JP3053131B2 - ガードカラムを備えた高速液体クロマトグラフ - Google Patents

ガードカラムを備えた高速液体クロマトグラフ

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、成分を分離する分離カ
ラムを保護するガードカラムを備えた高速液体クロマト
グラフに関する。
【0002】
【従来の技術】高速液体クロマトグラフィーは分離カラ
ムによって成分を分離し、それを経時的にクロマトグラ
ムとして検出し、定性・定量を行う分離分析装置であ
る。しかし、多検体数,長時間分析を続けると分離カラ
ムの分離能力が徐々に低下し、分離できなくなりついに
は寿命が尽きる。一般に分離カラムは消耗品とみなさ
れ、その交換は容易であるが、高価なものが多い。分離
カラムの寿命は、そのままランニングコストとして評価
され、より長い寿命のものが要求される。分離カラムの
寿命すなわち、分離能力を劣化させる要因は、次の3点
に分類される。
【0003】a.分離カラムに充填されている充填剤自
身の液の流れに対する物理的,化学的安定性に関するも
の、例えば、充填剤の形状・大きさ・均一性・耐圧性・
膨潤度・空隙率・官能基の安定度等があげられる。
【0004】b.カラムとフィルタの構造に関するも
の、例えばカラムの内径・長さ・容積・フィルタの材質
・目の大きさ・形状・流体抵抗・均一性・ロット差等が
あげられる。
【0005】c.流れに乗って混入して来る試料とそれ
に含まれる物理的及び化学的妨害物によって、充填剤が
影響を受けるもの。
【0006】これらの内、劣化要因aに関する先行技術
を図2を参照して説明する。図2において、溶離液1は
切換弁4によって選択され、送液ポンプ8によってサン
プラ16を経由して分離カラム28に送られる。4方弁
41は4つの出入口を溝42の1/4回転によって、溝
42の方向と、点線43の方向に切替えられる。これに
よって、分離カラム28は流れの方向に変えることがで
きる。従って分離カラムは、正逆方向に定期的に切替え
ることにより圧力負荷を平均化して、長時間安定して分
析させることができる。
【0007】次に、劣化要因cに関する先行技術を図3
を参照して説明する。図3の方法は分離カラム28の直
前にガードカラム34を設けることにより、物理的,化
学的妨害物をある程度の深さを持って立体的に補集し、
分離カラム28まで達しないようにするものである。ガ
ードカラム34は一般的に分離カラム28と同じか又は
同類の充填剤が充填されているため、化学的妨害物も吸
着,補集することができる。このガードカラム34が、
充填剤でなく単に流路フィルターである場合、物理的妨
害物(固形物,浮遊物,粘着物)のみを除去することが
できる。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】上述した図2の先行技
は、劣化要因cについてもある程度考慮している。す
なわち、サンプラ16から混入して来る、物理的、及び
化学的妨害物を分離カラム入口面で受け止めることにな
る。(流出するものは妨害物とならずに排出される。)
【0009】しかしながら、この妨害物は、次のステッ
プで逆方向に切換えることにより、ある程度流出される
ことになる。逆方向に流した時、分離カラムから脱離し
て来た物理的,化学的妨害物がそのまま検出器29に流
出することになる。この時、フローセル等の細管,セル
内壁を汚し、それが蓄積して、ドリフトやノイズを増大
させる欠点がある。
【0010】一方、図3の先行技術において採用されて
いるガードカラム34は、面で補集する構造であるため
に短期間で交換しなければならない。すなわち、ガード
カラム34は寿命になれば交換されるが、自己洗浄手段
を持たないため寿命が短くその交換頻度が高い欠点があ
る。
【0011】本発明の目的は、効率的にガードカラムを
再生し得、それにより分離カラムの寿命を向上できる高
速液体クロマトグラフを提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明は、溶離液を送液
する送液ポンプと、送液された溶離液が流れる流路に測
定対象試料を注入する試料注入部と、測定対象試料を分
離する分離カラムと、当該分離カラムで分離された試料
成分を検出する検出器を備えた高速液体クロマトグラフ
において、前記試料注入部と前記分離カラム間の流路
に、流路の切り換えを行う切換弁と、当該切換弁に接続
されたガードカラムを備え、前記切換弁は、分析時には
前記試料注入部から前記ガードカラムを経て前記分離カ
ラムに流れる流路を形成し、洗浄時には前記試料注入部
から前記ガードカラムを経てドレインに流れる流路を形
成することを特徴とする。
【0013】より寿命の長いガードカラムを提供する手
段として、 A.ガードカラムに、定期的な自己洗浄機能を持たすこ
とである。その一手段として、分析検体1検体分析毎、
あるいは数検体分析毎に逆方向に溶離液を流し、付着し
た物理的,化学的妨害物の一部又は大部分を排出除去す
ることである。
【0014】B.Aに述べた溶離液は分析に使用する溶
離液であるが、これをもっと溶離能力の高い再生液を用
いることで洗浄能力を高めようとするものである。
【0015】C.ガードカラムの充填剤の粒径を二種類
以上用い、より立体的に物理的,化学的妨害物をある深
さをもって補集させ、補集容量を増加させるものであ
る。
【0016】
【作用】手段Aについては定期的にガードカラムを逆方
向に切替え、流れる方向を逆にすることによって、一時
補集された物理的,化学的妨害物を離脱させ、洗浄する
作用を持つ。この作用は、大部分はガードカラムを対象
とするが、流す時間によっては、分離カラムも自己洗浄
作用を持つことができる。
【0017】手段Bについては、自己洗浄能力を高める
ため、分離分析する溶離液の最終段のより離脱能力の高
い溶離液、更には、分離分析する溶離液と異なるより離
脱能力の高い再生液を流すことによって、自己洗浄能力
を高めようとするものである。
【0018】手段Cについては、ガードカラムの充填剤
に、粒径の異なる複数種の充填剤を用い、物理的,化学
的妨害物は、まず粒子の大きいものから先に付着補集さ
せ、次に粒子の小さいものを補集し、より立体的な網目
構造とすることで、補集容量を増やそうとするものであ
る。
【0019】
【実施例】本発明の実施例を図1により説明する。図1
は本発明を採用したグリコヘモグロビン分析計の流路説
明図である。この分析計は図6に示すように高速液体ク
ロマトグラフィーの分析原理に基づき、グリコヘモグロ
ビン6成分を分離させ、A1Cの全成分の合計に対する成
分比率を求める。
【0020】グリコヘモグロビンを分離する種類の溶離
液1〜3は、いずれか1つを選択する切換弁4〜6によ
り選ばれ、マニホールド7を通り送液ポンプ8により、
試料導入弁11と逆洗弁21を経由して、分離カラム2
8に送られる。一方、希釈液9で160倍に希釈された
全血試料15は、オートサンプラ10により、試料導入
弁11を経由し、試料ループ12(容量8μl)に導入
される。この時、試料導入弁11には、その切換溝13
が点線の位置14に一時的に切換えられ、試料は試料ル
ープ12に満ち、その先端の一部はドレイン17に排出
される。次に切換溝13が図示のような流路に切替えら
れ、試料ループ12で計量された試料が逆方向から、中
間パイプ22を通って、逆洗弁21の図示の流路を通過
し、分離カラム28に導入される。分離カラム28の直
前にはガードカラム27があり、溶血試料のグリコヘモ
グロビン妨害物が吸着される。分離カラム28で分離さ
れた成分は検出器29により検出され、クロマトグラム
として、データ処理装置30にて記憶された後計算さ
れ、打ち出される。検出後の液はドレイン31に排出さ
れる。
【0021】このようにして、第1シリーズの50検体
の分析が終了すると逆洗弁21によって流路が点線24
のように切替えられ、洗浄液3が切換弁6を経由し送液
ポンプ8により、分離カラム28の逆方向33から送ら
れ、約30分間の洗浄が行われる。この操作により、ガ
ードカラム27に付着した全血妨害成分の一部は脱離
し、ドレイン25に排出される。尚、栓32は液が通過
しないようになっているため、点線の流路で検出器29
に接続された時に、大気と連通せず密封されたまま保持
させることができる。また溝26は逆洗流路の時、液が
流れるので滞留することがない。もし切替弁の位置が6
0°ずれている栓32を中心に回転すると滞留溝が存在
することになり、液が入れ替わらないことになる。
【0022】ここで、洗浄液3は、グリコヘモグロビン
の最終ピークA0 を溶離する場合に使用されるが、あわ
せて分離カラムの洗浄能力,再生能力を持っているた
め、ガードカラムの逆洗時の洗浄,再生液としても使用
することができる。
【0023】次に応用例1につき図4により、ガードカ
ラムのみの逆洗機能について述べる。図1との違いは、
分離カラム28が、逆洗弁21と検出器29の間に設置
されたことにある。すなわち、逆洗はガードカラム27
のみを行うことでより逆洗効率を高め、より早く洗浄し
ようとするものである。
【0024】次の応用例2を図5を参照して述べる。図
5と図1との違いは、第1のガードカラム27の他に、
第2のガードカラム27を分離カラムの下流に設けたこ
とにある。この方式では、洗浄のための時間が不要で、
分離分析中には、分離カラムの下流のガードカラムが、
そのまま自動逆洗洗浄が行われる。これを一定周期で交
互に切替え繰返して分析が行われる。
【0025】次にガードカラムに2種以上の粒径の異な
る充填剤を用いた場合の例を図9および図10に示す。
図9は、2種類の粒径の異なるガードカラムの充填方法
を示す。まず、粒径の大きい一定量の充填剤43を吸引
法でガードカラム45に流し込み、ガードカラム容積の
1/2で止める。次に粒径の小さい充填剤44を静かに
流し込み容積いっぱいに充填する。充填された側断面4
5は二層に充填されたガードカラムを示す。分析時には
矢印46の方向から使用し、まず粒子の大きい妨害物を
先に補集し、次に粒子の小さい妨害物を補集する。これ
により、妨害物は、立体的にある深さを持つことによ
り、補集容量を増大させることができる。図10は、あ
る分析を持った充填剤の例を示す。ガードカラムのパッ
カー48に、一定の分布を持った充填剤をいれ、ガード
カラムに接続して自然放置する。自重により、より粒子
の大きい充填剤が、下側に沈澱することになる。以上の
ようにして充填したガードカラム47は、分析時矢印4
9の方向から使用することにより容量の大きい補集能力
を持つことができる。
【0026】上述した実施例による効果を図8(a)お
よび図8(b)を参照して説明する。分離カラム及びガ
ードカラムの寿命を表す指標としては、圧力上昇と分離
能力低下がある。図8(a)は分離カラムの分析検体数
に対する圧力上昇を示す。この装置は圧力上昇が40ba
r を越えると注意表示が出るようになっている。グラフ
51は、ガードカラムを用いない場合の圧力上昇カー
ブで約250検体で寿命になる。その原因は全血をその
ままサンプラーにセットし、サンプラーの中で166倍
に溶血しているので、血球の膜などが流入して来るもの
である。分離カラムの充填剤の粒径は約3μmである。
グラフ52は本発明図1の流路図の構成と約30〜50
検体分析後、逆洗を行う方式の場合の寿命カーブで約3
000〜4000検体を分析することができる。但しガ
ードカラムは約250検体毎に交換した場合である。グ
ラフ53は図5の流路構成とし、1検体毎に逆方向に流
した場合の寿命カードで、約5000検体の寿命であ
る。但し、ガードカラムは250検体(合計500検
体)毎に交換した場合である。
【0027】図8(b)はガードカラムのみの分析検体
数に対する圧力上昇を示す。グラフ54は図1の流路構
成で逆洗をしない場合のカーブで約250検体の寿命で
ある。グラフ55は図1の流路構成で約30〜50検体
分析毎に30分間溶離液3で逆洗を行う方式での寿命カ
ーブである。グラフ56は図5の流路構成で、約30〜
50検体分析毎に方向を切替えて使用した場合である。
下流のガードカラムは分析時間と同じだけ逆方向に流れ
ているため洗浄効率が上がっている。
【0028】図6は本実施例の分析結果を示すクロマト
グラムで、分離カラムは初期の状態を示す。成分Alc
シャープで、成分下とは充分分離していることがわか
る。圧上昇はまずない状態である。
【0029】図7は図6に対し、寿命直前のクロマトグ
ラムである。成分Alcはブロードな形になり、成下と
はもう少しで分離しなくなる状態である。圧力上昇は4
0bar 近くである。
【0030】
【発明の効果】本発明によれば、分離カラムおよびガー
ドカラムを定期的に逆流洗浄して再生することができる
ので、これらを長寿命化できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例を示す流路説明図。
【図2】第1の先行技術を示す流路説明図。
【図3】第2の先行技術を示す説明図。
【図4】本発明を適用したガードカラム逆洗流路の説明
図。
【図5】2つのガードカラムを用いた逆洗流路説明図。
【図6】正常なカラム状態によるグリコヘモグロビン分
析で得られるクロマトグラムの図。
【図7】寿命に近いカラム状態によるグリコヘモグロビ
ン分析でのクロマトグラムの図。
【図8】寿命の程度を示す圧力上昇グラフの図。
【図9】2層式ガードカラムの充填剤の状態を示す図。
【図10】沈澱式ガードカラムの充填剤の状態を示す
図。
【符号の説明】
1〜3…溶離液、4〜6…溶離液切替弁、11…試料導
入弁、12…試料ループ、21…逆洗弁、27…ガード
カラム、28…分離カラム、29…検出器、30…デー
タ処理装置。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅里 文則 茨城県勝田市堀口字長久保832番地2 日立計測エンジニアリング株式会社内 (72)発明者 伊藤 正人 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社 日立製作所 計測器事業部内 (72)発明者 佐竹 尋志 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社 日立製作所 計測器事業部内 (72)発明者 三浦 順吉 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社 日立製作所 計測器事業部内 (56)参考文献 特開 昭62−206445(JP,A) 特開 昭63−67567(JP,A) 実開 昭61−102960(JP,U) 実開 昭62−44259(JP,U) Joumal of Chromat ography,544(1991.5.17) p.3−12 LC.GC.,8(3)(19909 p. 216−222 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 30/14 G01N 30/26 G01N 33/72 BIOSIS(DIALOG) JICSTファイル(JOIS)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】離液を送液する送液ポンプと、送液され
    た溶離液が流れる流路に測定対象試料を注入する試料注
    入部と、測定対象試料を分離する分離カラムと、当該分
    離カラムで分離された試料成分を検出する検出器を備え
    た高速液体クロマトグラフにおいて、前記試料注入部と前記分離カラム間の流路に、流路の切
    り換えを行う切換弁と、当該切換弁に接続されたガード
    カラムを備え、 前記切換弁は、分析時には前記試料注入部から前記 ガー
    ドカラムを経て前記分離カラムに流れる流路を形成し、
    洗浄時には前記試料注入部から前記ガードカラムを経て
    ドレインに流れる流路を形成することを特徴とする高速
    液体クロマトグラフ。
  2. 【請求項2】請求項1に記載の高速液体クロマトグラフ
    において、洗浄時には、カラムの洗浄能力及び再生能力を有する洗
    浄液を送液すること を特徴とする高速液体クロマトグラ
    フ。
  3. 【請求項3】 請求項1に記載の高速液体クロマトグラフ
    において、 記ガードカラムの充填剤は、記分離カラムの充填剤
    と同質の材質であって、二種類以上の異なる粒径より成
    ることを特徴とする高速液体クロマトグラフ。
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