JP3200442B2 - 受容体選択性の上昇した毛様神経栄養性因子の変種とその選択方法 - Google Patents
受容体選択性の上昇した毛様神経栄養性因子の変種とその選択方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、神経または他の疾患もしくは障害の治療に
有用な神経受容体選択性が上昇した毛様神経栄養性因子
（CNTF）変種に関する。
有用な神経受容体選択性が上昇した毛様神経栄養性因子
（CNTF）変種に関する。
CNTFは23kDaの神経サイトカインであり、末梢および
中枢神経系の両方で後期胚期間に開始して発現される
（マンソーブ（Manthorpe）ら、1993;イプ（Ip）とヤン
コポウロス（Yancopoulos）、1996、の総説）。CNTF
は、最初はヒヨコ胚の副交感神経ニューロンのインビト
ロの生存を促進する能力により同定され、次に種々のニ
ューロン細胞およびグリア細胞（運動ニューロン、感覚
ニューロン、交感神経ニューロン、海馬ニューロン、お
よび乏突起（神経）膠細胞を含む）に対して強力な増殖
促進および／または分化作用を示すことが証明された
（マンソーブ（Manthorpe）ら、1993;イプ（Ip）とヤン
コポウロス（Yancopoulos）、1996、の総説）。CNTFの
インビボ投与は、軸策切断したラットの顔面運動ニュー
ロンおよび突然変異進行性運動神経障害マウスの運動ニ
ューロンの成長の間の、ヒヨコの脊髄運動ニューロンの
変性を防止する。CNTFの神経防御作用により、これがヒ
トの運動ニューロン疾患およびおそらく他の神経変性疾
患の治療の候補となる（マンソーブ（Manthorpe）ら、1
993;イプ（Ip）とヤンコポウロス（Yancopoulos）、199
6）。
中枢神経系の両方で後期胚期間に開始して発現される
（マンソーブ（Manthorpe）ら、1993;イプ（Ip）とヤン
コポウロス（Yancopoulos）、1996、の総説）。CNTF
は、最初はヒヨコ胚の副交感神経ニューロンのインビト
ロの生存を促進する能力により同定され、次に種々のニ
ューロン細胞およびグリア細胞（運動ニューロン、感覚
ニューロン、交感神経ニューロン、海馬ニューロン、お
よび乏突起（神経）膠細胞を含む）に対して強力な増殖
促進および／または分化作用を示すことが証明された
（マンソーブ（Manthorpe）ら、1993;イプ（Ip）とヤン
コポウロス（Yancopoulos）、1996、の総説）。CNTFの
インビボ投与は、軸策切断したラットの顔面運動ニュー
ロンおよび突然変異進行性運動神経障害マウスの運動ニ
ューロンの成長の間の、ヒヨコの脊髄運動ニューロンの
変性を防止する。CNTFの神経防御作用により、これがヒ
トの運動ニューロン疾患およびおそらく他の神経変性疾
患の治療の候補となる（マンソーブ（Manthorpe）ら、1
993;イプ（Ip）とヤンコポウロス（Yancopoulos）、199
6）。
CNTFはその神経作用以外に、グリア（ヒューズ（Hugh
es）ら、1988;ルイス（Louis）ら、1993）、肝細胞（ス
クールトニク（Schooltnik）ら、1992）、骨格筋細胞
（ヘルグレン（Helgren）ら、1994）、胚性幹細胞（コ
ノバー（Conover）ら、1993）、骨髄間質細胞（ギルブ
ル（Gimble）ら、1994）、および腫瘍形質細胞（ザング
（Zhang）ら、1994）のような非ニューロン細胞におい
ても生物学的作用を誘発する。
es）ら、1988;ルイス（Louis）ら、1993）、肝細胞（ス
クールトニク（Schooltnik）ら、1992）、骨格筋細胞
（ヘルグレン（Helgren）ら、1994）、胚性幹細胞（コ
ノバー（Conover）ら、1993）、骨髄間質細胞（ギルブ
ル（Gimble）ら、1994）、および腫瘍形質細胞（ザング
（Zhang）ら、1994）のような非ニューロン細胞におい
ても生物学的作用を誘発する。
CNTFの機能的多面作用は、このタンパク質の治療的使
用に関連する問題の１つの考え得る理由である。CNTFは
インビボでの半減期が短く（デービス（Davies）ら、19
94）、標的組織で薬理学的に有用な濃度を達成するため
には高用量を投与する必要がある。高用量のCNTFは、体
重減少や急性相応答などの副作用を引き起こす（ディッ
トリッチ（Dittrich）ら、1995）。従って、その副作用
のすべてまたは一部を誘発することなくCNTFの神経栄養
性作用を模倣することができる薬剤に対するニーズがあ
る。
用に関連する問題の１つの考え得る理由である。CNTFは
インビボでの半減期が短く（デービス（Davies）ら、19
94）、標的組織で薬理学的に有用な濃度を達成するため
には高用量を投与する必要がある。高用量のCNTFは、体
重減少や急性相応答などの副作用を引き起こす（ディッ
トリッチ（Dittrich）ら、1995）。従って、その副作用
のすべてまたは一部を誘発することなくCNTFの神経栄養
性作用を模倣することができる薬剤に対するニーズがあ
る。
CNTFは、リガンド特異的ａ−受容体（CNTFR）とシグ
ナル伝達性サブユニットgp130と白血病阻害因子受容体
−ｂ（LIFR）からなる多サブユニット受容体複合体の、
結合、連続的アセンブリー、および活性化を通して、そ
の生物学的作用を示す（イプ（Ip）とヤンコポウロス
（Yancopoulos）、1996）。CNTFがCNTFRに結合すると、
gp130とLIFRの会合とヘテロダイマー化が引き続いて開
始され、Jakファミリーのタンパク質チロシンキナーゼ
とSTAT転写アクチベーターにより介在されるシグナル伝
達カスケードの活性化につながる。gp130のホモダイマ
ー化を介在するIL−６のａ−受容体であるgp80と同様
に、CNTFRは膜結合型または可溶性型のいずれかで機能
することができる（イプ（Ip）とヤンコポウロス（Yanc
opoulos）、1996）。膜結合型のCNTFR（ｍ−CNTFR）
（これは、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結
合を介して細胞表面に結合している）は、主にニューロ
ンおよび骨格筋細胞で発現される（デービス（Davies）
ら、1991;イプ（Ip）ら、1993）。ｍ−CNTFRのホスホリ
パーゼＣ介在切断により産生することができる可溶性型
のCNTFR（ｓ−CNTFR）は、gp130とLIFRを発現する細胞
に及ぼすCNTF作用を強化する補助因子として機能する
（デービス（Davies）ら、1993）。可能性CNTFRは、髄
液と血清中で検出されており（ヘルグレン（Helgren）
ら、1994;デービス（Davies）ら、1993）、これがCNTF
の非ニューロン性作用の一部（例えば急性相応答）を介
在するのに関与しているかも知れないことを示唆してい
る（ディットリッチ（Dittrich）ら、1994）。
ナル伝達性サブユニットgp130と白血病阻害因子受容体
−ｂ（LIFR）からなる多サブユニット受容体複合体の、
結合、連続的アセンブリー、および活性化を通して、そ
の生物学的作用を示す（イプ（Ip）とヤンコポウロス
（Yancopoulos）、1996）。CNTFがCNTFRに結合すると、
gp130とLIFRの会合とヘテロダイマー化が引き続いて開
始され、Jakファミリーのタンパク質チロシンキナーゼ
とSTAT転写アクチベーターにより介在されるシグナル伝
達カスケードの活性化につながる。gp130のホモダイマ
ー化を介在するIL−６のａ−受容体であるgp80と同様
に、CNTFRは膜結合型または可溶性型のいずれかで機能
することができる（イプ（Ip）とヤンコポウロス（Yanc
opoulos）、1996）。膜結合型のCNTFR（ｍ−CNTFR）
（これは、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結
合を介して細胞表面に結合している）は、主にニューロ
ンおよび骨格筋細胞で発現される（デービス（Davies）
ら、1991;イプ（Ip）ら、1993）。ｍ−CNTFRのホスホリ
パーゼＣ介在切断により産生することができる可溶性型
のCNTFR（ｓ−CNTFR）は、gp130とLIFRを発現する細胞
に及ぼすCNTF作用を強化する補助因子として機能する
（デービス（Davies）ら、1993）。可能性CNTFRは、髄
液と血清中で検出されており（ヘルグレン（Helgren）
ら、1994;デービス（Davies）ら、1993）、これがCNTF
の非ニューロン性作用の一部（例えば急性相応答）を介
在するのに関与しているかも知れないことを示唆してい
る（ディットリッチ（Dittrich）ら、1994）。
ｍ−CNTFRはCNTFのニューロン作用に必要であり、一
方ｓ−CNTFRは、非ニューロン性作用を介在すると考え
られているため、ｍ−CNTFRに対する選択性が上昇した
修飾CNTFタンパク質は、よりニューロン特異的なスペク
トルの薬理学的作用を示すことが予測される。
方ｓ−CNTFRは、非ニューロン性作用を介在すると考え
られているため、ｍ−CNTFRに対する選択性が上昇した
修飾CNTFタンパク質は、よりニューロン特異的なスペク
トルの薬理学的作用を示すことが予測される。
発明の説明 本発明は、本発明の特異的アミノ酸置換の作用とし
て、天然のCNTFと比較した時CNTFRへの結合能が低下
し、可溶性CNTFRにより介在される生物活性が低下し、
膜結合CNTFRに介在される生物活性は変化していないCNT
F変種に関する。
て、天然のCNTFと比較した時CNTFRへの結合能が低下
し、可溶性CNTFRにより介在される生物活性が低下し、
膜結合CNTFRに介在される生物活性は変化していないCNT
F変種に関する。
これらの変種は、ヒトおよび動物での神経疾患や障害
の治療のための方法に基づく。ある実施態様においてCN
TF変種の生物活性は、ヒト肝臓癌細胞＋可溶性CNTFRとC
NTFRを安定に発現するヒト肝臓癌細胞の間で比較され、
これは膜結合受容体の選択性を評価するための方法を提
供する。
の治療のための方法に基づく。ある実施態様においてCN
TF変種の生物活性は、ヒト肝臓癌細胞＋可溶性CNTFRとC
NTFRを安定に発現するヒト肝臓癌細胞の間で比較され、
これは膜結合受容体の選択性を評価するための方法を提
供する。
好適な実施態様において本発明の変種は、hCNTF（配
列番号１）の169位のアミノ酸スレオニンをイソロイシ
ンで置換し、174位のアミノ酸ヒスチジンをアラニンで
置換することにより得られる（以後この変種は、Thr169
Ile/His174Ala/hCNTF;IA−CNTF、または配列番号２と呼
ぶ）。この変種の特徴は、可溶性CNTFRに結合する能力
が低下していることである。
列番号１）の169位のアミノ酸スレオニンをイソロイシ
ンで置換し、174位のアミノ酸ヒスチジンをアラニンで
置換することにより得られる（以後この変種は、Thr169
Ile/His174Ala/hCNTF;IA−CNTF、または配列番号２と呼
ぶ）。この変種の特徴は、可溶性CNTFRに結合する能力
が低下していることである。
修飾hCNTFが急性相タンパク質ハプトグロビンの産生
を刺激する能力は、可溶性CNTFRの存在下でヒト肝臓癌
細胞で測定される。後述するように修飾CNTFは、野生型
CNTFに比較して力価が低下している。
を刺激する能力は、可溶性CNTFRの存在下でヒト肝臓癌
細胞で測定される。後述するように修飾CNTFは、野生型
CNTFに比較して力価が低下している。
別の実施態様において、修飾ヒトCNTFタンパク質がヒ
ト神経芽腫細胞株中のコリンアセチルトランスフェラー
ゼの産生を刺激する能力が測定される。後述されるよう
に修飾CNTFタンパク質は、この測定法で野生型CNTFタン
パク質と等しい力価を有する。
ト神経芽腫細胞株中のコリンアセチルトランスフェラー
ゼの産生を刺激する能力が測定される。後述されるよう
に修飾CNTFタンパク質は、この測定法で野生型CNTFタン
パク質と等しい力価を有する。
好適な実施態様において、CNTFRを発現しないヒト肝
臓癌細胞は、完全長ヒトCNTFRを発現するように作成さ
れ、これらの細胞を使用して修飾CNTFタンパク質がハプ
トグロビン産生を刺激する能力が測定される。この測定
法で生物活性は、可溶性CNTFRの存在下で測定される親
肝臓癌細胞で得られるものと比較される。この方法は、
膜結合CNTFRに対して可溶性CNTFRを介する生物学的応答
の選択性活性化の尺度となる。本明細書に記載されるよ
うに、この測定法では修飾CNTFタンパク質は野生型ヒト
CNTFと力価が等しく、このことは、修飾CNTFが膜結合CN
TFRを介する高い生物活性を維持し、一方可溶性CNTFRを
介する特異的に低下した活性を示すことを示している。
本明細書にも記載されるように、ニューロン受容体選択
性が上昇していることがすでに証明（イタリア特許出願
RM96A000492号）されたCNTF変種（Phe152Ala/Ser166Asp
/Gln167His/ヒトCNTFまたはAKDH−CHTF;イタリア特許出
願RM96A000492号で配列番号３として報告された配列で
あるアミノ酸152〜167を含有するヒトCNTF変種）はま
た、CNTFRを発現する肝臓癌細胞中で野生型CNTFと力価
が等しい。これらの結果は、この測定系を使用して、可
溶性CNTFRおよび膜結合CNTFRを介して異なる生物活性を
示すCNTF変種を同定できることを示している。
臓癌細胞は、完全長ヒトCNTFRを発現するように作成さ
れ、これらの細胞を使用して修飾CNTFタンパク質がハプ
トグロビン産生を刺激する能力が測定される。この測定
法で生物活性は、可溶性CNTFRの存在下で測定される親
肝臓癌細胞で得られるものと比較される。この方法は、
膜結合CNTFRに対して可溶性CNTFRを介する生物学的応答
の選択性活性化の尺度となる。本明細書に記載されるよ
うに、この測定法では修飾CNTFタンパク質は野生型ヒト
CNTFと力価が等しく、このことは、修飾CNTFが膜結合CN
TFRを介する高い生物活性を維持し、一方可溶性CNTFRを
介する特異的に低下した活性を示すことを示している。
本明細書にも記載されるように、ニューロン受容体選択
性が上昇していることがすでに証明（イタリア特許出願
RM96A000492号）されたCNTF変種（Phe152Ala/Ser166Asp
/Gln167His/ヒトCNTFまたはAKDH−CHTF;イタリア特許出
願RM96A000492号で配列番号３として報告された配列で
あるアミノ酸152〜167を含有するヒトCNTF変種）はま
た、CNTFRを発現する肝臓癌細胞中で野生型CNTFと力価
が等しい。これらの結果は、この測定系を使用して、可
溶性CNTFRおよび膜結合CNTFRを介して異なる生物活性を
示すCNTF変種を同定できることを示している。
リガンド保持仮説（バウマン（Baumann）ら、1994）
は、膜結合受容体および可溶性受容体イソフォームを有
するサイトカイン変種の薬理学的挙動のもっともらいし
い説明を提供する。バウマン（Baumann）と共同研究者
達（バウマン（Baumann）ら、1994）は、細胞表面での
サイトカイン受容体の濃度はマイクロモルの範囲にある
（これは、サイトカイン受容体平衡解離定数よりはるか
に過剰である）ことを計算し、これがほぼ１方向のリガ
ンド捕捉につながることを提唱した。サイトカイン受容
体の高い膜濃度は、受容体結合親和性が変化したサイト
カイン変種が、なぜ膜結合受容体を介して変わらないア
ゴニスト力価を示すことができるかを説明するであろ
う。すなわちニューロン細胞でのCNTFと改変CNTFR親和
性を有する変種との等力価は、飽和濃度のｓ−CNTFRの
存在下での非ニューロン細胞中の状態（イタリア特許出
願RM96A000492号）と同様に、ｍ−CNTFRによる擬不可逆
的リガンド捕捉によるのであろう。
は、膜結合受容体および可溶性受容体イソフォームを有
するサイトカイン変種の薬理学的挙動のもっともらいし
い説明を提供する。バウマン（Baumann）と共同研究者
達（バウマン（Baumann）ら、1994）は、細胞表面での
サイトカイン受容体の濃度はマイクロモルの範囲にある
（これは、サイトカイン受容体平衡解離定数よりはるか
に過剰である）ことを計算し、これがほぼ１方向のリガ
ンド捕捉につながることを提唱した。サイトカイン受容
体の高い膜濃度は、受容体結合親和性が変化したサイト
カイン変種が、なぜ膜結合受容体を介して変わらないア
ゴニスト力価を示すことができるかを説明するであろ
う。すなわちニューロン細胞でのCNTFと改変CNTFR親和
性を有する変種との等力価は、飽和濃度のｓ−CNTFRの
存在下での非ニューロン細胞中の状態（イタリア特許出
願RM96A000492号）と同様に、ｍ−CNTFRによる擬不可逆
的リガンド捕捉によるのであろう。
すなわち本発明において、ヒトCNTF野生型タンパク質
中のいくつかのアミノ酸置換の結果として、膜結合（ニ
ューロン性）CNTFR対可溶性（非ニューロン性）CNTFRに
ついて選択性の上昇を示す修飾ヒトCNTFタンパク質が得
られ、従って治療的性質が上昇することが期待されるで
あろう。
中のいくつかのアミノ酸置換の結果として、膜結合（ニ
ューロン性）CNTFR対可溶性（非ニューロン性）CNTFRに
ついて選択性の上昇を示す修飾ヒトCNTFタンパク質が得
られ、従って治療的性質が上昇することが期待されるで
あろう。
本発明の実施において有用なCNTF修飾分子は、原核生
物系および真核生物系でクローニングと発現をすること
により調製することができる。得られる組換え遺伝子は
任意の方法で発現と精製することができ、さらに安定な
生物活性タンパク質の形成を可能にする。
物系および真核生物系でクローニングと発現をすること
により調製することができる。得られる組換え遺伝子は
任意の方法で発現と精製することができ、さらに安定な
生物活性タンパク質の形成を可能にする。
本発明の主題は、以下に記載するものである。
169位のスレオニン残基がイソロイシン残基で置換さ
れ、かつ174位のヒスチジン残基がアラニン残基で置換
されている毛様神経栄養性因子（CNTF）の変種とヒトCN
TFの変種。これらの変種は、（膜）受容対に対して選択
性の上昇を示す。請求の範囲第１項または第２項に記載
のCNTFの変種と薬剤学的に許容される担体とを含んでな
る薬剤組成物。
れ、かつ174位のヒスチジン残基がアラニン残基で置換
されている毛様神経栄養性因子（CNTF）の変種とヒトCN
TFの変種。これらの変種は、（膜）受容対に対して選択
性の上昇を示す。請求の範囲第１項または第２項に記載
のCNTFの変種と薬剤学的に許容される担体とを含んでな
る薬剤組成物。
本発明において、本明細書に記載のように産生される
修飾CNTF分子またはそのハイブリッドもしくは突然変異
体は、CNTFに応答する細胞のインビトロまたはインビボ
での分化、増殖、または生存の促進に使用することがで
きる。本発明は、CNTFに応答する任意の細胞の病態を治
療するために使用することができ、好適な実施態様にお
いて膜結合CNTF受容体を発現するニューロン細胞の病態
を治療することができる。
修飾CNTF分子またはそのハイブリッドもしくは突然変異
体は、CNTFに応答する細胞のインビトロまたはインビボ
での分化、増殖、または生存の促進に使用することがで
きる。本発明は、CNTFに応答する任意の細胞の病態を治
療するために使用することができ、好適な実施態様にお
いて膜結合CNTF受容体を発現するニューロン細胞の病態
を治療することができる。
CNTFの変種の膜結合受容体に対する選択性の上昇の評
価方法は、膜結合CNTF受容体または可溶性CNTF受容体を
介する生物学的応答を誘導することである。上記方法に
より選択されるCNTFの変種。CNTF変種をコードする単離
され精製されたDNA分子。組換えDNA中の発現を調節する
ための配列に機能的に結合した上記DNAを含んでなる該D
NA組換え分子。組換えDNAで形質転換された単細胞宿主
であって、細菌、酵母、真菌、ならびに動物および植物
細胞よりなる群から選択される単細胞宿主。神経疾患ま
たは障害の治療用薬剤の調製のための上記変種の使用。
これらの神経疾患または障害には、網膜病態、脊髄、コ
リン作動性ニューロン、海馬ニューロンが関与する疾患
または病態、または運動ニューロンが関与する疾患また
は病態を含む。本発明の変種はまた、外傷、手術、心臓
発作、感染症および悪性腫瘍、または毒性物質への暴露
により引き起こされる神経系障害に由来する疾患または
病態の治療にも使用される。上記変種と他のタンパク質
もしくは他の分子との結合体。上記変種と、変種が脳血
液関門を越えるための輸送性受容体に対する抗体との結
合体。上記変種と、該変種の免疫原性を低下させるため
のポリエチレングリコールとの結合体。
価方法は、膜結合CNTF受容体または可溶性CNTF受容体を
介する生物学的応答を誘導することである。上記方法に
より選択されるCNTFの変種。CNTF変種をコードする単離
され精製されたDNA分子。組換えDNA中の発現を調節する
ための配列に機能的に結合した上記DNAを含んでなる該D
NA組換え分子。組換えDNAで形質転換された単細胞宿主
であって、細菌、酵母、真菌、ならびに動物および植物
細胞よりなる群から選択される単細胞宿主。神経疾患ま
たは障害の治療用薬剤の調製のための上記変種の使用。
これらの神経疾患または障害には、網膜病態、脊髄、コ
リン作動性ニューロン、海馬ニューロンが関与する疾患
または病態、または運動ニューロンが関与する疾患また
は病態を含む。本発明の変種はまた、外傷、手術、心臓
発作、感染症および悪性腫瘍、または毒性物質への暴露
により引き起こされる神経系障害に由来する疾患または
病態の治療にも使用される。上記変種と他のタンパク質
もしくは他の分子との結合体。上記変種と、変種が脳血
液関門を越えるための輸送性受容体に対する抗体との結
合体。上記変種と、該変種の免疫原性を低下させるため
のポリエチレングリコールとの結合体。
Fig.1は、CNTFとIA−CNTFのCNTFR結合を示す。固定化
されたCNTFRへのビオチン化ヒトCNTFの結合を、CNTF
（（）またはIA−CNTF（（）の非存在下（対照）でまた
は存在下で測定した。結果は対照結合のパーセントとし
て表し、二重測定からの平均±偏差である。データは、
同様の結果を与えた３回繰り返した代表的実験からのも
のである。
されたCNTFRへのビオチン化ヒトCNTFの結合を、CNTF
（（）またはIA−CNTF（（）の非存在下（対照）でまた
は存在下で測定した。結果は対照結合のパーセントとし
て表し、二重測定からの平均±偏差である。データは、
同様の結果を与えた３回繰り返した代表的実験からのも
のである。
Fig.2は、HepG2細胞でのｓ−CNTFR介在生物活性を示
す。HepG2細胞中のハプトグロビン産生の刺激は、80ng/
mlのｓ−CNTFR、およびCNTF（（）またはIA−CNT
F（（）の存在下で測定した。結果は、最大CNTF誘導性
応答のパーセントとして表す。各点は、少なくとも２つ
の異なる実験からの平均±標準誤差である。
す。HepG2細胞中のハプトグロビン産生の刺激は、80ng/
mlのｓ−CNTFR、およびCNTF（（）またはIA−CNT
F（（）の存在下で測定した。結果は、最大CNTF誘導性
応答のパーセントとして表す。各点は、少なくとも２つ
の異なる実験からの平均±標準誤差である。
Fig.3は、IMR−32細胞でｍ−CNTFR介在生物活性を示
す。CNTF（（）またはIA−CNTF（（）によるIMR−32細
胞中のコリンアセチルトランスフェラーゼ（Chat）活性
の誘導を測定した。結果は、最大CNTF誘導性応答のパー
セントとして表す。各点は、二重測定した培養皿からの
平均±標準誤差である。
す。CNTF（（）またはIA−CNTF（（）によるIMR−32細
胞中のコリンアセチルトランスフェラーゼ（Chat）活性
の誘導を測定した。結果は、最大CNTF誘導性応答のパー
セントとして表す。各点は、二重測定した培養皿からの
平均±標準誤差である。
Fig.4は、HepG2細胞でのCNTF＋ｓ−CNTFRとHepG2/CNT
FR細胞でのCNTFとの組合せの組合せにより介在される初
期のシグナル伝達応答を示す。細胞は、サイトカイン無
し（−）で処理したか、または100ng/mlのIL−６、LI
F、CNTF、または100ng/mlのｓ−CNTFR＋100ng/mlのCNTF
（CNTF＋ｓ−Ｒ）で15分間処理した。細胞性STAT因子の
活性化を、電子移動度シフト測定法により測定した。矢
印は結合STAT3ホモダイマー（ａ）、Stat1:Stat3ヘテロ
ダイマー（ｂ）、Stat1ホモダイマー（ｃ）の移動位置
を示す。図においてｎは非特異的結合を示す。
FR細胞でのCNTFとの組合せの組合せにより介在される初
期のシグナル伝達応答を示す。細胞は、サイトカイン無
し（−）で処理したか、または100ng/mlのIL−６、LI
F、CNTF、または100ng/mlのｓ−CNTFR＋100ng/mlのCNTF
（CNTF＋ｓ−Ｒ）で15分間処理した。細胞性STAT因子の
活性化を、電子移動度シフト測定法により測定した。矢
印は結合STAT3ホモダイマー（ａ）、Stat1:Stat3ヘテロ
ダイマー（ｂ）、Stat1ホモダイマー（ｃ）の移動位置
を示す。図においてｎは非特異的結合を示す。
Fig.5は、HepG2/CNTFR細胞でのｍ−CNTFR介在生物活
性を示す。実験の詳細と結果の処理は、Fig.2の凡例に
記載した通りである。試験したタンパク質は、CNT
F（（）、IA−CNTF（（）、およびAKDH−CNTF（（）で
ある。
性を示す。実験の詳細と結果の処理は、Fig.2の凡例に
記載した通りである。試験したタンパク質は、CNT
F（（）、IA−CNTF（（）、およびAKDH−CNTF（（）で
ある。
寄託 配列番号２をコードするヌクレオチド配列で形質転換
した大腸菌（E.coli）HB2151細菌を、1997年２月12日に
ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリ
ルアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッド
（The National Collections of Industrial and
Marine Bacteria Ltd.）（NCIMB）（アバーディー
ン（Aberdeen）、スコットランド、英国）に、受け入れ
番号NCIMB40860で提出した。
した大腸菌（E.coli）HB2151細菌を、1997年２月12日に
ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリ
ルアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッド
（The National Collections of Industrial and
Marine Bacteria Ltd.）（NCIMB）（アバーディー
ン（Aberdeen）、スコットランド、英国）に、受け入れ
番号NCIMB40860で提出した。
ここまで本発明を一般的に説明してきた。本発明の目
的、特徴、利点および操作方法をより明確に理解できる
ように、以下の例を参照して本発明の具体例をより詳細
に説明する。
的、特徴、利点および操作方法をより明確に理解できる
ように、以下の例を参照して本発明の具体例をより詳細
に説明する。
例 例1:修飾CNTFタンパク質の調製 ａ）修飾CNTFタンパク質をコードするDNAの作製 Thr169Ile/His174Ala/ヒトCNTF（IA−CNTF;配列番号
２）を調製した。pHenD−CNTFベクター（バウマン（Bau
mann）ら、1993）を鋳型として使用して、重複伸長PCR
（ホートン（Horton）とピース（Pease）、1991）によ
り突然変異体を作成した。オリゴヌクレオチドプライマ
ーセット１（５′−GATCGTCGACATGGCTTTCACAGAGCATTCAC
CGC−３′）＋２（５′−AGAAATGAAACGAAGGTCAGCGATGGA
CCTTACTGTCCA−３′）と３（５′−TGGACAGTAAGGTCCATC
GCTGACCTTCGTTTCATTTCT−３′）＋４（５′−GAAACCATC
GATAGCAGCACCGTAAT−３′）を94℃で２分、50℃で２
分、72℃で３分のサイクルで使用して、２つの別々のPC
R増幅を行なった。キアエックス（Qiaex）キットを使用
して２つのPCR産物を単離し、混合し、そして第２のPCR
反応で増幅した。プライマー１＋４の非存在下で５回の
PCRサイクル（前記）と、その存在下で35サイクルを行
なった。PCR産物をSal IとCla Iで消化し、キアエック
ス（Qiaex）で精製し、そしてSal I/Cla I消化したpHen
D−CNTFベクター中にサブクローニングして、ベクターp
HenD−IA−CNTFを得た。DNA配列決定により、使用した
突然変異誘発プライマーから予測されるHis174Ala置換
を与える突然変異の存在と、コードされたタンパク質配
列中でThr169Ileを生じる追加の点突然変異（おそら
く、ポリメラーゼのエラーによる）の存在が明らかにな
った。IA−CNTFのコード配列を以下の方法を使用して、
細菌中で高レベルのタンパク質発現を可能にするプラス
ミド（ホートン（Horton）とピース（Pease）、1991）
であるpRSET中にサブクローニングした。pHenD−IA−CN
TFベクターを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマ
ー５（５′−GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG−３′）
と６（５′−TGACGCGGCCGCCCTACACATTTTCTTGTTGTTAGCAA
TATA−３′）を、94℃で２分、50℃で２分、72℃で２分
を25サイクルで使用してPCR増幅を行なった。PCR産物を
Nco IとBamH Iで消化して、ウィザード（Wizard）PCRキ
ットを使用して精製し、Nco I/BamH I消化したプラスミ
ドpRSET−CNTF（ホートン（Horton）とピース（Peas
e）、1991）中にサブクローニングした。最終作製体の
本体を、DNA配列決定により確認した。
２）を調製した。pHenD−CNTFベクター（バウマン（Bau
mann）ら、1993）を鋳型として使用して、重複伸長PCR
（ホートン（Horton）とピース（Pease）、1991）によ
り突然変異体を作成した。オリゴヌクレオチドプライマ
ーセット１（５′−GATCGTCGACATGGCTTTCACAGAGCATTCAC
CGC−３′）＋２（５′−AGAAATGAAACGAAGGTCAGCGATGGA
CCTTACTGTCCA−３′）と３（５′−TGGACAGTAAGGTCCATC
GCTGACCTTCGTTTCATTTCT−３′）＋４（５′−GAAACCATC
GATAGCAGCACCGTAAT−３′）を94℃で２分、50℃で２
分、72℃で３分のサイクルで使用して、２つの別々のPC
R増幅を行なった。キアエックス（Qiaex）キットを使用
して２つのPCR産物を単離し、混合し、そして第２のPCR
反応で増幅した。プライマー１＋４の非存在下で５回の
PCRサイクル（前記）と、その存在下で35サイクルを行
なった。PCR産物をSal IとCla Iで消化し、キアエック
ス（Qiaex）で精製し、そしてSal I/Cla I消化したpHen
D−CNTFベクター中にサブクローニングして、ベクターp
HenD−IA−CNTFを得た。DNA配列決定により、使用した
突然変異誘発プライマーから予測されるHis174Ala置換
を与える突然変異の存在と、コードされたタンパク質配
列中でThr169Ileを生じる追加の点突然変異（おそら
く、ポリメラーゼのエラーによる）の存在が明らかにな
った。IA−CNTFのコード配列を以下の方法を使用して、
細菌中で高レベルのタンパク質発現を可能にするプラス
ミド（ホートン（Horton）とピース（Pease）、1991）
であるpRSET中にサブクローニングした。pHenD−IA−CN
TFベクターを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマ
ー５（５′−GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG−３′）
と６（５′−TGACGCGGCCGCCCTACACATTTTCTTGTTGTTAGCAA
TATA−３′）を、94℃で２分、50℃で２分、72℃で２分
を25サイクルで使用してPCR増幅を行なった。PCR産物を
Nco IとBamH Iで消化して、ウィザード（Wizard）PCRキ
ットを使用して精製し、Nco I/BamH I消化したプラスミ
ドpRSET−CNTF（ホートン（Horton）とピース（Peas
e）、1991）中にサブクローニングした。最終作製体の
本体を、DNA配列決定により確認した。
ｂ）修飾CNTFタンパク質の産生と精製 組換えタンパク質を大腸菌（E.coli）中で産生し、既
に記載されている（サッギオ（Saggio）ら、1995;ジ・
マルコ（Di Marco）ら、1996）ように逆相−HPLCによ
り精製した。
に記載されている（サッギオ（Saggio）ら、1995;ジ・
マルコ（Di Marco）ら、1996）ように逆相−HPLCによ
り精製した。
例2:修飾CNTFタンパク質の受容体結合活性 既に記載されている方法（サッギオ（Saggio）ら、19
95;サッギオ（Saggio）ら、1995）を使用して、固相固
定化CNTFRへの結合についてビオチン化CNTFと競合する
タンパク質の能力を測定することにより、CNTFとIA−CN
TFのCNTFR結合活性を測定した。Fig.1に示すように、IA
−CNTFは野生型タンパク質と比較してCNTFRに対する親
和性が15倍低下していた。
95;サッギオ（Saggio）ら、1995）を使用して、固相固
定化CNTFRへの結合についてビオチン化CNTFと競合する
タンパク質の能力を測定することにより、CNTFとIA−CN
TFのCNTFR結合活性を測定した。Fig.1に示すように、IA
−CNTFは野生型タンパク質と比較してCNTFRに対する親
和性が15倍低下していた。
例3:非ニューロン細胞中で可溶性CNTFRにより介在され
る生物活性 HepG2でのハプトグロビン産生の刺激 ヒト肝臓癌細胞株HepG2はLIFRとgp130を発現するが、
CNTFRは発現しない（バウマン（Baumann）ら、1993）。
可溶性CNTFRをHepG2細胞に添加すると、高親和性CNTF受
容体複合体の形成のためにCNTFに対する応答の上昇が用
量依存的に起きる。IA−CNTFの生物活性をFig.2に示
す。ｓ−CNTFRの飽和濃度でこの変種は、CNTFRに対する
親和性が低下したことと一致して、CNTFより５倍大きい
EC50値で、HepG2測定法で完全なアゴニストとして挙動
した。
る生物活性 HepG2でのハプトグロビン産生の刺激 ヒト肝臓癌細胞株HepG2はLIFRとgp130を発現するが、
CNTFRは発現しない（バウマン（Baumann）ら、1993）。
可溶性CNTFRをHepG2細胞に添加すると、高親和性CNTF受
容体複合体の形成のためにCNTFに対する応答の上昇が用
量依存的に起きる。IA−CNTFの生物活性をFig.2に示
す。ｓ−CNTFRの飽和濃度でこの変種は、CNTFRに対する
親和性が低下したことと一致して、CNTFより５倍大きい
EC50値で、HepG2測定法で完全なアゴニストとして挙動
した。
例4:ニューロン細胞中で膜結合CNTFRにより介在される
生物活性 IMR−32細胞でのコリンアセチルトランスフェラーゼ活
性の刺激 ｍ−CNTFRを発現する（バウマン（Baumann）ら、199
3;ハルボルセン（Halvorsen）ら、1996）ヒト神経芽腫
細胞株IMR−32細胞中でコリンアセチルトランスフェラ
ーゼを誘導するCNTFRとIA−CNTFの能力を測定した。Fi
g.3で証明されるように、HepG2細胞とは対照的にCNTFと
IA−CNTFはこの測定法で等力価であった。
生物活性 IMR−32細胞でのコリンアセチルトランスフェラーゼ活
性の刺激 ｍ−CNTFRを発現する（バウマン（Baumann）ら、199
3;ハルボルセン（Halvorsen）ら、1996）ヒト神経芽腫
細胞株IMR−32細胞中でコリンアセチルトランスフェラ
ーゼを誘導するCNTFRとIA−CNTFの能力を測定した。Fi
g.3で証明されるように、HepG2細胞とは対照的にCNTFと
IA−CNTFはこの測定法で等力価であった。
例5:膜結合CNTFRを発現するように作成した非ニューロ
ン細胞中での生物活性 CNTFRに対する親和性の低下にもかかわらず膜結合CNT
FRは、修飾CNTFタンパク質に高い応答性を与えるのに充
分であるか否かを試験するために、完全長CNTFRをコー
ドする発現ベクターでHepG2細胞を安定にトランスフェ
クションした。このために、完全長ヒトCNTFRをコード
するヒトcDNA（アミノ酸１〜372をコードするヌクレオ
チド264〜1382（デービス（Davis）ら、1991））を、SH
−SY5Y細胞から逆転写PCRにより得て、ネオマイシン耐
性遺伝子を有する真核生物発現プラスミドpcDNA3（イン
ビトロゲン（InVitrogen））のEcoR V部位にクローン化
した。DNA（20mg）をリン酸カルシウム沈殿物（グラハ
ム（Graham）とバン・デル・イービー（Van der E
b）、1973）としてHepG2細胞中にトランスフェクション
し、1mg/mlのG418を補足した完全培地（ペニシリン、ス
トレプトマイシン、および10％胎児牛血清を含有する最
小基本培地）中で細胞を選択させた。CNTFRを安定に発
現するサブクローン（HepG2/CNTFR）を、CNTF表面結合
とハプトグロビン産生のCNTF誘導性刺激に基づいて同定
した。HepG2/CNTFR細胞を、0.2mg/mlのG418を補足した
完全培地で維持した。
ン細胞中での生物活性 CNTFRに対する親和性の低下にもかかわらず膜結合CNT
FRは、修飾CNTFタンパク質に高い応答性を与えるのに充
分であるか否かを試験するために、完全長CNTFRをコー
ドする発現ベクターでHepG2細胞を安定にトランスフェ
クションした。このために、完全長ヒトCNTFRをコード
するヒトcDNA（アミノ酸１〜372をコードするヌクレオ
チド264〜1382（デービス（Davis）ら、1991））を、SH
−SY5Y細胞から逆転写PCRにより得て、ネオマイシン耐
性遺伝子を有する真核生物発現プラスミドpcDNA3（イン
ビトロゲン（InVitrogen））のEcoR V部位にクローン化
した。DNA（20mg）をリン酸カルシウム沈殿物（グラハ
ム（Graham）とバン・デル・イービー（Van der E
b）、1973）としてHepG2細胞中にトランスフェクション
し、1mg/mlのG418を補足した完全培地（ペニシリン、ス
トレプトマイシン、および10％胎児牛血清を含有する最
小基本培地）中で細胞を選択させた。CNTFRを安定に発
現するサブクローン（HepG2/CNTFR）を、CNTF表面結合
とハプトグロビン産生のCNTF誘導性刺激に基づいて同定
した。HepG2/CNTFR細胞を、0.2mg/mlのG418を補足した
完全培地で維持した。
HepG2/CNTFR細胞中の機能性ｍ−CNTFRの存在を、ｓ−
CNTFRの非存在下でSTAT転写因子の活性化を急速に誘導
するCNTFの能力により確認した。これに対してHepG2細
胞中のCNTFによるSTAT活性化は、Fig.4に示すようにｓ
−CNTFRの存在を必要とした。
CNTFRの非存在下でSTAT転写因子の活性化を急速に誘導
するCNTFの能力により確認した。これに対してHepG2細
胞中のCNTFによるSTAT活性化は、Fig.4に示すようにｓ
−CNTFRの存在を必要とした。
電子移動度シフト測定法 HepG2とHepG2/CNTFR細胞を100mlのペトリ皿中に入
れ、24時間後にセミコンフルエントになった時に使用し
た。細胞を４時間血清で枯渇させた後に、種々の試薬で
15分間処理した。次にNaF 50mMを含有する氷冷リン酸
塩緩衝液で細胞を洗浄し、遠心分離して集め、液体窒素
中で凍結した。既に記載されているように（デマルティ
ス（Demartis）ら、1996）総細胞抽出物を調製した。オ
リゴヌクレオチドSIE m67（ワグナー（Wagner）ら、19
90）を有する活性化STAT因子の高親和性結合を、サドウ
スキー（Sadowsky）とギルマン（Gilman）（サドウスキ
ー（Sadowsky）とギルマン（Gilman）、1993を参照され
たい）に従って10（ｇの細胞抽出物を使用して電子移動
度シフト測定法により測定した。［（−32P］dATPと
［（−32P］dCTP（3000Ci/mmoli）の存在下でクレノウ
酵素を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを５′末端
で標識した。複合体を、2.5％/0.5 TBE（トリス−ホウ
酸 45mM、EDTA 0.5mM、pH7.8）中のポリアクリルアミ
ドゲル５％グリセロール中に溶解し、次いで乾燥し、オ
ートラジオグラフィーに付した。
れ、24時間後にセミコンフルエントになった時に使用し
た。細胞を４時間血清で枯渇させた後に、種々の試薬で
15分間処理した。次にNaF 50mMを含有する氷冷リン酸
塩緩衝液で細胞を洗浄し、遠心分離して集め、液体窒素
中で凍結した。既に記載されているように（デマルティ
ス（Demartis）ら、1996）総細胞抽出物を調製した。オ
リゴヌクレオチドSIE m67（ワグナー（Wagner）ら、19
90）を有する活性化STAT因子の高親和性結合を、サドウ
スキー（Sadowsky）とギルマン（Gilman）（サドウスキ
ー（Sadowsky）とギルマン（Gilman）、1993を参照され
たい）に従って10（ｇの細胞抽出物を使用して電子移動
度シフト測定法により測定した。［（−32P］dATPと
［（−32P］dCTP（3000Ci/mmoli）の存在下でクレノウ
酵素を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを５′末端
で標識した。複合体を、2.5％/0.5 TBE（トリス−ホウ
酸 45mM、EDTA 0.5mM、pH7.8）中のポリアクリルアミ
ドゲル５％グリセロール中に溶解し、次いで乾燥し、オ
ートラジオグラフィーに付した。
CNTFとIA−CNTFは、HeG2/CNTFR細胞中のハプトグロビ
ン産生の刺激において等力価であり（Fig.5）、非ニュ
ーロン細胞中のCNTFRの膜結合は、ニューロンIMR−32細
胞中で観察されるものと同様の相対的生物活性のプロフ
ィールを与えるのに充分であることを証明していた。ニ
ューロン受容体選択性が上昇していることがすでに証明
されているヒトCNTF変種（イタリア特許出願RM96A00049
2号）であるAKDH−CNTF（Dhe152Ala/Ser166Asp/Gln167H
is/ヒトCNTF）もまた、CNTFRを発現する肝臓癌細胞中で
非常に高力価である。これらの結果は、この測定法が、
膜結合CNTFRに対して選択制が上昇したCNTF変種を同定
するのに役立ち得ることを証明している。
ン産生の刺激において等力価であり（Fig.5）、非ニュ
ーロン細胞中のCNTFRの膜結合は、ニューロンIMR−32細
胞中で観察されるものと同様の相対的生物活性のプロフ
ィールを与えるのに充分であることを証明していた。ニ
ューロン受容体選択性が上昇していることがすでに証明
されているヒトCNTF変種（イタリア特許出願RM96A00049
2号）であるAKDH−CNTF（Dhe152Ala/Ser166Asp/Gln167H
is/ヒトCNTF）もまた、CNTFRを発現する肝臓癌細胞中で
非常に高力価である。これらの結果は、この測定法が、
膜結合CNTFRに対して選択制が上昇したCNTF変種を同定
するのに役立ち得ることを証明している。
参考 （１） Manthorpe,M.,Louis,J.C.,Hagg,T.,e Varon,S.
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H.,e Sendtner,M.（1988）Nature 335,70−73 （４） Louis,J.−C.,Magal,E.,Takayama,S.,e Varon,
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P.C.,e Rose−John,S.（1992）FEBS Lett.314,280−284 （６） Helgren,M.E.,Squinto,S.P.,Davis,H.L.,Parr
y,D.J.,Boulton,T.G.,Heck,C.S.,Zhu,Y.,Yancopoulos,
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K.,Yancopoulos,G.D.,Turner,K.,Shoyab,M.,Taga,T.,Ki
shimoto,T.,Bataille,R.,e Klein,B.（1994）J.Exp.Me
d.177,1337−1342 （10） Dittrich,F.,Thoenen,H.,e Sendtner,M.（199
4）Ann.Neurol.35,151−163 （11） Davis,S.,Aldrich,T.H.,Valenzuela,D.M.,Won
g,V.,Furth,M.E.,Squinto,S.P.,e Yancopoulos,G.D.（1
991）Science 253,59−63 （12） Ip,N.Y.,McClain,J.,Barrezueta,N.X.,Aldric
h,T.H.,Pan,L.,Li,Y.,Wiegand,S.J.,Ffiedman,B.,Davi
s,S.,e Yancopoulos,G.D.（1993）Neuron 10,89−102 （13） Davis,S.,Aldrich,T.H.,Ip,N.Y.,Stahl,N.,Sch
erer,S.,Farruggella,T.,Distefano,P.S.,Curtis,R.,Pa
nayotatos,N.,gascan,H.,Chevalier,S.,e Yancopoulos,
G.D.（1993）Science 259,1736−1739. （14） Baumann,G.,Lowman,H.B.,Mercado,M.,e Wells,
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c.Natl.Acad.Sci.USA 93,9247−9252 （19） Baumann,H.,Ziegler,S.F.,Mosley,B.,Morella,
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n,B.H.（1990）EMBO J.9,4477−4484 （24） Sadowski,H.B.e Gilman,M.Z.（1993）Nature 3
62,79−83 （25） Gearing,D.P.（1993）Adv.Immunol.53,31−58 配列表 一般情報 （ｉ）出願人： インスティテュート・ディ・リセルケ・ディ・ビオロジ
ア・モレコラーレ・ピー・アンジェレッティ・エス・ピ
ー・エー（INSTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECO
LARE P.ANGELETTI S.p.A.） （ii）発明の名称：「受容体選択性が強化された修飾毛
様体神経栄養因子およびその選択方法」 （iii）配列の数:2 （iv）連絡住所： （Ａ）宛名：ソチエタ・イタリアーナ・ブレヴェッテ
ィ（Societa' Italiana Brevetti） （Ｂ）通り：ピアッツァ・ディ・ピエトラ、39（Piaz
za di Pietra,39） （Ｃ）市：ローマ （Ｄ）国：イタリア （Ｅ）郵便番号:I−00186 （ｖ）コンピューターで読める形式： （Ａ）支持体の型：フロッピーディスク、3.5イン
チ、1.44メガバイト （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
5.0版 （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード6.0 （viii）代理人情報 （Ａ）氏名：マリオ・ディ・セルボ（DI CERBO Mari
o）（博士（Dr.）） （Ｂ）照会:RM/X89001/PC−DC （ix）電話連絡先情報 （Ａ）電話:06/6785941 （Ｂ）ファックス:06/6794692 （Ｂ）テレックス:612287 ROPAT （１）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特色 （Ａ）長さ:200アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク質 （ix）配列の特徴： （Ａ）名称：ヒトCNTF （Ｄ）他の情報：ヒトCNTFの配列 （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特色 （Ａ）長さ:200アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク質 （ix）配列の特徴： （Ａ）名称：（Thr169Ile/His174Ala）ヒトCNTF;IA−
CNTF （Ｄ）他の情報：ヒトCNTFの配列 （xi）配列：配列番号:2:
（1993）in Neurotrophic factors（Loughlin,S.E.e Fa
llon,J.H.,eds）p.443−473,Academic Press,San Dieg
o,CA （２） Ip,N.Y.e Yancopoulos,G.D.（1996）Annu.Rev.
Neurosci.19,491−515 （３） Hughes,S.M.Lillien,L.E.,Raff,M.C.,Rohrer,
H.,e Sendtner,M.（1988）Nature 335,70−73 （４） Louis,J.−C.,Magal,E.,Takayama,S.,e Varon,
S.（1993）Science 259,689−692 （５） Schooltink,H.,Stoyan,T.,Roeb,E.,Heinrich,
P.C.,e Rose−John,S.（1992）FEBS Lett.314,280−284 （６） Helgren,M.E.,Squinto,S.P.,Davis,H.L.,Parr
y,D.J.,Boulton,T.G.,Heck,C.S.,Zhu,Y.,Yancopoulos,
G.D.,Lindsay,R.M.,e DiStefano,P.S.（1994）Cell 76,
493−504 （７） Conover,J.C.,Ip,N.Y.,Poueymirou,W.T.,Bate
s,B.,Goldfarb,M.P.,DeChiara,T.M.,e Yancopoulos,G.
D.（1993）Development 119,559−565 （８） Gimble,J.M.,Wanker,F.,Wang,C.−S.,Bass,H.,
Wu,X.,Kelly,K.,Yancopoulos,G.D.,e Hill,M.R.（199
4）J.Cell.Biochem.54,122−133 （９） Zhang,X.−G.,Gu,J.−J.,Lu,Z.−Y.,Yasukawa,
K.,Yancopoulos,G.D.,Turner,K.,Shoyab,M.,Taga,T.,Ki
shimoto,T.,Bataille,R.,e Klein,B.（1994）J.Exp.Me
d.177,1337−1342 （10） Dittrich,F.,Thoenen,H.,e Sendtner,M.（199
4）Ann.Neurol.35,151−163 （11） Davis,S.,Aldrich,T.H.,Valenzuela,D.M.,Won
g,V.,Furth,M.E.,Squinto,S.P.,e Yancopoulos,G.D.（1
991）Science 253,59−63 （12） Ip,N.Y.,McClain,J.,Barrezueta,N.X.,Aldric
h,T.H.,Pan,L.,Li,Y.,Wiegand,S.J.,Ffiedman,B.,Davi
s,S.,e Yancopoulos,G.D.（1993）Neuron 10,89−102 （13） Davis,S.,Aldrich,T.H.,Ip,N.Y.,Stahl,N.,Sch
erer,S.,Farruggella,T.,Distefano,P.S.,Curtis,R.,Pa
nayotatos,N.,gascan,H.,Chevalier,S.,e Yancopoulos,
G.D.（1993）Science 259,1736−1739. （14） Baumann,G.,Lowman,H.B.,Mercado,M.,e Wells,
J.A.（1994）J.Clin.Endocrinol.Metab.78,1113−1118 （15） Horton,R.M.e Pease,L.R.（1991）in Directed
mutagenesis:a practical approach,（ed.McPherson,
M.J.）Oxford Univ.Press,Oxford,pp.217−247 （16） Saggio,I.,Paonessa,G.,gloaguen,I.,Grazian
i,R.,Di Serio,A.,e Laufer,R.（1994）Anal.Biochem.2
21,387−391 （17） Saggio,I.,Gloaguen,I.,Poiana,G.,e Laufer,
R.（1995）EMBO J.14,3045−3054 （18） Di marco,A.,Gloaguen,I.,Graziani,R.,Paones
sa,G.,Saggio,I.,Hudson,K.R.,e Laufer,R.（1996）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 93,9247−9252 （19） Baumann,H.,Ziegler,S.F.,Mosley,B.,Morella,
K.K.,Pajovic,S.,e Gearing,D.P.（1993）J.Biol.Chem.
268,8414−8417 （20） Halvorsen,S.W.,Malek,R.,Wang,X.,e Jiang,N.
（1996）Neuropharmacology 35,257−265 （21） Graham,F.L.and Van der Eb,A.J.（1973）Viro
logy 52,456−461 （22） Demartis,A.,Bernassola,F.,Savino,R.,Melin
o,G.,e Ciliberto,G.（1996）Cancer Res.56,4213−421
8 （23） Wagner,B.J.,Hayes,T.E.,Hoban,C.J.,e Cochra
n,B.H.（1990）EMBO J.9,4477−4484 （24） Sadowski,H.B.e Gilman,M.Z.（1993）Nature 3
62,79−83 （25） Gearing,D.P.（1993）Adv.Immunol.53,31−58 配列表 一般情報 （ｉ）出願人： インスティテュート・ディ・リセルケ・ディ・ビオロジ
ア・モレコラーレ・ピー・アンジェレッティ・エス・ピ
ー・エー（INSTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECO
LARE P.ANGELETTI S.p.A.） （ii）発明の名称：「受容体選択性が強化された修飾毛
様体神経栄養因子およびその選択方法」 （iii）配列の数:2 （iv）連絡住所： （Ａ）宛名：ソチエタ・イタリアーナ・ブレヴェッテ
ィ（Societa' Italiana Brevetti） （Ｂ）通り：ピアッツァ・ディ・ピエトラ、39（Piaz
za di Pietra,39） （Ｃ）市：ローマ （Ｄ）国：イタリア （Ｅ）郵便番号:I−00186 （ｖ）コンピューターで読める形式： （Ａ）支持体の型：フロッピーディスク、3.5イン
チ、1.44メガバイト （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
5.0版 （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード6.0 （viii）代理人情報 （Ａ）氏名：マリオ・ディ・セルボ（DI CERBO Mari
o）（博士（Dr.）） （Ｂ）照会:RM/X89001/PC−DC （ix）電話連絡先情報 （Ａ）電話:06/6785941 （Ｂ）ファックス:06/6794692 （Ｂ）テレックス:612287 ROPAT （１）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特色 （Ａ）長さ:200アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク質 （ix）配列の特徴： （Ａ）名称：ヒトCNTF （Ｄ）他の情報：ヒトCNTFの配列 （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特色 （Ａ）長さ:200アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数:1本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク質 （ix）配列の特徴： （Ａ）名称：（Thr169Ile/His174Ala）ヒトCNTF;IA−
CNTF （Ｄ）他の情報：ヒトCNTFの配列 （xi）配列：配列番号:2:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 25/00 38/22 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/24 Ａ６１Ｐ 25/00 37/02 (72)発明者 デ マルティス，アンナ イタリア国，ローマ，ビア レオポルド ルスポリ，64 (72)発明者 ラウフェル，ラルフ イタリア国，ローマ，ビア モンターニ ュ ロッシオス，68 (72)発明者 サッジオ，イザベラ イタリア国，ローマ，ビア デイ カル タニ，５ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 C07K 14/00 - 14/825 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (11)
- 【請求項１】毛様神経栄養性因子（CNTF）の変種であっ
て、ヒトCNTF野生型（配列番号１）の169位と174位に対
応する位置の残基が、それぞれイソロイシン残基とアラ
ニン残基で置換されており、CNTF野生型に関してCNTF膜
受容体に対する結合親和性は変化せず、CNTF野生型に関
してCNTF可溶性受容体に対する結合親和性が低下してい
ることを特徴とする、上記変種。 - 【請求項２】CNTF、CNTF膜受容体、およびCNTF可溶性受
容体はヒトのものである、請求の範囲第１項記載のCNTF
の変種。 - 【請求項３】請求の範囲第１項または第２項記載のCNTF
変種をコードする、DNA分子。 - 【請求項４】DNA分子は単離され精製されたDNA分子であ
る、請求項第３項記載のDNA分子。 - 【請求項５】組換えDNA分子中でのDNA分子発現を調節す
る配列に機能的に結合した、請求の範囲第４項記載のDN
A分子を含んでなるDNA組換え分子。 - 【請求項６】請求の範囲第５項記載の組換えDNAで形質
転換した宿主細胞。 - 【請求項７】細菌、酵母、真菌、動物細胞および植物細
胞よりなる群から選択される、請求の範囲第６項記載の
宿主細胞。 - 【請求項８】他のタンパク質または他の分子との、請求
の範囲第１項または第２項記載の変種の結合体。 - 【請求項９】分子はポリエチレングリコールである、請
求の範囲第８項記載の結合体。 - 【請求項１０】CNTFに対する細胞の分化、増殖、または
生存をインビトロで促進するための、請求の範囲第１項
または第２項記載の変種の使用。 - 【請求項１１】CNTFに応答する細胞の分化、増殖、また
は生存をインビボで促進するための、請求の範囲第１項
または第２項記載の変種を含む組成物。
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