JP3057553B2 - 遺伝子の塩基置換の検査法 - Google Patents
遺伝子の塩基置換の検査法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、長さが異なることに
よって識別できる多数のプライマー、またはプローブの
混合物を、遺伝子上の各塩基置換に対応して設定し、こ
れを遺伝子と反応させ、残った未反応のプライマー、ま
たはプローブを検出することで遺伝子の塩基置換を検査
する方法に関するものである。
よって識別できる多数のプライマー、またはプローブの
混合物を、遺伝子上の各塩基置換に対応して設定し、こ
れを遺伝子と反応させ、残った未反応のプライマー、ま
たはプローブを検出することで遺伝子の塩基置換を検査
する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、プライマーによるポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ反応）や、プローブを用いたハイブリダ
イゼーションによる遺伝子の検査方法は広範囲に実施さ
れている。しかし、それらはいずれも、反応後の生成物
を検査するものであり、未反応のプライマーやプローブ
を特定するものではなかった。
鎖反応（ＰＣＲ反応）や、プローブを用いたハイブリダ
イゼーションによる遺伝子の検査方法は広範囲に実施さ
れている。しかし、それらはいずれも、反応後の生成物
を検査するものであり、未反応のプライマーやプローブ
を特定するものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来法には次のような
欠点があった。 （イ） 分子量の大きいＰＣＲ反応生成物は増幅されに
くく、鋳型となる遺伝子が分解している場合には、正常
なＰＣＲ反応生成物が得られない。 （ロ） 分子量が大きいＰＣＲ反応生成物の、一塩基の
違いを電気泳動法で検出することは困難である。 （ハ） ＰＣＲ反応では、しばしば間違った塩基の取り
込み反応が起こることが知られており、得られた反応生
成物が単一とは限らない。 （ニ） ＰＣＲ反応や、ハイブリダイゼーションによっ
て遺伝子の塩基置換を検出するには、検査する部位ごと
に分析条件（電気泳動条件、制限酵素の種類、ハイブリ
ダイゼーションの温度と時間など）を変えなければなら
ないため煩雑である。 （ホ） 一回の検査で検出できる遺伝子の塩基置換部位
は限られているので、個人識別を行うには、多くの検査
回数が必要である。
欠点があった。 （イ） 分子量の大きいＰＣＲ反応生成物は増幅されに
くく、鋳型となる遺伝子が分解している場合には、正常
なＰＣＲ反応生成物が得られない。 （ロ） 分子量が大きいＰＣＲ反応生成物の、一塩基の
違いを電気泳動法で検出することは困難である。 （ハ） ＰＣＲ反応では、しばしば間違った塩基の取り
込み反応が起こることが知られており、得られた反応生
成物が単一とは限らない。 （ニ） ＰＣＲ反応や、ハイブリダイゼーションによっ
て遺伝子の塩基置換を検出するには、検査する部位ごと
に分析条件（電気泳動条件、制限酵素の種類、ハイブリ
ダイゼーションの温度と時間など）を変えなければなら
ないため煩雑である。 （ホ） 一回の検査で検出できる遺伝子の塩基置換部位
は限られているので、個人識別を行うには、多くの検査
回数が必要である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、これらの欠点
を除くために次のような手段で検査を行う。遺伝子の塩
基置換に対応したプライマー、またはプローブの５’末
端に本来の塩基配列と非相補的な塩基配列を持つヌクレ
オチドを結合させ、各プライマー、またはプローブが鎖
長によって区別できるように設定する。この様に特定の
塩基数を持つ多数のプライマー、またはプローブの混合
物を遺伝子と反応させると、遺伝子上の塩基置換に対応
したプライマー、またはプローブのみが反応し、より高
分子の反応生成物ができる。そこで、残った未反応のプ
ライマー、またはプローブを電気泳動によって検出す
る。
を除くために次のような手段で検査を行う。遺伝子の塩
基置換に対応したプライマー、またはプローブの５’末
端に本来の塩基配列と非相補的な塩基配列を持つヌクレ
オチドを結合させ、各プライマー、またはプローブが鎖
長によって区別できるように設定する。この様に特定の
塩基数を持つ多数のプライマー、またはプローブの混合
物を遺伝子と反応させると、遺伝子上の塩基置換に対応
したプライマー、またはプローブのみが反応し、より高
分子の反応生成物ができる。そこで、残った未反応のプ
ライマー、またはプローブを電気泳動によって検出す
る。
【０００５】
【作用】本検査法では、ＰＣＲ反応や、ハイブリダイゼ
ーションによって生成した物質を分析するのではなく、
未反応のプライマー、またはプローブを分析するもので
あるから、分析条件は常に一定でよい。また、本来プラ
イマーやプローブの分子量は小さいので、一塩基でも鎖
長に違いがあれば、電気泳動によって充分区別すること
ができる。しかも、鋳型となる遺伝子が多少分解してい
たり、ＰＣＲ反応に間違いが生じても、未反応のプライ
マー、またはプローブが反応生成物と区別できれば検査
に影響しない。さらに、本検査法では、反応生成物の大
きさは問題にならないので、分析できる遺伝子上の塩基
置換部位が広がる。２１塩基（ｍｅｒ）から６０塩基
（ｍｅｒ）まで１塩基（ｍｅｒ）づつ長さの異なる４０
種類のプライマー、またはプローブを用いれば、その組
み合わせは２の４０乗（約１兆）となり、高度の個人識
別が可能となる。用いるプライマーやプローブの数は、
必要に応じて増減できる。
ーションによって生成した物質を分析するのではなく、
未反応のプライマー、またはプローブを分析するもので
あるから、分析条件は常に一定でよい。また、本来プラ
イマーやプローブの分子量は小さいので、一塩基でも鎖
長に違いがあれば、電気泳動によって充分区別すること
ができる。しかも、鋳型となる遺伝子が多少分解してい
たり、ＰＣＲ反応に間違いが生じても、未反応のプライ
マー、またはプローブが反応生成物と区別できれば検査
に影響しない。さらに、本検査法では、反応生成物の大
きさは問題にならないので、分析できる遺伝子上の塩基
置換部位が広がる。２１塩基（ｍｅｒ）から６０塩基
（ｍｅｒ）まで１塩基（ｍｅｒ）づつ長さの異なる４０
種類のプライマー、またはプローブを用いれば、その組
み合わせは２の４０乗（約１兆）となり、高度の個人識
別が可能となる。用いるプライマーやプローブの数は、
必要に応じて増減できる。
【０００６】
【実施例】ヒト第９染色体のＡＢＯ式血液型遺伝子座の
エクソン６にある２箇所の点変異部位（塩基番号２６１
番のグアニンの欠損部位と、塩基番号２９７番のアデニ
ンとグアニンの置換部位）に対応して鎖長の異なる４つ
の特異プライマーを合成した。（プライマー１；２７塩
基（ｍｅｒ）、プライマー２；２６塩基（ｍｅｒ）、プ
ライマー３；１７塩基（ｍｅｒ）、プライマー４；１８
塩基（ｍｅｒ）、プライマー１と２からＡ型遺伝子、プ
ライマー１と４からＢ型遺伝子、プライマー３と２、お
よび３と４からＯ型の２つの遺伝子が、それぞれ増幅さ
れる。）この４つのプライマーを２０ピコモルずつ混合
したものを含むＰＣＲ反応液と、血液型がＡ型、Ｂ型、
ＡＢ型、Ｏ型のヒトのＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行
い、反応液を２０％＝Ｔ、５％＝Ｃのポリアクリルアミ
ドゲルで２００Ｖで２時間電気泳動し、銀染色を行っ
た。遺伝子型が、ＡＡ型ではプライマー３、４が検出さ
れ、ＢＢ型ではプライマー２、３が検出され、ＡＢ型で
はプライマー３のみが検出され、ＯＯ型ではプライマー
１、２が検出された試料とプライマー１、４が検出され
た試料、プライマー１のみが検出された試料に分かれ
た。同様にして、ＩＴＩ遺伝子座、ＥｓＤ遺伝子座、Ｇ
ｃ遺伝子座、ＡＨＳＧ遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座におけ
る塩基置換部位の検出を行った。この方法で、プライマ
ーによって識別できる遺伝子上のすべての変異点、およ
びプローブによって特定される特異配列部位を検査する
ことができる。また、各プライマー、またはびプローブ
を識別するために結合させるオリゴヌクレオチドは、塩
基部分を修飾して４つの塩基（アデニン、グアニン、シ
トシン、チミン）と相補性をもたなくしたものや、塩基
自体を取り除いたものでもよく、ペプチドや、オリゴ糖
など分子量を区別できる化合物でもよい。そして、それ
らの化合物の一部に蛍光物質、あるいは色素を結合させ
て、自動シークエンサーや、キャピラリーシークエンサ
ー、キャピラリー電気泳動装置を用いて未反応のプライ
マー、またはブローブを検出してもよい。さらに、未反
応のプローブだけでなく、ハイブリダイゼーションで、
一度遺伝子と結合したプローブを分離し、加熱すること
によって解離してきたプローブを検査することで、塩基
置換部位の検出を行うこともできる。
エクソン６にある２箇所の点変異部位（塩基番号２６１
番のグアニンの欠損部位と、塩基番号２９７番のアデニ
ンとグアニンの置換部位）に対応して鎖長の異なる４つ
の特異プライマーを合成した。（プライマー１；２７塩
基（ｍｅｒ）、プライマー２；２６塩基（ｍｅｒ）、プ
ライマー３；１７塩基（ｍｅｒ）、プライマー４；１８
塩基（ｍｅｒ）、プライマー１と２からＡ型遺伝子、プ
ライマー１と４からＢ型遺伝子、プライマー３と２、お
よび３と４からＯ型の２つの遺伝子が、それぞれ増幅さ
れる。）この４つのプライマーを２０ピコモルずつ混合
したものを含むＰＣＲ反応液と、血液型がＡ型、Ｂ型、
ＡＢ型、Ｏ型のヒトのＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行
い、反応液を２０％＝Ｔ、５％＝Ｃのポリアクリルアミ
ドゲルで２００Ｖで２時間電気泳動し、銀染色を行っ
た。遺伝子型が、ＡＡ型ではプライマー３、４が検出さ
れ、ＢＢ型ではプライマー２、３が検出され、ＡＢ型で
はプライマー３のみが検出され、ＯＯ型ではプライマー
１、２が検出された試料とプライマー１、４が検出され
た試料、プライマー１のみが検出された試料に分かれ
た。同様にして、ＩＴＩ遺伝子座、ＥｓＤ遺伝子座、Ｇ
ｃ遺伝子座、ＡＨＳＧ遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座におけ
る塩基置換部位の検出を行った。この方法で、プライマ
ーによって識別できる遺伝子上のすべての変異点、およ
びプローブによって特定される特異配列部位を検査する
ことができる。また、各プライマー、またはびプローブ
を識別するために結合させるオリゴヌクレオチドは、塩
基部分を修飾して４つの塩基（アデニン、グアニン、シ
トシン、チミン）と相補性をもたなくしたものや、塩基
自体を取り除いたものでもよく、ペプチドや、オリゴ糖
など分子量を区別できる化合物でもよい。そして、それ
らの化合物の一部に蛍光物質、あるいは色素を結合させ
て、自動シークエンサーや、キャピラリーシークエンサ
ー、キャピラリー電気泳動装置を用いて未反応のプライ
マー、またはブローブを検出してもよい。さらに、未反
応のプローブだけでなく、ハイブリダイゼーションで、
一度遺伝子と結合したプローブを分離し、加熱すること
によって解離してきたプローブを検査することで、塩基
置換部位の検出を行うこともできる。
【０００７】
【発明の効果】この発明によれば、様々な生物の遺伝子
上の複数の塩基置換部分を同時に検査でき、各個体にお
ける遺伝子の違いや型を知ることができる。また、生物
の遺伝子における塩基置換を調べることによって、高い
精度で個体識別が可能である。なお、検査すべき遺伝子
が一部分解していても、本法による検査は可能なので、
分解や腐敗の進んだ試料から抽出された遺伝子の検査に
も適している。
上の複数の塩基置換部分を同時に検査でき、各個体にお
ける遺伝子の違いや型を知ることができる。また、生物
の遺伝子における塩基置換を調べることによって、高い
精度で個体識別が可能である。なお、検査すべき遺伝子
が一部分解していても、本法による検査は可能なので、
分解や腐敗の進んだ試料から抽出された遺伝子の検査に
も適している。
【図１】 本考案の実施例の説明図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 遺伝子の各塩基置換に対応し、鎖長の違
いによって特定できるプライマーの混合物を用いてポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）を行い、残った未反応
のプライマーを検出することによって、遺伝子の塩基置
換を検査する方法。 - 【請求項２】 遺伝子の各塩基配列の違いに対応し、鎖
長の違いによって特定できるプローブの混合物を遺伝子
とハイブリダイズし、残った未反応のプローブを検出す
ることによって、遺伝子の塩基置換を検査する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8139371A JP3057553B2 (ja) | 1996-04-23 | 1996-04-23 | 遺伝子の塩基置換の検査法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8139371A JP3057553B2 (ja) | 1996-04-23 | 1996-04-23 | 遺伝子の塩基置換の検査法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09285300A JPH09285300A (ja) | 1997-11-04 |
| JP3057553B2 true JP3057553B2 (ja) | 2000-06-26 |
Family
ID=15243777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8139371A Expired - Fee Related JP3057553B2 (ja) | 1996-04-23 | 1996-04-23 | 遺伝子の塩基置換の検査法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3057553B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008011829A (ja) * | 2006-07-10 | 2008-01-24 | Olympus Corp | 核酸の検出方法 |
-
1996
- 1996-04-23 JP JP8139371A patent/JP3057553B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09285300A (ja) | 1997-11-04 |
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