衝液RPN1518（アメ
ルシャム・インターナショナル） 緩衝液Ｂ＝コア緩衝液＋0.2％CTAB 緩衝液Ｃ＝コア緩衝液＋0.2％CPC ブロット上に５、２および１μｇを装填した。
方法２を採用した。
ハイブリダイゼーションは異なる期間実施された。
結果／結論 結果をオートラジオグラフとして記録した（17時間露
光）。バンドの強度（ハイブリダイズした量）をデンシ
トメトリーにより測定した。図２参照。
10％ポリエチレングリコールのほかに５％ポリスチレ
ンスルホン酸ナトリウムを含有する２種の緩衝液Ｂおよ
びＣは、速度増進剤として10％ポリエチレングリコール
のみを含有する緩衝液Ａの速度の約２倍のハイブリダイ
ゼーションを起こさせる。緩衝液Ｃ（0.2％CPCを含有）
は、緩衝液Ｂ（0.2％CTABを含有）より良好である。後
者は最大量のハイブリダイゼーションを２時間以内で起
こさせるからである。
実施例12 異なる緩衝液配合物をフルオレセイン標識プローブと共
に用いた場合のハイブリダイゼーション速度およびハイ
ブリダイズしたDNA全量の相異の測定 材料／方法 10ng/mlのフルオレセイン−dUMP標識Ｎ−ras−挿入DN
Aプローブをハイボンド−N+上のHind IIIヒトゲノムDN
Aサザンブロットにハイブリダイズさせるためのハイブ
リダイゼーション媒質として、下記の緩衝液を用いた：
− CPC＝セチルピリジニウムクロリド 緩衝液Ａ＝５％硫酸デキストラン＋５×SSC＋0.1％SD
S＋0.5％遮断剤 （この例に用いるプローブタイプと共に用いるために
至適化された硫酸デキストラン緩衝液） 緩衝液Ｂ＝10％ポリエチレングリコール＋５％ポリス
チレンスルホン酸ナトリウム＋５×SSC＋0.2％CPC （この緩衝液は32P−標識プローブと共に用いるため
に至適化されたものであるが、同様にフルオレセイン標
識プローブと共に用いられている） ブロット上に２、１および0.5μｇを装填した。
方法３を採用した。
ハイブリダイゼーションは異なる期間実施された。
結果／結論 結果をルミノグラフとして記録した（90分間露光）。
バンドの強度（ハイブリダイズした量）をデンシトメト
リーにより測定した。図３参照。
緩衝液Ｂのハイブリダイゼーション速度は、最初は緩
衝液Ａの場合より６−20倍迅速である。これらの結果
は、５％ポリスチレンスルホン酸ナトリウムおよび10％
ポリエチレングリコールを併用した場合、約２−３倍多
量のプローブDNAがハイブリダイズすることも示す。従
ってポリスチレンスルホン酸ナトリウムおよびポリエチ
レングリコールの組み合わせは硫酸デキストラン自身の
使用より優れている。この例は実施例11と合わせて、こ
の例の緩衝液配合物Ｂが異なるプローブタイプにつき用
いるのに適していることを示す。
実施例13 オリゴヌクレオチドプローブへの速度増進されたハイブ
リダイゼーション緩衝液の適用 材料／方法 10ng/mlの32P−標識されたM13前進配列決定用プライ
マーオリゴヌクレオチドDNAプローブをハイボンド−N+
上のM13 DNAドットブロットにハイブリダイスさせるた
めのハイブリダイゼーション媒質として、下記の緩衝液
を用いた：− 緩衝液Ａ＝５×SSC＋0.1％ハイブリダイゼーション緩
衝液成分（アメルシャムの３′−オリゴ標識用系RPN213
0から）＋0.02％SDS＋0.5％遮断剤 緩衝液Ｂ＝10％ポリエチレングリコール＋５％ポリス
チレンスルホン酸ナトリウム＋５×SSC＋0.2％CPC （この緩衝液は32P−標識プローブと共に用いるため
に至適化されたものであるが、同様にフルオレセイン標
識プローブと共に用いられている） ブロット上に 100、200、500pg 10、 20、 50pg を装填した。
方法３を採用した。
ハイブリダイゼーションは異なる期間実施された。
結果／結論 結果をオートラジオグラフとして記録した（５日間露
光）。
ハイブリダイゼーション速度は、速度増進された緩衝
液Ｂの場合、単純なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーション緩衝液である緩衝液Ａの場合より約２倍速い。
このハイブリダイゼーションに一定の期間を採用した場
合、結合したオリゴヌクレオチドの全量も速度増進され
た緩衝液（緩衝液Ｂ）の場合がより多い。この例は、オ
リゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの速度をハイ
ブリダイゼーション媒質中にポリスチレンスルホン酸ナ
トリウムおよびポリエチレングリコールを用いることに
よって促進しうることを示す。
実施例14 インサイチューハイブリダイゼーション法への速度増進
されたハイブリダイゼーション緩衝液の適用 材料／方法 100ng/mlのフルオレセイン−11−dUTP標識されたプロ
−オピオメラノ−コルチコトロピンホルモンDNAプロー
ブ（方法３により標識）を顕微鏡用ガラススライド上に
固定化された8umラット下垂体切片にハイブリダイズさ
せるためのハイブリダイゼーション媒質として、下記の
緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝５％ポリスチレンスルホン酸ナトリウム＋
6M尿素＋120mM Tris/HCl pH8.0＋0.4％SDS＋0.5M Na
Cl＋５％遮断剤 緩衝液Ｂ＝10％硫酸デキストラン＋50％脱イオン化ホ
ルムアミド＋0.02％ポリビニルピロリドン＋0.02％ウシ
血清アルブミン＋0.02％ファイコル＋４×SSC＋0.25mg/
ml酵母tRNA＋0.5mg/ml変性ニシン精子DNA ハイブリダイゼーションは42℃で17時間実施された。
ストリンジェンシー洗浄は下記に従って実施された：
− （ａ）２×SSC、0.1％SDS、室温で３×５分間。
（ｂ）0.2×SSC、0.1％SDS、42℃で２×15分間。
切片のブロッキング、抗体のインキュベーションおよ
び洗浄は方法３に従って実施された。用いた抗体は抗−
フルオレセイン抗体のアルカリホスファターゼコンジュ
ゲートであり、原液の1:1000で用いられた。
検出はアルカリホスファターゼ基質NBT/BCIPによるも
のであり、これによりハイブリダイゼーション部位に青
色の沈殿を生じた。
結果／結論 検出された切片を、ツァイス顕微鏡により×10および
×40の対物レンズを用いて観察した。切片の適正な領域
に信号が見えた。２種の異なるハイブリダイゼーション
緩衝液から得た結果は等しかった。従って緩衝液Ａは速
度増進剤として硫酸デキストランを含有する緩衝液と同
じ挙動を示す。
実施例15 インサイチューハイブリダイゼーション法への速度増進
されたハイブリダイゼーション緩衝液の適用 材料／方法 10ng/mlの35S−UTP標識されたプロ−オピオメラノ−
コルチコトロピンホルモンRNAプローブ（ペアード・プ
ロモーターSP6系RPM2006により標識、アメルシャム・イ
ンターナショナルplc.）を顕微鏡用ガラススライド上に
固定化された8umラット下垂体切片にハイブリダイズさ
せるためのハイブリダイゼーション媒質として、下記の
緩衝液を用いた：− 緩衝液Ａ＝５％ポリスチレンスルホン酸ナトリウム＋
6M尿素＋120mM Tris/HCl pH8.0＋0.4％SDS＋0.5M Na
Cl＋５％遮断剤 緩衝液Ｂ＝10％硫酸デキストラン＋50％脱イオン化ホ
ルムアミド＋0.02％ポリビニルピロリドン＋0.02％ウシ
血清アルブミン＋0.02％ファイコル＋４×SSC＋0.25mg/
ml酵母tRNA＋0.5mg/ml変性ニシン精子DNA ハイブリダイゼーションは55℃で17時間実施された。
ストリンジェンシー洗浄は下記に従って実施された：
− （ａ）２×SSC、0.1％SDS、室温で３×５分間。
（ｂ）0.1×SSC、0.1％SDS、55℃で２×15分間。
検出はスライドを核トラック（nuclear track）写真
乳剤でコーティングし、暗所で４℃において必要な期間
（一般に４−７日間）露光させることにより行われた。
結果／結論 検出された切片を、ツァイス顕微鏡により×10および
×40の対物レンズを用いて観察した。切片の適正な領域
に、組織形態を覆う沈着銀粒子として信号が見えた。２
種の異なるハイブリダイゼーション緩衝液から得た結果
は等しかった。従って緩衝液Ａは速度増進剤として硫酸
デキストランを含有する緩衝液と同じ挙動を示す。
方法１ プローブの調製 ECL直接核酸標識用および検出系RPN3000（アメルシャ
ム・インターナショナルplc）を用いて、100ngの標識反
応を行った。
1.1 標識すべきDNAを融解する。
1.2 10μｌのDNA（10ng/μｌ、水中）をミクロ遠心管
中で沸騰水浴中において95−100℃に５分間加熱するこ
とにより変性する。氷上に５分間乗せる。ミクロ遠心機
により遠心管を遠心し、遠心管の底にある物質を採集す
る。
1.3 各遠心管に等容量の標識用試薬（電荷修飾（char
ge−modified）ホースラディッシュ・ペルオキシダー
ゼ）を添加する。十分に撹拌する。
1.4 標識用試薬の容量と等容量のグルタルアルデヒド
溶液を添加し、十分に撹拌する。
1.5 遠心管を37℃で10分間インキュベートする。
1.6 反応物をハイブリダイゼーション反応に添加する
用意ができるまで最高30分間、氷上に乗せておく。
1.7 すべての反応物をプールする。
1.8 この時点で必要ならば、グリセリンを最終濃度50
％となるように添加することにより標識プローブDNAを
−20℃に保存することができる。
ハイブリダイゼーション 1.9 ハイブリダイゼーション緩衝液を42℃に予熱す
る。
1.10 ブロットをハイブリダイゼーション緩衝液中で予
備ハイブリダイズする。用いる容量は0.25ml/cm2（膜）
とすべきである。ただし必要な最少容量は5.5×3.5cmの
ボックス内では5mlであり、7.5×4.5cmのボックス内で
は10mlである。必要な容量の緩衝液をボックスに添加す
る。ブロットを緩衝液の表面に乗せ、予備湿潤させ、次
いで浸漬する。プローブが完全に緩衝液で覆われること
を確認する。
1.11 振盪水浴中において42℃で10分間インキュベート
する。
1.12 標識プローブを最終濃度10ng/mlとなるように各
ボックスに添加する（すなわち30μｌの標識プローブを
10mlの緩衝液に添加する）。ボックスを両側に傾けるこ
とにより、または緩和に撹拌することにより、十分に混
合する。
1.13 振盪水浴中において42℃で必要な期間、ハイブリ
ダイズする。
ストリンジェンシー洗浄 1.14 ブロットをピンセットで慎重にボックスから取り
出し、以下の一連のストリンジェンシー洗浄に用いるす
べてのブロットを一緒に洗浄する。これらの洗浄には最
少容量100mlが必要であり、洗浄は振盪水浴中で実施す
べきである。１回目のストリンジェンシー洗浄用緩衝液
（ａ）は使用前に42℃に予熱しておくべきである。
ａ） 6M尿素、0.5×SSC、0.4％SDS、42℃で２×20分
間。
ｂ） ２×SSC、室温で２×５分間。
ECL検出 1.15 等容量の検出用試薬１と検出用試薬２を混合し、
ブロットを覆うのに十分な量を得る（0.125ml/cm2が推
奨される）。
1.16 ブロットを除水し、DNA側を上にしてサランラッ
プ片を乗せる。混合したECL試薬をブロットの表面に添
加し、１分間放置する。
1.17 ティッシュ上のブロットを除水し、DNA側を下に
して新たなサランラップ片に乗せる。余分なサランラッ
プをブロットの裏側へ折り込み、エアポケットがあれ
ば、押し出す。
1.18 ブロットを、オートラジオグラフ用Ｘ線フィルム
に30分間露光する。
1.19 フィルムをフィルムプロセッサーにより処理す
る。
方法２ プローブの調製 メガプライム標識用キットRPN1606（アメルシャム・
インターナショナルplc）を用いて、25ngの標識反応を
行った。
2.1 標識すべきDNA、標識用緩衝液およびプライマー
溶液を氷浴中で融解する。（ａ−32P）−dCTPをフード
内で融解する。酵素は必要になるまで−20℃のフリーザ
ーから取り出してはならない。
2.2 DNAをPF水により10ng/μｌに希釈する。
2.3 各ミクロ遠心管に2.5μｌのDNA（25ng）、次いで
５μｌのプライマー、次いで25.5μｌの水を装入する。
2.4 これを沸騰水浴中において95−100℃に５分間加
熱することにより変性する。次いで室温にさらに５分間
放置する。ミクロ遠心機により遠心管を遠心し、遠心管
の底にある物質を採集する。
2.5 各遠心管に10μｌの標識用緩衝液を室温で添加す
る。
2.6 適宜な32Pスクリーン設備を備えた換気フードに
遠心管を移し、下記を添加する： （ａ−32P）−dCTP PB10205 ５μｌ 酵素溶液 ２μｌ 2.7 ピペットで徐々に吸入排出することにより、緩和
に混合する（酵素活性の著しい損失が起こる可能性があ
るので、激しい撹拌を避ける）。遠心管にキャップをす
る。
2.8 遠心管をミクロ遠心機により３秒間遠心し、遠心
管の底にある物質を採集する。
2.9 遠心管を37℃で10分間インキュベートする。
2.10 ５μｌの0.5M EDTA（pH8.0）を各遠心管に添加
することにより、反応を停止する。
2.11 すべての反応物をプールする。
2.12 いずれか適切な方法により取込み率％を調べる。
ハイブリダイゼーション 2.13 ハイブリダイゼーション緩衝液を65℃に予熱す
る。
2.14 ブロットをハイブリダイゼーション緩衝液中で予
備ハイブリダイズする。用いる容量は0.25ml/cm2（膜）
とすべきである。ただし必要な最少容量は5.5×3.5cmの
ボックス内では5mlであり、7.5×4.5cmのボックス内で
は10mlである。必要な容量の緩衝液をボックスに添加す
る。ブロットを緩衝液の表面に乗せ、予備湿潤させ、次
いで浸漬する。プローブが完全に緩衝液で覆われること
を確認する。
2.15 振盪水浴中において65℃で15分間インキュベート
する。
2.16 プローブを沸騰水浴中において95−100℃で５分
間変性し、氷上で冷却する。
2.17 5mlのハイブリダイゼーション緩衝液当たり14μ
ｌの新たに変性したプローブを添加する（約2ng/ml）。
プローブは可能な限りブロットから離れた位置に添加す
る。ボックスを両側に傾けることにより、または緩和に
撹拌することにより、十分に混合する。
2.18 振盪水浴中において65℃で２時間、ハイブリダイ
ズする。
ストリンジェンシー洗浄 2.19 ブロットをピンセットで慎重にボックスから取り
出し、以下の一連のストリンジェンシー洗浄に用いるす
べてのブロットを一緒に洗浄する（これらの洗浄にはそ
れぞれ100ml容量中での撹拌が必要である）。
ａ） ２×SSC、0.1％SDS、室温で20分間。
ｂ） 0.5×SSC、0.1％SDS、65℃で２×15分間（溶液を
予熱しておくべきである）。
検出 2.20 ブロットを濾紙上で乾燥させる。湿ったブロット
をサランラップに包む。気泡があれば、ティッシュで押
し出す。これらはオートラジオグラフを妨害するからで
ある。
２枚の増感紙を付与したＸ線フィルムに露光し、−70
℃のフリーザーに16時間入れておく。
2.21 フィルムをフィルムプロセッサーにより処理す
る。
2.22 さらに１枚のＸ線フィルムを上記に従って数日間
露光し、そして処理する。
方法３ プローブの調製 ECLランダムプライム標識用および検出系RPN3030（ア
メルシャム・インターナショナルplc）を用いて、50ng
の標識反応を行った。
3.1 標識すべきDNA、キットからのヌクレオチドミッ
クス、プライマー溶液および水を氷浴中で融解する。酵
素は必要になるまで−20℃のフリーザーから取り出して
はならない。
3.2 ５μｌのDNA（10ng/μｌ）をミクロ遠心管中で沸
騰水浴中において95−100℃に５分間加熱することによ
り変性する。次いで氷上に５分間乗せる。ミクロ遠心機
により遠心し、遠心管の底にある物質を採集する。
3.3 各遠心管に下記を添加する： ５μl プライマーミックス 10μｌ ヌクレオチドミックス（F1−dUTP,dATP,dCT
P,dGTPおよびdTTPを含有） 29μｌ 水 １μl 酵素溶液 3.4 ピペットで徐々に吸入排出することにより、緩和
に混合する（酵素活性の著しい損失が起こる可能性があ
るので、激しい撹拌を避ける）。遠心管にキャップをす
る。
3.5 遠心管を37℃で60分間インキュベートする。
3.6 ２μｌの0.5M EDTA（pH8.0）を各遠心管に添加
することにより、反応を停止する。
3.7 すべての反応物をプールする。
3.8 必要ならばこの時点で標識プローブDNAを−20℃
に保存することができる。
ハイブリダイゼーション 3.9 ハイブリダイゼーション緩衝液を60℃に予熱す
る。
3.10 ブロットをハイブリダイゼーション緩衝液中で予
備ハイブリダイズする。用いる容量は0.25ml/cm2（膜）
とすべきである。ただし必要な最少容量は5.5×3.5cmの
ボックス内では5mlであり、7.5×4.5cmのボックス内で
は10mlである。必要な容量の緩衝液をボックスに添加す
る。ブロットを緩衝液の表面に乗せ、予備湿潤させ、次
いで浸漬する。プローブが完全に緩衝液で覆われること
を確認する。
3.11 振盪水浴中において60℃で30分間インキュベート
する。
3.12 プローブを沸騰水浴中において95−100℃で５分
間変性し、氷上で冷却する。
3.13 各ボックスに最終濃度10ng/mlになるように変性
プローブを添加する（すなわち10mlの緩衝液に25μｌを
添加）。プローブは可能な限りブロットから離れた位置
に添加する。ボックスを両側に傾けることにより、また
は緩和に撹拌することにより、十分に混合する。
3.14 振盪水浴中において60℃で２時間、ハイブリダイ
ズする。
ストリンジェンシー洗浄 3.15 ブロットをピンセットで慎重にボックスから取り
出し、以下の一連のストリンジェンシー洗浄に用いるす
べてのブロットを一緒に洗浄する。これらの洗浄にはそ
れぞれ最少容量100mlが必要であり、洗浄は振盪水浴中
で実施すべきである。ストリンジェンシー洗浄用緩衝液
は使用前に60℃に予熱すべきである。
ａ） １×SSC、0.1％SDS、60℃で15分間。
ｂ） 0.5×SSC、0.1％SDS、60℃で15分間。
抗体の遮断、インキュベーションおよび洗浄 3.16 すべてのブロットを抗体洗浄用緩衝液中で室温に
おいて８−10分間リンスする。
3.17 すべてのブロットを一緒に100mlの遮断緩衝液中
で室温において60分間、緩和に撹拌しながらインキュベ
ートする。すべてのブロットが自由に移動することを確
認する。
3.18 ブロットを抗体洗浄用緩衝液中で室温において１
分間リンスする。
3.19 抗−フルオレセイン抗体−HRPコンジュゲートを
抗体インキュベーション用緩衝液中に1000倍希釈する
（すなわち100ml中に100μｌ）。必要な容量はハイブリ
ダイゼーションに用いたものと少なくとも当量、すなわ
ち0.25ml/cm2とすべきである。
3.20 ブロットを希釈抗体コンジュゲート中において室
温で60分間、緩和に撹拌しながらインキュベートする。
3.21 室温の洗浄溶液中において緩和に撹拌しながら、
２×10分間、次いで２×５分間洗浄することにより、結
合していないコンジュゲートを除去する。過剰量（2ml/
cm2）を用いる（フィルターをすべて一緒に、１回の洗
浄につき約100ml中で洗浄しうる）。
ECL検出 3.22 等容量の検出試薬１と検出試薬２を混合して、ブ
ロットを覆うのに十分な量を得る（0.125ml/cm2が推奨
される）。
3.23 ブロットを除水し、DNA側を上にしてサランラッ
プ片に乗せる。混合ECL試薬をブロットの表面に添加
し、１分間放置する。
3.24 ブロットをティッシュ上で除水し、DNA側を下に
して新たなサランラップ片に乗せる。余分なサランラッ
プをブロットの裏面に折り込み、エアポケットがあれば
押し出す。
3.25 ブロットをＸ線フィルムに60分間露光する。
3.26 フィルムをフィルムプロセッサーにより処理す
る。
方法４ プローブの調製 ３′−末端標識用キットN4020（アメルシャム・イン
ターナショナルplc）を用いて、10pmoleの標識反応を行
った。
4.1 標識すべきオリゴヌクレオチドDNA（たとえばM13
前進配列形成プライマー）および標識用緩衝液を氷浴中
で融解する。（ａ−32P）−dATPをフード内で融解す
る。酵素は必要になるまで−20℃のフリーザーから取り
出してはならない。
4.2 DNAを２回蒸留水により1pmole/μｌに希釈する。
4.3 各ミクロ遠心管に10μｌのDNA（10pmole）、次い
で25μｌの水を装入する。
4.4 各遠心管に５μｌの標識用緩衝液を室温で添加す
る。
4.5 適宜な32Pスクリーン設備を備えた換気フードに
遠心管を移し、下記を添加する： （ａ−32P）−dATP PB10204 ５μｌ ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ ５μｌ 4.6 ピペットで徐々に吸入排出することにより、緩和
に混合する（酵素活性の著しい損失が起こる可能性があ
るので、激しい撹拌を避ける）。遠心管にキャップをす
る。
4.7 遠心管をミクロ遠心機により３秒間遠心し、遠心
管の底にある物質を採集する。
4.8 遠心管を37℃で45分間インキュベートする。
4.9 ５μｌの0.5M EDTA（pH8.0）を各遠心管に添加
することにより、反応を停止する。
4.10 すべての反応物をプールする。
4.11 いずれか適切な方法により取込み率％を調べる。
ハイブリダイゼーション 4.12 ハイブリダイゼーション緩衝液を42℃に予熱す
る。
4.13 ブロットをハイブリダイゼーション緩衝液中で予
備ハイブリダイズする。用いる容量は0.25ml/cm2（膜）
とすべきである。ただし必要な最少容量は5.5×3.5cmの
ボックス内では5mlであり、7.5×4.5cmのボックス内で
は10mlである。必要な容量の緩衝液をボックスに添加す
る。ブロットを緩衝液の表面に乗せ、予備湿潤させ、次
いで浸漬する。プローブが完全に緩衝液で覆われること
を確認する。
4.14 振盪水浴中において42℃で15分間インキュベート
する。
4.15 5mlのハイブリダイゼーション緩衝液当たり５μ
ｌのプローブを添加する（約10ng/ml）。プローブは可
能な限りブロットから離れた位置に添加する。ボックス
を両側に傾けることにより、または緩和に撹拌すること
により、十分に混合する。
4.16 振盪水浴中において42℃で必要な時間、ハイブリ
ダイズする。
ストリンジェンシー洗浄 4.17 ブロットをピンセットで慎重にボックスから取り
出し、以下の一連のストリンジェンシー洗浄に用いるす
べてのブロットを一緒に洗浄する（これらの洗浄にはそ
れぞれ100ml容量中での撹拌が必要である）。
ａ） ５×SSC、0.1％SDS、室温で２×５分間。
ｂ） １×SSC、0.1％SDS、42℃で２×15分間（溶液を
予熱しておくべきである）。
検出 4.18 ブロットを濾紙上で乾燥させる。湿ったブロット
をサランラップに包む。気泡があれば、ティッシュで押
し出す。これらはオートラジオグラフを妨害するからで
ある。
２枚の増感紙を付与したＸ線フィルムに露光し、−70
℃のフリーザーに16時間入れておく。
4.19 フィルムをフィルムプロセッサーにより処理す
る。
4.20 さらに１枚のＸ線フィルムを上記に従って数日間
露光し、そして処理する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−54697（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃ ｈｅｍ．39（10）ｐ．1377−1384 （1991) Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 93 （５）ｐ．537−540（1990) Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 89 （３）ｐ．269−275（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】相補的ポリヌクレオチドを緩衝化された水
    性媒質中でハイブリダイゼーション条件下に保持するこ
    とよりなる相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼー
    ション法であって、緩衝化された水性媒質が、検知しう
    るほどのハイブリダイゼーションの速度および／または
    程度の増大を生じる濃度でポリビニルアルコールおよび
    ／またはポリスチレンスルホン酸を含有することを特徴
    とする方法。
  2. 【請求項２】検知しうるほどの相補的ポリヌクレオチド
    のハイブリダイゼーションの速度および／または程度の
    増大を生じるのに有効な濃度でポリビニルアルコールお
    よび／またはポリスチレンスルホン酸を含有することを
    特徴とする、ハイブリダイゼーション緩衝液。
JP50194193A 1991-07-01 1992-06-30 ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの増進 Expired - Lifetime JP3236293B2 (ja)

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