JP3113284B2 - Aspergillus fetidas expression system - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、組換えタンパク質の生産に有用な宿主細胞
に関する。特に、本発明は、組換えタンパク質、特に酵
素の高レベル発現に利用できるアスペルギルス属の真菌
宿主細胞に関する。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to host cells useful for producing recombinant proteins. In particular, the invention relates to fungal host cells of the genus Aspergillus that can be used for high-level expression of recombinant proteins, particularly enzymes.
発明の背景 異種タンパク質の発現に組換え宿主細胞を使うこと
は、近年、他の方法ではそれらの天然源からの精製によ
ってのみ得られる商業的に有益なタンパク質の大量生産
を大きく単純化した。現在、特定の任意のタンパク質の
生産のためには原核および真核宿主を含む様々な発現系
の選択肢がある。適当な発現系の選択は、しばしば活性
状態で妥当な収率でタンパク質を生産できる宿主細胞の
能力に依存するだけでなく、タンパク質の意図する最終
用途によっても大きく左右されるだろう。BACKGROUND OF THE INVENTION The use of recombinant host cells for the expression of heterologous proteins has greatly simplified the recent large-scale production of commercially valuable proteins that would otherwise only be obtained by purification from their natural sources. Currently, there are a variety of expression system options for the production of any particular protein, including prokaryotic and eukaryotic hosts. The choice of an appropriate expression system will often depend not only on the ability of the host cell to produce the protein in a reasonable yield in the active state, but will also largely depend on the intended end use of the protein.
哺乳動物細胞と酵母細胞が最も汎用されている真核宿
主であるが、糸状菌が組換えタンパク質生産用の宿主細
胞として非常に有用であると現在認識され始めている。
現在使われているかまたはそのような用途に提案されて
いる糸状菌の中には、ニューロスポラ・クラッサ（Neur
ospora crassa）、アクレモニウム・クリソゲナム（Acr
emonium chrysogenum）、トリポクラジウム・ゲオデス
（Tolypocladium geodes）、ムーコル・サーシネロイデ
ス（Mucor circinelloides）およびトリコデルマ・レー
セイ（Trichoderma reesei）がある。加えて、アスペル
ギルス属の幾つかの種は組換えタンパク質生産のための
宿主細胞として有効に使われている。アスペルギルス
は、分生子柄から成る潅水器状物が頂嚢で終わり、この
頂嚢が小柄またはフィアリド（小梗）と色々な名前で呼
ばれる一層もしくは二層の同時形成された特殊細胞を生
み、そして分生子と呼ばれる無性胞子を形成することに
より特徴づけられる。アスペルギルス・ニデュランス
（Aspergillus nidulans）種は組換えプラスミドにより
形質転換されると報告されている（Ballance他、Bioche
m.Biophys.Res.Comm.112:284−289,1983）が、形質転換
はかなり低い頻度で起こることがわかった。アスペルギ
ルス・ニガー（Aspergillus niger）とアスペルギルス
・オリゼ（Aspergillus oryzae）両種も組換えタンパク
質生産において有用であると記載されている。しかしな
がら、他のアスペルギルス種は異種タンパク質の発現に
有用であると示されておらず、実際に、貧弱な発現およ
び／またはプロテアーゼもしくはマイコトキシンの過剰
生産のために、アスペルギルスの全ての種がこの目的に
宿主細胞として適するわけではないし、或る種から判断
して次の種へとこの能力を予測することもできない。ア
スペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus）
はＢ型肝炎抗原の発現に使われている（Hongdi他,Acta
Microbiologica Sinica 30:98−104,1990）けれども、
他のいずれかの種類のタンパク質の発現に有用であると
は報告されておらず、また高収率でタンパク質を生産す
ることができるとは報告されていない。理想的な発現系
は、プロテアーゼおよびマイコトキシン並びに多量の内
因性的に作られる分泌タンパク質の生産が実質的にな
く、且つ既知の宿主細胞よりも高いレベルの発現が可能
であるものである。本発明は、それらの要件を満たし且
つ相当量の真菌酵素を発現することができる新規アスペ
ルギルス発現系を提供する。Although mammalian cells and yeast cells are the most commonly used eukaryotic hosts, filamentous fungi are now beginning to be recognized as being extremely useful as host cells for recombinant protein production.
Among the filamentous fungi currently in use or proposed for such use are the Neurospora crassa (Neur
ospora crassa), Acremonium chrysogenum (Acr
emonium chrysogenum, Tolypocladium geodes, Mucor circinelloides and Trichoderma reesei. In addition, some species of the genus Aspergillus have been effectively used as host cells for recombinant protein production. Aspergillus irrigates consisting of conidiophores terminate in the apical sac, which gives rise to one or two layers of simultaneously formed special cells called petiole or phialid, and It is characterized by the formation of asexual spores called conidia. Aspergillus nidulans species have been reported to be transformed by recombinant plasmids (Ballance et al., Bioche
112. 284-289, 1983) found that transformation occurs at a much lower frequency. Both Aspergillus niger and Aspergillus oryzae species are also described as being useful in recombinant protein production. However, no other Aspergillus species have been shown to be useful for the expression of heterologous proteins, and indeed, due to poor expression and / or overproduction of proteases or mycotoxins, all species of Aspergillus have been found to serve this purpose. It is not suitable as a host cell and cannot judge from one species to predict this ability to the next. Aspergillus foetidus
Has been used to express hepatitis B antigen (Hongdi et al., Acta
Microbiologica Sinica 30: 98-104, 1990)
It is not reported to be useful for the expression of any other type of protein, and it has not been reported that the protein can be produced in high yield. An ideal expression system is one that has substantially no production of proteases and mycotoxins and large amounts of endogenously produced secreted proteins, and is capable of higher levels of expression than known host cells. The present invention provides a novel Aspergillus expression system that meets these requirements and is capable of expressing significant amounts of fungal enzymes.
発明の要約 本発明は、異種酵素をコードする核酸配列を含有す
る、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foet
idus）宿主細胞を提供する。「異種酵素」とは、宿主細
胞にとって生来でない酵素、または生来の配列を変更す
る修正が行われている生来の酵素を意味する。好ましい
態様では、該タンパク質は異種真菌酵素である。該核酸
配列は、選択された宿主細胞中で該核酸配列の転写を指
令することのできる適当なプロモーター配列に作用可能
に連結される。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to Aspergillus foet containing nucleic acid sequences encoding a heterologous enzyme.
idus) host cells. By "heterologous enzyme" is meant an enzyme that is not native to the host cell or has been modified to alter the native sequence. In a preferred embodiment, the protein is a heterologous fungal enzyme. The nucleic acid sequence is operably linked to a suitable promoter sequence capable of directing transcription of the nucleic acid sequence in a selected host cell.
本発明はまた、酵素の組換え生産方法であって、異種
酵素をコードする核酸配列を含有するアスペルギルス・
フェティダス宿主細胞を、該酵素の発現を促す条件下で
培養し、そして培養物から該酵素を回収することを含ん
で成る方法にも関する。好ましい態様では、該酵素は真
菌酵素である。The present invention also relates to a method for the recombinant production of an enzyme, which comprises a nucleic acid sequence encoding a heterologous enzyme.
Fetidus host cells are also cultured under conditions that promote expression of the enzyme, and recovering the enzyme from the culture. In a preferred embodiment, the enzyme is a fungal enzyme.
本発明の宿主細胞および方法は、意外にも、他の既知
のアスペルギルス種、例えばA.ニガーまたはA.オリゼよ
りも、様々な真菌酵素の組換え生産においてより優れて
いる。The host cells and methods of the present invention are surprisingly superior to other known Aspergillus species, such as A. niger or A. oryzae, in the recombinant production of various fungal enzymes.
発明の詳細な説明 アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetid
us）種はアスペルギルス属の原色（Nigre）部門に属す
る。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に
より代表されるような黒色部門のメンバーは、放射状分
生子頭と黒色気味の分生子集団；球状頂嚢；滑らかで透
明な、または頂嚢の下が着色している菌柄；存在するか
または欠けており、しばしば着色しているメツラ（基底
梗子）により特徴づけられる（“The Genus Aspergillu
s",K.B.RaperおよびD.I.Fennel著,The Williams ＆ Wik
ins Company,Baltimore,1965）。胞子色と装飾物、また
は他の微視形態的特徴が異なるそれらの株の変異体もこ
の部門に含められる。アスペルギルス属の黒色部門で
は、主な分類法が第一に基礎にしている（即ち、Raper
およびFennel,前掲）コロニーの色と分生子形成構造が
多様であるため、分類群の境界は論争中である。Raper
およびFennelにより認められたA.フェティダス関連分類
群はA.フェティダス、A.フェティダス変種アシダス（A.
foetidus var.acidus）およびA.フェティダス変種パリ
ダス（A.foetidus var.pallidus）である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Aspergillus foetid
us) species belong to the primary color (Nigre) category of the genus Aspergillus. Members of the black division, such as those represented by Aspergillus niger, are radial conidial heads and a population of black conidia; spherical apical sac; smooth, transparent or colored beneath the apical sac Fungal stalks; characterized by a present or absent, often colored metula (basal stalk) ("The Genus Aspergillu
s ", by KBRaper and DIFennel, The Williams & Wik
ins Company, Baltimore, 1965). Variants of those strains that differ in spore color and ornamentation or other micromorphological features are also included in this category. In the black division of the genus Aspergillus, the main taxonomy is primarily based (ie, Raper
And Fennel, supra) Due to the diversity of colony colors and conidial formation structures, taxon boundaries have been controversial. Raper
And A. fetidas-related taxa recognized by Fennel include A. fetidas, A. fetidas var.
foetidus var. acidus) and A. fetidus var. paridas (A. foetidus var. pallidus).
A.フェティダスは一般的に、２列の梗子；灰色がかっ
た濃茶またはオリーブ茶色の分生子頭；成熟した時には
球状またはほぼ球状で、不規則に且つ細かくでこぼこに
なった分生子により特徴づけられる。より詳しくは、こ
の種は次のように特徴づけられる:Czapek溶液寒天上の
コロニーは室温（24〜26℃）でゆっくりと増殖し、10日
〜２週間で3.5〜4.5cmに達し、大部分が水面下にあるか
またはより密集した比較的硬い表面を形成する白色また
は黄色味を帯びた無性菌糸を有し、平坦であるかまたは
放射状に皺が寄り、非輪紋状または弱い輪紋状であり、
株によっては増殖している縁のところを除いて全体に豊
富なオリーブ茶〜黒褐色の分生子頭を生じる株もあり、
遅く且つあまり豊富にでなく胞子形成する株もあり；滲
出物は無いかまたは目立たなく；コロニーの裏側は黄色
〜橙色で、成熟すすると赤褐色になり；臭いは非常に強
く、アクチノマイセス様の突き刺すような臭いである。
分生子頭は最初は小さく球状〜放射状であり、密集した
コロニー中央領域ではそのようなままであるが、コロニ
ーの縁近くでは不規則に幾つかの明瞭な柱状体に割れ始
めており、通常は全直径が200〜300μであるが、株によ
っては500μに達することもあり；分生子柄は大部分が
直径25〜35μであるが、40〜50μに達する株もあり、大
きな頭部では全表面が稔性であり、小さな頂嚢では上側
の3/4が稔性であり；梗子は二列で、褐色気味に着色し
ており、第一列は幾分多様であり、大部分が７〜12μ×
3.0〜5.0μで、時にはそれより長く、第二列は７〜８μ
×2.5〜3.0μであり；分生子は大部分が球状、時に半球
状で、褐色でしばしば平滑に見えるが成熟すると不規則
で且つ細かくでこぼこした壁を有し、大部分は直径が4.
0〜4.5μであり、明らかな分岐点を持たずに鎖状にでき
る。A. fetidas is generally characterized by two rows of conidia; dark gray or olive-brown conidia; globular or nearly globular when mature, irregular and finely bumpy conidia . More specifically, this species is characterized as follows: colonies on Czapek solution agar grow slowly at room temperature (24-26 ° C.), reaching 3.5-4.5 cm in 10 days to 2 weeks, most Have a white or yellowish asexual mycelium that forms a relatively hard surface that is submerged or more dense, flat or radially wrinkled, non-ringed or weakly ringed State,
Some strains give rise to abundant olive tea-black-brown conidium heads except for the growing edges,
Some strains are slow and not very abundant and sporulate; no exudate or inconspicuous; the backside of the colony is yellow-orange, turns reddish-brown on maturation; very odorous, Actinomyces-like It has a sticky smell.
Conidial heads are initially small, globular to radial, and remain so in the dense central colony region, but have begun to randomly break into several distinct columns near the edge of the colony, usually Diameters are 200-300μ, but can reach 500μ in some strains; conidiophores are mostly 25-35μ in diameter, some strains can reach 40-50μ, with large heads having a whole surface. Fertile, small apical with upper 3/4 fertile; incotyls double row, brownish colored, first row somewhat varied, mostly 7-12μ ×
3.0-5.0μ, sometimes longer, the second row is 7-8μ
× 2.5-3.0μ; conidia mostly spherical, sometimes hemispherical, appear brown and often smooth but have irregular and finely rough walls upon maturation, most of which have a diameter of 4.
It is 0-4.5μ, and can be formed in a chain without having a clear branch point.
肉エキス寒天上のコロニーは、幾分速く２週間で５〜
6cmに増殖し、平坦で、ビロード状であり、水面下に且
つ無色またはわずかに黄色の無性菌糸を有し、全体に激
しく胞子形成し、黒褐色で、非輪紋状またはわずかに輪
紋状であり；裏側は淡黄色〜ほとんど無色であり；臭い
は顕著でない。分生子頭は通常多数の顕著に分岐したコ
ンパクトな柱状体に割れ、大部分の株では直径300〜350
μに達するが600〜800μに達する株もあり；分生子はCz
apek寒天上よりも一様に棘状である。分生子頭の構造上
の詳細は上述した通りである。この種はThomおよびRape
r,A Manual of the Aspergilli,219−220,図61C,1945に
より最初に記載された。The colonies on the meat extract agar are somewhat faster
Growing to 6 cm, flat, velvety, underwater and with colorless or slightly yellow asexual mycelia, vigorous sporulation throughout, dark brown, non-ringed or slightly ring-shaped The backside is pale yellow to almost colorless; the odor is not noticeable. Conidial heads usually break into many prominently branched compact pillars, with most strains 300-350 in diameter
μ, but some strains reach 600-800μ; conidia are Cz
More spiky than on apek agar. The structural details of the conidial head are as described above. This species is Thom and Rape
r, A Manual of the Aspergilli, 219-220, FIG. 61C, 1945.
A.フェティダス変種パリダス（Nakazawa,SimoおよびW
atanabe,J.Agr.Chem.Soc.Japan12:961−962,図10,193
6）は、コロニーがCzapek溶液寒天上でむしろ限定的に
増殖し、室温（24〜26℃）で10日〜２週間で2.0〜2.5cm
の直径に達し、平坦であるかまたはごくわずかに皺が寄
り、密集した基底菌糸から成り、非胞子形成性でありそ
して縁のところが白色または黄色を帯びているが、その
他はぼんやり灰色がかったオリーブ色〜濃いオリーブ色
に近いオリーブ茶色〜Chacturaまたはオリーブ黒色の密
集した分生子頭を生成し；裏側が最初は無色で次に黄色
を帯び、成熟すると濃い黄褐色になり；臭いが該種のも
のより顕著でなく、標微的でないことにより特徴づけら
れる。分生子頭は球状〜放射状で、直径が500〜600μま
でであり、通常は幾つかの不明瞭は柱状体に割れてお
り；分生子柄は滑らかで、無色または茶色がかってお
り、普通は長さ約1mm×幅８〜16μで、時にはそれより
長いことがあり；頂嚢は球状から球状に近く、最も大き
な頭部では直径が50〜60μまでであり、全表面が稔性で
あり；梗子は二列で、茶色味を帯びており、第一列は若
い時は通常10〜15μ×3.5〜5.0μであるが成熟した時は
30〜40μまでになり、第二列は大抵７〜10μ×3.0〜4.0
μであり；分生子は最初は楕円形〜卵形で且つ平滑また
はそれに近く、次第に直径3.5〜4.5μで且つかすかにで
こぼこしている球状または半球状になり、液体封入では
付着性であるが結合物では明白でない。A. Fetidas varieties Paridas (Nakazawa, Simo and W
atanabe, J. Agr. Chem. Soc. Japan 12: 961-962, Figures 10, 193
6) shows that colonies grow rather limitedly on Czapek solution agar and are 2.0-2.5 cm in 10 days to 2 weeks at room temperature (24-26 ° C.)
Olive, flat or very slightly wrinkled, consisting of dense basal hyphae, nonsporulating and white or yellow at the edges, but others dull greyish olive Produces a compact conidial head of color to dark olive-near olive brown to Chactura or olive black; reverse side initially colorless and then yellowish, matures to dark tan; smell of the species It is characterized by being less pronounced and less subtle. Conidial heads are spherical to radial, up to 500-600μ in diameter, usually with some obscurities broken into columns; conidiophores are smooth, colorless or brownish, usually long Approximately 1 mm x 8-16 μ in width and sometimes longer; the capsular sac is almost spherical in shape, the largest head is up to 50-60 μ in diameter, the whole surface is fertile; Is two rows, brownish, the first row is usually 10-15μ × 3.5-5.0μ when young, but when mature
Up to 30-40μ, the second row is usually 7-10μ × 3.0-4.0
conidia are initially oval to oval and smooth or close to it, gradually becoming 3.5-4.5μ in diameter and faintly bumpy spheres or hemispheres, and adherent in liquid encapsulation, Not obvious in the combination.
肉エキス上のコロニーは幾分迅速に増殖し、平坦で、
通常ビロード状で、全体に渡り激しく胞子形成してお
り、濃いオリーブ色〜黒色を帯びている。分生子構造は
直径が700〜800μで、本質的にはCzapek寒天上のものと
同じであるが、成熟した分生子は3.0〜3.5μの、有棘状
の球形であり、表面模様が縦方向を示す。この変種は、
主に、Czapek寒天上での一層制限された増殖、それの分
生子構造が一層大きい寸法とオリーブ色着色を示すこ
と、並びに肉エキス寒天上では成熟した分生子頭に明ら
かに分離した柱状部が無いことという点で、当該種とは
異なる。The colonies on the meat extract grew somewhat faster, were flat,
It is usually velvety, intensely spore forming throughout, and has a dark olive-black tinge. The conidial structure is 700-800μ in diameter and is essentially the same as on Czapek agar, but the mature conidia are 3.0-3.5μ, spiny, spherical, with a vertical surface pattern. Is shown. This variant is
Primarily, more restricted growth on Czapek agar, its conidial structure showing larger dimensions and olive coloration, and on meat extract agar the mature conidia had clearly separated pillars. It differs from the species in that it is absent.
A.フィティダス変種アシダス（Nakazawa,SimoおよびW
atanabe,J.Agr.Chem.Soc.Japan12:961−962,図10,193
6）は、コロニーがCzapek溶液寒天上でより遅く増殖
し、室温（24〜26℃）で10〜14日間で4.0〜5.0cmに達
し、最初は柔毛性で且つ白色〜淡黄色で、少し胞子形成
しているが、後に比較的少数の球状〜放射状の、黒褐色
分生子頭を周縁部と亜緑部に生成し；裏側が最初は黄味
を帯び、成熟すると濃い黄褐色に変わり；臭いが顕著で
なく；分生子頭が比較的大きく、直径350〜400μであ
り、明瞭な柱状体に割れておらず；分生子柄が比較的短
くて幅広であり、普通は600〜800μ×20〜30μで、まれ
に長さが1mmであり；頂嚢が球形からほぼ球形であり、
直径80〜85μまでであり、全表面に渡り稔性であり；梗
子は二列で、茶色味を帯びており、第一列は20〜40μ×
4.6μで、第二列は６〜10μ×2.5〜3.5μであり；分生
子が球形〜幾分平たく、茶色で、平滑に見えるかまたは
わずかに不規則であるが有棘状であったり小皺が寄って
いたりしない表面を有することにより特徴づけられる。A. phytidas var. Acididas (Nakazawa, Simo and W
atanabe, J. Agr. Chem. Soc. Japan 12: 961-962, Figures 10, 193
6) shows that the colonies grow slower on Czapek solution agar, reach 4.0-5.0 cm in 10-14 days at room temperature (24-26 ° C), are initially fluffy and white to pale yellow, Sporulating, but later produces relatively few globular to radial, dark brown conidium heads in the margins and subgreens; yellowish on the underside, turning dark yellow-brown on maturation; odor Not conspicuous; conidium head relatively large, 350-400μ in diameter, not broken into distinct columns; conidiophore relatively short and wide, usually 600-800μ × 20- 30μ, rarely 1mm in length; apical sac is spherical to nearly spherical,
Up to 80-85μ in diameter and fertile over the entire surface; the stems are double-rowed, brownish, the first row is 20-40μx
4.6 μ, second row 6-10 μ × 2.5-3.5 μ; conidia spherical to somewhat flat, brown, smooth or slightly irregular but spiny or wrinkled Is characterized by having a surface that is not offset.
肉エキス寒天上のコロニーは、より速く10日以内に不
規則に胞子形成し、広く輪紋状で、平坦であるかまたは
細かく皺が寄っており、大部分が水面下に明るい黄金色
の無性菌糸を有し；短い分生子柄の上に、上述したのと
同様であるがCzapek上よりも大きく、500〜600μの直径
に達し且つ多数の不明瞭な分生子の柱状体を示す、分生
子頭が生じる。この変種は、Czapek寒天上と肉エキス寒
天上で軽く胞子形成するコロニー、より大きな分生子頭
と構造部分、それの比較的短く幅の広い分生子柄、並び
に特にそれの明るい黄色の菌糸の点で、当該種とは異な
る。Colonies on meat extract agar sporulate irregularly faster within 10 days, are broadly ring-shaped, flat or finely wrinkled, and mostly have a bright golden yellow underwater surface. On a short conidiophore, similar to that described above, but larger than on Czapek, reaching a diameter of 500-600μ and showing a large number of ambiguous conidia columns A live offspring results. This variant consists of lightly sporulating colonies on Czapek agar and meat extract agar, larger conidial heads and structural parts, its relatively short and wide conidiophores, and especially its bright yellow mycelial spots. And different from the species.
本明細書および請求の範囲を通して、用語「A.フェテ
ィダス」の使用が、上述した３つの群に含まれる生物だ
けでなく、別の分類法において以前に指定されたかまた
は現在他の種と指定されているが、上記に定義したもの
と同じ形態的および培養的特徴を有し、A.フェティダス
およびそれの変異体の別名であるかもしれないそれらの
種も包含することは理解されよう。例えば、別名として
はA.アウレウス・ナカザワ（A.aureus Nakazawa）、お
よびA.アウレウス変種パリダス・ナカザワ，シモ＆ワタ
ナベ（A.aureus var.pallidus Nakazawa,Simo and Wata
nabe）が挙げられる（がそれらに限定されない）。ま
た、A.シトリクス・モサリー（A.citricus Mosseray）
（A.Musallam,Revision of the Black Aspergillus spe
cies,Ph.D.Thesis,University of Utrecht）もおそらく
別名であろう。Throughout this specification and the claims, the use of the term "A. fetidas" refers not only to the organisms included in the three groups mentioned above, but also to other species previously designated or currently designated in another taxonomy. However, it will be understood that those species which have the same morphological and cultural characteristics as defined above, and which may also be aliases for A. fetidas and variants thereof, are also encompassed. For example, A. aureus nakazawa (A. aureus Nakazawa), and A. aureus varieties Paridas nakazawa, Simo & Watanabe (A. aureus var. Pallidus Nakazawa, Simo and Wata)
nabe) (but not limited to). Also, A. citricus Mosseray
(A. Musallam, Revision of the Black Aspergillus spe
cies, Ph.D. Thesis, University of Utrecht) is probably another name.
宿主細胞候補としてのA.フェティダスの有用性の最初
の決定は、アスペルギルス属の異なる分類部門に属する
15以上の種からの様々な単離物により生産されるプロテ
アーゼのレベルの評価によって行う。これは、各単離物
を酸性、中性およびアルカリ性pHでのカゼイン透明化平
板アッセイにおいて試験することにより達成される。驚
くべきことに、黒色（Nigri）部門の幾つかのメンバー
が、生産される任意の組換えタンパク質の分解を潜在的
に引き起こし得るプロテアーゼを最少量生産したという
点で、最も良く働くことがわかった。この基準に基づい
て、更なる研究のために次の数種を選択する:A.フェテ
ィダス（A.foetidus）、A.ジャポニカス（A.japonicu
s）、A.ジャポニカス変種アクレータス（A.japonicus v
ar.aculetatus）、A.アクレータス（A.aculeatus）、A.
タマリィ（A.tamarii）、A.カルボナリウス（A.carbona
rius）およびA.フェニシス（A.phoenicis）。The first determination of the usefulness of A. fetidas as a candidate host cell belongs to different taxonomic divisions of the genus Aspergillus
This is done by assessing the levels of proteases produced by various isolates from more than 15 species. This is achieved by testing each isolate in a casein clarification plate assay at acidic, neutral and alkaline pH. Surprisingly, some members of the black (Nigri) division were found to work best in that they produced the least amount of protease that could potentially cause degradation of any recombinant protein produced. . Based on this criterion, select several species for further research: A. fetidus, A. japonicus
s), A. japonicus var.
ar.aculetatus), A. aculeatus, A. aculeatus
A. tamarii, A. carbonarius (A. carbona)
rius) and A. phoenicis.
次いで、選択された種を形質転換することを試みる。
最初の努力は標準的なA.オリゼ（A.orizae）形質転換技
術の使用に集中する（Christensen他,Bio/Technology
6:1419−1422,1988;EP出願第87 103 806.3号）。簡単に
言えば、プロトプラスト形成、形質転換、およびamdSま
たはヒグロマイシンＢ（hygB）マーカー遺伝子について
の選択に向けて、A.オリゼのプロトコールを使って同時
形質転換体を得る。発現ベクターは、異種コード配列に
加えて、A.オリゼのTAKA−アミラーゼ遺伝子と、A.ニガ
ーのグルコアミラーゼ遺伝子からの転写終結シグナルを
含有する。形質転換頻度は、DNA1μｇあたり１未満から
約10まで異なる。下記の実施例に詳述されるような発現
ベクターを使った同時形質転換実験では、同時形質転換
の頻度は０〜60％の範囲である。An attempt is then made to transform the selected species.
Initial efforts focused on using standard A. orizae transformation techniques (Christensen et al., Bio / Technology).
6: 1419-1422, 1988; EP Application No. 87 103 806.3). Briefly, co-transformants are obtained using the A. oryzae protocol for protoplast formation, transformation, and selection for the amdS or hygromycin B (hygB) marker gene. The expression vector contains, in addition to the heterologous coding sequence, the TAKA-amylase gene of A. oryzae and the transcription termination signal from the glucoamylase gene of A. niger. Transformation frequencies vary from less than 1 to about 10 per μg of DNA. In co-transformation experiments using expression vectors as detailed in the Examples below, the frequency of co-transformation ranges from 0-60%.
次いで形質転換された種を観察して様々な異種酵素の
発現レベルを測定する。試験した異種酵素としては、フ
ミコーラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa）リパ
ーゼ（HLL）、フミコーラ・インソレンス（Humicola in
solens）キシラナーゼ（キシラナーゼ）、フミコーラ・
インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ（セル
ラーゼ）およびコプリナス・シネレウス（Coprinus cin
ereus）ペルオキシダーゼ（CiP）が挙げられる。驚くべ
きことに、A.フェティダスは上記酵素の１または複数に
ついて良好な発現を示し、ある場合には、対照のA.オリ
ゼ株と同等のまたはそれより良い酵素収率を示す。特
に、A.フェティダスの１つの株は振盪フラスコ培養にお
いて非常に高いレベルのHLL（約1g/）を生産する。そ
れらの試験結果の要約は表２に与えられる。The transformed species are then observed to determine the level of expression of various heterologous enzymes. The heterologous enzymes tested include Humicola lanuginosa lipase (HLL), Humicola insolens (Humicola in
solens) xylanase (xylanase), Humicola
Humicola insolens cellulase (cellulase) and Coprinus cinereus (Coprinus cin)
ereus) peroxidase (CiP). Surprisingly, A. fetidas shows good expression for one or more of the above enzymes, and in some cases shows enzyme yields equal to or better than the control A. oryzae strain. In particular, one strain of A. fetidas produces very high levels of HLL (about 1 g /) in shake flask cultures. A summary of those test results is given in Table 2.
結果が明らかに示すように、この種の数個の単離物は
異種タンパク質を生産することができる。よって、この
能力は単一の単離物または株に限定されるのではなく、
むしろこの種の全体としての特徴であると理解される。
当業者は、それらの種の他の株または単離物も異種酵素
の発現に利用できると認識するだろう。各種の多数の株
がATCC（the American Type Culture Collection;12301
Parklawn Drive,Rockville Maryland 20852）;NRRL（A
gricultural Research Service Culture Collection;18
15 North University Street,Peoria,Illinois 6160
4）;FGSC（Fungal Genetics Stock Center;Kansas）;DS
M（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellk
ulturen;Mascheroder Weg 1B,D−3300 Braunschweig,Ge
rmany）;IAM（Institute of Applied Microbiology;113
東京都文京区弥生町１丁目１−１、東京大学）;IFO（In
stitute for Fermentation;532大阪府淀川区十三本町２
丁目17−85）およびCBS（Centraal Bureau voor Schimm
elcultures;Oosterstraat 1,3740AG Baarn,Netherland
s）の寄託機関において公に入手可能である。As the results clearly show, several isolates of this type are capable of producing heterologous proteins. Thus, this capacity is not limited to a single isolate or strain,
Rather, it is understood to be an overall feature of this kind.
One skilled in the art will recognize that other strains or isolates of those species can also be used for expression of the heterologous enzyme. A number of different strains have been established by the American Type Culture Collection (ATCC)
Parklawn Drive, Rockville Maryland 20852); NRRL (A
gricultural Research Service Culture Collection; 18
15 North University Street, Peoria, Illinois 6160
4); FGSC (Fungal Genetics Stock Center; Kansas); DS
M (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellk
ulturen; Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, Ge
rmany); IAM (Institute of Applied Microbiology; 113
1-1-1, Yayoi-cho, Bunkyo-ku, Tokyo; The University of Tokyo; IFO (In
Institute for Fermentation; 532 2, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka
Chome 17-85) and CBS (Centraal Bureau voor Schimm)
elcultures; Oosterstraat 1,3740AG Baarn, Netherland
s) is publicly available at the depository.
当業者は、本明細書中に記載の宿主種の好結果の形質
転換が、特に例示されたベクター、プロモーターおよび
選択マーカーの使用に限定されないことも認識するだろ
う。一般的に言って、A.オリゼ、A.ニガーおよびA.ニデ
ュランスの形質転換において有用であるそれらの技術
は、本発明の宿主細胞にも有用である。例えば、amdSお
よびhygB選択マーカーが好ましいけれども、他の有用な
選択マーカーとしてargB（A.ニデュランスまたはA.ニガ
ー）、trpC（A.ニガーまたはA.ニデュランス）、または
pyrG（A.ニガーまたはA.ニデュランス）マーカーが挙げ
られる。プロモーターは、それらの種において強力な転
写活性を示す任意のDNA配列であることができ、そして
細胞外と細胞内の両方のタンパク質、例えばアミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セル
ラーゼおよび解糖酵素をコードする遺伝子から誘導する
ことができる。そのような適当なプロモーターは、A.オ
リゼのTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhiz
omucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、A.
ニガーのグルコアミラーゼ、A.ニガーの中性α−アミラ
ーゼ、A.ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、およびリゾ
ムーコル・ミーヘイのリパーゼをコードする遺伝子から
誘導することができる。解糖酵素遺伝子からのプロモー
ターの例は、TPI,ADHおよびPGKである。プロモーターは
同種プロモーター、即ち生来のA.フェティダス遺伝子の
プロモーターであってもよい。本発明の好ましいプロモ
ーターは、A.オリゼのTAKAアミラーゼプロモーターであ
る。TAKAアミラーゼは公知のα−アミラーゼである（To
da他,Proc.Japan Acad.58Ser.B.:208−212,1982）。プ
ロモーター配列と着目の遺伝子または選択されたシグナ
ルペプチドまたはプレ領域との連結を容易にする特定の
制限部位を導入する目的で、プロモーター配列にリンカ
ーを提供してもよい。ターミネーターとポリアデニル化
配列もプロモーターと同じ源から誘導することができ
る。構成物中にエンハンサー配列を挿入することもでき
る。One skilled in the art will also recognize that successful transformation of the host species described herein is not limited to the use of the particularly exemplified vectors, promoters and selectable markers. Generally speaking, those techniques that are useful in the transformation of A. oryzae, A. niger and A. nidulans are also useful in the host cells of the present invention. For example, amdS and hygB selectable markers are preferred, but other useful selectable markers are argB (A. nidulans or A. niger), trpC (A. niger or A. nidulans), or
pyrG (A. niger or A. nidulans) marker. Promoters can be any DNA sequence that exhibits strong transcriptional activity in those species, and include both extracellular and intracellular proteins, such as amylase, glucoamylase, protease, lipase, cellulase and glycolytic enzymes. It can be derived from the encoding gene. Such suitable promoters include the TAKA amylase from A. oryzae, Rhizomacol mihei (Rhiz
omucor miehei) aspartate proteinase, A.
Niger glucoamylase, A. niger neutral α-amylase, A. niger acid-stable α-amylase, and Rhizomucor miehei lipase. Examples of promoters from glycolytic enzyme genes are TPI, ADH and PGK. The promoter may be a homologous promoter, ie, the promoter of the native A. fetidas gene. A preferred promoter of the present invention is the A. oryzae TAKA amylase promoter. TAKA amylase is a known α-amylase (To
da et al., Proc. Japan Acad. 58 Ser. B .: 208-212, 1982). A linker may be provided in the promoter sequence for the purpose of introducing a specific restriction site that facilitates the linkage of the promoter sequence to the gene of interest or the selected signal peptide or pre-region. Terminators and polyadenylation sequences can also be derived from the same sources as the promoter. An enhancer sequence can also be inserted into the construct.
発現産物を獲得するのに細胞を破壊する必要性を回避
するために、および細胞内で起こりうる発現産物の分解
の量を最小にするために、諸産物が細胞の外に分泌され
ることが好ましい。このために、好ましい態様では、着
目の遺伝子は、発現産物を細胞の分泌経路に差し向ける
ことができるプレ領域、例えばシグナルペプチドまたは
リーダーペプチドに連結される。プレ領域は任意の生物
からの任意の分泌タンパク質の遺伝子から誘導してもよ
く、または生来のプレ領域であってもよい。そのような
プレ領域のための有用な入手源の中には、アスペルギル
ス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝
子、バシラス（Bacillus）種からのアミラーゼ遺伝子、
リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）からの
リパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からのα
−因子遺伝子、または子牛のプロキモシン遺伝子があ
る。最も好ましくは、プレ領域はA.オリゼTAKAアミラー
ゼ遺伝子、A.ニガーの中性α−アミラーゼ遺伝子、A.ニ
ガーの酸安定性α−アミラーゼ遺伝子、B.リヘニフォル
ミス（B.licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子、バ
シラスNCIB 11837からのマルトース産生アミラーゼ遺伝
子、B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilu
s）のα−アミラーゼ遺伝子、またはB.リヘニフォルミ
ス（B.licheniformis）のサブチリシン遺伝子である。
有効なシグナル配列はA.オリゼのTAKAアミラーゼシグナ
ル、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラギン酸プロテア
ーゼシグナル、およびリゾムーコル・ミーヘイのリパー
ゼシグナルである。代わりのものとして、発現させよう
とする遺伝子にとって生来であるプレ領域を使ってもよ
い。Products may be secreted out of the cell to avoid the need to disrupt the cell to obtain the expression product and to minimize the amount of degradation of the expression product that can occur within the cell. preferable. To this end, in a preferred embodiment, the gene of interest is linked to a pre-region that can direct the expression product into the cell's secretory pathway, such as a signal peptide or leader peptide. The pre-region may be derived from the gene of any secreted protein from any organism, or may be a native pre-region. Useful sources for such pre-regions include the glucoamylase or amylase gene from Aspergillus sp., The amylase gene from Bacillus sp.
Lipase or proteinase gene from Rhizomucor miehei, α from Saccharomyces cerevisiae
-The factor gene or the calf prochymosin gene. Most preferably, the pre-region is the A. oryzae TAKA amylase gene, the A. niger neutral α-amylase gene, the A. niger acid-stable α-amylase gene, the B. licheniformis α-amylase gene. , A maltogenic amylase gene from Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus
s) or the subtilisin gene of B. licheniformis.
Useful signal sequences are the TAKA amylase signal of A. oryzae, the aspartic protease signal of Rhizomucor miehei, and the lipase signal of Rhizomucor miehei. Alternatively, a pre-region that is native to the gene to be expressed may be used.
プロモーターおよびターミネーター配列に作用可能に
連結された所望の生成物の遺伝子は、選択マーカーを含
むベクター中に含めることができ、また宿主株のゲノム
中に組み込むことができる別個のベクターもしくはプラ
スミド上に置くことができる。ベクター系は単一のベク
ターもしくはプラスミドであることができ、またはゲノ
ム中に組み込もうとする全DNAを一緒になって含有する
２以上のベクターもしくはプラスミドであることができ
る。ベクターまたはプラスミドは直鎖状分子であっても
閉環状分子であってもよい。本発明の好ましい態様によ
れば、１つが選択マーカーを含み、そしてもう１つがプ
ロモーター、所望のタンパク質をコードする遺伝子並び
に転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む
導入しようとする残りの異種DNAを含んで成る、２つの
ベクターを使って宿主を形質転換させる。The gene for the desired product operably linked to the promoter and terminator sequences can be included on a vector containing the selectable marker, or on a separate vector or plasmid that can be integrated into the genome of the host strain. be able to. The vector system can be a single vector or plasmid, or can be two or more vectors or plasmids that together contain the total DNA to be integrated into the genome. Vectors or plasmids can be linear or closed circular molecules. According to a preferred embodiment of the present invention, one comprises the selectable marker and the other comprises the promoter, the gene encoding the desired protein and the remaining heterologous DNA to be introduced, including the transcription terminator and polyadenylation sequences. The host is transformed with the two vectors.
本発明の宿主細胞種は、任意の原核または真核生物の
着目の異種酵素を発現させるのに用いることができ、好
ましくは、真核生物の酵素を発現させるのに使われる。
それの食品産業における使用が認可されているという点
でこの種は特に有用である。この種について特に着目さ
れるのは、異種真菌酵素の発現におけるそれらの利用で
ある（Regulatory Aspects of Microbial FoodEnzymes,
Third Edition,The Association of Microbial Food En
zyme Producers,Brussels,Belgium）。カタラーゼ、ラ
ッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オ
キシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペル
オキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラー
ゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分
解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダー
ゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペ
クチン分解酵素、アミラーゼ、グルコシアミラーゼ、α
−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グル
コシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イ
ソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシヌクレエ
アーゼのような酵素を発現させるのに本発明の新規発現
系を使うことができる。用語「真菌酵素」は生来の真菌
酵素だけでなく、アミノ酸の置換、削除、付加、または
活性、熱安定性、pH耐容性等を増強するために行うこと
ができる他の修正により変更されているそれらの真菌酵
素も包含することは、当業者により理解されるだろう。The host cell species of the invention can be used to express any prokaryotic or eukaryotic heterologous enzyme of interest, and preferably is used to express eukaryotic enzymes.
This species is particularly useful in that it has been approved for use in the food industry. Of particular interest for this species is their use in expressing heterologous fungal enzymes (Regulatory Aspects of Microbial Food Enzymes,
Third Edition, The Association of Microbial Food En
zyme Producers, Brussels, Belgium). Catalase, laccase, phenol oxidase, oxidase, oxidoreductase, cellulase, xylanase, peroxidase, lipase, hydrolase, esterase, cutinase, protease and other proteolytic enzymes, aminopeptidase, carboxypeptidase, phytase, lyase, pectinase and other pectin degradation Enzyme, amylase, glucosia amylase, α
Using the novel expression system of the present invention to express enzymes such as galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, mannosidase, isomerase, invertase, transferase, ribonuclease, chitinase, and deoxynuclease. Can be. The term "fungal enzyme" has been modified not only by the native fungal enzyme, but also by amino acid substitutions, deletions, additions, or other modifications that can be made to enhance activity, thermal stability, pH tolerance, etc. It will be understood by those skilled in the art that they also include those fungal enzymes.
本発明の宿主細胞は、宿主細胞にとって生来であるタ
ンパク質の組換え生産にも用いることができる。そのよ
うな用法の非限定的例としては、タンパク質の発現を増
強するため、シグナル配列の使用によって着目の生来の
タンパク質の細胞外への輸送を促進するため、または主
題の宿主細胞により通常生産されるタンパク質のコピー
数を増加させるために、異なるプロモーターの調節下に
A.フェティダスの生来のタンパク質を置くことが挙げら
れる。よって、本発明は、そのような発現が宿主細胞に
とって生来でない遺伝要素の使用、または宿主細胞中に
通常は見られない様式で働くように操作されている生来
の要素の使用を含む限り、同種タンパク質のそういった
組換え生産も包含する。The host cells of the present invention can also be used for recombinant production of proteins native to the host cells. Non-limiting examples of such uses include enhancing the expression of the protein, promoting the extracellular transport of the native protein of interest by using a signal sequence, or normally produced by the subject host cells. Under the control of different promoters to increase the copy number of the protein
Putting the native protein of A. fetidas. Thus, the present invention is directed to allogeneic genes as long as such expression involves the use of genetic elements that are not native to the host cell, or the use of native elements that have been engineered to work in a manner not normally found in the host cell. Such recombinant production of proteins is also included.
本発明を次の非限定例により更に説明する。 The present invention is further described by the following non-limiting examples.
I.プロテアーゼアッセイ 少なくとも15の異なる種からの50以上の株を試験し、
各単離物により生産されるプロテアーゼの量を測定し、
そしてそれらの細胞外タンパク質分布も観察する。培養
接種試料を調製するために、9cmのペトリ皿中の各株の
７〜10日培養物に10mlの滅菌蒸留水を加え、菌糸から静
かに胞子をかき取り、濃厚な懸濁液を作る。この懸濁液
2.5mlを使って100mlのASP04培地に接種する〔ASP04培地
は、水道水中に1g/lのCaCl2、2g/lの酵母エキス、1g/l
のMgSO4、5g/lのKH2PO4、2g/lのクエン酸、0.5mlの微量
金属溶液（14.3g/lのZnSO4・7H2O,CuSO4・5H2O,0.5g/l
のNiCl2・6H2O,13.8g/lのFeSO4・7H2O,8.5g/lのMnSO4・
H2Oおよび3g/lのクエン酸から成る）、1g/lの尿素、2g/
lの（NH4）2SO4、20g/lのマルトデキストリン（8mlの25
％原液、加圧滅菌後に加える）を含んで成り、加圧滅菌
前にpHを4.5または6.5に調整し、次いで加圧滅菌後に10
0mlあたり8mlの0.1Mクエン酸を使ってpH4.5に調整し
た〕。フラスコを、200rpmで軌道振盪器上で振盪させな
がら、連続した光の中で30および／または37℃で５日間
インキュベートする。各々の培養ブロスからの上清を25
00rpmで５分間遠心し、そしてカゼイン透明化平板アッ
セイで使用し、様々な真菌種から生産されるプロテアー
ゼのレベルを測定して組換えタンパク質発現の有力な候
補として評価する。I. Protease assay.Test more than 50 strains from at least 15 different species,
Measuring the amount of protease produced by each isolate;
And also observe their extracellular protein distribution. To prepare a culture inoculum, add 10 ml of sterile distilled water to the 7-10 day culture of each strain in a 9 cm Petri dish and gently scrape the spores from the mycelium to make a thick suspension. This suspension
Inoculate 100 ml of ASP04 medium using 2.5 ml (ASP04 medium is 1 g / l CaCl 2 in tap water, 2 g / l yeast extract, 1 g / l
MgSO 4, 5g / l of KH 2 PO 4, 2g / l of citric acid, ZnSO 4 · 7H 2 O of trace metals solution (14.3 g / l of 0.5ml, CuSO 4 · 5H 2 O , 0.5g / l of
Of NiCl 2 · 6H 2 O, FeSO 4 · 7H 2 O in 13.8g / l, MnSO 4 · of 8.5 g / l
H 2 consisting of O and citric acid 3 g / l), urea 1g / l, 2g /
l (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 g / l maltodextrin (8 ml 25
% Stock solution, added after autoclaving), adjusting the pH to 4.5 or 6.5 before autoclaving, then 10% after autoclaving.
PH was adjusted to 4.5 with 8 ml of 0.1 M citric acid per 0 ml]. The flask is incubated for 5 days at 30 and / or 37 ° C. in continuous light with shaking on an orbital shaker at 200 rpm. Supernatant from each culture broth
Centrifuge at 00 rpm for 5 minutes and use in casein clarification plate assay to measure the levels of proteases produced from various fungal species and evaluate them as potential candidates for recombinant protein expression.
カゼイン透明化平板アッセイは次のようにして行われ
る。平板培地は、20g/lの脱脂粉乳、20g/lのアガロー
ス、およびpH5とpH7で行われる試験には0.2Mのクエン酸
塩−リン酸塩緩衝液、pH9で行われる試験にはグリシン
−NaOH緩衝液から成る。脱脂粉乳を100mlの緩衝液と混
合し、60℃に維持する。アガロースを400mlの緩衝液と
混合し、そして５分間加圧滅菌する。わずかに冷却した
後、温かい脱脂粉乳混合物を添加し、混合物を穏やかに
２〜３回反転させて混合する。平板あたり50〜70mlを使
ってこの培地を150mmの平板に注ぎ、使用まで５℃で貯
蔵する。The casein clarification plate assay is performed as follows. The plating medium was 20 g / l skim milk powder, 20 g / l agarose, and 0.2 M citrate-phosphate buffer for tests performed at pH 5 and pH 7, and glycine-NaOH for tests performed at pH 9. Consists of a buffer. Mix the skim milk powder with 100 ml of buffer and maintain at 60 ° C. The agarose is mixed with 400 ml of buffer and autoclaved for 5 minutes. After cooling slightly, the warm skim milk mixture is added and the mixture is gently inverted 2-3 times to mix. The medium is poured into 150 mm plates using 50-70 ml per plate and stored at 5 ° C. until use.
使用直前に、寒天の中に平板あたり12個の穴を作る。
各株の醗酵物からの上清25μを各pHの平板１枚に加
え、37℃で一晩インキュベートする。pH9の平板には、
0.5M氷酢酸を加えてカゼインを沈澱させ、どんな透明帯
でも可視化する。次いで各平板を透明帯のサイズ（即
ち、透明帯なしから直径＞2cmまで）と透明帯の型（即
ち、透明、不透明または両方の型）について評価する。Immediately before use, make 12 holes per plate in the agar.
Add 25 μl of the supernatant from the fermentation of each strain to one plate at each pH and incubate overnight at 37 ° C. For a pH9 plate,
Casein is precipitated by adding 0.5 M glacial acetic acid and any zona pellucida is visualized. Each plate is then evaluated for clear zone size (ie, from no clear zone to> 2 cm in diameter) and clear zone type (ie, transparent, opaque or both types).
各培養物の上清を使って、株の細胞外タンパク質生産
も評価する。製造業者の取扱説明書に従って調製したNo
vex（San Diego,CA）８〜16％勾配ゲルを使ってタンパ
ク質分布を評価する。培養上清の75μ（３日および５
日）試料を、20μの５×解離緩衝液（解離緩衝液＝4m
lの1M Tris−HCl,pH6.8,1gのSDS,617mgのジチオスレイ
トールを滅菌蒸留水で10mlにする）とグリセロール／ブ
ロモフェノールブルー（約10mlの80〜90％グリセロール
に10〜20mgを加え、沸騰した湯の中に１〜２時間置いて
溶解させたもの）に添加し、５分間煮沸し、冷却し、負
荷し、そしてブロモフェノールブルー追跡色素がゲルの
下端に達するまで60〜200Vで泳動する。Biorad Silver
Stain Plusプロトコール（Biorad Laboratories,Hercul
es,CA）に従ってゲルを銀染色する。多数のバンドを示
すそれらの単離物は有力な新規宿主としてあまり適当で
ないと見なし、一方でわずか１〜４本の少量バンドを有
する比較的きれいな分布を示すものは更なる試験にかけ
る。The supernatant of each culture is also used to assess the extracellular protein production of the strain. No prepared according to the manufacturer's instructions
Evaluate protein distribution using a vex (San Diego, CA) 8-16% gradient gel. 75 μl of culture supernatant (3 days and 5
Day) Samples were mixed with 20μ of 5x dissociation buffer (dissociation buffer = 4m
1 M Tris-HCl, pH 6.8, 1 g SDS, 617 mg dithiothreitol to 10 ml with sterile distilled water) and glycerol / bromophenol blue (approximately 10-20 mg to about 10 ml 80-90% glycerol). , Dissolved in boiling water for 1-2 hours), boiled for 5 minutes, cooled, loaded and at 60-200V until the bromophenol blue chasing dye reached the bottom of the gel Run electrophoresis. Biorad Silver
Stain Plus protocol (Biorad Laboratories, Hercul
es, CA). Those isolates showing a large number of bands are considered less suitable as potential new hosts, while those showing a relatively clean distribution with only a few minor bands are subjected to further testing.
プロテアーゼアッセイとタンパク質分布の組合せ結果
を吟味すると、適当な有力候補の大部分は黒色（Nigr
i）部門のメンバーの中に見つかる。それらの結果に基
づいて、次の単離物を形質転換実験のために選択した:
A.フェティダスE46、A.フェティダスCBS103.14、A.フェ
ティダス変種パリダス（NRRL 356）、A.フェティダスN0
953（NRRL 337;ATCC 10254）、A.ジャポニカスA1438（C
BS 172.66）、A.アクレータスN1136（CBS 101.43）、A.
アクレータスA1454（CBA 172.66）、A.アクレータスA14
55（CBS 186.67）、A.ジャポニカス変種アクレータスN0
956（IAM 13871）、A.フェニシスA528（CBS 139.48）、
A.フェニシスA530（CBS 137.52）、A.フェニシスE419
（CBS 137.52）、A.カルボナリウスA3993（IBT 497
7）、A.カルボナリウスATCC 1025、A.タマリィE112（AT
CC 10836）、A.タマリィN2266（IFO 4358）およびA.タ
マリィN2267（IFO 4142）。それらの培養物は、ノボ・
ノルディスク・バイオテック・カルチャー・コレクショ
ン（Novo Nordisk Biotech Culture Collection;Davis,
Callifornia）の一部としても維持される。Examining the combined results of the protease assay and the protein distribution, most of the good candidates are black (Nigr
i) found among the members of the department. Based on those results, the following isolates were selected for transformation experiments:
A. fetidas E46, A. fetidas CBS103.14, A. fetidas variant paridas (NRRL 356), A. fetidas N0
953 (NRRL 337; ATCC 10254), A. japonicas A1438 (C
BS 172.66), A. Accretus N1136 (CBS 101.43), A.
Acretus A1454 (CBA 172.66), A. Acretus A14
55 (CBS 186.67), A. japonicas variant Acretus N0
956 (IAM 13871), A. phenesis A528 (CBS 139.48),
A. Phenisis A530 (CBS 137.52), A. Phenisis E419
(CBS 137.52), A. carbonarius A3993 (IBT 497)
7), A. carbonarius ATCC 1025, A. tamariy E112 (AT
CC 10836), A. tamary N2266 (IFO 4358) and A. tamary N2267 (IFO 4142). These cultures are from Novo
Novo Nordisk Biotech Culture Collection; Davis,
Callifornia).
II.ベクターの作製 A.選択マーカーベクター。ベクターpJaL77とpJaL154を
ヒグロマイシンＢ耐性選択マーカーによる宿主細胞の形
質転換に使用する。このマーカーはE.コリのヒグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子に基づいてお
り、pJaL77中ではTAKAプロモーターの調節下にそしてpJ
aL154中ではamdSプロモーターの調節下に置かれる。簡
単に言えば、それらのベクターは次のようにして作製さ
れる。ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与する遺伝子
を、Boehringer MannheimからプラスミドpHph−１とし
て購入する。この遺伝子に、プライマー:5′−GCT CAG
AAGCTT CCATCC TAC ACC TCA GCA ATG TCG CCT GAA CTC
ACC GCG ACG TCT−３′（Ｎ−末端）と３′−CGT CCG A
GG GCA AAG GAA TAG CTCCAG AGATCT CAT GCT−５′（Ｃ
−末端）を使って、PCRによりアミノ末端とカルボキシ
末端に適当な制限部位並びにATGコドンを取り付ける。P
CR断片を制限酵素BamH IとHho Iで切断し、次いでアス
ペルギルス発現ベクターpToC68（WP 91/17243中に記載
されている）中の対応部位にクローニングしてpJaL77を
作製する。II. Vector construction A. Selectable marker vector. The vectors pJaL77 and pJaL154 are used to transform host cells with a hygromycin B resistance selectable marker. This marker is based on the E. coli hygromycin B phosphotransferase gene and is under the control of the TAKA promoter in pJaL77 and pJaL77.
In aL154, it is under the control of the amdS promoter. Briefly, those vectors are made as follows. A gene that confers resistance to hygromycin B is purchased from Boehringer Mannheim as plasmid pHph-1. Primer: 5'-GCT CAG
AAGCTT CCATCC TAC ACC TCA GCA ATG TCG CCT GAA CTC
ACC GCG ACG TCT-3 '(N-terminal) and 3'-CGT CCG A
GG GCA AAG GAA TAG CTCCAG AGATCT CAT GCT-5 '(C
-End), attach appropriate restriction sites as well as ATG codons at the amino and carboxy termini by PCR. P
The CR fragment is cut with the restriction enzymes BamH I and Hho I and then cloned into the corresponding site in the Aspergillus expression vector pToC68 (described in WP 91/17243) to generate pJaL77.
プラスミドpJaL154は次のようにして作製する。次の
プライマー（下線領域はamdSプロモーターとの相同性を
示す）:CCT GGA TCC TCT GTG TTA GCT TAT AGおよびCTT
GCA TGC CGC CAG GAC CGA GCA AGを使ったPCRにより、
プラスミドpCaHj406からamdSプロモーター変異体I9＋I
666（Hynes他,Mol.Cell.Biol.3（８）:1430−1439,1983
およびKatz他,Mol.Gen.Gent.220:373−376,1990）をク
ローニングする。amdSプロモーターを含む694bpのPCR断
片をBamH IとSph Iで切断し、pJaL77のTAKAプロモータ
ーがamdSプロモーターで置換されるようにpJaL77中の対
応部位にクローニングする。Plasmid pJaL154 is prepared as follows. The following primers (underlined regions indicate homology to amdS promoter): CCT GGA TCC TCT GTG TTA GCT TAT AG and CTT
GCA TGC CGC CAG GAC CGA By PCR using GCA AG,
AmdS promoter mutant I 9 + I from plasmid pCaHj406
666 (Hynes et al., Mol. Cell. Biol. 3 (8): 1430-1439, 1983)
And Katz et al., Mol. Gen. Gent. 220: 373-376, 1990). The 694 bp PCR fragment containing the amdS promoter is cut with BamH I and Sph I, and cloned into the corresponding site in pJaL77 so that the TAKA promoter of pJaL77 is replaced with the amdS promoter.
amdSマーカーを含むプラスミドpToC90は、p3SR2（Hyn
es他，前掲）からの2.7kb Xba I断片を、Xba Iで切断し
そして脱リン酸したpUC19プラスミド中にクローニング
することにより作製する。pToC186と命名された誘導体
は、プロモーター領域がamdS遺伝子の発現を増強するこ
とが知られている２つの変異体（I9とI666）を含むこと
以外はpToC90と同じである（Hynes他，前掲;Corrick他,
Gene 53:63−71,1987）。Plasmid pToC90 containing the amdS marker was cloned into p3SR2 (Hyn
es et al., supra) is made by cloning into the pUC19 plasmid which has been cut with XbaI and dephosphorylated. derivatives, designated pToC186, except that comprise two mutants promoter region has been known to enhance the expression of the amdS gene (I 9 and I 666) is the same as pToC90 (Hynes et supra ; Corrick et al.,
Gene 53: 63-71, 1987).
B.発現ベクター。B. Expression vector.
1.フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）キ
シラナーゼ。ベクターpHD414はプラスミドp775（EP 238
023）の誘導体である。このプラスミドとは異なり、pH
D414はTAKAプロモーターとAMGターミネーターの間に一
連のユニークな制限部位を有する。該プラスミドは、タ
ーミネーターの３′末端の長さ約200bpの断片（望まし
くないRE部位を含む）の除去に続き、プロモーターの
５′末端の長さ約250bpの断片（同じく望ましくない部
位を含む）の除去により作製される。Nar I（pUCベクタ
ー中に存在する）とXba I（ターミネーターのすぐ３′
側）での消化により200bp領域を除去し、次いで生成し
た末端をクレノウDNAポリメラーゼ＋dNTPを使ってフィ
ルインし、ベクター断片をゲル上で精製し、そしてベク
ター断片を再連結する。このプラスミドをpHD413と命名
する。pHD413をStu I（プロモーターの５′末端に位置
する）とPvu II（pUCベクター中）で切断し、ゲル上で
分画しそして再連結し、pHD414を得る。pYES中に約1,10
0bpのキシラナラーゼHind III/Xba I cDNA断片を含有す
るE.コリの株をDSM 6995としてDSMに寄託する。該キシ
ラナーゼcDNA断片をHind III/Xba Iでの開裂によりクロ
ーンの１つから単離する。該断片をアガロースゲル電気
泳動により精製し、電気溶出させ、連結反応に向けて準
備する。該cDNA断片をpHD414中に連結してpAXX40−１−
１を作製する。キシラナーゼ遺伝子およびタンパク質の
配列は配列表の配列番号３と４に与えられる。該遺伝子
をDSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Z
ellkulturen GmbH）6995として寄託する。1. Humicola insolens xylanase. Vector pHD414 contains plasmid p775 (EP 238).
023). Unlike this plasmid, pH
D414 has a series of unique restriction sites between the TAKA promoter and the AMG terminator. The plasmid was constructed by removing the approximately 200 bp fragment of the terminator 3 'end (including the undesired RE site), followed by the removal of the approximately 250 bp fragment of the 5' end of the promoter (also including the undesired site). Made by removal. Nar I (present in the pUC vector) and Xba I (immediately 3 'of the terminator)
The 200 bp region is removed by digestion on the side), then the resulting ends are filled in using Klenow DNA polymerase + dNTP, the vector fragment is purified on a gel and the vector fragment is religated. This plasmid is named pHD413. pHD413 is cut with Stu I (located at the 5 'end of the promoter) and Pvu II (in the pUC vector), fractionated on a gel and religated to yield pHD414. About 1,10 during pYES
A strain of E. coli containing the 0 bp xylanase Hind III / Xba I cDNA fragment is deposited with DSM as DSM 6995. The xylanase cDNA fragment is isolated from one of the clones by cleavage with HindIII / XbaI. The fragment is purified by agarose gel electrophoresis, electroeluted and prepared for the ligation reaction. The cDNA fragment was ligated into pHD414 and pAXX40-1-
Prepare No. 1. Xylanase gene and protein sequences are provided in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the Sequence Listing. The gene was converted to DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Z
ellkulturen GmbH) 6995.
2.フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セ
ルラーゼ。フミコーラ・インソレンスのセルラーゼの詳
細な特徴づけはWO91/17243中に見つかる。セルラーゼ発
現に使った発現ベクターpCaHj418は、制限酵素BamH Iと
Sal Iでの開裂によりpCaHj201から926bpセルラーゼコー
ド領域断片を切除することにより作製される。この断片
を標準技術を使った調製用ゲル電気泳動により精製し、
そしてBamH IでXho Iで処理しておいたpHD414（上述）
と連結せしめる。得られた発現ベクターpCaHj418は、A.
オリゼのTAKAアミラーゼプロモーターとA.ニガーのグル
コアミラーゼターミネーター領域の転写調節下にセルラ
ーゼ遺伝子を含有する。2. Humicola insolens cellulase. Detailed characterization of the cellulase of Humicola insolens can be found in WO91 / 17243. The expression vector pCaHj418 used for cellulase expression is compatible with the restriction enzyme BamHI.
It is made by excision of a 926 bp cellulase coding region fragment from pCaHj201 by cleavage with SalI. This fragment is purified by preparative gel electrophoresis using standard techniques,
And pHD414 treated with Xho I with BamHI (described above)
And let it be connected. The resulting expression vector pCaHj418 was used as A.
It contains a cellulase gene under the transcriptional control of the TAKA amylase promoter of Oryzae and the glucoamylase terminator region of A. niger.
3.フミコーラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa）
リパーゼ。H.ラヌギノーザのリパーゼ遺伝子の単離およ
び発現はEP 305216中とUS出願第07/236,605号中に報告
されており、その内容は参考として本明細書中に組み込
まれる。簡単に言えば、ホモジナイズしたH.ラヌギノー
ザ菌糸からBoel他（EMBO J.3:1097−1102,1984）とChir
gwin他（Biochemistry 18:5294−5299,1979）により記
載された方法を使って全RNAを抽出する。AvivおよびLed
er（PNAS USA 69:1408−1412,1972）により記載された
ようなオリゴ（dT）−セルロース上での２度のアフィニ
ティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有RNA
を得る。次いでOkayamaおよびBerg（Mol.Cell.Biol.2:1
61−170,1982）により記載された方法と、Noma他（Natu
re 319:640−646,1986）により記載されたベクターpSP6
2−K2とpCD VI−PLを使ってcDNAを合成する。合成したc
DNAをE.コリMC1000のhsdR-,M+誘導体（Casadabanおよび
Cohen,J.Mol.Biol.138:179−207,1980）中に形質転換せ
しめ、組換えクローンを作製する。3. Humicola lanuginosa
Lipase. Isolation and expression of the H. lanuginosa lipase gene is reported in EP 305216 and in US application Ser. No. 07 / 236,605, the contents of which are incorporated herein by reference. Briefly, Boel et al. (EMBO J. 3: 1097-1102, 1984) and Chir from homogenized H. lanuginosa mycelia.
Total RNA is extracted using the method described by gwin et al. (Biochemistry 18: 5294-5299, 1979). Aviv and Led
poly (A) -containing RNA by two rounds of affinity chromatography on oligo (dT) -cellulose as described by ER (PNAS USA 69: 1408-1412, 1972).
Get. Then Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 2: 1
61-170, 1982) and the method described by Noma et al. (Natu
re 319: 640-646, 1986).
Synthesize cDNA using 2-K2 and pCD VI-PL. Synthesized c
The DNA hsdR of E. coli MC1000 -, M + derivative (Casadaban and
Cohen, J. Mol. Biol. 138: 179-207, 1980) to generate recombinant clones.
32個のペンタデカマー（15マー）オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの混合物 （その１つは、Phe−Asn−Gln−Phe−Asnをコードする
領域がH.ラヌギノーザのリパーゼmRNAと相補的である）
をApplied Biosystems,Inc.のDNA合成装置上で合成し、
PAGEにより精製する。H.ラヌギノーザcDNAライブラリー
からの約10,000のE.コリ組換え体をWhatman 540フィル
ターに移す。Gergen他（Nucleic Acids Res.7:2115−21
35,1979）により記載されたようにコロニーを溶解させ
固定化する。Boel他（EMBO J.3:1097−1102,1984）によ
り記載された通りに該フィルターを32P−標識H.ラヌギ
ノーザリパーゼ特異的ペンタデカマー混合物とハイブリ
ダイズさせる。フィルターのハイブリダイゼーションと
洗浄をそれぞれ37℃と43℃で行い、次いで映像強化膜を
使って24時間オートラジオグラフィーを行う。標準手段
（BirnboimおよびDoly,Nucleic Acids Res.7:1513−152
3,1979）により２つのハイブリダイズしているコロニー
pHLL 702.3とpHLL702.4からMiniprepプラスミドDNAを単
離し、そしてMaxamおよびGilbert（Methods Enzymol.6
5:499−560,1980）の手順により該DNA挿入断片のDNA配
列を決定する。A mixture of 32 pentadecamer (15-mer) oligodeoxyribonucleotides (One is that the region encoding Phe-Asn-Gln-Phe-Asn is complementary to H. lanuginosa lipase mRNA.)
Was synthesized on Applied Biosystems, Inc.'s DNA synthesizer,
Purify by PAGE. Approximately 10,000 E. coli recombinants from the H. lanuginosa cDNA library are transferred to Whatman 540 filters. Gergen et al. (Nucleic Acids Res. 7: 2115-21
The colonies are lysed and immobilized as described by P. 35, 1979). The filters are hybridized with a 32 P-labeled H. lanuginosa lipase-specific pentadecamer mixture as described by Boel et al. (EMBO J. 3: 1097-1102, 1984). Hybridization and washing of the filters are performed at 37 ° C. and 43 ° C., respectively, followed by autoradiography using an image-enhancing membrane for 24 hours. Standard means (Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res. 7: 1513-152
3,1979), two hybridizing colonies
Miniprep plasmid DNA was isolated from pHLL 702.3 and pHLL 702.4 and analyzed by Maxam and Gilbert (Methods Enzymol.
5: 499-560, 1980) to determine the DNA sequence of the DNA insert.
該cDNAを使った作製作業を更に容易にするために、次
のようにしてユニーク制限部位を含むDNA配列を該cDNA
の５′末端と３′末端に付加する。３′非翻訳領域中で
cDNAを消化するSau961でpHLL702.3を消化し、生じた末
端をE.コリDNAポリメラーゼ（クレノウ断片）と４つのd
NTPを使ってフィルインする。このDNAを次いで該cDNAの
メチオニン開始コドンのすぐ３′側を１回切断するSac
Iで消化する。得られた0.9kb cDNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応
に備える。５′アダプターとして２つのオリゴヌクレオ
チド927と928を合成する。このアダプターは、cDNAのMe
t開始コドンのすぐ５′にHind IIIとBamH I部位を付加
するようにデザインされる。この２つのオリゴをATPとT
4ポリヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化し、互い
にアニーリングし、そしてHind IIIとHinc IIで消化し
0.7％アガロースゲル上で精製したpUC19ベクター中の精
製0.9kb cDNA配列に連結せしめる。得られたプラスミド
は、ポータブル0.9kb BamH I断片としてH.ラヌギノーザ
のリパーゼcDNAを担持している。BamH I消化とアガロー
スゲル上での0.9kb cDNA断片の精製の後、その断片をBa
mH Iで消化されリン酸化されたp775と連結せしめ、p960
を作製する。p960中では、リパーゼcDNAがA.オリゼから
のTAKAプロモーターとA.ニガーからのAMGターミネータ
ーの転写調節下に置かれている。To further facilitate the production operation using the cDNA, the DNA sequence containing a unique restriction site was
At the 5 'end and 3' end. In the 3 'untranslated region
pHLL702.3 is digested with Sau961 to digest the cDNA, and the resulting ends are digested with E. coli DNA polymerase (Klenow fragment) and four d's.
Fill in using NTP. This DNA is then ligated with Sac, which cuts once just 3 'of the methionine start codon of the cDNA.
Digest with I. The resulting 0.9 kb cDNA fragment is purified by agarose gel electrophoresis, electroeluted and ready for ligation. Two oligonucleotides 927 and 928 are synthesized as 5 'adapters. This adapter is used for cDNA Me
Designed to add Hind III and Bam HI sites just 5 'of the t start codon. ATP and T
Phosphorylate using 4 polynucleotide kinase, anneal to each other, and digest with Hind III and Hinc II
Ligation to a purified 0.9 kb cDNA sequence in a purified pUC19 vector on a 0.7% agarose gel. The resulting plasmid carries the H. lanuginosa lipase cDNA as a portable 0.9 kb BamHI fragment. After BamHI digestion and purification of the 0.9 kb cDNA fragment on an agarose gel, the fragment was
ligated with p775 digested with mHI and phosphorylated, p960
Is prepared. In p960, the lipase cDNA is under the transcriptional control of the TAKA promoter from A. oryzae and the AMG terminator from A. niger.
pMHan37を調製するために、フミコーラ・ラヌギノー
ザのリパーゼ遺伝子のすぐ上流のA.オリゼTAKAプロモー
ターの５′非翻訳領域の60塩基対を、A.ニデュランスの
tpiA遺伝子（McKnight他,Cell 46:143−147,1986）から
の対応領域により置換することにより、p960を変更す
る。非翻訳領域のすぐ外側にp960配列と相同である20塩
基対により各端において隣接されたA.ニデュランスのtp
iA遺伝子からの５′非翻訳領域を含む合成オリゴヌクレ
オチドを、TAKAプロモーター領域中にBssH II部位を含
む別のプライマーと一緒にPCR反応に使用する。変異誘
発プライマーはATG開始コドンの近くにBamH I部位を含
むので、PCR断片をBamH IとBssH IIで消化し、そしてBs
sH IIで消化しBamH Iで部分消化したp960中に再クロー
ニングする。MHan37中のATGコドンの上流の200塩基をDN
A配列分析により確認する。p960とpMHan37との配列の相
違を下記に示す： 5.コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペル
オキシダーゼ。コプリナス・シネレウスのペルオキシダ
ーゼ遺伝子の単離および発現はWO 92/16634中に記載さ
れている。簡単に言えば、Boel他（EMBO J.3:1097−110
2,1984）とChirgwin他（Biochemistry 18:5294−5299,1
979）により記載された通りに最大ペルオキシダーゼ活
性の時期に収集しホモジナイズしたコプリナス・シネレ
ウス（IFO 8371）菌糸から全RNAを抽出する。Avivおよ
びLeder（PNAS USA 69:1408−1412,1972）により記載さ
れたようなオリゴ（dT）−セルロース上での２度のアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有
RNAを得る。製造業者の取扱説明書に従ってInvitrogen
からのcDNA合成キットを使ってcDNAを合成する。コプリ
ナス・シネレウスcDNAライブラリーからの約50,000のE.
コリ形質転換体をWhatman 540濾紙に移す。Gergen他（N
ucleic Acids Res.7:2115−2135,1979）により記載され
たようにコロニーを溶解させ固定化する。該フィルター
を0.2×SSC,0.1％SDS中で32P−標識430塩基対ペルオキ
シダーゼ特異的プローブとハイブリダイズさせる。フィ
ルターのハイブリダイゼーションと洗浄を65℃で行い、
次いで映像強化膜を使って24時間オートラジオグラフィ
ーを行う。オートラジオグラフィー後、増加する温度で
フィルターを洗浄し、次いで映像強化膜を使って24時間
オートラジオグラフィーを行う。こうして、50以上の陽
性クローンが同定される。ハイブリダイズしているコロ
ニーから標準手順（BirnboimおよびDoly,Nucl.Acids Re
s.7:1513−1523,1979）によりMiniprepプラスミドDNAを
単離し、そしてSangerのジデオキシ法（Sanger他,PNAS
USA 74:5463−5467,1977）によりcDNA挿入断片のDNA配
列を決定する。このペルオキシダーゼcDNA断片をHind I
II/Xho Iでの開裂によりベクターから切り出し、アガロ
ースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、そして連
結反応に備える。該cDNA断片をHind III/Xho Iで消化さ
れたHD414中に連結せしめ、該cDNAがA.オリゼからのTAK
AプロモーターとA.ニガーからのAMGターミネーターの転
写調節下に置かれているpCipを作製する。pCiPから、ペ
ルオキシダーゼ開始コドンのすぐ上流のSac I,Kpn I,Hi
nd III,pst I,Sal IおよびBamH I制限部位が削除されて
いるプラスミドpJVi9を調製する。To prepare pMHan37, 60 base pairs of the 5 'untranslated region of the A. oryzae TAKA promoter immediately upstream of the Humicola lanuginosa lipase gene were added to A. nidulans.
Alter p960 by replacing with the corresponding region from the tpiA gene (McKnight et al., Cell 46: 143-147, 1986). A. nidulans tp flanked at each end by 20 base pairs homologous to the p960 sequence just outside the untranslated region
A synthetic oligonucleotide containing the 5 'untranslated region from the iA gene is used in a PCR reaction along with another primer containing a BssHII site in the TAKA promoter region. Since the mutagenic primer contains a BamHI site near the ATG start codon, the PCR fragment was digested with BamHI and BssHII and BsHI
Recloned into p960 digested with sHII and partially digested with BamHI. 200 bases upstream of the ATG codon in MHan37 are DN
Confirm by A sequence analysis. The sequence differences between p960 and pMHan37 are shown below: 5. Coprinus cinereus peroxidase. Isolation and expression of the peroxidase gene of Coprinus cinereus is described in WO 92/16634. Briefly, Boel et al. (EMBO J. 3: 1097-110
2,1984) and Chirgwin et al. (Biochemistry 18: 5294-5299, 1).
Total RNA is extracted from homogenized Coprinus cinereus (IFO 8371) hyphae collected and homogenized at the time of maximum peroxidase activity as described by 979). Twice affinity chromatography on oligo (dT) -cellulose as described by Aviv and Leder (PNAS USA 69: 1408-1412,1972) contained poly (A) containing
Obtain RNA. Invitrogen according to the manufacturer's instructions
CDNA is synthesized using the cDNA synthesis kit from. About 50,000 E. coli from the Coprinus cinereus cDNA library.
Transfer E. coli transformants to Whatman 540 filter paper. Gergen et al. (N
The colonies are lysed and fixed as described by Ucleic Acids Res. 7: 2115-2135, 1979). The filters are hybridized with a 32 P-labeled 430 base pair peroxidase specific probe in 0.2 × SSC, 0.1% SDS. Perform hybridization and washing of the filter at 65 ° C.
Autoradiography is then performed for 24 hours using an image enhancement film. After autoradiography, the filters are washed at increasing temperatures and then autoradiographed for 24 hours using an image-enhancing membrane. Thus, more than 50 positive clones are identified. Standard procedures from hybridizing colonies (Birnboim and Doly, Nucl. Acids Re
s. 7: 1513-1523, 1979) and isolated the Miniprep plasmid DNA and performed the Sanger dideoxy method (Sanger et al., PNAS).
USA 74: 5463-5467, 1977) to determine the DNA sequence of the cDNA insert. This peroxidase cDNA fragment was
The vector is excised by cleavage with II / XhoI, purified by agarose gel electrophoresis, electroeluted and prepared for the ligation reaction. The cDNA fragment was ligated into HD414 digested with HindIII / XhoI and the cDNA was TAK from A. oryzae.
Create pCips that are under the transcriptional control of the A promoter and the AMG terminator from A. niger. From pCiP, Sac I, Kpn I, Hi immediately upstream of the peroxidase start codon
Prepare plasmid pJVi9 with the ndIII, pstI, SalI and BamHI restriction sites deleted.
コプリナス・シネレウスのペルオキシダーゼをコード
するcDNA配列は配列表の配列番号３と４に示される。The cDNA sequence encoding the peroxidase of Coprinus cinereus is shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing.
6.フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）クチナー
ゼ。クチナーゼ発現ベクターpCaHj427は、A.オリゼのTA
KA−アミラーゼプロモーターとA.ニガーのグルコアミラ
ーゼターミネーター領域の転写調節下にフザリウム・ソ
ラニf.pisiクチナーゼコード領域（Soliday他,J.Bacter
iol.171:1942−1951,1989）を含有する（Christiansen
他，図1,前掲）。これを上述のpToC90と共に使用してA.
フェティダス株NRRL 341,NRRL 357およびCBS 103.14を
同時形質転換せしめる。6. Fusarium solani cutinase. The cutinase expression vector pCaHj427 is an A. oryzae TA
Fusarium solani f.pisi cutinase coding region (Soliday et al., J. Bacter) under the transcriptional control of the KA-amylase promoter and the glucoamylase terminator region of A. niger.
iol. 171 : 1942-1951, 1989) (Christiansen
Others, Figure 1, supra). Using this with pToC90 described above.
Fetidas strains NRRL 341, NRRL 357 and CBS 103.14 are co-transformed.
7.カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）
リパーゼＢ。発現ベクターpMT1335は、A.オリゼのTAKA
−アミラーゼプロモーターとA.ニガーのグルコアミラー
ゼターミネーター領域の転写調節下にカンジダ・アンタ
ークティカのリパーゼＢ遺伝子を含有する（Christians
en他，前掲）。このベクターを上述のpToC90と共に使用
してA.フェティダス株CBS 103.14,NRRL 356,NRRL 357お
よびNRRL 341を同時形質転換せしめる。7. Candida antarctica
Lipase B. The expression vector pMT1335 was obtained from A. oryzae TAKA.
-Contains the Candida antarctica lipase B gene under the transcriptional control of the amylase promoter and the A. niger glucoamylase terminator region (Christians
en et al., supra). This vector is used with pToC90 as described above to co-transform A. fetidas strains CBS 103.14, NRRL 356, NRRL 357 and NRRL 341.
作製した発現ベクターの要約を表１に与える。 A summary of the expression vectors generated is provided in Table 1.
III.アスペルギルス宿主の形質転換 例外を表記しない限り、試験した全ての株の形質転換
において次の一般手順を使用する。 III. Transformation of Aspergillus hosts The following general procedure is used in the transformation of all strains tested unless otherwise indicated.
100mlのYPD培地（Sherman他,Methods in Yeast Genet
ics,Cold Spring Harbor Laboratory,1981）に軽質転換
しようとする株の胞子を接種し、34℃で振盪しながら１
〜２日間インキュベートする。ミラクロス（Miraclot
h）を通した濾過により菌糸を収集し、200mlの0.6M MgS
O4で洗浄する。菌糸を15mlの1.2M MgSO4,10mM NaH2PO4,
pH＝5.8中に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、そ
れに120mgのNovozyme 234を含む緩衝液1mlを加える。
５分後、1mlの12mg/mlBSA（Sigma H25型）を加え、顕微
鏡下で観察した時に試料中に多数のプロトプラストが見
えるようになるまで穏やかに攪拌しながら37℃で1.5〜
2.5時間インキュベーションを続ける。 100 ml of YPD medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genet
ics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981)
Inoculate with spores of the strain to be grown and shake at 34 ° C for 1
Incubate for ~ 2 days. Miracross
h) Collect the mycelium by filtration through and add 200 ml of 0.6 M MgS
OFourWash with. Hyphalize with 15 ml of 1.2 M MgSOFour, 10mM NaHTwoPOFour,
Suspend in pH = 5.8. The suspension is cooled on ice and
120mg of Novozyme Add 1 ml of buffer containing 234.
Five minutes later, 1 ml of 12 mg / ml BSA (Sigma H25 type) was added, and microscopy was performed.
Many protoplasts were observed in the sample when observed under a mirror.
1.5 to 37 ° C with gentle stirring until
Continue incubation for 2.5 hours.
この懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を無菌
試験管に移し、その上に5mlの0.6Mソルビトール,100mM
Tris−HCl,pH＝7.0を重層する。2500rpmで15分間遠心を
行い、MgSO4クッションの上部からプロトプラストを収
集する。２容のSTC（1.2Mソルビトール,10mM Tris−HCl
pH＝7.5,10mM CaCl2）をプロトプラスト懸濁液に加
え、混合物を1000×ｇで５分間遠心する。プロトプラス
トペレットを3mlのSTC中に再懸濁し、再びペレット化す
る。これを繰り返した後、プロトプラストを0.2〜1mlの
STCに再懸濁する。The suspension was filtered through Miracloth and the filtrate was transferred to a sterile test tube, on which 5 ml of 0.6 M sorbitol, 100 mM
Overlay Tris-HCl, pH = 7.0. Centrifuge at 2500 rpm for 15 minutes and collect protoplasts from the top of the MgSO 4 cushion. 2 volumes of STC (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl
pH = 7.5,10 mM CaCl 2 ) is added to the protoplast suspension and the mixture is centrifuged at 1000 × g for 5 minutes. Resuspend the protoplast pellet in 3 ml STC and pellet again. After repeating this, add 0.2-1 ml of protoplasts
Resuspend in STC.
100μのプロトプラスト懸濁液を10μのSTC中の５
〜25μｇの適当なDNAと混合する。着目の構造遺伝子を
含む発現ベクター（表１参照）と選択マーカーを含むプ
ラスミドを使って各株を同時形質転換せしめる。プラス
ミドpToC90とpToC186はA.ニデュランスamdS遺伝子を含
み、形質転換および唯一の窒素源としてのアセトアミド
上での増殖についての選択に使われる。プラスミドpJaL
77とpJaL154は形質転換およびヒグロマイシンＢ耐性の
選択に使われる。100 μl of the protoplast suspension was added to 5 μl of
Mix with 2525 μg of the appropriate DNA. Each strain is co-transformed with an expression vector containing the structural gene of interest (see Table 1) and a plasmid containing the selectable marker. Plasmids pToC90 and pToC186 contain the A. nidulans amdS gene and are used for transformation and selection for growth on acetamide as the sole nitrogen source. Plasmid pJaL
77 and pJaL154 are used for transformation and selection for hygromycin B resistance.
混合物を室温で25分間維持する。0.2mlの60％PEG 400
0（BDH 29576）,10mM CaCl2および10mM Tris−HCl pH＝
7.5を加え、注意深く２度混合し、最後に同じ溶液0.85m
lを加え、注意深く混合する。この混合物を室温で25分
間維持し、2500×ｇで15分間遠心し、ペレットを2mlの
1.2Mソルビトール中に再懸濁する。もう１沈澱させた
後、プロトプラストを適当な平板上に塗抹する。1.0Mシ
ョ糖,pH＝7.0、窒素源としての10mMアセトアミド（amdS
が選択マーカーである時）およびバックグラウンド増殖
を阻害するための20mM CsClを含有する最少培地（Cove,
Biochem.Biophys.Acta113:51−56,1966）上にプロトプ
ラストを塗抹する。hygBが選択マーカーである時、培地
は窒素源として10mM亜硝酸ナトリウムを使いそして150
μg/mlのヒグロマイシンＢが存在する点で異なる。最終
遠心段階、再懸濁および塗抹に代わるものとして、8ml
のSTCを加えてプロトプラストと混合し、３枚の選択用
平板の各々に3mlを加え、次いで渦巻状に動かして平板
全体に広げる。37℃で４〜７日間インキュベートした
後、分生子を有するコロニーを取り、滅菌蒸留水に懸濁
し、そして単一コロニーの選択のために塗抹する。この
手順を繰り返し、２回目の再単離後の単一コロニーの胞
子を限定された形質転換体として保存する。The mixture is kept at room temperature for 25 minutes. 0.2 ml of 60% PEG 400
0 (BDH 29576), 10 mM CaCl 2 and 10 mM Tris-HCl pH =
Add 7.5 and mix carefully twice, finally 0.85m of the same solution
Add l and mix carefully. The mixture is kept at room temperature for 25 minutes, centrifuged at 2500 × g for 15 minutes, and the pellet is
Resuspend in 1.2 M sorbitol. After another settling, the protoplasts are spread on a suitable plate. 1.0M sucrose, pH = 7.0, 10mM acetamide as nitrogen source (amdS
) Is a selectable marker) and a minimal medium containing 20 mM CsCl to inhibit background growth (Cove,
Smear the protoplasts on Biochem. Biophys. Acta 113 : 51-56, 1966). When hygB is the selectable marker, the medium used 10 mM sodium nitrite as a nitrogen source and
The difference is that μg / ml of hygromycin B is present. 8 ml as an alternative to the final centrifugation step, resuspension and smearing
And mix with the protoplasts, add 3 ml to each of the three selection plates, and then swirl to spread the entire plate. After incubation at 37 ° C for 4-7 days, colonies with conidia are picked, suspended in sterile distilled water, and smeared for single colony selection. This procedure is repeated and the spores of a single colony after the second re-isolation are stored as limited transformants.
IV.組換えタンパク質発現の評価 上記手順の後、選択された株の個々の単離物を表１に
記載の発現ベクターのうちの１つと前の実施例で言及し
た選択マーカーを含むプラスミドのうちの１つを使って
同時形質転換させる。次いで各々の同時形質転換体を適
当なアッセイにより試験して着目の遺伝子の発現を調べ
る。IV. Evaluation of Recombinant Protein Expression After the above procedure, individual isolates of the selected strain were transformed into one of the expression vectors listed in Table 1 and the plasmid containing the selectable marker mentioned in the previous example. Co-transform with one of the following. Each co-transformant is then tested by a suitable assay to determine the expression of the gene of interest.
A.リパーゼ リパーゼ活性の同時形質転換体を、１の蒸留水中、
50g/lのマルトデキストリン,2g/lのMgSO4・7H2O,2g/lの
KH2PO4,3g/lのK2SO4,4g/lのクエン酸,8g/lの酵母エキ
ス,3g/lの（NH4）2SO4,0.5mlの微量金属溶液,4mlの50％
尿素溶液（別々に加圧滅菌したもの）,pH6.0から成るM4
00Da培地中で培養し、そして5g/lの酵母エキスを水道水
中に800ml作製する。加熱滅菌後、166mlの濾過滅菌済の
1M尿素（10g/lの最終濃度を与える）と35.3mlの濾過滅
菌済の1M NaNO3（0.3％の最終濃度を与える）を加え
る。A. Lipase The co-transformant of lipase activity was
Maltodextrin 50g / l, MgSO 4 · 7H 2 O in 2 g / l, of 2 g / l
KH 2 PO 4 , 3 g / l K 2 SO 4 , 4 g / l citric acid, 8 g / l yeast extract, 3 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 ml trace metal solution, 4 ml 50 %
Urea solution (separately autoclaved), pH 6.0, M4
Culture in 00Da medium and make 5 g / l yeast extract in tap water 800 ml. After heat sterilization, 166 ml of filter sterilized
Add 1 M urea (to give a final concentration of 10 g / l) and 35.3 ml of filter-sterilized 1 M NaNO 3 (to give a final concentration of 0.3%).
基質としてｐ−ニトロフェニルブチレート（pNB）を
使って培養濾液中のリパーゼ活性を測定する。pNBの原
液は、104.6μのpNBを5mlのDMSOに加えることにより
調製する。ミクロタイタープレートの各ウエルに90μ
の50mM Tris,pH7を加える。各ウエルに10μの試料を
加え、ミクロタイタープレートを約１分間振盪すること
により混合する。アッセイの直前に、20μのpNB原液
を970μの50mM Tris緩衝液,pH7と混合する。市販のプ
レートリーダーを使ってリパーゼ活性についてアッセイ
する直前に、100μのpNB−Tris混合物を各試料ウエル
に加え、３分間に渡り405nmで吸光度を測定する。アッ
セイは温度感受性であるので、各試料セットと共に内部
標準を使用する。各試料について決定された傾きはリパ
ーゼ活性と正比例する；アッセイの直線領域は約0.005
〜５μｇリパーゼ/mlである。この型のアッセイにおい
て、H.ラヌギノーザのリパーゼの比活性は約4000LU/mg
であると決定され、一方でカンジダのリパーゼＡの比活
性は約400LU/mgである。The lipase activity in the culture filtrate is measured using p-nitrophenyl butyrate (pNB) as a substrate. A stock solution of pNB is prepared by adding 104.6 μ of pNB to 5 ml of DMSO. 90μ in each well of the microtiter plate
Of 50 mM Tris, pH7. Add 10μ sample to each well and mix by shaking the microtiter plate for about 1 minute. Immediately prior to the assay, mix 20μ of pNB stock with 970μ of 50mM Tris buffer, pH7. Immediately before assaying for lipase activity using a commercially available plate reader, 100 μl of the pNB-Tris mixture is added to each sample well and the absorbance is measured at 405 nm for 3 minutes. Since the assay is temperature sensitive, an internal standard is used with each sample set. The slope determined for each sample is directly proportional to lipase activity; the linear area of the assay is approximately 0.005
５5 μg lipase / ml. In this type of assay, the specific activity of H. lanuginosa lipase is about 4000 LU / mg.
, While the specific activity of Candida lipase A is about 400 LU / mg.
B.キシラナーゼ 全てのキシラナーゼ形質転換体は次の組成（g/lで）
を有する培地中で増殖させる：マルトデキストリン,50;
MgSO4・7H2O,2.0;KH2PO4,10.0;K2SO4,2.0;クエン酸,2.
0;酵母エキス,10.0;AMG微量金属溶液,0.5ml;尿素2.0;pH
6.0。全ての形質転換体は34℃で深部攪拌培養物として
増殖させる。B. Xylanase All xylanase transformants have the following composition (in g / l)
Grown in medium with: maltodextrin, 50;
MgSO 4 · 7H 2 O, 2.0 ; KH 2 PO 4, 10.0; K 2 SO 4, 2.0; citric acid, 2.
0; yeast extract, 10.0; AMG trace metal solution, 0.5 ml; urea 2.0; pH
6.0. All transformants are grown at 34 ° C. as submerged cultures.
培養ブロス中のキシラナーゼ活性は、クエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液,pH6.5中に懸濁した0.2％AZCL−キシラン
（Megazyme Co.,Australia）を使って測定する。培養液
を通常は100倍希釈し、希釈した培養液10μを1mlの0.
2％AZCL−キシラン基質と混合する。この混合物を42℃
で30分間インキュベートする。反応混合物を５分毎によ
く混合する。インキュベーションの終わりに、10,000rp
mでの５分間の遠心により未消化の基質を沈澱させる。
基質から放出された青色色素を595nmでの吸光度により
定量し、そして既知の活性を有する酵素調製物を使って
作った標準曲線から培養ブロス中の酵素活性の量を計算
する。同一条件下で調製した酵素標準物と比較してエン
ドキシラナーゼ単位（EXU）を決定する。Xylanase activity in the culture broth is measured using 0.2% AZCL-xylan (Megazyme Co., Australia) suspended in citrate-phosphate buffer, pH 6.5. The culture is usually diluted 100-fold, and 10 μ of the diluted culture is added to 1 ml of 0.
Mix with 2% AZCL-xylan substrate. 42 ° C
And incubate for 30 minutes. Mix the reaction mixture well every 5 minutes. At the end of the incubation, 10,000 rp
Undigested substrate is precipitated by centrifugation at 5 m for 5 minutes.
The blue dye released from the substrate is quantified by absorbance at 595 nm, and the amount of enzyme activity in the culture broth is calculated from a standard curve generated using an enzyme preparation with known activity. The endoxylanase unit (EXU) is determined in comparison to an enzyme standard prepared under the same conditions.
C.セルラーゼ セルラーゼ形質転換体をMY50培地（50g/lのマルトデ
キストリン,2g/lのMgSO4・7H2O,10g/lのKH2PO4,2g/lのK
2SO4,2g/lのクエン酸,10g/lの酵母エキス,0.5mlの微量
金属溶液,2.0gの尿素）中で深部培養物として34℃で増
殖させる。Maltodextrin C. cellulase cellulase transformants MY50 medium (50g / l, 2g / l MgSO 4 · 7H 2 O, 10g / l of KH 2 PO 4 in, 2 g / l of K
2 SO 4 , 2 g / l citric acid, 10 g / l yeast extract, 0.5 ml trace metal solution, 2.0 g urea) and grow as subculture at 34 ° C.
セルラーゼ活性は、0.1Mクエン酸塩−リン酸塩緩衝
液,pH6.5中に懸濁した0.2％AZCL−HE−セルロース（Meg
azyme）を基質として使って測定する。培養液を0.1Mク
エン酸塩緩衝液,pH6.5中に希釈し、希釈した培養液10μ
を1mlの0.2％AZCL−HE−セルロースと混合する。この
混合物を振盪しながら42℃で30分間インキュベートす
る。反応混合物を５分毎によく混合する。インキュベー
ション後、10,000rpmでの５分間の遠心により未消化の
基質を沈澱させる。上清中の青色色素を595nmで分光光
度的に定量し、そして既知のセルラーゼ標準物を使って
作った標準曲線から酵素活性の量を決定する。同一条件
下で調製した酵素標準物と比較してエンドセルラーゼ単
位（ECU）を決定する。Cellulase activity was measured using 0.2% AZCL-HE-cellulose (Meg) suspended in 0.1 M citrate-phosphate buffer, pH 6.5.
azyme) as a substrate. The culture was diluted in 0.1 M citrate buffer, pH 6.5, and the diluted culture 10 μl was added.
Is mixed with 1 ml of 0.2% AZCL-HE-cellulose. This mixture is incubated for 30 minutes at 42 ° C. with shaking. Mix the reaction mixture well every 5 minutes. After incubation, undigested substrate is precipitated by centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes. The blue dye in the supernatant is quantified spectrophotometrically at 595 nm, and the amount of enzyme activity is determined from a standard curve generated using known cellulase standards. The endocellulase unit (ECU) is determined by comparing with an enzyme standard prepared under the same conditions.
D.ペルオキシダーゼ CiPの同時形質転換体は、１の蒸留水中、50g/lのマ
ルトデキストリン,2g/lのMgSO4・7H2O,2g/lのKH2PO4,3g
/lのK2SO4,4g/lのクエン酸,8g/lの酵母エキス,3g/lの
（NH4）2SO4,0.5mlの微量金属溶液,4mlの50％尿素溶液
（別々に加圧滅菌したもの）,pH6.0から成るM400Da培地
中で培養する。Cotransformants of D. peroxidase CiP is 1 in distilled water, maltodextrin 50g / l, 2g / l MgSO 4 · 7H 2 O, 2g / l KH 2 PO 4 in, 3g
/ l K 2 SO 4 , 4 g / l citric acid, 8 g / l yeast extract, 3 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 ml trace metal solution, 4 ml 50% urea solution (separately (Pressurized), and cultured in M400Da medium consisting of pH 6.0.
基質としてABTSを使ってまたは既知濃度の標準物に比
較したロケット免疫電気泳動により、ペルオキシダーゼ
発現をモニタリングする。免疫拡散法のために、TM緩衝
液（1.3g/lのTris塩基,0.6g/lのマレイン酸,pH7）中の
１％アガロースを溶融し次いで55℃に冷却する。400μ
のCiPに対するウサギ抗血清を15mlのアガロースと混
合し、10cm×10cmの平板上に塗抹しそして凝固させる。
CDM中で37℃で７日間増殖させたCiP形質転換体のCDM寒
天（1g/lのK2PO4,30g/lのショ糖,0.3g/lのNaNO3,0.05g/
lのKCl,0.05g/lのMgSO4・7H2O,0.001g/lのFeSO4・7H2O,
0.001g/lのZnSO4・7H2O,0.0005g/lのCuSO4・5H2O,20g/l
のマルトデキストリン,15g/lのアガロース）培養試料
を、寒天平板上に作った5mmの穴に適用する。タンパク
質を48時間拡散させる。該平板をクーマシーブルーＲで
染色してタンパク質−抗体沈澱帯を可視化する。標準溶
液として、500,1000および2000ペルオキシダーゼ単位
（PODU）/mlの濃度で精製物質を使用する。1PODUは、標
準条件下で１分あたり１μモルの過酸化水素の変換を触
媒する酵素の量である。Peroxidase expression is monitored using ABTS as a substrate or by rocket immunoelectrophoresis compared to standards of known concentration. For immunodiffusion, 1% agarose in TM buffer (1.3 g / l Tris base, 0.6 g / l maleic acid, pH 7) is melted and cooled to 55 ° C. 400μ
Is mixed with 15 ml of agarose, spread on a 10 cm × 10 cm plate and allowed to clot.
CDM agar (1 g / l K 2 PO 4 , 30 g / l sucrose, 0.3 g / l NaNO 3 , 0.05 g / l) of CiP transformants grown in CDM at 37 ° C. for 7 days
l of KCl, MgSO 4 · 7H 2 O of 0.05g / l, FeSO 4 · 7H 2 O of 0.001 g / l,
ZnSO 4 · 7H 2 O of 0.001g / l, CuSO 4 · 5H 2 O of 0.0005g / l, 20g / l
Maltodextrin, 15 g / l agarose) Culture samples are applied to 5 mm holes made on agar plates. Allow the protein to diffuse for 48 hours. The plate is stained with Coomassie Blue R to visualize the protein-antibody precipitation zone. The purified material is used as a standard solution at a concentration of 500, 1000 and 2000 peroxidase units (PODU) / ml. 1 PODU is the amount of enzyme that catalyzes the conversion of 1 μmol of hydrogen peroxide per minute under standard conditions.
ABTS〔2,2′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホネート）〕法によりペルオキシダーゼ
を測定するために、2mlの2mM ABTS〔0.1Mリン酸塩緩衝
液（10.63gのリン酸水素二ナトリウム二水和物p.a.M658
0と5.49gのリン酸二水素カリウムp.a.M4873を脱イオン
水中に溶かして１にしたもの）中の0.110gのABTS,Boe
hringer Mannheim No.102946〕を30℃で10分間予熱す
る。これにガラス試験管中の10.6mM H2O2溶液（1.0gのP
erhydrol Suprapur 30％H2O2Merck 7298を脱イオン水
に溶かして25mlにしたもの）と0.2mlの試料または標準
物質（標準物質＝5.0mgのKem−En−Tec,grade 1,No.414
0Aをリン酸塩緩衝液に溶かして25mlに調整し、それを40
0倍希釈したもの）を加える。反応を30℃で３分間行
う。試料の吸光度をMilli Q脱イオン水に対して418nmで
測定し、３分間監視する。ペルオキシダーゼ活性の最良
の反映は吸光度差：ΔＡ＝Ａ（75 sec）−Ａ（15 sec）
により与えられる。吸光度差は試料では0.05〜0.1PODU/
mlに相当する0.15〜0.30の間にあるだろう。 ABTS [2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazo
Phosphorus-6-sulfonate)] method
2 ml of 2 mM ABTS [0.1 M phosphate buffer to determine
Liquid (10.63 g disodium hydrogen phosphate dihydrate p.a.M658
Deionize 0 and 5.49 g of potassium dihydrogen phosphate p.a.M4873
0.110 g of ABTS, Boe in water dissolved to 1)
hringer Mannheim No. 102946] at 30 ° C for 10 minutes
You. 10.6 mM H in a glass test tubeTwoOTwoSolution (1.0g P
erhydrol Suprapur 30% HTwoOTwoDeionized water for Merck 7298
25 ml) and 0.2 ml of sample or standard
Substance (standard substance = 5.0mg Kem-En-Tec, grade 1, No.414
Dissolve 0A in phosphate buffer, adjust to 25 ml, and add
(0-fold dilution) is added. Run the reaction at 30 ° C for 3 minutes
U. Sample absorbance at 418 nm against Milli Q deionized water
Measure and monitor for 3 minutes. Best peroxidase activity
Reflects the absorbance difference: ΔA = A(75 sec)-A(15 sec)
Given by The absorbance difference is 0.05 to 0.1 PODU /
It will be between 0.15 and 0.30, equivalent to ml.
４クチナーゼ 選択された形質転換体を、トリブチリン寒天（13％マ
ルトデキストリン,0.3％MgSO4・7H2O,0.5％KH2PO4,0.4
％クエン酸,0.6％K2SO4,0.5％酵母エキス,1％トリブチ
リン,1％尿素,0.3％NaNO3,0.5mlの微量金属,2％寒天,pH
4.5）上で、トリブチリンの透明化により検出される細
胞外クチナーゼを生産する能力についてスクリーニング
する。4 cutinase selected transformants, tributyrin agar (13% maltodextrin, 0.3% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.5% KH 2 PO 4, 0.4
% Citric acid, 0.6% K 2 SO 4 , 0.5% yeast extract, 1% tributyrin, 1% urea, 0.3% NaNO 3 , 0.5ml trace metals, 2% agar, pH
4.5) Screen above for the ability to produce extracellular cutinase, detected by clarification of tributyrin.
37℃でM400Da培地（上述）を使った振盪フラスコ培養
において最大の透明帯を生じる株を評価する。細胞外ク
チナーゼ活性を上記と同様にｐ−ニトロフェニルブチレ
ートを使って測定する。全形質転換体の中で、最大のク
チナーゼ生産株は、CBS 103.14/CaHj427.1と命名された
A.フェティダスCBS 103.14形質転換体である。３日間の
振盪培養期間に渡り、この形質転換体はA.オリゼ対照形
質転換体Qu−１−１により生産される量とほぼ等しいレ
ベルで細胞外クチナーゼを生産する。小規模（２）の
醗酵では、この形質転換体は約1g/の細胞外クチナー
ゼを生産する。The strain that produces the largest zona pellucida in shake flask cultures using M400Da medium (described above) at 37 ° C. is evaluated. Extracellular cutinase activity is measured using p-nitrophenyl butyrate as described above. Among all the transformants, the largest cutinase-producing strain was named CBS 103.14 / CaHj427.1.
A. Fetidus CBS 103.14 transformant. Over a 3-day shaking culture period, this transformant produces extracellular cutinase at a level approximately equivalent to that produced by the A. oryzae control transformant Qu-1-1. In a small scale (2) fermentation, this transformant produces about 1 g / extracellular cutinase.
VI.結果および考察 表２は、本発明の代用宿主により生産される様々な異
種真菌酵素の発現レベルを要約する。全ての株が少なく
とも１つの着目の遺伝子の発現に成功したことがこの表
から明らかである。幾つかの場合には、新規宿主株が意
外にも高レベルの酵素を与える。例えば、A.フェティダ
スの少なくとも１つの株が振盪フラスコ培養において驚
くほど高いレベルのHLLを生産し（約1g/）、それらの
種が多量の異種タンパク質を発現できることを証明す
る。実際、それらの形質転換体により生産されるHLLの
生産レベルは、A.オリゼの最良の一次形質転換体（例え
ばHL−23）と同じ位かまたはそれより高いと思われる。
同様に、２つの株が同じようなリパーゼＢの高レベル発
現を示す。VI. Results and Discussion Table 2 summarizes the expression levels of various heterologous fungal enzymes produced by the surrogate hosts of the present invention. It is clear from this table that all strains successfully expressed at least one gene of interest. In some cases, the novel host strain provides unexpectedly high levels of enzyme. For example, at least one strain of A. fetidas produces surprisingly high levels of HLL in shake flask culture (about 1 g /), demonstrating that those species can express large amounts of heterologous protein. In fact, the production levels of HLL produced by those transformants appear to be as high or higher than the best primary transformants of A. oryzae (eg HL-23).
Similarly, the two strains show similar high level expression of lipase B.
A.フェティダスはまた、A.オリゼに比べてキシラナー
ゼの生産のための優れた宿主であることがわかる。この
酵素についての振盪フラスコ収率は、最良のA.オリゴ形
質転換体に見られるレベルの約２倍である。A. fetidus also proves to be an excellent host for xylanase production compared to A. oryzae. The shake flask yield for this enzyme is about twice the level found in the best A. oligo transformants.
与えられたデータからわかるように、A.フェティダス
種の多数の株が様々な異種タンパク質を相当量生産する
ことができ、従って標準的なA.ニガーおよびA.オリゼ宿
主系の代替物として有用であると確立され、またそれら
の既知宿主の使用よりも好ましい場合がある。 As can be seen from the data provided, a number of strains of the A. fetidas species are capable of producing significant amounts of various heterologous proteins, and thus are useful as alternatives to the standard A. niger and A. oryzae host systems. May be established and may be preferred over the use of their known hosts.
生物学的材料の寄託 下記の生物学的材料をNRRL（Agricultural Research
Service Culture Collection;1815 North University S
treet,Peoria,Illinois 61604）に寄託した。細胞系 寄託番号 pJVi9を含有するE.コリDH5α NRRL B−21161 pCaHJ418を含有するE.コリDH5α NRRL B−21162 pMT1229を含有するE.コリDH5α NRRL B−21163 pAXX40−１−１を含有するE.コリDH5αNRRL B−21164 pMHan37を含有するE.コリDH5α NRRL B−21165 A.フェティダスE46 NRRL B−21167 Deposit of Biological Materials The following biological materials were transferred to NRRL (Agricultural Research)
Service Culture Collection; 1815 North University S
treet, Peoria, Illinois 61604). E. coli containing DH5α NRRL B-21161 pCaHJ418 E. coli containing DH5α NRRL B-21162 pMT1229 containing E. coli DH5α NRRL B-21163 pAXX40-1-1 containing the deposit number pJVi9 E. coli DH5α NRRL B-21164 containing pMHan37 E. coli DH5α NRRL B-21165 A. fetidas E46 NRRL B-21167
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:66） 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−２１１６５ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ ２１１６７Ｎ (72)発明者 ヨダー，ウェンディ アメリカ合衆国，カリフォルニア 95694，ウィンターズ，プレザント バ レー 8503 (72)発明者 高木 忍 アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，コーウェル ブール バード ＃128 1880 (72)発明者 ブーミナサン，カルッパン チェティア アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，ハンボルト アベニ ュ 2233 (56)参考文献 Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ ｃａ Ｓｉｎｉｃａ，30（２) （1990），ｐ．98−103 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)────────────────────────────────────────────────── 7 Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FIC12R 1:66) Accession number of microorganism NRRL B-21165 Accession number of microorganism NRRL 21167N (72) Inventor Yodder, Wendy United States of America, California 95694, Winters, Pleasant Valley 8503 (72) Inventor Shinobu Takagi United States, California 95616, Davis, Cowell Boulevard # 128 1880 (72) Inventor Boumina San, Carpanpanetia United States, California 95616, Davis, Humboldt Avenue 2233 (56) Reference References Acta Microbiology ca Sinica, 30 (2) (1990), p. 98-103 (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) BIOSIS (DIALOG) EPAT (QUESTEL) WPI (DIALOG)
Claims (24)
酵素をコードする核酸配列を含んで成るアスペルギルス
・フェティダス（Aspergillus foetidus）宿主細胞であ
って、ここで当該宿主細胞は機能的分泌型の当該異種酵
素を発現可能である、宿主細胞。1. An Aspergillus foetidus host cell comprising a nucleic acid sequence encoding a heterologous enzyme operably linked to a promoter, wherein the host cell is a functionally secreted form of the heterologous enzyme. A host cell capable of expressing the enzyme.
シダーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシドレダクタ
ーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、
リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、
アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィタ
ーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、アミラーゼ、
グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、
リボヌクレアーゼ、キチナーゼおよびデオキシリボヌク
レアーゼから成る群より選択される、請求項１の宿主細
胞。2. The method according to claim 1, wherein said enzyme is catalase, laccase, oxidase, phenol oxidase, oxidoreductase, cellulase, xylanase, peroxidase.
Lipase, esterase, cutinase, protease,
Aminopeptidase, carboxypeptidase, phytase, pectinase, pectin lyase, amylase,
Glucoamylase, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, mannosidase, isomerase, invertase,
2. The host cell of claim 1, wherein the host cell is selected from the group consisting of ribonuclease, chitinase and deoxyribonuclease.
る、請求項１の宿主細胞。3. The host cell of claim 1, wherein said promoter is a fungal promoter.
１の宿主細胞。4. The host cell of claim 1, wherein said protein is a fungal enzyme.
の宿主細胞。5. The method of claim 1, further comprising a selectable marker.
Host cells.
びhygBから成る群より選択される、請求項５の宿主細
胞。6. The host cell according to claim 5, wherein said marker is selected from the group consisting of argB, trpC, pyrG, amdS and hygB.
e）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizo
mucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、A.
ニガー（A.niger）のグルコアミラーゼ、A.ニガー（A.n
iger）の中性α−アミラーゼ、A.ニガーの（A.niger）
酸安定性α−アミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rh
izomucor miehei）のリパーゼからのプロモーターおよ
び生来のA.フェティダス（A.foetidus）プロモーターか
ら成る群より選択される、請求項３の宿主細胞。7. The method according to claim 7, wherein the promoter is A. oryzae.
e) TAKA amylase, Rhizomucor
mucor miehei) aspartate proteinase, A.
A. niger glucoamylase, A. niger (An
iger) neutral α-amylase, from A. niger
Acid-stable α-amylase, Rhizomucor mihei (Rh
4. The host cell of claim 3, wherein the host cell is selected from the group consisting of a promoter from a lipase of izomucor miehei) and a native A. foetidus promoter.
異種真菌酵素をコードする核酸配列および選択マーカー
を含んで成るアスペルギルス・フェティダス（Aspergil
lus foetidus）宿主細胞であって、ここで当該宿主細胞
は機能的分泌型の当該異種酵素を発現可能である、宿主
細胞。8. An Aspergillus fetidas comprising a nucleic acid sequence encoding a heterologous fungal enzyme operably linked to a fungal promoter and a selectable marker.
lus foetidus) host cell, wherein the host cell is capable of expressing a functional secreted form of the heterologous enzyme.
シダーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシドレダクタ
ーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、
リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、
プロテアーゼおよびその他のタンパク質分解酵素、アミ
ノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィター
ゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよびその他のペクチン分
解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクト
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダー
ゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラー
ゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレ
アーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼ
から成る群より選択される、請求項８の細胞。9. The method according to claim 9, wherein said enzyme is catalase, laccase, oxidase, phenol oxidase, oxidoreductase, cellulase, xylanase, peroxidase,
Lipase, hydrolase, esterase, cutinase,
Proteases and other proteolytic enzymes, aminopeptidases, carboxypeptidases, phytases, lyases, pectinases and other pectinolytic enzymes, amylase, glucoamylase, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, mannosidase, isomerase 9. The cell of claim 8, wherein the cell is selected from the group consisting of: invertase, transferase, ribonuclease, chitinase, and deoxyribonuclease.
ゼから成る群より選択された真菌酵素を含んで成る、請
求項９の宿主細胞。10. The host cell of claim 9, comprising a fungal enzyme selected from the group consisting of lipase, xylanase and cellulase.
ae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhiz
omucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、A.
ニガー（A.niger）のグルコアミラーゼ、A.ニガー（A.n
iger）の中性α−アミラーゼ、A.ニガーの（A.niger）
酸安定性α−アミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rh
izomucor miehei）のリパーゼからのプロモーターおよ
び生来のA.フェティダス（A.foetidus）プロモーターか
ら成る群より選択される、請求項８の宿主細胞。11. The method according to claim 11, wherein the promoter is A. oryz.
ae) TAKA amylase, Rhizomucor mihei (Rhiz
omucor miehei) aspartate proteinase, A.
A. niger glucoamylase, A. niger (An
iger) neutral α-amylase, from A. niger
Acid-stable α-amylase, Rhizomucor mihei (Rh
9. The host cell of claim 8, wherein the host cell is selected from the group consisting of a promoter from a lipase of izomucor miehei) and a native A. foetidus promoter.
mdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項８の
宿主細胞。12. The method according to claim 12, wherein the selection marker is argB, trpC, pyrG, a.
9. The host cell of claim 8, wherein the host cell is selected from the group consisting of mdS and hygB.
能に連結された真菌リパーゼをコードする核酸配列を含
んで成り、そしてamdSマーカーを更に含んで成る、請求
項８の宿主細胞。13. The host cell of claim 8, comprising a nucleic acid sequence encoding a fungal lipase operably linked to a TAKA-amylase promoter, and further comprising an amdS marker.
Gプロモーターに作用可能に連結された真菌キシラナー
ゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSまた
はhygBマーカーを更に含んで成る、請求項８の宿主細
胞。14. A TAKA-amylase promoter or AM
9. The host cell of claim 8, comprising a nucleic acid sequence encoding a fungal xylanase operably linked to a G promoter, and further comprising an amdS or hygB marker.
ーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコード
する核酸配列を含んで成るアスペルギルス・フェティダ
ス宿主細胞を、該タンパク質の発現を可能にする条件下
で培養し、そして培養物から該タンパク質を回収するこ
とを含んで成り、ここで当該宿主細胞は機能的分泌型の
当該異種酵素を発現可能である、方法。15. A method for producing an enzyme of interest comprising the steps of: providing an Aspergillus fetidas host cell comprising a nucleic acid sequence encoding a heterologous protein operably linked to a promoter under conditions that allow expression of the protein. And recovering the protein from the culture, wherein the host cell is capable of expressing a functional secreted form of the heterologous enzyme.
項15の方法。16. The method of claim 15, wherein said protein is a eukaryotic enzyme.
ある、請求項15の方法。17. The method of claim 15, wherein said promoter is a fungal promoter.
項16の方法。18. The method of claim 16, wherein said protein is a fungal enzyme.
ェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダク
ターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナー
ゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミ
ノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィター
ゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵
素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β
−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、イ
ンベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアー
ゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから
成る群より選択される、請求項16の方法。19. The method according to claim 19, wherein said enzyme is catalase, laccase, phenol oxidase, oxidase, oxidoreductase, cellulase, xylanase, peroxidase, lipase, hydrolase, esterase, cutinase, protease and other proteolytic enzymes, aminopeptidase, carboxypeptidase, phytase, Lyases, pectinases and other pectinolytic enzymes, amylase, glucoamylase, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β
17. The method of claim 16, wherein the method is selected from the group consisting of glucosidase, mannosidase, isomerase, invertase, transferase, ribonuclease, chitinase, and deoxyribonuclease.
15の方法。20. The method of claim 20, further comprising a selectable marker.
15 ways.
よびhygBから成る群より選択される、請求項20の方法。21. The method of claim 20, wherein said marker is selected from the group consisting of argB, trpC, pyrG, amdS and hygB.
ミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラギン酸プ
ロテイナーゼ、A.ニガーのグルコアミラーゼ、A.ニガー
の中性α−アミラーゼ、A.ニガーの酸安定性α−アミラ
ーゼおよびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼからのプ
ロモーターから成る群より選択される、請求項15の方
法。22. The promoter according to claim 19, wherein the promoter is TAKA amylase of A. oryzae, aspartic proteinase of Rhizomucor miehei, glucoamylase of A. niger, neutral α-amylase of A. niger, or acid-stable α-amylase of A. niger. 16. The method of claim 15, wherein the method is selected from the group consisting of amylase and a promoter from Rhizomucor mihei lipase.
種酵素をコードする組換え核酸配列を含んで成るアスペ
ルギルス・フェティダス宿主細胞であって、ここで当該
宿主細胞は機能的分泌型の当該異種酵素を発現可能であ
る。23. An Aspergillus fetidas host cell comprising a recombinant nucleic acid sequence encoding a heterologous enzyme operably linked to a promoter, wherein the host cell comprises a functional secreted form of the heterologous enzyme. Can be expressed.
ーターに作用可能に連結された異種酵素をコードする組
換え核酸配列を含んで成るアスペルギルス・フェティダ
ス宿主細胞を、該酵素の発現を可能にする条件下で培養
し、そして培養物から該酵素を回収することを含んで成
り、ここで当該宿主細胞は機能的分泌型の当該異種酵素
を発現可能である、方法。24. A method for producing an enzyme of interest, comprising the steps of: allowing an Aspergillus fetidas host cell comprising a recombinant nucleic acid sequence encoding a heterologous enzyme operably linked to a promoter to enable expression of said enzyme. And recovering the enzyme from the culture, wherein the host cell is capable of expressing a functional secreted form of the heterologous enzyme.
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