JP3233779U - Two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light - Google Patents

Two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light Download PDF

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昌剣
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鄭慧琳
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Abstract

【課題】励起スポットと損失光スポットを素早く高精度で集束させる、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供する。
【解決手段】連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡１０であって、二光子イメージングユニット１００とＳＴＥＤイメージングユニット２００を備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニット１００を用い、サンプルの表層における興味がある領域の場合、ＳＴＥＤイメージングユニット２００を用いることができ、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡にＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングという２種の機能を集積させる。
【選択図】図１PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light, which can quickly and accurately focus an excitation spot and a loss light spot.
SOLUTION: The two-photon stimulated emission suppression composite microscope 10 using continuous loss light is provided with a two-photon imaging unit 100 and a STED imaging unit 200, and in the case of a thick sample, the two-photon imaging unit 100 is used to obtain a sample. In the case of an area of interest on the surface layer, the SSTD imaging unit 200 can be used, and two types of functions, SSTD imaging and two-photon imaging, are integrated in a two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light.
[Selection diagram] Fig. 1

Description

本考案は、顕微光学イメージングの技術分野に関し、特に、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に関する。 The present invention relates to the technical field of microscopic optical imaging, and particularly to a two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light.

超解像度光学顕微鏡法では、イメージングの解像度が光回折の限界を超え、そのイメージング解像度が従来の光学顕微鏡よりもはるかに高く、近年の研究の焦点となっており、さまざまなタイプのものが現れる。誘導放出抑制（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ、ＳＴＥＤ）顕微鏡法は、初めて提案されており直接光回折の限界を克服する遠視野光学顕微鏡法であり、レーザー共焦点顕微イメージングに基づくものであり、他のタイプの超解像度顕微鏡法に比べて、イメージングの速度が高く、生細胞をイメージングすることができ、生物医学の研究においてより精細な構造を検出できる。 In ultra-resolution optical microscopy, the resolution of imaging exceeds the limits of optical diffraction, and the imaging resolution is much higher than that of conventional optical microscopes, which has become the focus of recent research, and various types emerge. Stimulated Emission Depletion (STED) microscopy is the first proposed far-field optical microscopy that overcomes the limitations of direct light diffraction, is based on laser confocal microscopy, and is of another type. Compared to ultra-resolution microscopy, the imaging speed is higher, living cells can be imaged, and finer structures can be detected in biomedical research.

ＳＴＥＤイメージングは、解像度が極めて高いものの、イメージング深度が低く、二光子顕微イメージングは、解像度が悪いが、近赤外光を用いるため、イメージング深度が高く、しかしながら、現在、厚いサンプルの場合、二光子イメージングを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングを用い得る、ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させた複合顕微鏡についての報告はまだ提案されていない。 STED imaging has extremely high resolution, but the imaging depth is low, and two-photon microscopy has poor resolution, but because it uses near-infrared light, the imaging depth is high. No report has yet been proposed for a composite microscope that integrates two functions, SSTD imaging and two-photon imaging, which can use STED ultra-resolution imaging for areas of interest on the surface of the sample using imaging. ..

これを鑑み、従来技術に存在している欠陥に対して、励起スポットと損失光スポットを素早く高精度で集束させ得る、連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供することが求められる。 In view of this, it is required to provide a two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light that can quickly and accurately focus the excitation spot and the loss light spot for the defects existing in the prior art. Be done.

上記の目的を達成させるために、本考案は下記の技術案を採用する。 In order to achieve the above object, the present invention adopts the following technical proposal.

連続光損失を用いた二光子刺激発光損失複合顕微鏡であって、二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第１反射鏡、第２反射鏡、第１レンズと第２レンズからなるビームエキスパンダ、第３反射鏡、第１ダイクロイックミラー、λ／４スライド、第４反射鏡、ＸＹスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第２ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、フィルタ、第５反射鏡、第３レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ／４スライドに入り、さらに前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順に経て前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第５反射鏡によって反射され、前記第３レンズに入り、前記第３レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記ＳＴＥＤイメージングユニットは、前記フェムト秒レーザー、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、前記第１レンズと前記第２レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第３反射鏡、連続レーザー、第６反射鏡、第７反射鏡、第８反射鏡、位相板、前記第１ダイクロイックミラー、前記λ／４スライド、前記第４反射鏡、前記ＸＹスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第２ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、前記サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、前記フィルタ、前記第５反射鏡、第４レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第５反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過して励起光を形成し、
前記連続光レーザーから放射されたレーザー光は、前記第６反射鏡と前記第７反射鏡を経た後、前記第８反射鏡に入り、前記第８反射鏡を経た後、前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第１ダイクロイックミラーによって反射されて損失光となり、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第１ダイクロイックミラーを経て集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドに入って偏光調整され、前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズＴＬを順に経た後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第５反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第４レンズに直接入り、前記第４レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現する。 It is a two-photon stimulation emission loss composite microscope using continuous light loss, and is equipped with a two-photon imaging unit and a STED imaging unit.
The two-photon imaging unit includes a femtosecond laser, a first reflector, a second reflector, a beam expander composed of a first lens and a second lens, a third reflector, a first dichroic mirror, a λ / 4 slide, and a first lens. 4 reflector, XY scan galvanometer, scanning lens, tube lens, 2nd dichroic mirror, objective lens, 3D nanodisplacement platform for placing samples, filter, 5th reflector, 3rd lens, and photoelectron multiplier Including
The femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser is reflected by the first reflecting mirror and the second reflecting mirror and enters a beam expander composed of the first lens and the second lens, and the light beam is emitted. After being emitted from the second lens, it is reflected by the third reflecting mirror, enters the first dichroic mirror, passes through the first dichroic mirror, enters the λ / 4 slide, and further enters the fourth. The light beam reflected by the reflector and enters the XY scan galvanometer, and the light beam emitted from the XY scan galvanometer enters the second dichroic mirror via the scanning lens and the tube lens in order, and enters the second dichroic mirror. The transmitted light beam enters the objective lens and is focused by the objective lens on the sample on the three-dimensional nanodisplacement platform, and the fluorescence emitted from the sample is collected by the objective lens and then the first. The second dichroic mirror enters and is reflected by the second dichroic mirror and enters the filter, the filter suppresses incident laser light and transmits fluorescence, and the fluorescence transmitted through the filter is the fifth. The light beam reflected by the reflector and entering the third lens and focused by the third lens enters the photoelectron multiplier tube, thereby realizing detection of the diphoton imaging fluorescence signal.
The SSTD imaging unit includes the femtosecond laser, the first reflecting mirror, the second reflecting mirror, the beam expander including the first lens and the second lens, the third reflecting mirror, the continuous laser, and the sixth. Reflector, 7th reflector, 8th reflector, phase plate, 1st dichroic mirror, λ / 4 slide, 4th reflector, XY scan galvanometer, scanning lens, tube lens, 2nd It comprises a dichroic mirror, the objective lens, a three-dimensional nanodisplacement platform for placing the sample, the filter, the fifth reflector, the fourth lens, a pinhole, and an avalanche diode, the fifth reflector is located. Movable out of the light path,
The femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser is reflected by the first reflecting mirror and the second reflecting mirror and enters a beam expander composed of the first lens and the second lens, and the light beam is emitted. After being emitted from the second lens, it is reflected by the third reflecting mirror, enters the first dichroic mirror, and passes through the first dichroic mirror to form excitation light.
The laser light emitted from the continuous light laser enters the eighth reflecting mirror after passing through the sixth reflecting mirror and the seventh reflecting mirror, passes through the eighth reflecting mirror, and then enters the phase plate. The light beam transmitted through the phase plate is reflected by the first dichroic mirror to become lost light, and the excitation light and the lost light are focused through the first dichroic mirror, and the focused light beam is generated. The light beam that enters the λ / 4 slide, is polarized, is reflected by the fourth reflector, enters the XY scan galvanometer, and is emitted from the XY scan galvanometer, sequentially passes through the scanning lens and the tube lens TL. After that, the light beam that enters the second dichroic mirror and passes through the second dichroic mirror enters the objective lens and is focused by the objective lens on the sample on the three-dimensional nanodisplacement platform from the sample. The emitted fluorescence enters the second dichroic mirror after being collected by the objective lens and is reflected by the second dichroic mirror and enters the filter, which suppresses the incident laser light. , The fifth reflector is moved out of the light path where it is located, and the fluorescence transmitted through the filter enters the fourth lens directly and is focused on the pinhole at the focal position of the fourth lens. Then, the light beam emitted from the pinhole enters the avalanche diode, thereby realizing the detection of the STED imaging fluorescence signal.

いくつかの好適な実施例では、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、第６反射鏡、及び前記第７反射鏡はいずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できる。 In some preferred embodiments, the first reflector, the second reflector, the third reflector, the fourth reflector, the fifth reflector, the sixth reflector, and the seventh reflector are all. The angle can be adjusted around the XY axes.

いくつかの好適な実施例では、前記第１反射鏡及び前記第２反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできる。 In some preferred embodiments, by adjusting the angles of the first and second reflectors around the XY axes, the light beam emitted from the femtosecond laser beam is quickly delivered to the composite microscope. Can be accessed.

いくつかの好適な実施例では、前記第６反射鏡及び前記第７反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、連続光レーザーから放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできる。 In some preferred embodiments, by adjusting the angles of the sixth and seventh reflectors around the XY axes, the light beam emitted by the continuous light laser quickly accesses the composite microscope. can.

いくつかの好適な実施例では、前記第３反射鏡の角度をＸ軸又はＹ軸の周りに調整し、Ｘ方向又はＹ方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のＺ方向に沿って前記第２レンズの位置を調整し、Ｚ方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせる。 In some preferred embodiments, the angle of the third reflector is adjusted around the X or Y axis, the position of the excitation light spot in the X or Y direction is adjusted, and along the Z direction of the optical axis. By adjusting the position of the second lens and adjusting the position of the excitation light spot in the Z direction, the excitation light spot and the loss light spot are accurately overlapped with each other.

いくつかの好適な実施例では、前記第２レンズの光軸の、ｚ方向に沿う位置が調整可能である。いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の位相分布は、０〜２πのらせん分布である。 In some preferred embodiments, the position of the optical axis of the second lens along the z direction is adjustable. In some preferred embodiments, the phase distribution on the phase plate is a spiral distribution from 0 to 2π.

いくつかの好適な実施例では、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動させ、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かない。 In some preferred embodiments, when detecting a two-photon imaging fluorescence signal, the XY scan galvanometer scans and moves the light beam and the three-dimensional nanodisplacement platform does not move.

いくつかの好適な実施例では、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現する。 In some preferred embodiments, the XY scan galvanometer does not perform a mobile scan and remains in the zero position when detecting the STED imaging fluorescence signal, and the 3D nanodisplacement platform entrains the scan movement of the sample. , Achieve imaging.

いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーは、前記連続光損失を用いた二光子刺激発光損失複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。 In some preferred embodiments, the femtosecond laser and the continuous light laser are detachably attached to a two-photon stimulation emission loss composite microscope using the continuous light loss.

本考案では、上記技術案による利点は以下のとおりである。 In the present invention, the advantages of the above technical proposal are as follows.

本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングユニットを用いることができ、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、ＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。 The two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light according to the present invention is provided with a two-photon imaging unit and a STED imaging unit. In the case of, the STED super-resolution imaging unit can be used, and the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light according to the present invention integrates two types of functions, STD imaging and two-photon imaging, and is the most suitable. Provides powerful tools for advanced biomedical research.

本考案の実施例又は従来技術の技術案をより明確に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に必要な図面を簡単に説明するが、無論、以下の説明における図面は本考案の実施例の一部に過ぎず、当業者であれば、創造的な努力を必要とせずに、これらの図面に基づいて他の図面を得ることもできる。
本考案の実施例に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の構造模式図である。 本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の対物レンズの焦点での励起スポットの光強度分布である。 本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡の対物レンズの焦点での損失光スポットの光強度分布である。 In order to more clearly explain the embodiment of the present invention or the technical proposal of the prior art, the drawings necessary for the explanation of the embodiment or the prior art will be briefly described below, but of course, the drawings in the following description are the present invention. It is only a part of the embodiment of the above, and a person skilled in the art can obtain other drawings based on these drawings without any creative effort.
It is a structural schematic diagram of the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous loss light which concerns on the Example of this invention. It is the light intensity distribution of the excitation spot at the focal point of the objective lens of the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous loss light according to the present invention. It is the light intensity distribution of the loss light spot at the focal point of the objective lens of the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous loss light according to the present invention.

以下、本考案の実施例の図面を参照しながら、本考案の実施例の技術案を明瞭かつ完全に説明するが、無論、説明する実施例は、本考案の実施例の一部に過ぎず、すべての実施例ではない。本考案の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力を必要とせずに得たすべてのほかの実施例は、本考案が保護する範囲に属する。 Hereinafter, the technical proposal of the embodiment of the present invention will be clearly and completely described with reference to the drawings of the embodiment of the present invention, but of course, the illustrated example is only a part of the embodiment of the present invention. , Not all examples. All other examples obtained by those skilled in the art based on the embodiments of the present invention without the need for creative effort fall within the scope of the present invention.

図１は、本考案の実施例に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡１０の構造模式図を示し、二光子イメージングユニット１００とＳＴＥＤイメージングユニット２００を備える。 FIG. 1 shows a schematic structural diagram of a two-photon stimulated emission suppression composite microscope 10 using continuous loss light according to an embodiment of the present invention, and includes a two-photon imaging unit 100 and a STED imaging unit 200.

前記二光子イメージングユニット１００は、フェムト秒レーザー１１０、第１反射鏡Ｍ１、第２反射鏡Ｍ２、第１レンズＬ１と第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダ、第３反射鏡Ｍ３、第１ダイクロイックミラーＤＭ１、λ／４スライド１２０、第４反射鏡Ｍ４、ＸＹスキャンガルバノメータ１３０、走査レンズＳＬ、チューブレンズＴＬ、第２ダイクロイックミラーＤＭ２、対物レンズＯＬ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム１４０、フィルタＦ１、第５反射鏡Ｍ５、第３レンズＬ３、及び光電子増倍管１５０を備える。 The two-photon imaging unit 100 includes a femtosecond laser 110, a first reflecting mirror M1, a second reflecting mirror M2, a beam expander including a first lens L1 and a second lens L2, a third reflecting mirror M3, and a first dichroic mirror. DM1, λ / 4 slide 120, 4th reflector M4, XY scan galvanometer 130, scanning lens SL, tube lens TL, 2nd dichroic mirror DM2, objective lens OL, 3D nanodisplacement platform 140 for placing samples, filter It includes F1, a fifth reflector M5, a third lens L3, and a photoelectron multiplier tube 150.

本考案の実施例に係る二光子イメージングユニット１００の作動方式は以下のとおりである。 The operating method of the two-photon imaging unit 100 according to the embodiment of the present invention is as follows.

前記フェムト秒レーザー１１０から放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡Ｍ１と前記第２反射鏡Ｍ２によって反射され、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズＬ２から射出された後、前記第３反射鏡Ｍ３によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１に入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を透過した後、前記λ／４スライド１２０に入り、さらに前記第４反射鏡Ｍ４によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０に入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０から射出された光ビームは、前記走査レンズＳＬと前記チューブレンズＴＬを順に経て前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２を透過した光ビームは、前記対物レンズＯＬに入り、且つ前記対物レンズＯＬによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム１４０にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズＯＬによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２によって反射され、前記フィルタＦ１に入り、前記フィルタＦ１は、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記フィルタＦ１を透過した蛍光は、前記第５反射鏡Ｍ５によって反射され、前記第３レンズＬ３に入り、前記第３レンズＬ３によって集束された光ビームは、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）１５０に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現する。 The femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser 110 is reflected by the first reflecting mirror M1 and the second reflecting mirror M2, and enters the beam expander including the first lens L1 and the second lens L2. The light beam is emitted from the second lens L2, reflected by the third reflector M3, enters the first dichroic mirror DM1, passes through the first dichroic mirror DM1, and then passes through the first dichroic mirror DM1. The light beam that enters the four slides 120, is further reflected by the fourth reflector M4, enters the XY scan galvanometer 130, and is emitted from the XY scan galvanometer 130 passes through the scanning lens SL and the tube lens TL in this order. The light beam that enters the second dichroic mirror DM2 and has passed through the second dichroic mirror DM2 enters the objective lens OL and is focused by the objective lens OL on the sample on the three-dimensional nanodisplacement platform 140. The fluorescence emitted from the sample enters the second dichroic mirror DM2 after being collected by the objective lens OL, is reflected by the second dichroic mirror DM2, enters the filter F1, and the filter F1 emits light. The incoming laser light is suppressed and the fluorescence is transmitted, and the fluorescence transmitted through the filter F1 is reflected by the fifth reflecting mirror M5, enters the third lens L3, and is focused by the third lens L3. The light beam enters the photoelectron multiplying tube (PMT) 150, thereby realizing detection of a two-photon imaging fluorescent signal.

なお、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動させ、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かない。 When detecting the two-photon imaging fluorescence signal, the XY scan galvanometer scans and moves the light beam, and the three-dimensional nanodisplacement platform does not move.

前記ＳＴＥＤイメージングユニット２００は、前記フェムト秒レーザー１１０、前記第１反射鏡Ｍ１、前記第２反射鏡Ｍ２、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなる前記ビームエキスパンダ、前記第３反射鏡Ｍ３、連続レーザー２１０、第６反射鏡Ｍ６、第７反射鏡Ｍ７、第８反射鏡Ｍ８、位相板２２０、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１、前記λ／４スライド１２０、前記第４反射鏡Ｍ４、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０、前記走査レンズＳＬ、前記チューブレンズＴＬ、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２、前記対物レンズＯＬ、前記サインプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム１４０、前記フィルタＦ１、前記第５反射鏡Ｍ５、第４レンズＬ４、ピンホール２３０、及びアバランシェダイオード２４０を備え、前記第５反射鏡Ｍ５は、所在する光路の外に移動可能である。 The SSTD imaging unit 200 includes the femtosecond laser 110, the first reflecting mirror M1, the second reflecting mirror M2, the beam expander including the first lens L1 and the second lens L2, and the third reflecting mirror. M3, continuous laser 210, sixth reflecting mirror M6, seventh reflecting mirror M7, eighth reflecting mirror M8, phase plate 220, the first dichroic mirror DM1, the λ / 4 slide 120, the fourth reflecting mirror M4, the above. XY scan galvanometer 130, scanning lens SL, tube lens TL, second dichroic mirror DM2, objective lens OL, three-dimensional nanodisplacement platform 140 for placing sine pull, filter F1, fifth reflecting mirror M5. A fourth lens L4, a pinhole 230, and an avalanche diode 240 are provided, and the fifth reflector M5 can move out of the optical path where it is located.

本考案の実施例に係るＳＴＥＤイメージングユニット２００の作動方式は以下のとおりである。 The operating method of the STED imaging unit 200 according to the embodiment of the present invention is as follows.

前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡Ｍ１と前記第２反射鏡Ｍ２によって反射され、前記第１レンズＬ１と前記第２レンズＬ２からなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズＬ２から射出された後、前記第３反射鏡Ｍ３によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１に入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を透過して励起光を形成し、
前記連続光レーザー２１０から放射されたレーザー光は、前記第６反射鏡Ｍ６と前記第７反射鏡Ｍ７を経た後、前記第８反射鏡Ｍ８に入り、前記第８反射鏡Ｍ８を経た後、前記位相板２２０に入り、前記位相板２２０を透過した光ビームは、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１によって反射されて損失光となり、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第１ダイクロイックミラーＤＭ１を経て集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドに入って偏光調整され、前記第４反射鏡Ｍ４によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０に入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータ１３０から射出された光ビームは、前記走査レンズＳＬと前記チューブレンズＴＬを順に経た後、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２を透過した光ビームは前記対物レンズＯＬに入り、且つ前記対物レンズＯＬによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム１４０にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズＯＬによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２に入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーＤＭ２によって反射され、前記フィルタＦ１に入り、前記フィルタＦ１は、射入されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第５反射鏡Ｍ５は所在する光路の外に移動され、前記フィルタＦ１を透過した蛍光は、前記第４レンズＬ４に直接入り、前記第４レンズＬ４の焦点位置でのピンホール２３０に集束され、前記ピンホール２３０から射出された光ビームは、前記アバランシェダイオード２４０（ＡＰＤ）に入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現する。 The femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser is reflected by the first reflecting mirror M1 and the second reflecting mirror M2, and enters the beam expander composed of the first lens L1 and the second lens L2. After being emitted from the second lens L2, the light beam is reflected by the third reflecting mirror M3, enters the first dichroic mirror DM1, and passes through the first dichroic mirror DM1 to form excitation light. ,
The laser light emitted from the continuous light laser 210 enters the eighth reflecting mirror M8 after passing through the sixth reflecting mirror M6 and the seventh reflecting mirror M7, passes through the eighth reflecting mirror M8, and then passes through the eighth reflecting mirror M8. The light beam that enters the phase plate 220 and passes through the phase plate 220 is reflected by the first dichroic mirror DM1 to become lost light, and the excitation light and the lost light are focused through the first dichroic mirror DM1. The focused light beam enters the λ / 4 slide, is polarized, is reflected by the fourth reflector M4, enters the XY scan galvanometer 130, and is emitted from the XY scan galvanometer 130. After passing through the scanning lens SL and the tube lens TL in order, enters the second dichroic mirror DM2, and the light beam transmitted through the second dichroic mirror DM2 enters the objective lens OL and is formed by the objective lens OL. The fluorescence focused on the sample on the three-dimensional nanodisplacement platform 140 and emitted from the sample enters the second dichroic mirror DM2 after being collected by the objective lens OL and is reflected by the second dichroic mirror DM2. Then, it enters the filter F1, the filter F1 suppresses the emitted laser light and transmits fluorescence, and the fifth reflecting mirror M5 is moved out of the optical path where it is located and passes through the filter F1. The fluorescence enters the fourth lens L4 directly, is focused on the pinhole 230 at the focal position of the fourth lens L4, and the light beam emitted from the pinhole 230 enters the avalanche diode 240 (APD). , Thereby, the detection of the STED imaging fluorescent signal is realized.

なお、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現する。 When detecting the STED imaging fluorescence signal, the XY scan galvanometer does not perform moving scanning and stays at the zero position, and the three-dimensional nanodisplacement platform takes the scanning movement of the sample to realize imaging.

いくつかの好適な実施例では、レーザー光が顕微鏡システムに結合して入力されるように、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、第６反射鏡、及び前記第７反射鏡はいずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できる。 In some preferred embodiments, the first reflector, the second reflector, the third reflector, the fourth reflector, the fifth reflector so that the laser light is coupled to the microscope system and input. , The 6th reflector, and the 7th reflector can all adjust the angle around the XY axis.

具体的には、フェムト秒レーザー１１０については、それから放射された光ビームが自由空間で伝播し、ＸＹ軸の周りに角度を調整可能な第１反射鏡Ｍ１と第２反射鏡Ｍ２が使用され、Ｍ１とＭ２を調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは顕微鏡システムに素早くアクセスでき、連続光レーザー２１０については、それから放射された光ビームが自由空間で伝播し、ＸＹ軸の周りに角度を調整可能な第６反射鏡Ｍ６と第７反射鏡Ｍ７が使用され、Ｍ６とＭ７を調整することにより、連続光レーザーから放射された光ビームは顕微鏡システムに素早くアクセスできる。 Specifically, for the femtosecond laser 110, a first reflector M1 and a second reflector M2 are used in which the light beam radiated from the femtosecond laser 110 propagates in free space and the angle can be adjusted around the XY axes. By adjusting M1 and M2, the light beam emitted from the femtosecond laser light can quickly access the microscope system, and for the continuous light laser 210, the light beam emitted from it propagates in free space and is of the XY axis. A sixth reflector M6 and a seventh reflector M7, whose angles can be adjusted around, are used, and by adjusting the M6 and M7, the light beam emitted from the continuous light laser can quickly access the microscope system.

いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の位相分布は０〜２πのらせん分布である。 In some preferred embodiments, the phase distribution on the phase plate is a spiral distribution from 0 to 2π.

いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーは、前記連続光損失を用いた二光子刺激発光損失複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。 In some preferred embodiments, the femtosecond laser and the continuous light laser are detachably attached to a two-photon stimulation emission loss composite microscope using the continuous light loss.

なお、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡で使用されるフェムト秒レーザー光及び連続光レーザーは、両方ともに体積が大きく、顕微鏡の輸送や位置移動時に、これらのレーザーを顕微鏡から取り外す必要があり、フェムト秒レーザー光及び連続光レーザーが顕微鏡システムに素早く接続できるように、前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーが前記連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられ、それにより、取り外しや輸送が簡便になる。 The femtosecond laser light and the continuous light laser used in the diphoton-induced emission suppression composite microscope using the continuous loss light according to the present invention both have a large volume, and these lasers are used when transporting or moving the position of the microscope. The femtosecond laser and the continuous light laser are diphoton-induced emission suppression composite microscopes using the continuous loss light so that the femtosecond laser light and continuous light laser can be quickly connected to the microscope system. Detachable and easy to remove and transport.

図２は、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での励起スポットの光強度分布（ＸＹ面とＸＺ面内の光強度分布）を示し、励起光が対物レンズを経た後、長い楕円形の中実三次元スポットとして集束される。 FIG. 2 shows the light intensity distribution (light intensity distribution in the XY plane and the XZ plane) of the excitation spot at the focal point of the objective lens in the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous loss light according to the present invention. After the light passes through the objective lens, it is focused as a long oval solid three-dimensional spot.

図３は、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での損失光スポットの光強度分布（ＸＹ面とＸＺ面内の光強度分布）を示し、損失光が、対物レンズを経た後、柱状の中空三次元スポットとして集束される。 FIG. 3 shows the light intensity distribution (light intensity distribution in the XY plane and the XZ plane) of the lost light spot at the focal point of the objective lens in the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous loss light according to the present invention. After passing through the objective lens, the lost light is focused as a columnar hollow three-dimensional spot.

なお、ＳＴＥＤイメージングには、励起スポットと損失光スポットを三次元方向に精度よく重なり合わせる必要があり、損失光スポットの位置を基準（一定に維持）として、励起光スポットと精度よく重なり合うように励起光スポットの三次元位置を調整し、Ｘ軸又はＹ軸の周りに第３反射鏡Ｍ３の角度を調整することにより、励起光スポットのＸ方向又はＹ方向での位置を変えることができ、光軸のＺ方向に沿って第２レンズＬ２の位置を調整することにより、励起光スポットのＺ方向での位置を変えることができ、それにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることができる。 For STED imaging, it is necessary to accurately overlap the excitation spot and the loss light spot in the three-dimensional direction, and the excitation spot is excited so as to accurately overlap the excitation light spot with the position of the loss light spot as a reference (maintained constant). By adjusting the three-dimensional position of the light spot and adjusting the angle of the third reflector M3 around the X-axis or the Y-axis, the position of the excitation light spot in the X-direction or the Y-direction can be changed, and the light can be changed. By adjusting the position of the second lens L2 along the Z direction of the axis, the position of the excitation light spot in the Z direction can be changed, whereby the excitation light spot and the loss light spot can be accurately overlapped with each other. Can be done.

本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡では、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、ＳＴＥＤ超解像度イメージングユニットを用いることができ、本考案に係る連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡はＳＴＥＤイメージングと二光子イメージングとの２種の機能を集積させ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。 In the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light according to the present invention, a two-photon imaging unit is used for a thick sample, and a SSTD ultra-resolution imaging unit is used for an area of interest on the surface layer of the sample. The diphoton stimulated emission suppression composite microscope using continuous loss light according to the present invention integrates two types of functions, STD imaging and diphoton imaging, and is a powerful tool for cutting-edge biomedical research. offer.

もちろん、本考案の連続損失光を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡にはさまざまな置換や変形を加えることもでき、上記実施形態の特定の構造に制限されない。要するに、本考案の保護範囲は、当業者にとって明らかな置換、代替や変形を含むべきである。 Of course, the two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous loss light of the present invention can be subjected to various substitutions and modifications, and is not limited to the specific structure of the above embodiment. In short, the scope of protection of the present invention should include substitutions, substitutions and modifications that are apparent to those skilled in the art.

Claims (10)

二光子イメージングユニットとＳＴＥＤイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第１反射鏡、第２反射鏡、第１レンズと第２レンズからなるビームエキスパンダ、第３反射鏡、第１ダイクロイックミラー、λ／４スライド、第４反射鏡、ＸＹスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第２ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、フィルタ、第５反射鏡、第３レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ／４スライドに入り、さらに前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順に経て前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第５反射鏡によって反射され、前記第３レンズに入り、前記第３レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記ＳＴＥＤイメージングユニットは、前記フェムト秒レーザー、前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、前記第１レンズと前記第２レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第３反射鏡、連続レーザー、第６反射鏡、第７反射鏡、第８反射鏡、位相板、前記第１ダイクロイックミラー、前記λ／４スライド、前記第４反射鏡、前記ＸＹスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第２ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、前記サンプルを置くための３次元ナノ変位プラットフォーム、前記フィルタ、前記第５反射鏡、第４レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第５反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第１反射鏡と前記第２反射鏡によって反射され、前記第１レンズと前記第２レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは、前記第２レンズから射出された後、前記第３反射鏡によって反射され、前記第１ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第１ダイクロイックミラーを透過して励起光を形成し、
前記連続光レーザーから放射されたレーザー光は、前記第６反射鏡と前記第７反射鏡を経た後、前記第８反射鏡に入り、前記第８反射鏡を経た後、前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第１ダイクロイックミラーによって反射されて損失光となり、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第１ダイクロイックミラーを経て集束され、集束された光ビームは、前記λ／４スライドに入って偏光調整され、前記第４反射鏡によって反射され、前記ＸＹスキャンガルバノメータに入り、前記ＸＹスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズＴＬを順に経た後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、前記第２ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記３次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第２ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第２ダイクロイックミラーによって反射され、前記フィルタに入り、前記フィルタは、入射されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第５反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記フィルタを透過した蛍光は、前記第４レンズに直接入り、前記第４レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、ＳＴＥＤイメージング蛍光信号の検出を実現することを特徴とする連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 Equipped with a two-photon imaging unit and a STED imaging unit
The two-photon imaging unit includes a femtosecond laser, a first reflector, a second reflector, a beam expander composed of a first lens and a second lens, a third reflector, a first dichroic mirror, a λ / 4 slide, and a first lens. 4 reflector, XY scan galvanometer, scanning lens, tube lens, 2nd dichroic mirror, objective lens, 3D nanodisplacement platform for placing samples, filter, 5th reflector, 3rd lens, and photoelectron multiplier Including
The femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser is reflected by the first reflecting mirror and the second reflecting mirror and enters a beam expander composed of the first lens and the second lens, and the light beam is emitted. After being emitted from the second lens, it is reflected by the third reflecting mirror, enters the first dichroic mirror, passes through the first dichroic mirror, enters the λ / 4 slide, and further enters the fourth. The light beam reflected by the reflector and enters the XY scan galvanometer, and the light beam emitted from the XY scan galvanometer enters the second dichroic mirror via the scanning lens and the tube lens in order, and enters the second dichroic mirror. The transmitted light beam enters the objective lens and is focused by the objective lens on the sample on the three-dimensional nanodisplacement platform, and the fluorescence emitted from the sample is collected by the objective lens and then the first. The second dichroic mirror enters and is reflected by the second dichroic mirror and enters the filter, the filter suppresses incident laser light and transmits fluorescence, and the fluorescence transmitted through the filter is the fifth. The light beam reflected by the reflector and entering the third lens and focused by the third lens enters the photoelectron multiplier tube, thereby realizing detection of the diphoton imaging fluorescence signal.
The SSTD imaging unit includes the femtosecond laser, the first reflecting mirror, the second reflecting mirror, the beam expander including the first lens and the second lens, the third reflecting mirror, the continuous laser, and the sixth. Reflector, 7th reflector, 8th reflector, phase plate, 1st dichroic mirror, λ / 4 slide, 4th reflector, XY scan galvanometer, scanning lens, tube lens, 2nd It comprises a dichroic mirror, the objective lens, a three-dimensional nanodisplacement platform for placing the sample, the filter, the fifth reflector, the fourth lens, a pinhole, and an avalanche diode, the fifth reflector is located. Movable out of the light path,
The femtosecond laser light emitted from the femtosecond laser is reflected by the first reflecting mirror and the second reflecting mirror and enters a beam expander composed of the first lens and the second lens, and the light beam is emitted. After being emitted from the second lens, it is reflected by the third reflecting mirror, enters the first dichroic mirror, and passes through the first dichroic mirror to form excitation light.
The laser light emitted from the continuous light laser enters the eighth reflecting mirror after passing through the sixth reflecting mirror and the seventh reflecting mirror, passes through the eighth reflecting mirror, and then enters the phase plate. The light beam transmitted through the phase plate is reflected by the first dichroic mirror to become lost light, and the excitation light and the lost light are focused through the first dichroic mirror, and the focused light beam is generated. The light beam that enters the λ / 4 slide, is polarized, is reflected by the fourth reflector, enters the XY scan galvanometer, and is emitted from the XY scan galvanometer, sequentially passes through the scanning lens and the tube lens TL. After that, the light beam that enters the second dichroic mirror and passes through the second dichroic mirror enters the objective lens and is focused by the objective lens on the sample on the three-dimensional nanodisplacement platform from the sample. The emitted fluorescence enters the second dichroic mirror after being collected by the objective lens and is reflected by the second dichroic mirror and enters the filter, which suppresses the incident laser light. , The fifth reflector is moved out of the light path where it is located, and the fluorescence transmitted through the filter enters the fourth lens directly and is focused on the pinhole at the focal position of the fourth lens. A two-photon-induced emission suppression composite microscope using continuous light loss, characterized in that the light beam emitted from the pinhole enters the avalanche diode, thereby realizing detection of a STED imaging fluorescent signal. 前記第１反射鏡、前記第２反射鏡、第３反射鏡、第４反射鏡、第５反射鏡、第６反射鏡、及び前記第７反射鏡はいずれもＸＹ軸の周りに角度を調整できることを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 The first reflector, the second reflector, the third reflector, the fourth reflector, the fifth reflector, the sixth reflector, and the seventh reflector can all adjust the angle around the XY axis. The two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous light loss according to claim 1. 前記第１反射鏡及び前記第２反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできることを特徴とする請求項２に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 2. The second reflecting mirror is characterized in that the light beam emitted from the femtosecond laser beam can quickly access the composite microscope by adjusting the angles of the first reflecting mirror and the second reflecting mirror around the XY axes. A two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous light loss described in. 前記第６反射鏡及び前記第７反射鏡の角度をＸＹ軸の周りに調整することにより、連続光レーザーから放射された光ビームは、前記複合顕微鏡に素早くアクセスできることを特徴とする請求項２に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 2. The second aspect of the present invention is that the light beam emitted from the continuous light laser can quickly access the composite microscope by adjusting the angles of the sixth reflector and the seventh reflector around the XY axes. Two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the described continuous light loss. 前記第２レンズの光軸の、ｚ方向に沿う位置が調整可能であることを特徴とする請求項２に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 The two-photon stimulated emission suppression composite microscope according to claim 2, wherein the position of the optical axis of the second lens along the z direction can be adjusted. 前記第３反射鏡の角度をＸ軸又はＹ軸の周りに調整し、Ｘ方向又はＹ方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のｚ方向に沿って前記第２レンズの位置を調整し、Ｚ方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることを特徴とする請求項３に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 The angle of the third reflector is adjusted around the X-axis or the Y-axis, the position of the excitation light spot in the X-direction or the Y-direction is adjusted, and the position of the second lens is adjusted along the z-direction of the optical axis. However, by adjusting the position of the excitation light spot in the Z direction, the excitation light spot and the loss light spot are accurately overlapped with each other, and the diphoton stimulated emission suppression using the continuous light loss according to claim 3. Composite microscope. 前記位相板上の位相分布は、０〜２πのらせん分布であることを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 The two-photon stimulated emission suppression composite microscope using continuous light loss according to claim 1, wherein the phase distribution on the phase plate is a spiral distribution of 0 to 2π. 二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動させ、前記３次元ナノ変位プラットフォームが動かないことを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 The continuous light loss according to claim 1, wherein the XY scan galvanometer scans and moves the light beam when detecting a two-photon imaging fluorescence signal, and the three-dimensional nanodisplacement platform does not move. Two-photon stimulated emission suppression composite microscope. ＳＴＥＤイメージング蛍光信号を検出する際に、前記ＸＹスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記３次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現することを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 When detecting a STED imaging fluorescence signal, the XY scan galvanometer does not perform moving scanning and stays at the zero position, and the three-dimensional nanodisplacement platform is characterized by entraining scanning movement of the sample to realize imaging. The two-photon stimulated emission suppression composite microscope using the continuous light loss according to claim 1. 前記フェムト秒レーザー及び前記連続光レーザーは、前記連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられることを特徴とする請求項１に記載の連続光損失を用いた二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 The diphoton using continuous light loss according to claim 1, wherein the femtosecond laser and the continuous light laser are detachably attached to a diphoton stimulated emission suppression composite microscope using the continuous light loss. Stimulated emission suppression composite laser.
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