JP3043727B1 - 粘膜上皮細胞シート - Google Patents
粘膜上皮細胞シートInfo
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Abstract
【要約】
【課題】 より迅速に調製でき、長期にわたり生着でき
る移植片としての細胞シートを提供する。 【解決手段】 口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着
し、歯肉溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、
複数の層を形成することによって構成された粘膜上皮細
胞シートを提供する。
る移植片としての細胞シートを提供する。 【解決手段】 口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着
し、歯肉溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、
複数の層を形成することによって構成された粘膜上皮細
胞シートを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、上皮細胞シートに
関し、特に、口腔粘膜上皮に連続して歯に付着し、歯肉
溝の一部を形成する口腔粘膜付着上皮細胞が、複数の層
を形成することによって形成された口腔粘膜上皮細胞シ
ート及びその製造方法に関する。
関し、特に、口腔粘膜上皮に連続して歯に付着し、歯肉
溝の一部を形成する口腔粘膜付着上皮細胞が、複数の層
を形成することによって形成された口腔粘膜上皮細胞シ
ート及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトを始めとする生体に、生きた細胞や
組織を移植したり導入したりすることがある。例えば、
創傷包帯としての組織を移植することがある。この場
合、手術や事故などによって生体の組織が一部除去され
た個所が、除去された部分を補うためや外観をよくする
ために、他の組織（移植片）で補われる。このような目
的のために、様々な移植片が用いられている。
組織を移植したり導入したりすることがある。例えば、
創傷包帯としての組織を移植することがある。この場
合、手術や事故などによって生体の組織が一部除去され
た個所が、除去された部分を補うためや外観をよくする
ために、他の組織（移植片）で補われる。このような目
的のために、様々な移植片が用いられている。
【０００３】特に、表皮細胞のシートは、自己の表皮細
胞から作製することができるという利点を有する。この
ように作製された表皮細胞シートには、拒絶反応が起こ
ることはなく、このため、表皮細胞シートは火傷などの
場合に有用な移植片として高く評価されている。また、
口腔粘膜細胞から単離された上皮細胞は、皮膚の角化細
胞よりも未分化の細胞であるため、皮膚角化細胞よりも
短い代謝サイクルを有しており、また角化することなく
長期間の維持が可能であるという利点を有する。このよ
うな性質から、口腔粘膜細胞は、表皮角化細胞よりも、
移植用組織として一層有用であると考えられている。
胞から作製することができるという利点を有する。この
ように作製された表皮細胞シートには、拒絶反応が起こ
ることはなく、このため、表皮細胞シートは火傷などの
場合に有用な移植片として高く評価されている。また、
口腔粘膜細胞から単離された上皮細胞は、皮膚の角化細
胞よりも未分化の細胞であるため、皮膚角化細胞よりも
短い代謝サイクルを有しており、また角化することなく
長期間の維持が可能であるという利点を有する。このよ
うな性質から、口腔粘膜細胞は、表皮角化細胞よりも、
移植用組織として一層有用であると考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、組織を
生体に移植する場合、移植の必要性が生じてから短時間
に移植片を用意する必要がある。特に、重度の火傷など
の場合には、移植片の調製には一刻を争うことがある。
その一方で、自己の組織から移植片を作製できない場合
に代用された非自己の移植片では、移植した後で拒絶さ
れ、一旦生着したとしてもわずかな期間で排除されてし
まう。
生体に移植する場合、移植の必要性が生じてから短時間
に移植片を用意する必要がある。特に、重度の火傷など
の場合には、移植片の調製には一刻を争うことがある。
その一方で、自己の組織から移植片を作製できない場合
に代用された非自己の移植片では、移植した後で拒絶さ
れ、一旦生着したとしてもわずかな期間で排除されてし
まう。
【０００５】従って、本発明の目的は、より迅速に調製
することができると共に長期にわたり生着できる移植片
を提供することである。また、本発明の目的は、長期に
わたり生着できる移植片をより迅速に調製することであ
る。
することができると共に長期にわたり生着できる移植片
を提供することである。また、本発明の目的は、長期に
わたり生着できる移植片をより迅速に調製することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の粘膜上皮細胞シ
ートは、口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着し、歯肉
溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、複数の層
を形成することによって構成された粘膜上皮細胞シート
であることを特徴としている。他の態様において本発明
の上記粘膜上皮細胞シートは、前記口腔内縁粘膜上皮細
胞が、抜歯の際に歯に付着して歯肉から分離されたもの
に由来することを特徴としている。
ートは、口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着し、歯肉
溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、複数の層
を形成することによって構成された粘膜上皮細胞シート
であることを特徴としている。他の態様において本発明
の上記粘膜上皮細胞シートは、前記口腔内縁粘膜上皮細
胞が、抜歯の際に歯に付着して歯肉から分離されたもの
に由来することを特徴としている。
【０００７】また、本発明の粘膜上皮細胞シートの作製
方法は、口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着し、歯肉
溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、複数の層
を形成することによって構成された粘膜上皮細胞シート
の作製方法であって、前記口腔内縁粘膜上皮細胞と、該
口腔内縁粘膜上皮細胞の成育を支持する支持細胞とを得
て、複数層の前記口腔内縁粘膜上皮細胞で構成された粘
膜上皮細胞シートを形成させるために、前記支持細胞の
存在下で前記口腔内縁粘膜上皮細胞を培養し、形成され
た粘膜上皮細胞シートを得る、ことを含む粘膜上皮細胞
シートの作製方法であることを特徴としている。本発明
のある態様では、上記粘膜上皮細胞シートの作製方法
は、前記口腔内縁粘膜上皮細胞は、抜歯の際に歯に付着
したまま歯肉から分離されたものであることを特徴とし
ている。また、本発明の他の態様では、上記粘膜上皮細
胞シートの作製方法は、前記支持細胞と前記口腔内縁粘
膜上皮細胞との同時培養の前に、薬剤又は放射線照射に
より前記支持細胞の分裂能を消失させることを含むこと
を特徴としている。
方法は、口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着し、歯肉
溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、複数の層
を形成することによって構成された粘膜上皮細胞シート
の作製方法であって、前記口腔内縁粘膜上皮細胞と、該
口腔内縁粘膜上皮細胞の成育を支持する支持細胞とを得
て、複数層の前記口腔内縁粘膜上皮細胞で構成された粘
膜上皮細胞シートを形成させるために、前記支持細胞の
存在下で前記口腔内縁粘膜上皮細胞を培養し、形成され
た粘膜上皮細胞シートを得る、ことを含む粘膜上皮細胞
シートの作製方法であることを特徴としている。本発明
のある態様では、上記粘膜上皮細胞シートの作製方法
は、前記口腔内縁粘膜上皮細胞は、抜歯の際に歯に付着
したまま歯肉から分離されたものであることを特徴とし
ている。また、本発明の他の態様では、上記粘膜上皮細
胞シートの作製方法は、前記支持細胞と前記口腔内縁粘
膜上皮細胞との同時培養の前に、薬剤又は放射線照射に
より前記支持細胞の分裂能を消失させることを含むこと
を特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の粘膜上皮細胞シートは、
複数層の口腔内縁粘膜上皮細胞から構成されている。口
腔内縁粘膜上皮細胞は、口腔粘膜上皮細胞の１種であ
る。図１及び図２に示されるように、口腔内縁粘膜上皮
細胞は、歯１０の下端部を支持する歯肉１２の一部であ
る内縁上皮細胞層１４を構成している。また、口腔内縁
粘膜上皮細胞は、歯１０のエナメル層１６表面に付着し
て、一般に歯周ポケットと呼ばれる歯肉溝１８を形成し
ている。本明細書では、この口腔内縁粘膜上皮細胞は、
便宜上、生体内での解剖学的な位置で特定される細胞群
を意味する。図２に示されるように、歯肉１２の上端で
は、内縁上皮細胞層１４が、口腔粘膜細胞層２０に連続
しており、歯肉１２の内部には、結合組織部２２が配置
されている。口腔粘膜細胞層２０は、口腔内縁粘膜上皮
細胞と異なる口腔粘膜上皮細胞で構成されている。
複数層の口腔内縁粘膜上皮細胞から構成されている。口
腔内縁粘膜上皮細胞は、口腔粘膜上皮細胞の１種であ
る。図１及び図２に示されるように、口腔内縁粘膜上皮
細胞は、歯１０の下端部を支持する歯肉１２の一部であ
る内縁上皮細胞層１４を構成している。また、口腔内縁
粘膜上皮細胞は、歯１０のエナメル層１６表面に付着し
て、一般に歯周ポケットと呼ばれる歯肉溝１８を形成し
ている。本明細書では、この口腔内縁粘膜上皮細胞は、
便宜上、生体内での解剖学的な位置で特定される細胞群
を意味する。図２に示されるように、歯肉１２の上端で
は、内縁上皮細胞層１４が、口腔粘膜細胞層２０に連続
しており、歯肉１２の内部には、結合組織部２２が配置
されている。口腔粘膜細胞層２０は、口腔内縁粘膜上皮
細胞と異なる口腔粘膜上皮細胞で構成されている。
【０００９】本発明者は、この口腔内縁粘膜上皮細胞
が、歯肉１２の外側側面及び口腔内の他の部位に配置さ
れている口腔粘膜上皮細胞と異なる性質を有することを
見出した。
が、歯肉１２の外側側面及び口腔内の他の部位に配置さ
れている口腔粘膜上皮細胞と異なる性質を有することを
見出した。
【００１０】すなわち、一般に、歯肉溝１８には、歯垢
が溜まりやすく、細菌が繁殖しやすいため、同様の粘膜
上皮細胞であっても、口腔内縁上皮細胞層１４では、常
に細菌による感染の危険性に晒されており、口腔内縁粘
膜上皮細胞は、このような環境に対応できるように特殊
化したと思われる。
が溜まりやすく、細菌が繁殖しやすいため、同様の粘膜
上皮細胞であっても、口腔内縁上皮細胞層１４では、常
に細菌による感染の危険性に晒されており、口腔内縁粘
膜上皮細胞は、このような環境に対応できるように特殊
化したと思われる。
【００１１】特に、口腔内縁上皮細胞は、他の部位の口
腔粘膜上皮細胞に比べて分裂能が非常に高いことが見出
された。これは、細菌の感染や損傷に対抗するためのも
のであると思われる。また、他の部位の口腔粘膜上皮細
胞に比べて抗原性が低いことも見出された。すなわち、
口腔内縁粘膜上皮細胞は、拒絶反応が口腔粘膜上皮細胞
に比べて起こりにくいという利点を有している。
腔粘膜上皮細胞に比べて分裂能が非常に高いことが見出
された。これは、細菌の感染や損傷に対抗するためのも
のであると思われる。また、他の部位の口腔粘膜上皮細
胞に比べて抗原性が低いことも見出された。すなわち、
口腔内縁粘膜上皮細胞は、拒絶反応が口腔粘膜上皮細胞
に比べて起こりにくいという利点を有している。
【００１２】従って、本発明の粘膜上皮細胞シートは、
上述したような口腔内縁粘膜上皮細胞の特性をそのまま
備えたものであり、従来の口腔粘膜上皮細胞シートより
も、高い分裂能と低い抗原性、すなわち短期間での調製
と長期間の生着を実現するものである。
上述したような口腔内縁粘膜上皮細胞の特性をそのまま
備えたものであり、従来の口腔粘膜上皮細胞シートより
も、高い分裂能と低い抗原性、すなわち短期間での調製
と長期間の生着を実現するものである。
【００１３】この口腔内縁上皮細胞から構成された内縁
上皮細胞層１４は、生体では図１に示したように、歯肉
１２の口腔粘膜細胞層２０に連続して、歯肉１２の上端
で内縁へ陥入し、歯１０側の面で歯１０のエナメル層１
６に付着しているので、内縁粘膜上皮細胞は、内縁上皮
細胞層１４を歯肉溝１８の上端で口腔粘膜細胞層２０か
ら分離させると共にエナメル層１６から脱離させること
によって、容易に単離することができる。
上皮細胞層１４は、生体では図１に示したように、歯肉
１２の口腔粘膜細胞層２０に連続して、歯肉１２の上端
で内縁へ陥入し、歯１０側の面で歯１０のエナメル層１
６に付着しているので、内縁粘膜上皮細胞は、内縁上皮
細胞層１４を歯肉溝１８の上端で口腔粘膜細胞層２０か
ら分離させると共にエナメル層１６から脱離させること
によって、容易に単離することができる。
【００１４】口腔内縁粘膜上皮細胞を口腔粘膜細胞層２
０から分離する方法は、通常の切除などで行うことがで
きるが、エナメル層１６との付着の程度が口腔粘膜細胞
層２０及び結合組織との連続性よりも強いため、歯１０
を抜歯する際にエナメル層１６に付着した状態で口腔粘
膜細胞層２０及び結合組織部２２より分離することがで
きる。従って、抜歯された歯１０から容易に回収するこ
とができる。多くの場合、抜歯は歯１０における異常／
問題が原因で行われるため、歯１０に付着して回収され
る口腔内縁粘膜上皮細胞自体は、細胞の有する特性をそ
のまま保持している。このため、このような口腔内縁粘
膜上皮細胞を使用することが有利である。
０から分離する方法は、通常の切除などで行うことがで
きるが、エナメル層１６との付着の程度が口腔粘膜細胞
層２０及び結合組織との連続性よりも強いため、歯１０
を抜歯する際にエナメル層１６に付着した状態で口腔粘
膜細胞層２０及び結合組織部２２より分離することがで
きる。従って、抜歯された歯１０から容易に回収するこ
とができる。多くの場合、抜歯は歯１０における異常／
問題が原因で行われるため、歯１０に付着して回収され
る口腔内縁粘膜上皮細胞自体は、細胞の有する特性をそ
のまま保持している。このため、このような口腔内縁粘
膜上皮細胞を使用することが有利である。
【００１５】回収された内縁粘膜上皮細胞に、例えば結
合組織やデブリスなどが含まれている場合には、適当な
酵素、例えばディスパーゼ、トリプシンなどや、ナイロ
ンメッシュなどを用いて除去することができる。
合組織やデブリスなどが含まれている場合には、適当な
酵素、例えばディスパーゼ、トリプシンなどや、ナイロ
ンメッシュなどを用いて除去することができる。
【００１６】本発明の粘膜上皮細胞シートは、口腔内縁
粘膜上皮細胞の性質を有するものであり、口腔内縁粘膜
上皮細胞の構造的特徴も保持している。例えば、口腔内
縁粘膜上皮細胞は、他の部位の口腔粘膜上皮細胞よりも
広い細胞間隙を有することが知られている。このため、
拡大された細胞間隙に基づいて、本発明の粘膜上皮細胞
シートを容易に特定することができる。また、このよう
な特徴以外の形態は、他の粘膜細胞シートと同様であ
り、粘膜細胞シートを移植できる部位に違和感なく移植
できる。
粘膜上皮細胞の性質を有するものであり、口腔内縁粘膜
上皮細胞の構造的特徴も保持している。例えば、口腔内
縁粘膜上皮細胞は、他の部位の口腔粘膜上皮細胞よりも
広い細胞間隙を有することが知られている。このため、
拡大された細胞間隙に基づいて、本発明の粘膜上皮細胞
シートを容易に特定することができる。また、このよう
な特徴以外の形態は、他の粘膜細胞シートと同様であ
り、粘膜細胞シートを移植できる部位に違和感なく移植
できる。
【００１７】本発明の粘膜上皮細胞シートは、支持細胞
との同時培養により作製される。支持細胞には、例えば
線維芽細胞、例えばマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、３Ｔ３Ｊ
２、スイス３Ｔ３が含まれ、形成される粘膜上皮細胞シ
ートの厚みや増殖速度の観点から、３Ｔ３Ｊ２細胞が好
ましい。
との同時培養により作製される。支持細胞には、例えば
線維芽細胞、例えばマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、３Ｔ３Ｊ
２、スイス３Ｔ３が含まれ、形成される粘膜上皮細胞シ
ートの厚みや増殖速度の観点から、３Ｔ３Ｊ２細胞が好
ましい。
【００１８】支持細胞は、口腔内縁粘膜上皮細胞の成育
を干渉しないように増殖能の消失処理が施されることが
好ましい。増殖能の消失は、当技術分野において周知の
方法、例えば、マイトマイシンＣによる処理や放射線照
射によって行うことができる。また、培養は、プラスチ
ックディッシュのような通常の細胞培養容器を用いて行
う。
を干渉しないように増殖能の消失処理が施されることが
好ましい。増殖能の消失は、当技術分野において周知の
方法、例えば、マイトマイシンＣによる処理や放射線照
射によって行うことができる。また、培養は、プラスチ
ックディッシュのような通常の細胞培養容器を用いて行
う。
【００１９】口腔内縁粘膜上皮細胞の増殖は、支持細胞
の存在下において行われる。３Ｔ３などの支持細胞は、
口腔内縁粘膜上皮細胞よりも先に層を形成するため、口
腔内縁粘膜上皮細胞と同時に播種しても口腔内縁粘膜上
皮細胞は、支持細胞上で成育する。このため、口腔内縁
粘膜上皮細胞は、増殖時に支持細胞が存在していればよ
く、支持細胞と同時に播種してもよく、支持細胞が層を
形成してからその上に播種してもよい。
の存在下において行われる。３Ｔ３などの支持細胞は、
口腔内縁粘膜上皮細胞よりも先に層を形成するため、口
腔内縁粘膜上皮細胞と同時に播種しても口腔内縁粘膜上
皮細胞は、支持細胞上で成育する。このため、口腔内縁
粘膜上皮細胞は、増殖時に支持細胞が存在していればよ
く、支持細胞と同時に播種してもよく、支持細胞が層を
形成してからその上に播種してもよい。
【００２０】口腔内縁粘膜上皮細胞は、１×１０４個／
ｃｍ２以上の細胞密度で播種することができ、一方、支
持細胞は１×１０個／ｃｍ２〜１×１０３個／ｃｍ２以
上で播種することができる。支持細胞が、これよりも少
ないと支持細胞としての役割を十分に果たすことができ
ず、またこれよりも多いと口腔内縁粘膜上皮細胞の増殖
の妨げとなるため好ましくない。また、口腔内縁粘膜上
皮細胞が、この範囲よりも少ない又は多いと効率よく増
殖することができないため、好ましくない。
ｃｍ２以上の細胞密度で播種することができ、一方、支
持細胞は１×１０個／ｃｍ２〜１×１０３個／ｃｍ２以
上で播種することができる。支持細胞が、これよりも少
ないと支持細胞としての役割を十分に果たすことができ
ず、またこれよりも多いと口腔内縁粘膜上皮細胞の増殖
の妨げとなるため好ましくない。また、口腔内縁粘膜上
皮細胞が、この範囲よりも少ない又は多いと効率よく増
殖することができないため、好ましくない。
【００２１】本発明において、口腔内縁粘膜上皮細胞を
支持細胞上で成育させるために成育培地が用いられる。
この目的に用いられる成育培地には、当業界で既知の種
々の培地から選択することができる。成育培地中での培
養によって、口腔内縁粘膜上皮細胞は容易に複数層を形
成する。一方、支持細胞は、粘膜上皮細胞の成育を支持
するのみで死滅し、粘膜上皮細胞が複数層を形成したと
きには、もはや存在しない。
支持細胞上で成育させるために成育培地が用いられる。
この目的に用いられる成育培地には、当業界で既知の種
々の培地から選択することができる。成育培地中での培
養によって、口腔内縁粘膜上皮細胞は容易に複数層を形
成する。一方、支持細胞は、粘膜上皮細胞の成育を支持
するのみで死滅し、粘膜上皮細胞が複数層を形成したと
きには、もはや存在しない。
【００２２】成育培地には、シート形成能がある上皮シ
ート形成培地（ＥＦＭ）を用いることが好ましい。ＥＦ
Ｍは、通常、表皮細胞を層状に成育させるために用いら
れている培地であり、ＤＭＥＭとハムＦ−１２培地の
３：１混合液で構成され、５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌの
インシュリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２×
10−９Ｍのトリヨードサイロニン、１×10−９Ｍのコレ
ラ毒素、０.４μｇ／ｍｌのハイドロコルチゾン、１０
０Ｕ／ｍｌのペニシリン、０.１μｇ／ｍｌのカナマイ
シン、０.２５μｇ／ｍｌのアンホテリチンＢ及び１０
ｎｇ／ｍｌのヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子（Ｅ
ＧＦ）が補充されている。
ート形成培地（ＥＦＭ）を用いることが好ましい。ＥＦ
Ｍは、通常、表皮細胞を層状に成育させるために用いら
れている培地であり、ＤＭＥＭとハムＦ−１２培地の
３：１混合液で構成され、５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌの
インシュリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２×
10−９Ｍのトリヨードサイロニン、１×10−９Ｍのコレ
ラ毒素、０.４μｇ／ｍｌのハイドロコルチゾン、１０
０Ｕ／ｍｌのペニシリン、０.１μｇ／ｍｌのカナマイ
シン、０.２５μｇ／ｍｌのアンホテリチンＢ及び１０
ｎｇ／ｍｌのヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子（Ｅ
ＧＦ）が補充されている。
【００２３】複数層化した口腔内縁粘膜上皮細胞は、層
構成を維持したまま培養容器から分離される。この分離
は、当業界において既知の方法によって行うことがで
き、例えばディスパーゼなどの適当な酵素を用いて基底
層の接着を阻害することにより容易に行うことができ
る。
構成を維持したまま培養容器から分離される。この分離
は、当業界において既知の方法によって行うことがで
き、例えばディスパーゼなどの適当な酵素を用いて基底
層の接着を阻害することにより容易に行うことができ
る。
【００２４】得られた粘膜上皮細胞シートは、当分野に
おいて既知の方法により、生体へ移植される。本発明の
粘膜上皮細胞シートは、複数層の口腔内縁粘膜上皮細胞
で構成されているので、例えばそのまま移植片として移
植部位に移植することができる。また、本発明の粘膜上
皮細胞シートは、口腔内、皮膚下など湿潤環境下にも移
植することにも適しているが、外界に接している表皮上
にも移植することができる。移植は、口腔内縁粘膜上皮
細胞シートに適合した既知の方法をそのまま適用して実
施することができる。
おいて既知の方法により、生体へ移植される。本発明の
粘膜上皮細胞シートは、複数層の口腔内縁粘膜上皮細胞
で構成されているので、例えばそのまま移植片として移
植部位に移植することができる。また、本発明の粘膜上
皮細胞シートは、口腔内、皮膚下など湿潤環境下にも移
植することにも適しているが、外界に接している表皮上
にも移植することができる。移植は、口腔内縁粘膜上皮
細胞シートに適合した既知の方法をそのまま適用して実
施することができる。
【００２５】
【実施例】１．口腔内縁粘膜上皮細胞の回収 口腔内縁粘膜上皮細胞は、親知らずの抜歯を目的として
病院に来た患者の了解を得て、抜歯処理後の歯から回収
された。口腔内縁粘膜上皮層は、抜歯の際に、歯肉の上
端部分で引きちぎられており、これにより、他の部位の
口腔粘膜上皮細胞から分離されていた。抜歯はできるだ
け無菌的に行い、抜歯された歯に付着している口腔内縁
粘膜上皮層を、丁寧に歯のエナメルセメント移行部より
分離した。
病院に来た患者の了解を得て、抜歯処理後の歯から回収
された。口腔内縁粘膜上皮層は、抜歯の際に、歯肉の上
端部分で引きちぎられており、これにより、他の部位の
口腔粘膜上皮細胞から分離されていた。抜歯はできるだ
け無菌的に行い、抜歯された歯に付着している口腔内縁
粘膜上皮層を、丁寧に歯のエナメルセメント移行部より
分離した。
【００２６】口腔内縁粘膜上皮層を、１０００Ｕ／ｍｌ
のペニシリン(Sigma, St.Louis, MO)、１ｍｇ／ｍｌの
カナマイシン及び２.５μｇのアンホテリシンＢ(Gibco,
Gland Island,NY)を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
で、３０分間３７℃で２回浸漬した。組織をそれから１
０００ＰＵ／ｍｌのディスパーゼ（登録商標)(合同酒精
株式会社製）を含有するダルベッコ改変最小必須培地
（ＤＭＥＭ）に１６時間４℃で浸漬し、その後、３０分
間室温で０.２５％トリプシン(Gibco, Gland Island,N
Y)で処理して、細胞を分離させた。酵素活性は、１０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）(Hyclone, UT)を含有するＤＭ
ＥＭで洗浄することにより停止させた。その後、１０％
ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで３０分間攪拌してから、５
０μｍのナイロンガーゼでデブリスをろ過して、口腔内
縁粘膜上皮細胞を単離した。
のペニシリン(Sigma, St.Louis, MO)、１ｍｇ／ｍｌの
カナマイシン及び２.５μｇのアンホテリシンＢ(Gibco,
Gland Island,NY)を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）
で、３０分間３７℃で２回浸漬した。組織をそれから１
０００ＰＵ／ｍｌのディスパーゼ（登録商標)(合同酒精
株式会社製）を含有するダルベッコ改変最小必須培地
（ＤＭＥＭ）に１６時間４℃で浸漬し、その後、３０分
間室温で０.２５％トリプシン(Gibco, Gland Island,N
Y)で処理して、細胞を分離させた。酵素活性は、１０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）(Hyclone, UT)を含有するＤＭ
ＥＭで洗浄することにより停止させた。その後、１０％
ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで３０分間攪拌してから、５
０μｍのナイロンガーゼでデブリスをろ過して、口腔内
縁粘膜上皮細胞を単離した。
【００２７】２．口腔内縁粘膜上皮細胞の特性 （１）シート形成能 口腔内縁粘膜上皮細胞の増殖活性を確認するために、上
述の口腔内縁粘膜上皮細胞（以下、内縁上皮細胞とす
る）と、口腔内の他の部位の粘膜上皮細胞（以下、口腔
上皮細胞とする）と、表皮細胞とのコロニー形成能及び
増殖速度を測定した。口腔上皮細胞は、ヒトの口腔内の
歯槽歯肉堤粘膜から単離した。また表皮細胞は、ヒトの
腹部の皮膚から単離した。
述の口腔内縁粘膜上皮細胞（以下、内縁上皮細胞とす
る）と、口腔内の他の部位の粘膜上皮細胞（以下、口腔
上皮細胞とする）と、表皮細胞とのコロニー形成能及び
増殖速度を測定した。口腔上皮細胞は、ヒトの口腔内の
歯槽歯肉堤粘膜から単離した。また表皮細胞は、ヒトの
腹部の皮膚から単離した。
【００２８】コロニー形成能アッセイは、既知の方法に
より行った。簡単に説明すれば、以下の通りである。２
５ｃｍ２のＴ型フラスコ（Nunc社製）に、内縁上皮細
胞、口腔上皮細胞及び表皮細胞をそれぞれ１×１０３個
ずつ播種し、培養５日後に、メチレンブルー（SIGMA社
製）で染色した。コロニーの数は、染色のものを肉眼で
計測した。結果を図３に示す。
より行った。簡単に説明すれば、以下の通りである。２
５ｃｍ２のＴ型フラスコ（Nunc社製）に、内縁上皮細
胞、口腔上皮細胞及び表皮細胞をそれぞれ１×１０３個
ずつ播種し、培養５日後に、メチレンブルー（SIGMA社
製）で染色した。コロニーの数は、染色のものを肉眼で
計測した。結果を図３に示す。
【００２９】増殖速度は、細胞数による計測方法と、Ｍ
ＴＴアッセイにより行った。細胞数による計測方法は、
ヘモサイトメーターを用いて、細胞数を直接計測した。
ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチ
オゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリ
ウムブロマイド）（SIGMA社製）の色素変化を利用した
方法である。ＭＴＴは、帯黄色の化合物であるが、生細
胞の活動性ミトコンドリアにより分解されて、暗青色の
フォルマザン化合物を生じる。このため、この色素によ
り生きた細胞のみを染色し、相対的な細胞量を簡便に計
測した。結果をそれぞれ図４及び図５に示す。
ＴＴアッセイにより行った。細胞数による計測方法は、
ヘモサイトメーターを用いて、細胞数を直接計測した。
ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチ
オゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリ
ウムブロマイド）（SIGMA社製）の色素変化を利用した
方法である。ＭＴＴは、帯黄色の化合物であるが、生細
胞の活動性ミトコンドリアにより分解されて、暗青色の
フォルマザン化合物を生じる。このため、この色素によ
り生きた細胞のみを染色し、相対的な細胞量を簡便に計
測した。結果をそれぞれ図４及び図５に示す。
【００３０】コロニー形成能は、細胞の有する増殖ポテ
ンシャルを示すものである。図３に示されるように、内
縁上皮細胞のコロニー形成能は、表皮細胞の約２倍であ
り、口腔上皮細胞に対しても有意に高いことが示され
た。また、内縁上皮細胞の増殖速度は、表皮細胞及び口
腔上皮細胞よりも速いことが示された（図４及び図５参
照）。
ンシャルを示すものである。図３に示されるように、内
縁上皮細胞のコロニー形成能は、表皮細胞の約２倍であ
り、口腔上皮細胞に対しても有意に高いことが示され
た。また、内縁上皮細胞の増殖速度は、表皮細胞及び口
腔上皮細胞よりも速いことが示された（図４及び図５参
照）。
【００３１】これらの結果から、内縁上皮細胞は、高い
増殖能を有するという特徴を持ち、口腔上皮細胞とは明
らかに異なる細胞群であり、細胞シートの形成をする場
合、より迅速にシートを形成できる、すなわちシート形
成能が高いことが示唆される。
増殖能を有するという特徴を持ち、口腔上皮細胞とは明
らかに異なる細胞群であり、細胞シートの形成をする場
合、より迅速にシートを形成できる、すなわちシート形
成能が高いことが示唆される。
【００３２】（２）抗原性 次に、口腔内縁粘膜上皮細胞シートの抗原性について調
べた。抗原性は、内縁上皮細胞と口腔上皮細胞の双方に
おけるＩＡ抗原及びＴｈｙ−１抗原の発現のアッセイに
より測定した。アッセイ方法は、以下の通りである。
べた。抗原性は、内縁上皮細胞と口腔上皮細胞の双方に
おけるＩＡ抗原及びＴｈｙ−１抗原の発現のアッセイに
より測定した。アッセイ方法は、以下の通りである。
【００３３】上述した方法にしたがって、５−６週齢の
雄のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＡ＝ｄ、日本エス・エル
・シー、浜松）から内縁上皮細胞及び表皮細胞を得た。
また、同様にして、同週齢の雄マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
ｎ、ＩＡ＝ｋ）から口腔上皮細胞及び表皮細胞を得た。
単離されたＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞に抗ＩＡｄ抗体
（Ceclarlane社製）を、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎマウス細胞に抗
ＩＡｋ抗体（Becton Dickinson社製）を、それぞれ１／
２５の濃度で加え、４℃６０分インキュベートしてか
ら、次いでラビット補体を加えて３７℃６０分間培養し
た。培養開始前、培養３,５,７日目に、それぞれ細胞を
回収し、ＦＩＴＣ結合抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体（Becton
Dickinson社製）を１／３００の濃度で加えて４℃４５
分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で観察した。次
いで、ＩＡ抗原陽性細胞及びＴｈｙ−１抗原陽性細胞
（樹状細胞）の数を、フローサイトメトリーを用いて測
定した。結果を図６に示す。
雄のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＡ＝ｄ、日本エス・エル
・シー、浜松）から内縁上皮細胞及び表皮細胞を得た。
また、同様にして、同週齢の雄マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ
ｎ、ＩＡ＝ｋ）から口腔上皮細胞及び表皮細胞を得た。
単離されたＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞に抗ＩＡｄ抗体
（Ceclarlane社製）を、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎマウス細胞に抗
ＩＡｋ抗体（Becton Dickinson社製）を、それぞれ１／
２５の濃度で加え、４℃６０分インキュベートしてか
ら、次いでラビット補体を加えて３７℃６０分間培養し
た。培養開始前、培養３,５,７日目に、それぞれ細胞を
回収し、ＦＩＴＣ結合抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体（Becton
Dickinson社製）を１／３００の濃度で加えて４℃４５
分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で観察した。次
いで、ＩＡ抗原陽性細胞及びＴｈｙ−１抗原陽性細胞
（樹状細胞）の数を、フローサイトメトリーを用いて測
定した。結果を図６に示す。
【００３４】図６に示されるように、内縁上皮細胞にお
けるＴｈｙ−１抗原及びＩＡ抗原の発現は、共に培養期
間の経過に従って低下していた。このＩＡ抗原は、内縁
上皮細胞中の免疫担当細胞、ランゲルハンス細胞上に発
現されていると思われる。内縁上皮細胞では、このよう
に、細胞抗原となるＩＡ抗原及びＴｈｙ−１抗原の発現
が共に経時的低下していることから、培養期間の経過と
共に免疫応答が弱くなることが示唆された。
けるＴｈｙ−１抗原及びＩＡ抗原の発現は、共に培養期
間の経過に従って低下していた。このＩＡ抗原は、内縁
上皮細胞中の免疫担当細胞、ランゲルハンス細胞上に発
現されていると思われる。内縁上皮細胞では、このよう
に、細胞抗原となるＩＡ抗原及びＴｈｙ−１抗原の発現
が共に経時的低下していることから、培養期間の経過と
共に免疫応答が弱くなることが示唆された。
【００３５】一方、口腔上皮細胞におけるＴｈｙ−１抗
原の発現は、ＩＡ抗原の発現とは異なり、培養期間が経
過しても低下しないことが示された。このため、口腔上
皮細胞は、内縁上皮細胞よりも細胞抗原量の低下が認め
られず、培養期間が経過しても内縁上皮細胞ほど、免疫
応答の縮小化が認められないことが示唆される。
原の発現は、ＩＡ抗原の発現とは異なり、培養期間が経
過しても低下しないことが示された。このため、口腔上
皮細胞は、内縁上皮細胞よりも細胞抗原量の低下が認め
られず、培養期間が経過しても内縁上皮細胞ほど、免疫
応答の縮小化が認められないことが示唆される。
【００３６】これらのことから、内縁上皮細胞は、抗原
性が低いという特徴を有することで口腔上皮細胞とは異
なる細胞群であり、移植させても拒絶反応が起こりにく
い細胞シートを形成できることが示唆された。
性が低いという特徴を有することで口腔上皮細胞とは異
なる細胞群であり、移植させても拒絶反応が起こりにく
い細胞シートを形成できることが示唆された。
【００３７】３．粘膜上皮細胞シートの形成 （１）支持細胞の調製 支持細胞としての３Ｔ３−Ｊ２細胞を、血清を含有しな
いＤＭＥＭ中４μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（協和醗
酵、東京）で処理した。２時間後に、ＰＢＳ（−）で数
回リンスしてマイトマイシンＣを除去し、トリプシン処
理した後、１×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で播種でき
るように、細胞懸濁液を調製した。
いＤＭＥＭ中４μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（協和醗
酵、東京）で処理した。２時間後に、ＰＢＳ（−）で数
回リンスしてマイトマイシンＣを除去し、トリプシン処
理した後、１×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で播種でき
るように、細胞懸濁液を調製した。
【００３８】（２）シートの形成 １×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で播種できるように調
整された口腔内縁粘膜上皮細胞の懸濁液と、１×１０４
個／ｃｍ２の細胞密度で播種できるように調整された支
持細胞の懸濁液とを、３５ｍｍディッシュに１ｍｌずつ
添加して、ＥＦＭ培地中で培養した。２−３日毎に培地
を、新鮮な上記ＥＦＭ選択培地と交換した。支持細胞上
に播種して培養した口腔内縁粘膜上皮細胞は、支持細胞
上での約１０日ほどの培養により、使用可能な粘膜細胞
シートとして十分な厚さ（３〜５層、１００μｍ程度）
になった。一方、支持細胞は、増殖能が消失しているの
で、口腔内縁粘膜上皮細胞の培養期間中で死滅し、粘膜
上皮細胞シートが形成されるときには、培養系から除去
されていた。形成された粘膜上皮細胞シートは、口腔内
縁粘膜上皮細胞から構成されており、この粘膜上皮細胞
シートを使用する際には、上皮細胞シートを、ディスパ
ーゼ（４００ＰＵ／ｍｌ）でディッシュから剥離し、Ｐ
ＢＳで２回洗浄した。
整された口腔内縁粘膜上皮細胞の懸濁液と、１×１０４
個／ｃｍ２の細胞密度で播種できるように調整された支
持細胞の懸濁液とを、３５ｍｍディッシュに１ｍｌずつ
添加して、ＥＦＭ培地中で培養した。２−３日毎に培地
を、新鮮な上記ＥＦＭ選択培地と交換した。支持細胞上
に播種して培養した口腔内縁粘膜上皮細胞は、支持細胞
上での約１０日ほどの培養により、使用可能な粘膜細胞
シートとして十分な厚さ（３〜５層、１００μｍ程度）
になった。一方、支持細胞は、増殖能が消失しているの
で、口腔内縁粘膜上皮細胞の培養期間中で死滅し、粘膜
上皮細胞シートが形成されるときには、培養系から除去
されていた。形成された粘膜上皮細胞シートは、口腔内
縁粘膜上皮細胞から構成されており、この粘膜上皮細胞
シートを使用する際には、上皮細胞シートを、ディスパ
ーゼ（４００ＰＵ／ｍｌ）でディッシュから剥離し、Ｐ
ＢＳで２回洗浄した。
【００３９】４．粘膜上皮細胞シートの性質 （１）粘膜上皮細胞シートの形成能 上述のようにして形成された内縁上皮細胞の粘膜上皮細
胞シートは、約１０日の培養により、移植片として使用
可能な状態になることができた。これに対して、口腔上
皮細胞シートは、約２週間程度の培養時間を必要とす
る。このことから、内縁上皮細胞シートは、口腔上皮細
胞シートよりも早期に使用可能な移植片であることが示
された。
胞シートは、約１０日の培養により、移植片として使用
可能な状態になることができた。これに対して、口腔上
皮細胞シートは、約２週間程度の培養時間を必要とす
る。このことから、内縁上皮細胞シートは、口腔上皮細
胞シートよりも早期に使用可能な移植片であることが示
された。
【００４０】（２）粘膜上皮細胞シートの形態的特性 次に、内縁上皮細胞と粘膜上皮細胞との細胞シートにお
ける形態的な相違を調べるために、電子顕微鏡により観
察した。内縁上皮細胞シート及び粘膜上皮細胞シート
と、表皮細胞シートとを、それぞれ上述したようにして
形成し、カルノフスキ固定液で２時間固定し、薄切後、
透過型電子顕微鏡にて撮影した。結果を図７（Ａ）、図
７（Ｂ）及び図７（Ｃ）に示す。図７（Ａ）に示される
ように、内縁上皮細胞から構成された粘膜上皮細胞シー
トは、表皮細胞シート（図７（Ｃ）とは異なる形態を示
しており、更に、口腔上皮細胞から構成された粘膜上皮
細胞シート（図７（Ｂ)）と比較して、内縁上皮細胞か
ら構成された粘膜上皮細胞シートの方が細胞間隙が広い
ことが示された。
ける形態的な相違を調べるために、電子顕微鏡により観
察した。内縁上皮細胞シート及び粘膜上皮細胞シート
と、表皮細胞シートとを、それぞれ上述したようにして
形成し、カルノフスキ固定液で２時間固定し、薄切後、
透過型電子顕微鏡にて撮影した。結果を図７（Ａ）、図
７（Ｂ）及び図７（Ｃ）に示す。図７（Ａ）に示される
ように、内縁上皮細胞から構成された粘膜上皮細胞シー
トは、表皮細胞シート（図７（Ｃ）とは異なる形態を示
しており、更に、口腔上皮細胞から構成された粘膜上皮
細胞シート（図７（Ｂ)）と比較して、内縁上皮細胞か
ら構成された粘膜上皮細胞シートの方が細胞間隙が広い
ことが示された。
【００４１】このような広い細胞間隙は、内縁上皮細胞
の特有の性質であり、内縁上皮細胞から構成された粘膜
上皮細胞シートにも保持されていることが示された。ま
た、このような形態的な特性に基づいて、内縁上皮細胞
から構成された粘膜上皮細胞シートを特定できることも
確認された。
の特有の性質であり、内縁上皮細胞から構成された粘膜
上皮細胞シートにも保持されていることが示された。ま
た、このような形態的な特性に基づいて、内縁上皮細胞
から構成された粘膜上皮細胞シートを特定できることも
確認された。
【００４２】（３）粘膜上皮細胞シートの抗原性 粘膜上皮細胞シートの抗原性を調べるために、マウスの
細胞を用いて生着アッセイを行った。上述した方法と同
様の方法により、内縁上皮細胞、口腔上皮細胞及び表皮
細胞を採取して、所定期間の培養により重層化させた。
それぞれの細胞が重層化したら、ディスパーゼ（４００
ＰＵ／ｍｌ）で剥離し、ＰＢＳで２回洗浄することによ
って、移植片としてのそれぞれの細胞シートを用意し
た。それぞれの細胞シートは、ベントバルビタール０.
０４ｍｇ／ｇの腹腔内投与による全身麻酔下のヌードマ
ウス（５−６週齢、雄、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｃ／ｎｃ）(日
本エスエルシー株式会社、浜松）に移植した。
細胞を用いて生着アッセイを行った。上述した方法と同
様の方法により、内縁上皮細胞、口腔上皮細胞及び表皮
細胞を採取して、所定期間の培養により重層化させた。
それぞれの細胞が重層化したら、ディスパーゼ（４００
ＰＵ／ｍｌ）で剥離し、ＰＢＳで２回洗浄することによ
って、移植片としてのそれぞれの細胞シートを用意し
た。それぞれの細胞シートは、ベントバルビタール０.
０４ｍｇ／ｇの腹腔内投与による全身麻酔下のヌードマ
ウス（５−６週齢、雄、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｃ／ｎｃ）(日
本エスエルシー株式会社、浜松）に移植した。
【００４３】移植方法は、Barrandonらの方法(Barrando
nら、J.Invest.Dermatol.,(1998) 91,315-318)及び杉村
らの方法(杉村ら、J.cranio-maxillofac Surg.,(1997)2
4,352-359)に基づいて行った。すなわち、マウス背部を
１０％ヒビテンアルコールで十分に消毒した後、３０×
３０ｍｍの矩形の皮弁を作製し、筋層を露出させた。露
出したマウス筋層の全面に、滅菌したシリコーン膜を載
置して、皮弁と筋層とを隔離した。次に作製したそれぞ
れの細胞シートを、移植キャリアとしての滅菌したシリ
コーン膜に配置し、シートの細胞が皮弁内側と接するよ
うにシリコーン膜上に移植した。それから、移植した粘
膜上皮細胞シート及びシリコーン膜を覆うように皮弁を
戻し、５−ナイロン糸で縫合して移植を終了した。
nら、J.Invest.Dermatol.,(1998) 91,315-318)及び杉村
らの方法(杉村ら、J.cranio-maxillofac Surg.,(1997)2
4,352-359)に基づいて行った。すなわち、マウス背部を
１０％ヒビテンアルコールで十分に消毒した後、３０×
３０ｍｍの矩形の皮弁を作製し、筋層を露出させた。露
出したマウス筋層の全面に、滅菌したシリコーン膜を載
置して、皮弁と筋層とを隔離した。次に作製したそれぞ
れの細胞シートを、移植キャリアとしての滅菌したシリ
コーン膜に配置し、シートの細胞が皮弁内側と接するよ
うにシリコーン膜上に移植した。それから、移植した粘
膜上皮細胞シート及びシリコーン膜を覆うように皮弁を
戻し、５−ナイロン糸で縫合して移植を終了した。
【００４４】移植３日目より、３日毎に、皮弁を再挙上
し、それぞれの細胞シート移植部を肉眼的に観察した。
白化して剥離してきた細胞は、生着できずに死滅してい
ると判断した。生着率は、移植面に対する生着細胞の面
積の比率から算出した。結果を図８に示す。
し、それぞれの細胞シート移植部を肉眼的に観察した。
白化して剥離してきた細胞は、生着できずに死滅してい
ると判断した。生着率は、移植面に対する生着細胞の面
積の比率から算出した。結果を図８に示す。
【００４５】図８に示されるように、内縁粘膜上皮細胞
シートは、約２週間で生着率がわずかに低下するもの、
その後３週間を経過しても生着率を維持していた。これ
に対して、表皮細胞（△）は移植後約１０日でほぼ全て
の細胞が死滅した。また、口腔上皮細胞（■）は１２日
を経過した頃より生着率が低下し始め、約２週間を経過
すると共に全て死滅した。表皮細胞及び口腔上皮細胞の
移植片の死滅は、拒絶反応によるものと考えられる。内
縁粘膜上皮細胞の細胞シートの高い生着率の維持は、内
縁粘膜上皮細胞におけるＴｈｙ−１抗原の発現の低下
（図６参照）と関係があるものと考えられる。
シートは、約２週間で生着率がわずかに低下するもの、
その後３週間を経過しても生着率を維持していた。これ
に対して、表皮細胞（△）は移植後約１０日でほぼ全て
の細胞が死滅した。また、口腔上皮細胞（■）は１２日
を経過した頃より生着率が低下し始め、約２週間を経過
すると共に全て死滅した。表皮細胞及び口腔上皮細胞の
移植片の死滅は、拒絶反応によるものと考えられる。内
縁粘膜上皮細胞の細胞シートの高い生着率の維持は、内
縁粘膜上皮細胞におけるＴｈｙ−１抗原の発現の低下
（図６参照）と関係があるものと考えられる。
【００４６】以上にように、本発明の粘膜上皮細胞シー
トは、口腔内縁粘膜上皮細胞から形成されているので、
細胞から短時間で粘膜上皮細胞シートを調製することが
でき、また、得られた粘膜上皮細胞シートは長期にわた
って移植片として使用することができる。また、抜歯さ
れた歯に付着した口腔内縁粘膜上皮細胞から細胞シート
を形成するので、従来、生体廃棄物として廃棄されてい
た口腔内縁粘膜上皮細胞を有効利用することができる。
トは、口腔内縁粘膜上皮細胞から形成されているので、
細胞から短時間で粘膜上皮細胞シートを調製することが
でき、また、得られた粘膜上皮細胞シートは長期にわた
って移植片として使用することができる。また、抜歯さ
れた歯に付着した口腔内縁粘膜上皮細胞から細胞シート
を形成するので、従来、生体廃棄物として廃棄されてい
た口腔内縁粘膜上皮細胞を有効利用することができる。
【発明の効果】本発明により、より迅速に調製すること
ができると共に長期にわたり生着できる移植片を提供す
ることができる。また、本発明により、長期にわたり生
着できる移植片をより迅速に調製することができる。
ができると共に長期にわたり生着できる移植片を提供す
ることができる。また、本発明により、長期にわたり生
着できる移植片をより迅速に調製することができる。
【図１】 歯及び歯肉の断面図である。
【図２】 口腔内縁粘膜上皮細胞層の位置を示す図１の
部分拡大図である。
部分拡大図である。
【図３】 口腔内縁粘膜上皮細胞のコロニー形成能を示
したグラフである。
したグラフである。
【図４】 口腔内縁粘膜上皮細胞の増殖曲線を示すグラ
フである。
フである。
【図５】 口腔内縁粘膜上皮細胞の増殖アッセイを示し
たグラフである。
たグラフである。
【図６】 （Ａ）は口腔上皮細胞の抗原性を示したグラ
フ、（Ｂ）は口腔内縁粘膜上皮細胞の抗原性を示したグ
ラフである。
フ、（Ｂ）は口腔内縁粘膜上皮細胞の抗原性を示したグ
ラフである。
【図７】 （Ａ）は口腔内縁粘膜上皮細胞から構成され
た粘膜上皮細胞シートの電子顕微鏡写真、（Ｂ）は口腔
粘膜上皮細胞から構成された細胞シートの電子顕微鏡写
真、（Ｃ）は表皮細胞から構成された細胞シートの電子
顕微鏡写真である。
た粘膜上皮細胞シートの電子顕微鏡写真、（Ｂ）は口腔
粘膜上皮細胞から構成された細胞シートの電子顕微鏡写
真、（Ｃ）は表皮細胞から構成された細胞シートの電子
顕微鏡写真である。
【図８】 口腔内縁粘膜上皮細胞から形成された粘膜上
皮細胞シートの生着率を示すグラフである。
皮細胞シートの生着率を示すグラフである。
１０ 歯 １２ 歯肉 １４ 内縁上皮細胞層 １６ エナメル層 １８ 歯周溝 ２０ 口腔粘膜細胞層 ２２ 結合組織部
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平10−277143（ＪＰ，Ａ) 特表 平９−511637（ＪＰ，Ａ) Ｕｅｄａ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ ａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒ ｇｅｒｙ，1995，Ｖｏｌ．35，Ｎｏ. ５，ｐａｇｅｓ 498−504. Ｈａｔａ Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎ ａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒ ｇｅｒｙ，1995，Ｖｏｌ．34，Ｎｏ. ５，ｐａｇｅｓ 530−538. Ｕｅｄａ Ｍ．，Ｎａｇｏｙａ Ｊ. Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，1995，Ｖｏｌ．58, ｐａｇｅｓ 13−28. 各務秀明 他、組織培養工学、1998− ４−25、24巻、４号、138−142頁 畠賢一郎 他、医学のあゆみ、1998− 11−14、187巻、７号、685−688頁 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61L 27/00 C12N 5/06 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (5)
- 【請求項１】 口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着
し、歯肉溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、
複数の層を形成することによって構成された粘膜上皮細
胞シート。 - 【請求項２】 前記口腔内縁粘膜上皮細胞は、抜歯の際
に歯に付着して歯肉から分離されたものに由来する請求
項１に記載の粘膜上皮細胞シート。 - 【請求項３】 口腔粘膜上皮細胞に連続して歯に付着
し、歯肉溝の一部を形成する口腔内縁粘膜上皮細胞が、
複数の層を形成することによって構成された粘膜上皮細
胞シートの作製方法であって、 前記口腔内縁粘膜上皮細胞と、該口腔内縁粘膜上皮細胞
の成育を支持する支持細胞とを得て、 複数層の前記口腔内縁粘膜上皮細胞で構成された粘膜上
皮細胞シートを形成させるために、前記支持細胞の存在
下で前記口腔内縁粘膜上皮細胞を培養し、 形成された粘膜上皮細胞シートを得る、ことを含む粘膜
上皮細胞シートの作製方法。 - 【請求項４】 前記口腔内縁粘膜上皮細胞は、抜歯の際
に歯に付着したまま歯肉から分離されたものであること
を特徴とする請求項３に記載の口腔粘膜上皮細胞シート
の作製方法。 - 【請求項５】 前記支持細胞と前記口腔内縁粘膜上皮細
胞との同時培養の前に、薬剤又は放射線照射により前記
支持細胞の分裂能を消失させることを含む請求項３又は
４に記載の口腔粘膜上皮細胞シートの作製方法。
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|---|---|---|---|
| JP10336397A JP3043727B1 (ja) | 1998-11-26 | 1998-11-26 | 粘膜上皮細胞シート |
| PCT/JP1999/006517 WO2000030695A1 (fr) | 1998-11-26 | 1999-11-22 | Plaque de cellules epitheliales de muqueuse et son procede de production |
| AU11860/00A AU1186000A (en) | 1998-11-26 | 1999-11-22 | Mucosal epithelial cell sheet and method for producing the same |
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| JP10336397A JP3043727B1 (ja) | 1998-11-26 | 1998-11-26 | 粘膜上皮細胞シート |
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| JP10336397A Expired - Fee Related JP3043727B1 (ja) | 1998-11-26 | 1998-11-26 | 粘膜上皮細胞シート |
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-
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| Ｈａｔａ Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．５，ｐａｇｅｓ ５３０−５３８． |
| Ｕｅｄａ Ｍ．，Ｎａｇｏｙａ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，１９９５，Ｖｏｌ．５８，ｐａｇｅｓ １３−２８． |
| Ｕｅｄａ Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．５，ｐａｇｅｓ ４９８−５０４． |
| 各務秀明 他、組織培養工学、１９９８−４−２５、２４巻、４号、１３８−１４２頁 |
| 畠賢一郎 他、医学のあゆみ、１９９８−１１−１４、１８７巻、７号、６８５−６８８頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000030695A1 (fr) | 2000-06-02 |
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| AU1186000A (en) | 2000-06-13 |
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