JP2966093B2 - ヒトドーパミンｄ▲下４▼リセプタおよびその使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘ
ルスにより支援されたNIMH認可MH−45614号の下で政府
の援助を受けて行なわれた。政府は本発明に所定の権利
を有する。

1. 発明の技術分野 本発明は、哺乳動物からのドーパミンリセプタおよび
この種のリセプタに対応する遺伝子に関する。特に本発
明は、ヒトドーパミンリセプタD₄に関する。詳細には本
発明は、ヒトD₄リセプタ遺伝子の分離、クローン化およ
び配列決定に関する。さらに本発明は、形質転換された
真核細胞の培養物にてヒトD₄ドーパミンリセプタを発現
しうる真核発現ベクターの作成、並びにこの種の培養物
におけるヒトD₄ドーパミンリセプタの合成に関する。さ
らに本発明は、抗精神病薬物を特性化するためのヒトD₄
ドーパミンリセプタを産生する形質転換された真核細胞
の培養物の使用に関するものである。

2. 情報の開示 ドーパミンは、神経系により媒介される各種の異なる
機能（たとえば視覚、運動および挙動を含む）に関与す
る神経伝達物質である［一般にJ.クーパー等、「神経薬
理学の生化学的基礎」、第161〜195頁（オックスフォー
ド・ユニバーシティ・プレス、NY、第３版（1978）参
照］。ドーパミンの種々の生理学的作用は次いで基本的
種類のＧ蛋白結合リセプタの２種（すなわち、それぞれ
酵素アデルニシクラーゼを刺激および抑制するD₁および
D₂）との相互作用により媒介される［J.ケバビアおよび
D.カルネ、ネイチャー、第277巻、第93〜96頁（197
9）］。これらリセプタの数もしくは活性の変化は、た
とえばパーキンソン氏病（運動障害）および精神分裂症
（挙動障害）のような病気状態に関与する因子となりう
る。

D₁およびD₂ドーパミンリセプタの生化学に関し多くの
情報が集積しており、これらリセプタ蛋白を溶解および
精製する方法が開発されている［S.セノグレス等、バイ
オケミストリー、第25巻、第749〜753頁（1986）;S.セ
ノグレス等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第263巻、第18996〜19002頁（1988）;J.ギングリッ
チ等、バイオケミストリー、第27巻、第3907〜3912頁
（1988）;J.ギングリッチ等（印刷中）参照］。数種の
組織におけるD₁ドーパミンリセプタは約72kDaのグリコ
シル化された膜蛋白であると思われる［N.アムレイキー
等、モレキュラ・ファーマコロジー、第31巻、第129〜1
34頁（1987）;H.ニニク等、バイオケミストリー、第27
巻、第7594〜7599頁（1988）］。D₂リセプタは、約90〜
150kDaの高い分子量を有することが示唆されている［N.
アムレイキーおよびM.カロン、ジャーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第260巻、第1983〜1986頁（198
5）;N.アムレイキーおよびM.カロン、ジャーナル・ニュ
ーロケミストリー、第47巻、第196〜204頁（1986）;J.
ジャルビー等、モレキュラ・ファーマコロジー、第34
巻、第91〜97頁（1988）］。最近見出されたD₃と呼ばれ
る他のドーパミンリセプタについては大して知られてい
ない［P.ソコロフ等、ネイチャー、第347巻、第146〜15
1頁（1990）］。ドーパミンリセプタは、たとえばパー
キンソン氏病のような精神運動障害およびたとえば精神
分裂症のような情緒障害の臨床的処置に主たる標的を有
する［P.シーマン等、ニューロサイコファーマコロジ
ー、第１巻、第５〜15頁（1987）;P.シーマン、シナプ
ス、第１巻、第152〜333頁（1987）］。３種の異なるド
ーパミンリセプタ（D₁、D₂、D₃）は、これらリセプタ遺
伝子の間に存在するヌクレオチド配列相同性（homolog
y）の結果としてクローン化されている［J.R.ブンゾウ
等、ネイチャー、第336巻、第783〜787頁（1988）;D.K.
グランジー等、プロシーディング・ナショナル・アカデ
ミー・サイエンス、LSU、第86巻、第9762〜9766頁（198
9）;R.ダルトソ等、EMBOジャーナル、第８巻、第4025〜
4034頁（1989）;Q.Y.ゾウ等、ネイチャー、第346巻、第
76〜80頁（1990）;R.K.スナハラ等、ネイチャー、第346
巻、第80〜83頁（1990）;P.ソコロフ等、ネイチャー、
第347巻、第146〜151頁（1990）］。

抗精神病剤クロザピンは、社会的に引きこもりかつ処
置に抗する精神分裂症に対し有用である［J.ケイン等、
ネイチャー、第347巻、第146〜151頁（1990）］が、他
の抗精神病薬物とは異なりクロザピンは遅発性運動障害
を引き起こさない［D.E.ケーシー、サイコファーマコロ
ジー、第99巻、第547〜553頁（1989）］。しかしなが
ら、クロザピンは血漿水におけるクロザピンの治療遊離
濃度よりも３〜30倍高いD₂およびD₃における解離定数を
有する［M.アッケンヘイル等、アルツナイ・フォルシュ
ンク、第26巻、第1156〜1158頁（1976）；サンドズ・カ
ナダ・インコーポレーション社、クロザリル；予備臨床
および臨床データの要約（1990）］。これは、抗精神病
剤クロザピンに対し感受性がより高いドーパミンリセプ
タの存在を示唆している。

本発明者等は、D₄と称するこの種のヒトドーパミンリ
セプタをクローン化すると共に配列決定した。このドー
パミンD₄リセプタ遺伝子は、ヒトドーパミンD₂およびD₃
リセプタ遺伝子に対し高い相同性を有する。このリセプ
タの薬理学的性質はD₂およびD₃リセプタの性質に類似す
るが、10倍高いクロザピンに対する親和性を有する。本
発明者等は、ここに開示したD₄ドーパミンリセプタがク
ロザピンと同様に遅発性運動障害および他の運動副作用
を誘発しない新規な種類の精神分裂症の薬物を見出すの
に有用であると予想する。

発明の要点 本発明は、ヒトD₄ドーパミンリセプタの分離、特性化
および薬理学的使用、このリセプタに対応する遺伝子、
形質転換された真核細胞の培養物にてヒトD₄ドーパミン
リセプタを発現しうる組換真核発現ベクター、並びにヒ
トD₄ドーパミンリセプタを合成する形質転換された真核
細胞の培養物に向けられる。

本発明の目的は、哺乳動物ドーパミンリセプタをコー
ドするヌクレオチド配列を提供することにある。さらに
本発明の目的は、新規かつ明確な薬理学的性質を有する
哺乳動物ドーパミンリセプタをコードするヌクレオチド
配列を提供することにある。特に本発明の目的は、ヒト
ドーパミンリセプタD₄の特定の薬物解離特性を有する哺
乳動物ドーパミンリセプタをコードするヌクレオチド配
列を提供することにある。特に、本発明のヌクレオチド
配列によりコードされる哺乳動物ドーパミンリセプタは
薬物クロザピンに対し高い親和性を有する。本発明で実
現されるヒトD₄ドーパミンリセプタは、ここに開示する
［H³］スピペロン結合分析により検出して１〜40ナノモ
ル（nM）、好ましくは１〜20nM、特に好ましくは11nMク
ロザピンの生化学的阻止定数（K_Iと称する）を示す。本
発明で実現されるヒトD₄ドーパミンリセプタは、［H³］
スピペロン結合分析における［H³］スピペロン結合の阻
止につき次の薬理学的性質を示す：スピペロン＞エチク
ロプリド＞クロザピン＞（＋）−ブタクラモール＞ラク
ロプリド＞SCH23390。本発明の好適具体例においてドー
パミンリセプタをコードするヌクレオチド配列はヒトド
ーパミンリセプタD₄をコードする。本発明は、ヒト神経
芽細胞ラインSK−Ｎ−MCからのRNAで作成されるcDNA保
存物から分離されたcDNA分子から誘導される哺乳動物ド
ーパミンリセプタをコードするヌクレオチド配列を含
む。この本発明の具体例においてヌクレオチド配列は、
経膜領域Ｖ、VIおよびVIIからなるヒトD₄ドーパミンリ
セプタ遺伝子の780個のヌクレオチドと、３′未翻訳配
列の126個のヌクレオチドとを含む。

さらに本発明は、ヒトゲノムDNAから誘導されたヌク
レオチド配列をも含む。本発明のこの具体例においてヌ
クレオチド配列は、ドーパミンリセプタD₄をコードする
５キロベース（kb）のヒトゲノムDNAを含む。この具体
例はcDNAに存在する配列と、経膜領域Ｉ、II、IIIおよ
びIVからなるコード配列の追加516個のヌクレオチド
と、５′未翻訳配列の590個のヌクレオチドとを含む。
さらに、この本発明の具体例はヒトD₄ドーパミンリセプ
タ遺伝子のコード配列を中断する４つの介在配列よりな
る配列を含む。

本発明はヒトD₄リセプタ分子のヌクレオチド配列を含
み、さらにこのヌクレオチド配列の対立型をも含み、さ
らに対応のD₄リセプタ分子は天然産であっても或いはイ
ンビトロの化学的もしくは遺伝子的改変の生産物であっ
てもよく、ここに開示したヒトD₄リセプタのヌクレオチ
ド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有し、得られ
るヒトD₄リセプタ分子はここに開示するヌクレオチド配
列に対応したヒトD₄リセプタ分子と実質的に同じ薬物解
離特性を有する。

さらに本発明は、D₄ドーパミンリセプタ遺伝子の完全
コード配列からなるヌクレオチド配列より推定されたヒ
トD₄ドーパミンリセプタにつき予想のアミノ酸配列を含
む。

本発明は、これら配列から誘導されるヌクレオチドお
よびアミノ酸プローブの両者を提供する。本発明はcDNA
もしくはゲノムDNAクローンから分離されたプローブ、
並びにそれから得られる配列情報で合成されたプローブ
を含む。特に本発明は、オリゴヌクレオチドに限定され
ずニックトランスレーション、ランダムプライミングま
たはインビトロ増幅で得られたプローブを包含し、これ
らは本発明を実現するcDNAもしくはゲノムクローンを用
いて作成され、さらに本発明による具体例のcDNAもしく
はゲノムクローンのヌクレオチド配列情報を用いて化学
合成されたオリゴヌクレオチドおよび他の合成プローブ
をも包含する。

さらに本発明の目的は、ヒトを含む哺乳動物の種々の
組織におけるこのリセプタの発現のパターン、量および
程度を測定するプローブとして使用するためのヒトD₄ド
ーパミンリセプタの配列を提供することにある。さらに
本発明の目的は、遺伝子病の検出および診断に使用する
ための、ヒトD₄ドーパミンリセプタの配列から得られる
プローブを提供することにある。本発明の目的は、新規
な関連リセプタ遺伝子の検出に使用するための、ヒトD₄
ドーパミンリセプタの配列から得られるプローブを提供
することにある。

さらに本発明は、その具体例のcDNAもしくはゲノムク
ローンからなるヌクレオチド配列情報を用いて作成され
た合成ペプチドをも含む。本発明は天然産もしくは合成
のペプチドをも含み、これらはD₄ドーパミンリセプタ特
異性抗体を産生させるための抗原として使用することが
でき、或いは薬物結合に関するD₄リセプタ分子の競合体
につき使用することができ、或いはドーパミンまたはD₄
ドーパミンリセプタセプタ分子のドーパミン同族体の結
合阻止剤を生産すべく使用することもできる。

さらに本発明は、ヒトD₄ドーパミンリセプタからなる
クローン化用ベクター、並びにこのベクターを有する微
生物の複製および選択増殖を媒介する配列をも包含す
る。

本発明は、ヒトD₄ドーパミンリセプタのヌクレオチド
配列と、形質転換された真核細胞の培養物でヒトD₄ドー
パミンリセプタの合成を指令するのに充分な配列とから
なる組換発現ベクターを提供する。好適具体例において
組換発現ベクターは、プラスミドpCD−PSから得られる
プラスミド配列とハイブリッドヒトD₄ドーパミン遺伝子
とで構成される。このハイブリッドヒトD₄ドーパミン遺
伝子は、ここに記載した特定D₄ドーパミンゲノムクロー
ンからエクソンIIIに位置するPst I部位に至る全ゲノム
配列、次いでヒト神経芽細胞ラインから得られる特定ヒ
トcDNA配列に存在するコード用および３′未翻訳配列の
残部で構成される。本発明は、形質転換された真核細胞
の培養物にて発現を行なう具体例で、ヒトD₄ドーパミン
リセプタのゲノムおよびcDNAクローンのヌクレオチド配
列から実質的になる組換発現ベクターを含む。

さらに本発明の目的は、この種の組換発現ベクターに
より形質転換されると共にヒトD₄ドーパミンリセプタ蛋
白を合成する形質転換された真核細胞の培養物をも提供
する。好適具体例において本発明は、ヒトD₄ドーパミン
リセプタ蛋白を合成するサルCOS細胞を提供する。

さらに本発明はヒトD₄ドーパミンリセプタの蛋白調製
物、および形質転換された真核細胞の培養物から得られ
るヒトD₄ドーパミンリセプタを含有する膜の調製物をも
含む。好適具体例においてヒトD₄ドーパミンリセプタ蛋
白を含有する細胞膜は、ヒトD₄ドーパミンリセプタの合
成を指令する組換発現ベクターにより形質転換されたCO
S−７細胞の培養物から分離される。

本発明の目的はさらに、新規な抗精神病化合物のイン
ビトロスクリーニングに使用するためのヒトD₄ドーパミ
ンリセプタを提供することにある。好適具体例におい
て、形質転換された真核細胞の培養物から得られるヒト
D₄ドーパミンリセプタを含有した膜調製物は、抗精神病
化合物の薬物解離特性をインビトロで測定すべく使用さ
れる。これら性質は、次いで公知の抗精神病化合物の結
合特性と比較して、新規な抗精神病化合物を特性化すべ
く使用される。

さらに本発明は、既知もしくは未知の天然産または抗
精神病薬物などの具体例としてのドーパミンおよびドー
パミン同族体のインビボ検出に有用である。

本発明の目的は、天然産または抗精神病薬物などの具
体例としてのドーパミンおよびドーパミン同族体の定量
検出法をも提供する。さらに本発明の目的は、血液、唾
液、精液、脳脊髄液、血漿、リンパ液または他の体液に
おけるドーパミンまたはドーパミン同族体の検出方法を
も提供する。

図面の説明 第１図は、ヒトD₄ドーパミンリセプタ遺伝子からなる
ゲノムクローンの構造を示す。

ゲノムヒトドーパミンD₄リセプタクローンの制限マッ
プ、およびヒトドーパミンD₂リセプタのゲノムイントロ
ン／エキソン構成との整列、並びにD₄リセプタにおける
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位が示される。Sal I
部位はEMBL3におけるクローン化部位の部分である。提
案されたコード化領域に枠を施し、ローマ数字で番号を
付ける。提案されたイントロン／エクソン接合部位の完
全な一致が、リセプタクローン間の点線を接続して示さ
れる。

第２図は、ヒトD₄ドーパミンリセプタク遺伝子のゲノ
ムおよびcDNAクローンのヌクレオチド配列を示す。

ヒトドーパミンリセプタク遺伝子およびcDNAのヌクレ
オチドおよび推定アミノ酸配列が示される。推定コード
配列を大文字で示し（非コード配列はイタリックで示
す）、さらに推定アミノ酸配列をヌクレオチド配列の上
側に示す。推定コード配列の番号付けは開放読枠の第１
メチオニンで始まる。cDNAクローンに対応する配列には
ハッチングする。

第３図は、哺乳動物ドーパミンリセプタのアミノ酸配
列の連携を示す。

ヒトD₄リセプタクの推定アミノ酸配列とヒトおよびラ
ットD₂、ラットD₃並びにヒトおよびラットD₁リセプタと
の連携を示す。ドーパミンリセプタの群内で保持される
アミノ酸に陰影を施す。推定経膜領域には上線を施し、
ローマ数字で標識する。

第４図は、トランスフェクトされたCOS−７細胞膜に
対する［H³］スピペロンの結合を示す。

クローン化されたヒトドーパミンD₄リセプタを発現す
るCOS−７細胞からの膜に対する［H³］スピペロンの特
異的結合の飽和等温線が示される。示した結果は、それ
ぞれ２反復で行なった２つの独立した実験を示す。内枠
は、同じデータの分散プロットを示す。推定Ｂ（最大）
（約260fモル/mg蛋白）およびＫ（１）（70pM）の数値
はリガンドコンピュータプログラムによって得られた。

第５図は、トランスフェクトされたCOS−７細胞に対
する［H³］スピペロンの結合の薬理学的特異性を示す。

図示した曲線は、各種のドーパミン性作用剤および拮
抗剤による［H³］スピペロンの結合に関する濃度依存性
の阻止を示す。データはリガンドにより分析し、示した
結果は２反復測定値の平均である。推定K_I値を、GH
（４）ZR（７）細胞で発現されたヒトD₂リセプタにて得
られたK_I値と一緒に第Ｉ表に示す。

好適具体例の詳細な説明 ここに用いた「D₄ドーパミンリセプタ」という用語
は、第２図に示したヌクレオチド配列によりコードされ
る蛋白と実質的に相同であると共に実質的に同じ生物学
的活性を有する蛋白（すなわちクロザピンに対し高い親
和性の結合を示す蛋白）を意味する。この規定は、D₄ド
ーパミンリセプタ配列における天然対立型を包含するこ
とを意図する。本発明のクローン化遺伝子はマウス、ラ
ット、ウサギ、ネコおよびヒトを包含する任意の動物の
D₄ドーパミンリセプタをコード化しうるが、好ましくは
哺乳動物、特に好ましくはヒトのリセプタをコードす
る。

ヌクレオチド塩基はここでは次のように略記される： Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン アミノ酸残基は、ここでは３つの文字または単一の文
字で次のように略記される： Ala;A＝アラニン Arg;R＝アルギニン Asn;N＝アスパラギン Asp;D＝アスパラギン酸 Cys:c＝システイン Gln;Q＝グルタミン Glu;E＝グルタミン酸 Gly;G＝グリシン His;H＝ヒスチジン Ile;I＝イソロイシン Leu;L＝ロイシン Lys;K＝リシン Met;M＝メチオニン Phe;F＝フェニルアラニン Pro:P＝プロリン Ser;S＝セリン Thr;T＝スレオニン Trp;W＝トリプトファン Tyr;Y＝チロシン Val;V＝バリン 遺伝子工学によりクローン化遺伝子からたとえばD₄ド
ーパミンリセプタのような蛋白を産生することは周知さ
れている［たとえばベル等に係る米国特許第4,761,371
号、第６欄第３行〜第９欄第65行、参照］（本明細書で
引用される全ての米国特許の開示を参考のためここに挿
入する）。以下の説明はしたがってこの技術分野の概説
を意図し、全技術状態を反映するものでない。

D₄ドーパミンリセプタをコードするDNAは、本発明の
開示に鑑み、化学合成により或いは適する細胞もしくは
細胞ライン培養物からのmRNAの逆転写をスクリーニング
することにより或いは適する細胞からのゲノム保存物を
スクリーニングすることにより或いはこれら手順の組合
せにより下記するように得ることができる。mRNAもしく
はゲノムDNAのスクリーニングは、ここに示したD₄ドー
パミンリセプタ遺伝子配列情報から得られたオリゴヌク
レオチドプローブを用いて行なうことができる。プロー
ブはたとえば螢光性、放射性原子もしくは化学ルミネセ
ンス基のような検出しうる基で公知の手法により標識す
ると共に慣用のハイブリッド化分析で使用することがで
き、これらにつき後記実施例に一層詳細に説明する。代
案として、D₄ドーパミンリセプタ遺伝子配列はポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて得ることもでき、PCRオ
リゴヌクレオチドプライマはここに示したD₄ドーパミン
リセプタ遺伝子配列から産生される［ムリス等に係る米
国特許第4,683,195号およびムリスに係る第4,683,202号
参照］。

D₄ドーパミンリセプタは、D₄ドーパミンリセプタをコ
ードするDNAを含有したベクターにより形質転換させた
宿主細胞で合成することができる。ベクターは複製しう
るDNA構成である。ここではベクターを用いて、D₄ドー
パミンリセプタをコードするDNAを増殖させるか或いはD
₄ドーパミンリセプタをコードするDNAを発現させる。発
現ベクターは複製しうるDNA構成であって、D₄リセプタ
をコードするDNA配列を適する宿主にてD₄リセプタの発
現を行ないうる適当な制御配列に作用結合させる。この
種の制御配列の必要性は、選択する宿主および選択する
形質転換法に依存して変化する。一般に制御配列は転写
プロモータ、転写を制御する適宜のオペレータ配列、適
するmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、および
転写と翻訳との停止を制御する配列を含む。増殖ベクタ
ーは発現制御領域を必要としない。必要とすることは、
一般に複製のオリジンにより与えられる宿主における複
製の能力、および形質転換体の識別を容易化させる選択
遺伝子である。

本発明を実施するのに有用なベクターはプラスミド、
ウィルス（ファージを含む）、レトロウィルスおよび組
込みうるDNA断片（すなわち相同組換により宿主ゲノム
中に組込みうる断片）を包含する。ベクターは宿主ゲノ
ムとは独立して複製しかつ機能し或いは場合によりゲノ
ム自身に組込むことができる。適するベクターはレプリ
コンおよび所定の発現宿主と適合しうる動物から得られ
る制御配列を含有する。形質転換された宿主細胞は、組
換DNA技術を用いて作成されたD₄リセプタベクターで形
質転換もしくはトランスフェクトされた細胞である。形
質転換された宿主細胞は一般にD₄リセプタを発現する
が、D₄リセプタDNAをクローン化または増殖する目的で
形質転換させた宿主細胞はD₄リセプタを発現する必要が
ない。発現されると、D₄リセプタは典型的には宿主細胞
の膜に位置する。

DNA領域は、これらが互いに機能的に関連する場合に
は作用結合する。たとえばプロモータは配列の転写を制
御する場合はコード配列に作用結合し、リボソーム結合
部位は翻訳を可能にするよう位置せしめる場合はコード
配列に作用結合する。一般に作用結合とは隣接を意味
し、リーダー配列の場合には隣接した同じ翻訳読枠を意
味する。

多細胞生物から得られる細胞の培養物が、組換D₄ドー
パミンリセプタ合成につき望ましい宿主である。原理的
に、任意の高級真核細胞培養物を脊椎動物または無脊椎
動物の培養物のいずれであっても用いることができる。
しかしながら、実施例で示すように哺乳動物細胞が好適
である。細胞培養物におけるこの種の細胞の増殖が日常
の作業となった［組織培養、アカデミックプレス社、ク
リンスおよびパターソン編（1973）参照］。有用な宿主
細胞ラインの例はVEROおよびHeLa細胞、支那ハムスター
卵巣（CHO）細胞ライン、並びにWI138、BHK、COS−７、
CVおよびMDCK細胞ラインである。この種の細胞に対する
発現ベクターは一般に（必要に応じ）複製のオリジン、
発現すべき遺伝子から上流に位置するプロモータ、リボ
ソーム結合部位、RNAスプライス部位（イントロン含有
ゲノムDNAを使用する場合）、ポリアデニル化部位およ
び転写停止配列を含む。

脊椎動物細胞を形質転換する際に使用すべき発現ベク
ターにおける転写および翻訳制御配列は、しばしばウィ
ルス源により与えられる。たとえば、一般的に用いるプ
ロモータはポリオーマ、アデノウィルス２およびサルウ
ィルス40（SV40）から誘導される［たとえば米国特許第
4,599,308号参照］。SV40の早期および後期プロモータ
が有用である。何故なら、これら両者はSV40ウィルス複
製オリジンをも含有する断片としてウィルスから容易に
得られるからである［フィアス等、ネイチャー、第273
巻、第113頁（1978）参照］。さらに、ヒトゲノムD₄リ
セプタプロモータ、制御配列および／または信号配列も
使用しうるが、ただしこの種の制御配列は選択する宿主
細胞に対し適合性とする。

複製オリジンは、たとえばSV40または他のウィルス源
（たとえばポリオーマ、アデノウィルス、VSVもしくはM
PV）から誘導しうるような外来オリジンを含むようベク
ターの構成によって与えることができ、或いは宿主細胞
の染色体複製メカニズムによって与えることができる。
ベクターを宿主細胞の染色体に組込む場合は、後者にて
充分である。

本発明によりクローン化遺伝子から作成されたD₄ドー
パミンリセプタは、D₄ドーパミンリセプタ活性のための
化合物をスクリーニングすべく或いは溶液（たとえば血
漿もしくは血清）におけるドーパミン性薬物の量を測定
すべく使用することができる。たとえば宿主細胞を本発
明のベクターで形質転換させ、D₄ドーパミンリセプタを
その宿主で発現させ、細胞を溶解させ、次いでこれら細
胞からの膜を使用してD₄ドーパミンリセプタ結合活性に
つき化合物をスクリーニングすることができる。この種
の手法を行ないうる競合結合分析は、たとえば後記実施
例に示すように周知されている。通常はドーパミンリセ
プタを発現しない宿主細胞を選択することにより、D₄リ
セプタを含有する膜の純粋な調製物を得ることができ
る。さらに、D₄ドーパミンリセプタ作用剤および拮抗剤
は、宿主細胞を本発明のベクターで形質転換させて同定
することができる。この種の細胞から得られる膜は、薬
物解離活性を監視する結合試験で用いることができる。
この種の細胞は血漿または他の細胞膜にD₄蛋白を含有せ
ねばならない。これらの分析を行なうための手法につい
ても後記実施例に一層詳細に説明する。

本発明のクローン化された遺伝子およびベクターは、
通常はD₄ドーパミンリセプタを発現しない細胞を形質転
換させて、このリセプタをその後に発現させる分子生物
学にて有用である。この種の細胞は、リセプタ結合分析
に有用な細胞膜調製物を作成するための中間体として有
用であり、次いでこれらは薬物スクリーニングに有用で
ある。さらに、本発明の遺伝子およびベクターは遺伝子
治療に有用である。この種の目的でテミンおよびワタナ
ベに係る米国特許第4,650,764号またはミラーに係る米
国特許第4,861,719号に記載されたレトロウィルスベク
ターを用いることができる。本発明のクローン化遺伝子
またはその断片は、相同組換または部位指向突然変異で
行なわれる遺伝子治療に使用することもできる［一般に
K.トーマスおよびM.カペッチー、セル、第51巻、第503
〜512頁（1987）;W.バートリング、バイオサイエンス・
レポート、第７巻、第107〜112頁（1987）;O.スミチエ
ス等、ネイチャー、第317巻、第230〜234頁（1985）参
照］。

本発明のクローン化遺伝子およびそれらから得られる
オリゴヌクレオチドは、或る種の遺伝子障害に関連する
制限断片長多型（RFLP）をスクリーニングするのに有用
である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、神経組織におけるD₄
リセプタ遺伝子発現を検査するための診断用具として有
用である。たとえば、検出しうる基を有するオリゴヌク
レオチドプローブを用い、慣用の放射線写真技術（後記
実施例に詳細に説明する）により組織をその場で検査し
て、このリセプタの本来の発現またはそれに関連する病
理学的状態を検査することができる。さらに、染色体を
検査してD₄ドーパミンリセプタ遺伝子の存在もしくは不
存在およびこれに関連する潜在的な病理学的状態を検査
することもでき、これについても後記実施例で示す。

以下の実施例は本発明の特定具体例およびその各種の
用途を示すものである。これらは単に説明の目的で示し
たに過ぎず、決して本発明を限定するものと解釈しては
ならない。

実施例１ ドーパミン様リセプタ発現に関する組織および細胞ライ
ンRNAのスクリーニング ブンゾウ等、ネイチャー、第336巻、第783〜787頁（1
988）に記載されたグアジニウムチオシアネート/CsCl法
を用いて、RNAを種々異なるラット組織もしくは細胞ラ
インから作成した。これら組織は心臓、副睾丸、睾丸、
腸、膵臓、脾臓、胸腺、筋肉、心室、心房、肺、副腎、
腎臓、肝臓、松果体および下垂体を包含した。スクリー
ニングした細胞ラインはSK−Ｎ−MC、SK−Ｎ−SH、CO
S、AKR1、Ltk^-、GH4Cl、NG108−15、AtT20、3T3、BSC4
0、C6、CV−１、Hela、IMR−32、N4TG1、NCB−20、PC−
12、Rion m5fおよびWERI−Rb−１を含んだ。20μｇのR
NAを、推定の経膜領域VIおよびVIIをコードするラットD
₂リセプタの放射能標識されたBstY I−Bgl II DNA断片
を用いノーザンブロットハイブリット化により分析し
た。用いたハイブリッド化条件は25％ホルムアミド、1M
NaCl、１％SDS、100μg/ml変性鮭精子DNA、0.2％ポリ
ビニルピロリドン、0.2％フィコールおよび0.05Mトリス
/HCl（pH7.4）とし、ハイブリッド化を37℃にて１晩行
なった。次いでブロットを2X標準塩水／クエン酸塩（SS
C）および１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で55℃に
て洗浄した。増感スクリーンを用い露出を−70℃にて２
日間行なった。比較のため同じブロットを高厳密性条件
下でハイブリッド化させ、その条件はハイブリッド化に
つき50％ホルムアミドおよび42℃、並びに洗浄のための
0.2X SSCを用いる同じ条件とした。高厳密性および低
厳密性の下では副腎のみがプラス信号を示したのに対
し、低厳密性の下ではSK−Ｎ−MCラインも信号を示し
た。

実施例２ 神経芽細胞RNAを用いるcDNAファージ保存物の作成 二本鎖cDNAを、標準技術［J.サムブルック等、モレキ
ュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス社（1989）参照］により、実施例１に記載したヒ
ト神経芽細胞ラインSK−Ｎ−MCより分離されたポリ
（Ａ）＋mRNAから合成した。このcDNAをファージクロー
ン化用ベクターλZAPII［ストラタジーン、11099ノース
・トレー・パインズ・ロード、ラ・ジョラ、CA92037］
のEcoR IおよびXho I制限エンドヌクレアーゼ部位に直
接的にクローン化させた。保存物をコロニープラークス
クリーンフィルタ［ニュー・イングランド・ヌクレア
社、549アルバニー・ストリート、ボストン、MA02118］
に移し、25％ホルムアミド、0.2％ポリビニルピロリド
ン、0.2％フィコール、0.05Mトリス/HCl（pH7.5）、1M
NaCl、0.1％ピロホスフェート、１％SDSおよび変性鮭
精子DNA（100μg/ml）にて37℃で１晩にわたり予備ハイ
ブリッド化させた。約500,000個の独立したクローンを
ハイブリッド化の低厳密性条件下でスクリーニングし
た。ハイブリッド化は、ラットD₂リセプタクローンの1.
6kb BamH I−BglI Iおよび300bpのBstY I−BglI I断片
を用いて30時間行い、ランダムプライミング標識システ
ム［ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社、
秘書箱50414、インジアナポリス、IN46250］を用い、10
⁶dpm/μｇの比活性にてP³²−標識した。これらフィルタ
を2X SSCおよび１％SDSにて55℃で洗浄した。クローン
D₂10Sを分離し、シクエナーゼ［U.S.バイオケミカル・
コーポレーション社、秘書箱22400、クリーブランド、O
H44122］により触媒されるサンガー・ジデオキシ連鎖停
止法により配列決定した。このクローンの配列を第２図
（ハッチング部分）に示す。

実施例３ ヒトドーパミンリセプタプローブを用いるゲノムDNAフ
ァージ保存物のスクリーニング クローンD₂10Sをランダムプライミング合成によりP³²
−標識すると共に、これを用いてファージベクターEMBL
3（クローンテク社）でクローン化した市販のヒトゲノ
ム保存物をスクリーニングした。ハイブリッド化は、50
％ホルムアミドを用いて実施例２に記載したように行な
った。ハイブリッド化の後、フィルタを0.1X SSCおよ
び0.1％SDSにて65℃で洗浄した。クローンD₂10Gを分離
し、制限エンドヌクレアーゼおよびサウザンブロット分
析により分析した。このゲノムクローンのマップを第１
図に示し、ここでD₄リセプタ遺伝子の構造をD₂遺伝子の
構造と比較した。D₄リセプタ遺伝子の1.3kbおよび2.6kb
Pst I−Pst I断片、並びに重なる2.0kb Sal I−EcoR
I断片をプラスミドpBluescript−SK（ストラトジー
ン）にサブクローン化させた。サブクローン化された断
片を、上記したように配列分析により特性化した。この
配列を第２図に示す。

実施例４ ヒトD₄ドーパミンリセプタのDNA配列分析 低厳密性におけるラットD₂プローブ（D₂10S）でSK−
Ｎ−MC神経芽細胞保存物をスクリーニングすることによ
り検出されたcDNAクローンの１種は780bpのラットプロ
ーブにハイブリッドするEcoR I−Xho I挿入物を有して
いる。この挿入物の配列分析は、第３図示したようにD₂
リセプタの経膜領域Ｖ（45％）、VI（46％）およびVII
（78％）のアミノ酸配列に対する相同性にて開放読枠の
存在を示した。

高厳密性条件下におけるクローンD₂10Sを用いたヒト
ゲノムEMBL3保存物（クローンテク）のスクリーニング
により、ゲノムクローンD₂10Gを分離した。サウザンブ
ロットおよび配列分析は、このクローンがD₂10Sの全遺
伝子をコードする5kb Sal I−Pst I断片を有すること
を示した。配列分析はSal I部位から590bp下流に潜在的
翻訳開始コドン（ATG）を示し、次いでD₂リセプタの経
膜領域Ｉ（36％）およびII（63％）とのアミノ酸配列相
同性を示す開放読枠が存在した。経膜領域IIからほぼ直
ぐ下流でD₂リセプタに対する相同性が消失し、これはゲ
ノムDNAにおけるイントロンの存在を示す。このイント
ロンは約2kbの範囲にわたり、その後にD₂リセプタに対
する配列相同性が再び生じた。推定遺伝子生産物の翻訳
はD₂リセプタの経膜領域III（68％）、IV（37％）、Ｖ
（46％）およびVII（78％）の相同性を示した（第３図
参照）。

経膜領域II、IIIおよびIVには第１図に示すように、
潜在的なスプライス接合ドナーおよびアクセプタ部位
［マウント、ヌクレア・アシッズ・リサーチ、第10巻、
第461〜472頁（1982）］が見られた。これらスプライス
部位はD₂およびD₃リセプタ遺伝子および第１図における
と同様に同一位置に存在した［D.K.グランジー等、プロ
シーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、
USA、、第86巻、第9762〜9766頁（1989）;R.ダルトソ
等、EMBOジャーナル、第８巻、第4025〜4034頁（198
9）;P.ソコロフ等、ネイチャー、第347巻、第146〜151
頁（1990）］。経膜領域VIから下流のコード配列はクロ
ーンD₂10Sの配列と同一であるが、経膜領域ＶとVIとの
間の約300bpのイントロンおよび経膜領域VIにおける92b
pの他のイントロンによって中断される（第１図、ハッ
チング部分）。経膜ＶとVIとの間のイントロンに関する
スプライス部位の正確な位置は、コード配列に存在する
52bpの配列がイントロンの両側で正確に反復するという
事実により決定することができない（第２図）。

ゲノムおよびcDNAヌクレオチド配列からの推定アミノ
酸配列は、この遺伝子が41kDの見掛け分子量を有する38
7アミノ酸の蛋白をコードすることを示した。この蛋白
配列の疎水性プロットは７個の経膜領域の存在を示唆す
る。これら領域はヒトD₂リセプタおよびＧ−蛋白結合リ
セプタ群に属する他のリセプタにおける観察された相同
領域と相関する［J.R.ブンゾウ等、ネイチャー、第336
巻、第783〜787頁（1988）;P.ソコロフ等、ネイチャ
ー、第347巻、第146〜151頁（1990）;H.G.ドールマン
等、バイオケミストリー、第26巻、第2657〜2664頁（19
87）および第２図］。開始メチオニンから下流の２個の
アミノ酸は潜在的なＮ−結合グリコシル化部位である
［S.ヒューバードおよびR.イバット、アニュアル・レビ
ュー・バイオケミストー、第50巻、第555〜583頁（198
1）］。D₄リセプタにおけるアミノ酸残基Asp（80）およ
びAsp（115）はカテコールアミン性リセプタ群で保持さ
れ、カテコールアミン結合でセンチュリオンとして作用
すると思われる［C.D.ストラダー等、ジャーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー、第263巻、第10267〜10271
頁（1988）］。さらにカテコールアミン性リセプタ群に
はSer（197）およびSer（700）も保持され、これらはカ
テコールヒドロキシル基と相互作用することが示唆され
ている［M.コザック、ヌクレイック・アシッド・リサー
チ、第12巻、第857〜872頁（1984）］。蛋白キナーゼＣ
および蛋白キナーゼＡによる潜在的ホスホリル化のため
の数種の共通部位が第３細胞質ループに認められる［D.
R.シブレー等、セル、第48巻、第913〜922頁（1987）;
M.ブービール等、ネイチャー、第333巻、第370〜373頁
（1988）］。パルミトイル化のための基質として作用し
うるCys（187）はＧ−蛋白結合リセプタの大部分で保持
される［B.F.オドウド等、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー、第264巻、第7564〜7569頁（198
9）］。D₂およびD₃リセプタと同様にCys（387）で終端
する短いカルボキシル末端［J.R.ブンゾウ等、ネイチャ
ー、第336巻、第783〜787頁（1988）;D.K.グランジー
等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス、USA、第86巻、第9762〜9766頁（1989）;R.ダル
トソ等、EMBOジャーナル、第８巻、第4025〜4034頁（19
89）;P.ソコロフ等、ネイチャー、第347巻、第146〜151
頁（1990）］および比較的大きい第３細胞質ループは、
異性型（isoform）のＧ蛋白と相互作用する殆どのリセ
プタで観察される特徴である。

実施例５ ドーパミンリセプタcDNAを用いる哺乳動物DNA発現ベク
ターの作成 Sal I−Pst I遺伝子断片（第１図、経膜領域Ｖの後の
エクソンIIIに見られるPst I部位）を、SK−Ｎ−MC cD
NAから分離された対応のPst I−EcoR I cDNA断片に結
合させた。次いで、この作成物をベクターpCD−PSにク
ローン化させた［ボナー等、ニューロン、第１巻、第40
3〜410頁（1988）］。このベクターは、SV40プロモータ
からのヒトD₄リセプタ遺伝子の発現を可能にする。標準
技術を用いて、多量のpCD−PS−D₄構成プラスミドを作
成した。このプラスミドを燐酸カルシウム沈澱技術［ゴ
ーマン等、サイエンス、第221巻、第551〜553頁（198
3）］によりCOS−７細胞にトランスフェクトした。２日
間の後に膜細胞を集め、実施例６に記載したように分析
した。

実施例６ D₄ドーパミンリセプタにおけるドーパミン−拮抗剤結合
の分析 細胞を集め、5mM EDTAと1.5mM CaCl₂と5mM MgCl₂
と5mM KClと120mM NaClとを含有する50mMトリス−HCl
（pH7.4、４℃）の緩衝液にてテフロン乳棒を用いてホ
モゲナイズした。ホモゲナイズ物を39,000gにて15分間
にわたり遠心分離し、得られたペレットを150〜250μg/
mlの濃度にて緩衝液に再懸濁させた。飽和実験のため0.
25mlの組織ホモゲナイズ物を、［H³］スピペロンの濃度
を増大させながら（70.3Ci/ミリモル;10〜3000pM最終濃
度）1mlの全容積にて22℃で120分間にわたり２反復でイ
ンキュベートした。これら実験の結果を第４図示す。競
合結合実験のため、分析を0.25mlの膜の添加により開始
し、第５図に示した競合性リガンドの濃度（10^-14〜10
^-3M）および［H³］スピペロンの濃度（150〜300pM）に
て22℃で120分間にわたり２反復でインキュベートし
た。イターテク・セル・ハーベスタでの急速濾過により
分析を終了させ、次いでフィルタを監視して放射性トリ
チウムを定量した。全実験につき、比［H³］スピペロン
結合を10μＭ（＋）スルピリドにより阻止されるものと
規定した。飽和および競合の結合データを、デジタルマ
イクロ−PP−11で行なう非線状最小自乗曲線近似プログ
ラム・リガンドにより分析した。ヒトD₄ドーパミンリセ
プタは、この分析にて［H³］スピペロン結合の阻止につ
き次の薬理学的性質を示した：スピペロン＞エチクロプ
リド＞クロザピン＞（＋）−ブタクラモール＞ラクロプ
リド＞SCH23390。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 チヴェリ、 オリヴィエ アメリカ合衆国 97212 オレゴン州 ポートランド ノースイースト トゥェ ンティフォース アヴェニュー 3012 (72)発明者 ヴァン トル、 ヒューバート カナダ国 エム５エム ２ケイ３ オン タリオ州 トロント ブルック アヴェ ニュー 133 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/12 C12P 21/02 C07K 14/705 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／Ｇｅｎｅｓ ｅｇ

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列、 で表されるアミノ酸配列をコードするヒトのドーパミン
   リセプタD₄遺伝子または核酸。
2. 【請求項２】請求項１に記載のアミノ酸配列をコードす
   る遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、クロザピンに対して高い親和性を有するドーパミン
   リセプタを発現する遺伝子または核酸。
3. 【請求項３】次のアミノ酸配列、 で表されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列にお
   いて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
   加されたアミノ酸配列を有する、41kDのヒトドーパミン
   リセプタD₄。
4. 【請求項４】請求項３に記載のアミノ酸配列、または前
   記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
   失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、クロ
   ザピンに対して高い親和性を有するドーパミンリセプ
   タ。
5. 【請求項５】請求項１または２に記載の遺伝子を含む組
   換ベクター。
6. 【請求項６】請求項１に記載の遺伝子を含み、真核細胞
   中でヒトドーパミンリセプタD₄を発現する組換ベクタ
   ー。
7. 【請求項７】請求項５または６に記載の組換ベクターを
   含み、真核細胞からなる形質転換体。
8. 【請求項８】請求項１または２に記載の遺伝子のヌクレ
   オチド配列の一部もしくは断片を含み、ヒトドーパミン
   リセプタD₄の遺伝子とハイブリダイズすることが可能な
   核酸プローブ。
9. 【請求項９】ヒトドーパミンリセプタD₄に結合するドー
   パミンの阻止剤としての化合物をスクリーニングするに
   際し、 （ａ）真核細胞においてヒトドーパミンリセプタD₄を発
   現することができる請求項５または６に記載の発現ベク
   ターで真核細胞培養体をトランスフォームして、 （ｂ）検出しうるドーパミン同族体の結合を阻止する化
   合物の能力をアッセイすることを備えるスクリーニング
   法。
10. 【請求項１０】抗精神病用の化合物をスクリーニングす
    るに際し、 （ａ）真核細胞においてヒトドーパミンリセプタD₄を発
    現することができる請求項５または６に記載の組換ベク
    ターで真核細胞培養体をトランスフォームして、 （ｂ）検出しうるドーパミン同族体の結合を阻止する化
    合物の能力をアッセイし、 （ｃ）D₄ドーパミンリセプタに対する親和性に基づいて
    抗精神病活性についてテストすることを備えるスクリー
    ニング法。
11. 【請求項１１】ヒトドーパミンリセプタD₄に結合するド
    ーパミンの阻止剤としての化合物を定量的に検出するに
    際し、 （ａ）真核細胞においてヒトドーパミンリセプタD₄を発
    現することができる請求項５または６に記載の組換ベク
    ターで真核細胞培養体をトランスフォームして、 （ｂ）検出しうるドーパミン同族体の結合の阻止の程度
    を測定することによって化合物の量をアッセイすること
    を備える定量的検出法。
12. 【請求項１２】テストされるべき化合物がヒトの中に存
    在している請求項11に記載の方法。
13. 【請求項１３】化合物がヒトの血液中に存在している請
    求項11に記載の方法。
14. 【請求項１４】化合物がヒトの脳脊髄液中に存在してい
    る請求項11に記載の方法。
15. 【請求項１５】化合物がヒトの脳内に存在している請求
    項11に記載の方法。
16. 【請求項１６】化合物が未知のものである請求項11に記
    載の方法。