JP3020930B1 - フェニルボロン酸基を含む高分子によりコーティングされた培養床を用いた、初代肝細胞のスフェロイド形成および長期培養を可能とする、培養方法、培養床およびコーティング剤 - Google Patents

Abstract

【要約】 【課題】 初代肝細胞のスフェロイド形成および長期培
養を可能とする技術を開発する。 【解決手段】 フェニルボロン酸基を含む高分子により
コーティングされた培養床を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、初代肝細胞のスフ
ェロイド形成および長期培養を可能とする、フェニルボ
ロン酸基を含有するモノマー、アミノ基を含有するモノ
マー、及び２ーヒドロキシエチルメタクリレートの共重
合体からなる高分子物質をコーティングしたシャーレを
用いた細胞培養方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】機能低下や障害を起こしている臓器に対
して、本来の機能発現を取り戻すための組織再生技術の
開発は、現在の臓器移植に代わる医療として重要な課題
である。例えば、肝臓は解毒作用や血清中のタンパク質
を合成するなどの機能を持つ大切な臓器であるが、肝機
能障害を起こした場合、その機能を再生することは容易
ではない。細胞培養のレベルで見た場合にも、従来、正
常細胞である初代肝細胞は継代培養が困難で、培養開始
５日目以降より機能低下を引き起こす。

【０００３】従って、初代肝細胞の機能を長期に維持し
ながら培養する技術の開発は、薬物の毒性評価を動物実
験に頼らず細胞レベルの初期のスクリーニング法により
行うことが可能となるばかりではなく、体外循環回路に
よる人工肝臓や体内での肝細胞組織構築化を実現する手
段として重要な領域となってきている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】組織を再生させる技術
としては、細胞外マトリックスや各種細胞の増殖因子な
どの生理活性物質を利用した組織再生技術が研究されて
いるが、人工臓器材料による細胞の組織構築の誘導も大
切な研究課題である。それは、人工材料の組成、分子量
などの制御が可能であるばかりでなく、大量生産などに
おいて容易で、有利であるからである。肝組織において
そのような課題を達成するためには、肝実質細胞の組織
構築と５日以上の長期培養を可能とする技術の確立が必
須となる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記で述べたように、初
代肝細胞の組織構築を誘導し、機能を維持させるための
環境を提供できる人工材料の開発は、再生医学において
大切な研究課題である。発明者らは、これまでにグルコ
ースのようなジオール化合物と結合する性質を持つフェ
ニルボロン酸基を高分子側鎖に導入し、細胞膜表面の糖
鎖と特異的に相互作用を起こす人工材料を目指して、こ
の材料上での血管内皮細胞の培養とその細胞の応答性に
ついて検討してきた。合成した人工材料はフェニルボロ
ン酸基と３級アミノ基を有し、この材料表面上で培養し
た血管内皮細胞が管腔形成を誘導することを見出した。

【０００６】そこで、肝実質細胞において組織再生を誘
導できる高分子材料を目指して、次のような特長を持つ
共重合体を合成した。 （１）細胞膜表面の糖鎖と特異的に相互作用を起こすフ
ェニルボロン酸基を高分子側鎖に導入した。このフェニ
ルボロン酸基は、グルコースのようなジオール化合物と
結合する性質を持ち、細胞への特異的なシグナルを送り
細胞の組織構築を誘導することが期待される。そのよう
な目的で、メタクリルアミドフェニルボロン酸（ＭＰ
Ｂ）を用いた。 （２）フェニルボロン酸基と細胞表面の糖鎖との相互作
用を効率よく生起させるために、３級アミノ基を有する
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド
（ＤＰＡ）を導入した。 （３）水溶液中で安定した製膜性を維持するために、生
体適合性の高い２ーヒドロキシエチルメタクリレート
（ＨＥＭＡ）を導入した。

【０００７】組織構築を実現するために、これらのモノ
マーの親水性−疎水性そしてフェニルボロン酸基−アミ
ノ基の良好なバランスを鋭意工夫して見出し、この共重
合体が初代肝実質細胞で特異的なシグナルを送り、組織
構築を誘導し、細胞の機能を維持したまま３０日以上の
長期培養を可能とする材料を開発した。

【０００８】

【実施例】（ポリマーの合成）本研究で用いた各ポリマ
ーの構造式を図１に示した。各ポリマーの仕込比、重合
溶媒、モノマー濃度を表１に示した。各ポリマーは、モ
ノマーを所定の溶媒に溶解し重合管内で真空脱気して封
管した後、重合した。開始剤の濃度を５ｍＭとし、７０
℃、３．５時間で反応させた．その後、ジエチルエーテ
ルを用いて２回再沈殿した。

【０００９】

【表１】

【００１０】（ポリマーの解析） （１）過塩素酸/ 酢酸０．０５Ｎ非水滴定 ポリマーの共重合比を決定するために、過塩素酸／酢酸
非水滴定によりアミノ基の含量を算出した。サンプルは
仕込比から換算して、ポリマー中のアミンユニットが約
０．１ｍｍｏｌに相当する量のポリマーを１０ｍｌの溶
媒に溶解し非水滴定を行った。３元系のポリマーはエタ
ノール、それ以外のポリマーはメタノールに溶解し非水
滴定を行った。 （２）合成ポリマーの¹ Ｈ−ＮＭＲ測定 ポリマーの共重合比を確認するために、¹ Ｈ−ＮＭＲ測
定を行った。３元系のポリマーは重水素化エタノール、
それ以外のポリマーは重水素化メタノールで測定した。

【００１１】（合成ポリマーの組成比と収率）各ポリマ
ーの組成比と収率を表１に示した。ポリマー名は、コモ
ノマーであるＨＥＭＡのＨ、ボロン酸基のＢ、そして、
アミノ基のＡをそれぞれとった。なお、ＰＨＥＭＡは、
ＨＥＭＡのホモポリマーである。３元系であるＨＡＢ
は、ボロン酸基が１０．０ｍｏｌ％そして、アミノ基が
６．６ｍｏｌ％含まれており、２元系であるＨＢとＨＡ
は、ボロン酸基とアミノ基をそれぞれ９．２ｍｏｌ％と
８．３ｍｏｌ％含んでいた。

【００１２】（ポリマーキャスト膜の作成）０．５ｗｔ
％のポリマー溶液を作り、シリンジフィルターでろ過し
た。窒素袋内で、乾燥窒素を流し込みながら、直径３５
ｍｍのシャーレ中に０．２ｍｌのポリマー溶液を注ぎ静
置した。用いた溶媒を表１に示した。シャーレの蓋をか
ぶせたままで窒素袋中で一晩乾燥させた後、減圧乾燥器
で一晩乾燥させた。なお、溶媒雰囲気下にするために溶
媒を満たしたビーカーと乾燥剤として塩化カルシウムを
置いてこれらの操作を行なった。

【００１３】（ポリマーキャスト膜の表面解析） （１）静的接触角測定 上記の方法により作成したそれぞれのポリマーコートシ
ャーレを約２×３ｃｍの大きさに切断し、再度減圧乾燥
器で一晩十分に乾燥させ、これを静的接触角用のサンプ
ルとした。室温下で超純水（１滴）をサンプル表面上に
滴下し、表面の水に対する静的接触角を１４秒間に１秒
ごと測定した。測定は、接触角測定装置で行った。 （２）Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ (ＥＳＣ
Ａ) 測定 それぞれのポリマー膜をコートしたシャーレを約２ｃｍ
² に切断し、減圧乾燥器で一晩乾燥させた後、ＥＳＣＡ
測定装置により膜表面近傍付近の元素分析を行なった。

【００１４】（ポリマーのキャスト膜表面の物性） （１）ポリマーキャスト膜の静的接触角測定 室温下、超純水の水滴をポリマー膜表面に滴下してか
ら、１４秒間の水に対する静的接触角を、１秒ごとに測
定した。その結果を図２に示した。いずれのポリマー膜
表面も、コーティングしていない培養シャーレ（ＴＣ）
表面より親水性であった。ＨＡ膜表面は、調製したキャ
スト膜の中で最も親水性を示した。これは、導入された
アミノ基のプロトン化によるものと考えられる。総じて
ＨＡＢ，ＨＢそしてＰＨＥＭＡ表面は比較的同じ接触角
の値を示した。これは、主成分であるＨＥＭＡの性質が
現れているものと思われる。しかし、ＨＢ膜は、ＰＨＥ
ＭＡ膜よりもやや疎水性表面であった。これは、疎水性
のボロン酸基モノマーであるＭＰＢＡの性質が表面に反
映されたものと考えられる。ＨＡＢ膜表面は経時変化に
伴い親水性を示した。これは、アミノ基の効果によるも
のと考えられるが、ボロン酸基の疎水性も反映してお
り、ＨＡ表面ほど親水性にはならなかった。 （２）ＥＳＣＡによるポリマーキャスト膜表面近傍のホ
ウ素元素分析 表２に示した通り、ボロン酸基を含むポリマーのキャス
ト膜表面近傍にホウ素が確認されたことから膜の表面近
傍にボロン酸が存在していることを確認した。

【００１５】

【表２】

【００１６】（ラット肝細胞の初代培養） （滅菌操作）上記作成したポリマーをコーティングした
シャーレを、エチレンオキサイドガス滅菌処理して細胞
培養床として用いた。その他の器具、例えば培地保存用
ギアマン瓶などは、それぞれアルミホイルを巻きオート
クレーブで２０分間加熱、加圧滅菌１ａｔｍ／１２０℃
の後、乾熱滅菌を１６０℃／６０分間行ってから使用し
た。また、乾熱滅菌に耐えられない灌流用チューブなど
はオートクレーブのみとし、また、手術用のガーゼは、
１６０℃, ３０分間乾熱滅菌とした。

【００１７】（ラット肝細胞培養の種々の溶液の調製） （１）Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地の調製 滅菌水にＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（ＧＩＢＣＯ） 1
袋、硫酸カナマイシン（山之内製薬, 最終濃度：５０ｍ
ｇ／ｌ）、セファメジン (藤沢薬品工業, 最終濃度：２
５ｍｇ／ｌ）、プロリン( 最終濃度、３０ｍｇ／ｌ) 、
アスコルビン (最終濃度、０．２ｍＭ）を加え、メイロ
ン（７％ｗ／ｖ炭酸水素ナトリウム注射液、大塚製薬）
３１．４ｍｌを添加した。さらに滅菌水を加えて全量を
１ｌとし、メンブレンフィルターを用いて濾過滅菌し
た。 （２）合成培地の調製 ５％のウシ胎児血清 (ＦＣＳ，ＧＩＢＣＯ) 、インシュ
リン（最終濃度：１０ ^-7Ｍ）、デキサメサゾン( 最終濃
度：１０^-8Ｍ）、ニコチン酸アミド（２４４ｍｇ）をメ
スシリンダーに入れ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地を加え
て全量を２００ｍｌとした。これをメンブレンフィルタ
ーを通して濾過滅菌した。その後、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ、湧永製薬・最
終濃度：１０ｎｇ／ｍｌ）と、アプロチニン (トラジオ
ール, ＢＡＹＥＲ・最終濃度：５Ｕ／ｍｌ) を加えた。 （３）ＭＥＭ培地の調製 ＭＥＭ培地（日水製薬）９．４ｇを再蒸留滅菌水に入れ
て溶かした。メイロン２５ｍｌ、グルタミン（最終濃
度：２９２ｍｇ／ｌ）を入れ、滅菌水を加えて全量を１
０００ｍｌとした。その後、メンブレンフィルターを通
して濾過滅菌した。 （４）ＰＢＳ（−）の調製 ＰＢＳ粉末（日水製薬）９．６ｇを滅菌水１ｌに溶解さ
せ、メンブレンフィルターを用いて濾過滅菌した。 （５）０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液 ０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ生理食塩水
溶液 (ＧＩＢＣＯ）１０ｍｌをＰＢＳ（−）で１００ｍ
ｌに希釈し、ボトルトップフィルターで濾過滅菌した。

【００１８】（ラット肝細胞の単離と初代培養）肝細胞
の単離はＳｅｇｌｅｎらのコラゲナーゼ灌流法を用いて
行った。単離した肝実質細胞を合成培地に懸濁させ、
１．５ｍｌずつ１枚のシャーレに播種した。これらを、
３７℃、５％ＣＯ₂ インキュベーター内で培養した。培
地交換は、播種後１日目に培地をガラスの綿栓つきパス
ツールピペットで吸い取り、新しい培地をピペットでゆ
っくりと１ｍｌ注いだ。その後は３日後、６日後に０．
５ｍｌの培地を１ｍｌのピペットで吸い取り、新たに
０．５ｍｌの培地を加えることにより交換を行なった。
その後は、４日毎に０．５ｍｌの培地を新たに交換し
た。

【００１９】（初期接着率の測定）単離した肝細胞をポ
リマーキャスト培養床上に３×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ
²で播種し、接着した細胞を所定時間後に測定した。ま
ず、浮遊している細胞を取り除くために、シャーレ上の
培養液を吸い取った。３７℃に温めたトリプシンＥＤＴ
Ａ溶液を１ｍｌずつ培養床に注ぎ、３７℃で５分間イン
キュベートした後、細胞を懸濁させて試験管に移した。
シャーレ上に残っている細胞を集めるため、さらに１ｍ
ｌの血清を含んだ培養液をシャーレに注ぎ懸濁させたあ
とで、同じ試験管に懸濁液を集めた。その溶液の細胞数
を血球計算盤を用いて計測し、シャーレ当たりの細胞数
を求めた。

【００２０】前述の表２に、細胞播種２４時間後の細胞
の初期接着率を示した。ポリマーをコートしていないシ
ャーレ上には、細胞は１００％の接着率を示した。ボロ
ン酸基とアミノ基を有する３元系ポリマーであるＨＡＢ
は、約９１％の高い接着率を示し、ボロン酸基のみを有
する２元系のポリマーＨＢは、７６％の接着率であっ
た。ボロン酸基の多価水酸基化合物との相互作用は平衡
反応であり、フェニルボロン酸基のｐＫａであるｐＨ
８．６以上で有効に相互作用する。従って、生理条件下
の培養では、ＨＢ表面のボロン酸基と細胞表面の糖鎖と
の相互作用が効率良く生起せず、比較的低い接着率を示
したものと考えられる。しかし、３級アミノ基を共存さ
せるとｐＨ７付近でもボロン酸基は水酸基化合物と安定
に相互作用することから、培養条件下においても３元系
のＨＡＢ上のボロン酸基と細胞表面の糖鎖との相互作用
が起こり、ＨＢ上の接着率より高い接着性を示した。ア
ミノ基を含んだ２元系ポリマーのＨＡ表面では、ポリマ
ー表面の親水性が細胞接着を抑制した。すなわち、ポリ
マー表面のカチオン的性質と細胞表面との静電的相互作
用を介した細胞接着が誘導されていないことが分かっ
た。このことから、ＨＡＢ上の細胞接着は、含まれてい
るアミノ基による静電的相互作用でないことを現してい
る。ＨＡＢとＨＢは、ともにＨＥＭＡを主な成分として
含み、静的接触角の値もＰＨＥＭＡとほとんど変わりの
ないことを考慮すると、材料間により認められた細胞の
接着性の違いは、材料表面の物理化学的性質に依存した
のではなく、フェニルボロン酸基が細胞表面への結合サ
イトとして働いた結果と考えられる。

【００２１】（フェニルボロン酸基含有ポリマー上の細
胞増殖性）肝細胞をポリマーキャスト培養床上に３×１
０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ² で播種し、培養開始１日後から
４日後にディッシュ上に接着している細胞を計測し、増
殖曲線を図３に示した。細胞の増殖が認められたのが、
コーティングしていない培養シャーレ（ＴＣ）上とＰＨ
ＥＭＡ上で培養された細胞であった。ＰＨＥＭＡ表面上
への細胞の初期接着率が低かったものの、ＴＣ上の細胞
と同じ増殖性を示した。一方で、ＨＡＢ，ＨＢ，ＨＡの
ポリマー上の細胞の増殖性は、低く抑えられていた。従
って、これらポリマー上で培養した細胞が分化相に位置
していることが示唆された。

【００２２】（フェニルボロン酸基含有ポリマー上での
ラット肝細胞の形態変化）位相差顕微鏡により経時的な
肝細胞の形態変化を観察した。 （ＨＡＢコーティング）播種２時間後に伸展した細胞が
観察された。播種６〜１６時間後には接着している細胞
の半分が１個の丸い形態や、細胞数個からなる小さな塊
になっているのが観察された。播種後２４時間後では、
ほぼすべての細胞が1 個の丸い形態の細胞や、細胞数個
からなる小さな塊として観察された。３日後には、明ら
かな細胞の多層集合体が形成された。図４にＨＡＢ上に
おける培養５日後の位相差顕微鏡写真を示す。この多層
集合体は、３０日間以上にわたって安定に存在した。

【００２３】（ＨＢコーティング）播種１時間後には細
胞同士で少し凝集していた。播種４時間後には、伸展し
た細胞が観察された。しかしながら、播種６時間後には
１個の丸い形態の細胞や、細胞数個からなる小さな凝集
塊が観察された。播種７時間後では観察される塊が少し
大きくなる一方で、伸展している細胞も観察された。１
６時間後では、伸展した細胞をより多く観察した。２４
時間後には、再び１個の丸い形態の細胞や、細胞数個か
らなる小さな塊が観察された。２日目には、細胞は１日
目より大きい塊が観察され、その塊のシャーレ表面との
接着部分が少し伸展していた。ＨＡＢと同様に３日後に
多層集合体が形成され、３０日間以上にわたって安定に
シャーレ上に存在した。図５にＨＢ上における培養５日
後の位相差顕微鏡写真を示す。

【００２４】前述した通り、ボロン酸基と多価水酸基と
の相互作用は平衡反応に基づいている。また、ボロン酸
基のｐＫａが８．６であることから、生理ｐＨ条件下に
おいては、この両者の相互作用は有利に働かない。従っ
て、ＨＢ上の細胞は少ない結合点でポリマー表面と接着
しているものと考えられる。その不安定な結合による接
着を、安定な接着とするために、細胞自身が伸展形態と
球状形態を繰り返し、足場作りをしていたと考察され
る。これに対し、ＨＡＢ上の細胞は、アミノ基の存在に
よりボロン酸基と細胞表面の糖鎖との相互作用が安定に
起こり、特異的な刺激を受けて球状の接着形態を示した
と考えられる。

【００２５】（ＨＡコーティング）播種２時間後、伸展
した細胞が観察された。７時間後には半数以上の細胞が
接着し伸展形態を示した。播種後２４時間後にも、細胞
が伸展した接着形態を示していた。５日目においてＨＡ
は伸展した状態を保っている部分と、伸展した細胞が単
層のシートで剥がれて凝集し、再びシャーレ表面に接着
した部分が観察された。図６にＨＡ上における培養５日
後の位相差顕微鏡写真を示す。

【００２６】（ＰＨＥＭＡコーティング）播種２時間後
は、少し凝集した状態で観察された。播種４時間後に
は、伸展した細胞が観察された。２４時間後には、伸展
形態と凝集形態をとった細胞が観察された。２日目には
培養床のどの部分の細胞も伸展形態を示した。コーティ
ングしていない培養シャーレ（ＴＣ）と同様に５日目か
ら非実質細胞が観察されるようになり、８日目の培地交
換で細胞が剥離した。図７にＰＨＥＭＡ上における培養
５日後の位相差顕微鏡写真を示す。

【００２７】（ラット初代肝細胞のアルブミン分泌量の
測定） （各種試薬の調製） （１）０．１Ｍリン酸緩衝溶液 (ｐＨ７．４） リン酸二水素ナトリウム１．５６ｇを全量が１００ｍｌ
になるように精製水に溶解させ０．１Ｍのリン酸水素二
ナトリウム溶液を調製した。また、リン酸水素二ナトリ
ウム１７．９ｇを全量が５００ｍｌになるように精製水
に溶解させて０．１Ｍのリン酸水素二ナトリウム溶液を
調製した。０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液３９０
ｍｌに、０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液を混合し
てｐＨ７．４に調整した。 （２）０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液 塩化ナトリウム８．７７ｇを全量が１０００ｍｌになる
ように精製水に溶解させた。 （３）０．１Ｍトリス塩酸溶液 (ｐＨ８．０ａｔ４℃） トリス１２．１ｇを全量が１０００ｍｌになるように精
製水に溶解させた溶液を、４℃に保ちながら０．１Ｍ塩
酸を用いてｐＨ８．０に調整した。 （４）５０ｍＭクエン酸ーリン酸緩衝溶液 (ｐＨ５．
０) クエン酸１．５７ｇを全量が１５０ｍｌになるように精
製水に溶解させ５０ｍＭクエン酸水溶液を調製した。リ
ン酸水素二ナトリウム５．３７ｇを全量が３００ｍｌに
なるように精製水に溶解させ５０ｍＭリン酸水素二ナト
リウム溶液を調製した。５０ｍＭリン酸水素二ナトリウ
ム溶液２５０ｍｌに５０ｍＭクエン酸水溶液を加えｐＨ
５．０に調整した。 （５）Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ ０．１Ｍリン酸緩衝溶液 (ｐＨ７．４）２００ｍｌに等
量の精製水を加え０．５ｍＭリン酸緩衝溶液 (ｐＨ７．
４）４００ｍｌとし、これに０．８８ｗ／ｖ％のゼラチ
ン（国産化学）を加え電子レンジで軽く加熱してゼラチ
ンを溶かし、０．０４ｇのチメロザール (Ｓｏｄｉｕｍ
Ｅｔｈｙｌｍｅｒｃｕｒｉｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌａ
ｔｅ）（ＳＩＧＭＡ）を加えた。 （６）ペルオキシダーゼ結合抗ラットアルブミンウサギ
ＩｇＧ画分（ａｎｔｉ−ａｌｂｕｍｉｎ−ＰＯＸ，Ｃａ
ｐｐｅｌ） ａｎｔｉ−ａｌｂｕｍｉｎ−ＰＯＸを蒸留水に３ｍｇ／
ｍｌになるように溶解し、０．５ｍｌずつ分注して冷凍
庫内で保存した。使用時に、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ
で６０００倍に希釈して０．５ｍｇ／ｍｌにして用い
た。 （７）基質溶液 ５０ｍＭクエン酸ーリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）１０
０ｍｌに２５０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（和光純
薬工業）（２．５ｍｇ／ｍｌ）を加えよく攪拌して溶解
させた後、５０μｌの３１％過酸化水素水溶液（和光純
薬工業）（０．５μｌ／ｍｌ）を加えたものを用時調製
し使用した。 （８）１．５Ｎ硫酸水溶液 濃硫酸１２ｍｌを精製水で３００ｍｌに希釈した。

【００２８】（抗体ビーズの作製）ポリスチレンビーズ
（積水化学工業）は水でよく洗い、次にメタノールで洗
い再び蒸留水で洗浄したものを用いた。抗ラットアルブ
ミンＩｇＧ画分（Ｃａｐｐｅｌ）を０．１Ｍトリス塩酸
溶液 (ｐＨ８．０ａｔ４℃）で５０〜１０μｇ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ／ｍｌに調整し、ポリスチレンビーズ（４個ビ
ーズ／ｍｌ）を加えた。室温で攪拌しながら脱気操作を
２時間行った後、冷蔵庫内で一晩攪拌させ、０．１５Ｍ
塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した後、Ａｓｓａｙ
ｂｕｆｆｅｒ中に入れ冷蔵庫内で保存した。

【００２９】（アルブミン分泌量の測定用のサンプル調
整） （１）無血清培地の調整 インシュリン (１０^-7Ｍ）、デキサメサゾン (１０
^-8Ｍ）、ニコチン酸アミド(２４４ｍｇ) をメスシリン
ダーに入れ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地を加えて全量を
２００ｍｌにし、十分攪拌した。これをメンブレンフィ
ルターを通して濾過滅菌した。その後、ＥＧＦ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）と、アプロチニン（５Ｕ／ｍｌ）を加えた。 （２）アルブミン分泌量の測定用のサンプル調整 前述の無血清培地を所定時間培養したシャーレ上に１ｍ
ｌ注いで一定時間インキュベートしたものを、Ａｓｓａ
ｙ ｂｕｆｆｅｒで任意の倍率で希釈することにより測
定に用いた。 （３）ラットアルブミンの標準溶液の調製 ラットアルブミンの希釈系列 (０，１０，５０，１０
０，５００、１０００、５０００ｎｇ／ｍｌ）をＡｓｓ
ａｙ ｂｕｆｆｅｒを用いて調製した。 （４）アルブミン分泌量の測定 試験管にあらかじめ５００μｌのＡｓｓａｙ ｂｕｆｆ
ｅｒを加えておき、サンプルもしくは標準溶液を５０μ
ｌ、作製した抗体ポリスチレンビーズを１個入れ蓋をし
て、冷蔵庫内で一晩ゆっくりと攪拌した。水流アスピレ
ーターを用いて溶液を吸引除去後、０．１５Ｍ塩化ナト
リウム水溶液２ｍｌを勢いよく注入し、再び水流アスピ
レーターを用いて溶液を吸引するという操作を４回繰り
返しビーズを洗浄した。上記調製したａｎｔｉ−ａｌｂ
ｕｍｉｎ−ＰＯＸを５００μｌ加え、冷蔵庫内で３時間
ゆっくりと攪拌した。再び０．１５Ｍ塩化ナトリウム水
溶液を用いて４回ポリスチレンビーズを洗浄した後、ガ
ラスの試験管にビーズを移し基質溶液を５００μｌ加え
約２０℃で３０分間静置した。その後１．５Ｎ硫酸水溶
液を正確に３ｍｌずつ加え酵素反応を停止した後、マイ
クロプレートリーダーを用いて４９２ｎｍの吸光度を測
定した。

【００３０】（アルブミン分泌定量）細胞培養開始５日
目と３０日目のラット肝細胞から分泌されたアルブミン
の量を測定した。図８に、５日目の培養細胞からのアル
ブミン分泌の定量の結果を示した。ボロン酸基を含んだ
ＨＡＢとＨＢ上の細胞は、高いアルブミン分泌量を示し
たのに対し、ＨＡ, ＰＨＥＭＡそしてコーティングして
いない培養シャーレ（ＴＣ）上の細胞からは低いアルブ
ミン分泌量が認められた。細胞増殖が低く抑えられてい
たことと、接着形態は多層集合体を形成していたことか
ら、ＨＡＢとＨＢ表面はラット初代肝細胞をスフェロイ
ド形成に誘導する機能を発現することが分かった。ＨＡ
上の細胞は、同様に増殖性が低く、多層集合体を一部形
成していたものの、このアルブミン定量の結果から、機
能を維持したスフェロイド形成に至っていないことが明
らかになった。また、細胞の明らかな増殖性と伸展形態
を示していたその接着形態から、ＰＨＥＭＡそしてTC上
の細胞は、機能分化への変化を示さなかった。

【００３１】図９に、長期培養した場合のアルブミン分
泌量の定量を行った。３元系の共重合体であるＨＡＢ上
の肝細胞は、３０日間の長期にわたって高いアルブミン
分泌量が認められ、機能を維持していた。この後培養を
継続したところ、９５日間はこのアルブミン産生能を維
持していた。また、２元系のＨＢ上の細胞もＨＡＢ上の
細胞と比較すると低い値であったが、アルブミン分泌が
維持されていることが認められた。ＴＣとＰＨＥＭＡ上
で培養された細胞は、２週間後には脱着し、長期培養で
の機能評価をすることが不可能であった。ＨＡ上では、
接着した細胞が不安定で、培地交換をした際にシャーレ
中央に接着していた細胞が脱着し、機能評価を議論する
ことが困難であった。３０日間の長期培養で安定にスフ
ェロイドを形成し、アルブミン分泌能を維持していたの
は、ボロン酸基を有するポリマーだけであった。

【００３２】

【発明の効果】本発明により、フェニルボロン酸基を含
有するモノマー、アミノ基を含有するモノマー、及び２
ーヒドロキシエチルメタクリレートの共重合体からなる
高分子物質をコーティングしたシャーレを用いることに
より、初代肝細胞のスフェロイド形成および３０日以上
の長期培養が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に関与するコポリマーの化学構造式。

【図２】ポリマーコートシャーレ表面の静的接触角値の
経時変化。

【図３】それぞれのポリマー表面上において培養された
ラット肝細胞の増殖。

【図４】ＨＡＢコートシャーレ表面上において５日間培
養されたラット肝細胞の形態の、位相差顕微鏡写真。

【図５】ＨＢコートシャーレ表面上において５日間培養
されたラット肝細胞の形態の、位相差顕微鏡写真。

【図６】ＨＡコートシャーレ表面上において５日間培養
されたラット肝細胞の形態の、位相差顕微鏡写真。

【図７】ＰＨＥＭＡコートシャーレ表面上において５日
間培養されたラット肝細胞の形態の、位相差顕微鏡写
真。

【図８】それぞれのポリマー表面上において５日間培養
されたラット肝細胞における、アルブミン分泌。

【図９】それぞれのポリマー表面上において長期培養を
おこなったラット肝細胞における、アルブミン分泌。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片岡 一則 千葉県柏市大室1083−４ 柏ビレッジ 141−９ (72)発明者 緒方 直哉 東京都杉並区阿佐ヶ谷北６丁目29番６号 (72)発明者 讃井 浩平 東京都世田谷区若林４丁目29番８号 (72)発明者 青木 隆史 神奈川県川崎市宮前区土橋３丁目24番８ −６号 (72)発明者 廣山 麻美 千葉県八千代市勝田台３丁目32番６号 (56)参考文献 特開 平６−339367（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/00 - 7/08 C12M 1/00 - 3/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 初代肝細胞の３０日以上の培養維持を可
   能とする、フェニルボロン酸基を含有するモノマー、ア
   ミノ基を含有するモノマー、及び２ーヒドロキシエチル
   メタクリレートの共重合体からなる高分子物質をコーテ
   ィングした培養床を用いた、初代肝細胞の培養方法。
2. 【請求項２】 初代肝細胞を３０日以上培養しても、細
   胞がアルブミン分泌作用を維持することを可能とする、
   請求項１記載の初代肝細胞の培養方法。
3. 【請求項３】 初代肝細胞の培養床であって、フェニル
   ボロン酸基を含有するモノマー、アミノ基を含有するモ
   ノマー、及び２ーヒドロキシエチルメタクリレートの共
   重合体からなる高分子物質によりコーティングされてい
   る、培養床。
4. 【請求項４】 初代肝細胞の培養床に用いるコーティン
   グ剤であって、フェニルボロン酸基を含有するモノマ
   ー、アミノ基を含有するモノマー、及び２ーヒドロキシ
   エチルメタクリレートの共重合体からなる高分子物質か
   らなるコーティング剤。