JP2961237B2 - 繊維芽細胞増殖因子−１モノクローナル抗体及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、繊維芽細胞増殖因子モ
ノクローナル抗体及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】繊維芽細胞増殖因子は、９種類の因子
（繊維芽細胞増殖因子−１〜９）から構成されているタ
ンパク質又は遺伝子ファミリーである。これらのファミ
リーは、いずれの繊維芽細胞増殖因子もアミノ酸配列に
おいて約30〜60％のホモロジーを有する類似タンパク質
群である。従って、それぞれの因子のみを特異的に認識
するモノクローナル抗体の作成は非常に困難である。ま
た、様々な種類の動物細胞の内部に存在する未知のタン
パク質の中から繊維芽細胞増殖因子−１のみを特異的に
認識できるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体
は、現在では知られていない。

【０００３】さらに本願発明者は、繊維芽細胞増殖因子
−１に対する抗体が、その由来がポリクローナルである
と、モノクローナルであるとを問わず、動物細胞の内部
に存在する複数の未同定のタンパク質との交差反応する
ことを経験している。すなわち、抗繊維芽細胞増殖因子
−１抗体の場合、細胞に存する無関係なタンパク質と交
差反応しやすいので、必ずしも抗繊維芽細胞増殖因子−
１抗体が繊維芽細胞増殖因子−１と特異的に反応すると
は限らない。このことは、動物細胞が産生している繊維
芽細胞増殖因子−１を、他の細胞や組織のタンパク質と
混合した状態で未精製のまま検出又は定量しようとする
ことが極めて困難であることを意味しており、大きな問
題となっている。

【０００４】一方、繊維芽細胞増殖因子−１は、血管内
皮細胞、血管平滑筋細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝臓
細胞などをはじめ、内胚葉、神経外胚葉に由来する各種
細胞の増殖促進に用いることができるほか、神経細胞な
どの分化形質の促進にも用いることのできる有用な増殖
因子である。また、動物胚の初期発生において中胚葉誘
導にも用いることができる。さらに、生体内の現象とし
て血管新生、関節炎、緑内障、さらに脳において学習行
動や摂食行動にも調節因子として深く関わっていること
が示されている。このように、繊維芽細胞増殖因子−１
は多くの重要な生命現象において決定的な働きをしてい
る点で有用であるため、繊維芽細胞増殖因子−１のみと
特異的に反応し、その他の細胞成分や成体成分とは反応
しないモノクローナル抗体が強く必要とされる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、繊維芽細胞
増殖因子−１のみと特異的に反応するモノクローナル抗
体およびその製造方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、繊維芽細胞増殖因子
−１遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換された形
質転換体又は繊維芽細胞増殖因子−１を自然発現してい
る細胞から得られる総タンパク質を用いてスクリーニン
グすることにより、繊維芽細胞増殖因子−１のみと特異
的に反応するモノクローナル抗体を得ることに成功し、
本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、繊維芽細胞増殖因子
−１のみと特異的に反応することを特徴とする繊維芽細
胞増殖因子−１モノクローナル抗体である。さらに、本
発明は、繊維芽細胞増殖因子−１で免疫した哺乳動物の
免疫細胞と骨髄腫細胞との融合細胞から産生されるモノ
クローナル抗体を、繊維芽細胞増殖因子−１遺伝子を含
む発現ベクターにより形質転換された形質転換体又は繊
維芽細胞増殖因子−１を自然発現している細胞から産生
される総タンパク質と反応させ、前記モノクローナル抗
体のうち、該総タンパク質中の繊維芽細胞増殖因子−１
のみと特異的に反応するものを選出することを特徴とす
る繊維芽細胞増殖因子−１モノクローナル抗体の製造方
法である。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
モノクローナル抗体は、次のようにして得ることができ
る。まず、哺乳動物を繊維芽細胞増殖因子−１（以下
「ＦＧＦ−１」という）で免疫した後に脾細胞を取り出
し、得られる脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と
を融合させる。次に、得られる融合細胞をＨＡＴ培地に
よる選択を行ってＦＧＦモノクローナル抗体を産生する
融合細胞を得る。この段階では、得られる融合細胞の中
には、ＦＧＦの各ファミリーと結合してしまうモノクロ
ーナル抗体を産生するものが含まれている。

【０００９】そこで、これらの融合細胞から産生される
モノクローナル抗体を、ＦＧＦ−１遺伝子を含む発現ベ
クターによって形質転換された形質転換体又は繊維芽細
胞増殖因子−１を自然発現している細胞が産生する総タ
ンパク質と反応させる。そして、総タンパク質中のＦＧ
Ｆ−１以外のタンパク質とは反応せず、かつ、ＦＧＦ−
１のみと特異的に反応したものを本発明のＦＧＦ−１モ
ノクローナル抗体として得る。

【００１０】本発明のＦＧＦ−１モノクローナル抗体を
産生する融合細胞は保存が可能であり、培養により、又
はマウス腹腔の腹水中に産生させることにより、いつで
も本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。 (1) 抗体産生細胞の調製 免疫用ＦＧＦ−１は、哺乳類由来のもの、例えば、ヒ
ト、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスタ
ー、ラット、マウスのＦＧＦを用いることができる。ま
た、ニワトリなどの鳥類やカエルなどの両生類由来のＦ
ＧＦも用いることが可能である。ＦＧＦ−１の調製は、
公知の方法により行いうる（Burgess, W.H. et al., (1
985) J. Biol. Chem., 260, 11389-11392) 。さらに、
遺伝子組み換え体によって作成したＦＧＦ−１を免疫用
ＦＧＦ−１として用いることもできる。

【００１１】また、免疫用哺乳動物としては、例えば、
マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット等が挙げら
れ、マウスには、BALB/C、C57BL/6 、ＩＣＲ系マウス等
が用いられる。そして、免疫動物一匹に対して、４週齢
〜20週齢のマウスの場合 0.1〜1,000μｇの量を抗原と
して１〜４週間ごとに２〜５回免疫を行う。また、必要
に応じて、フロイントの完全又は不完全アジュバントを
添加してもよい。動物の飼育及び脾細胞の採取は常法に
従う（岩崎辰夫ら著，「単クローン抗体−ハイブリドー
マとELISA 」，講談社サイエンティフィク, 講談社1983
年発行 )。

【００１２】(2) ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、P3XAg8.653（ATCC CRL-158
0)、P3X63Ag8U.1 (ATCCCRL-1597) 、P3/NS1/1-Ag4-1（C
RL-TIB-18）、Sp2/0-Ag14（CRL-1581) 等が挙げられ
る。これら細胞の継代培養についても常法に従えばよい
（岩崎ら，上掲）。 (3) 細胞融合 細胞融合についても、公知の方法を用いることができる
（岩崎ら，上掲）。例えば、脾細胞とミエローマ細胞と
を25：１〜１：１の割合で混合し、分子量1,000〜10,00
0のポリエチレングリコールを50％含むRPMI-1640培地
中、両細胞を25〜37℃で１〜10分間インキュベートする
ことにより細胞融合を行う。

【００１３】(4) 融合細胞の調製 融合細胞（以下「融合細胞」を「ハイブリドーマ」とい
うこともある）は、ヒポキサンチン（50〜200μＭ）、
アミノプテリン（0.2 〜0.8μＭ）、チミジン（８〜32
μＭ）、ペニシリン（25〜100単位／ml）、牛胎児血清
（２〜20％）、ストレプトマイシン（25〜100μg/m
l）、ピルビン酸ナトリウム（50〜220μg/ml、L-グルタ
ミン(150〜600μg/ml) を添加した基礎培地を用いて選
択培養し、免疫ブロッティングにより、抗ＦＧＦ−１
ＩｇＧを産生可能な細胞を陽性細胞として得る。次に、
陽性細胞を限界希釈法によりサブクローニングする。

【００１４】通常は、この段階で、同じ抗原を用いて反
応性の強いものをスクリーニングした後、有用株のクロ
ーニングを繰り返し行い、最終的に得られたクローンか
ら得られるモノクローナル抗体を、その結合特異性など
について特徴付けを行う。しかし、抗ＦＧＦ−１抗体の
場合、細胞に存する無関係なタンパク質と交差反応しや
すいことを本願発明者は見出しているので、必ずしも抗
ＦＧＦ−１抗体がＦＧＦ−１のみと特異的に反応すると
は限らない。

【００１５】そこで、スクリーニングの段階で抗原に用
いたＦＧＦ−１を用いるのではなく、本発明では、ＦＧ
Ｆ−１を強制発現させた細胞株の総タンパク質を電気泳
動で分離したものを用いて、ＦＧＦ−１を認識するこ
と、および他の細胞タンパク質に交差反応しないことを
同時に指標として有用なモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマを選出する。

【００１６】(5) ハイブリドーマの選出 (4)によりサブクローニングされたハイブリドーマが産
生するモノクローナル抗体を、ＦＧＦ−１を自然発現す
る組織若しくは細胞の総タンパク質と反応させ、また
は、該モノクローナル抗体を、ＦＧＦ−１を強制発現さ
せた細胞株が産生する総タンパク質と反応させる。ＦＧ
Ｆ−１を自然発現する組織としては、哺乳類動物の脳の
全部若しくは一部、多くの骨格筋若しくは心筋、再生中
の肝臓又は関節炎局所の組織などを使用することができ
る。但し、これら以外の組織でもＦＧＦ−１が発現して
いる組織であれば特に限定されずに使用することができ
る。

【００１７】ＦＧＦ−１を自然発現する細胞としては、
ＭＨ１Ｃ１カルシノーマ細胞、Ｌ６筋芽細胞、再生中の
肝臓から取り出した肝実質細胞などを使用することがで
きる。但し、これら以外の細胞でもＦＧＦ−１が発現し
ている細胞であれば特に限定されずに使用することがで
きる。ＦＧＦ−１を強制発現させた細胞株とは、ＦＧＦ
−１遺伝子（ｃＤＮＡ）を発現ベクターに組み込み、こ
れを宿主細胞に形質転換して得られた形質転換体をい
う。

【００１８】ここで使用するＦＧＦ−１遺伝子は、哺乳
類動物由来のものであれば特に限定されず、天然または
合成により、公知の方法により得ることができる。例え
ば、アプライドバイオシステムズ社（ＡＢＩ社）の自動
ＤＮＡ合成機を用いて合成するか、またはｃＤＮＡライ
ブラリーよりＦＧＦ−１特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いて釣り上げるか、またはｍＲＮＡからこれを
逆転写後、ＦＧＦ−１特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーのセットを用いてポリメレースチェーンリアクショ
ン（ＰＣＲ）により増幅する。あるいは、これらの方法
により得た部分をつなぎ合わせて全長のＦＧＦ−１遺伝
子を取得することもできる（Imamura, T. et al.,Scien
ce, 249, 1567-1570 (1990); Forough, R. et al., Bio
chim. Biophys. Acta, 1090, 293-298 (1991))。

【００１９】次に、ＦＧＦ−１遺伝子を含むＤＮＡの全
部若しくは一部を適当な制限酵素によって切り出し、ま
たはリンカー（アダプター）配列を接続してこれを適当
なプロモーターの下流につないだ後、これを形質転換可
能な宿主に導入することにより形質転換させる。ここで
使用されるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクタ
ー、シャトルベクター、ファージベクター、ウイルスベ
クターなどが挙げられ、宿主としては、酵母、大腸菌、
動物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。そして、前記形質
転換体を一般的に使用されている培地（例えば、動物細
胞においてはDMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Mediu
m)等単独又はそれらに血清等を添加したもの）で培養
し、その培養物（培養液、培養菌体若しくは培養細胞又
は培養上清液）を集める。

【００２０】なお、培養後の培養上清液については、遠
心分離等を行って形質転換体を除くことにより、または
ＦＧＦ−１の性質を利用した方法により濃縮した状態で
得ることができる。上記の如く得られた培養物を電気泳
動、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
等を行い、ウエスタンブロッティングなどの技術を用い
て最終的にＦＧＦ−１のみに特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体をスクリーニングする。

【００２１】すなわち、電気泳動により得られたバンド
をニトロセルロースなどに写し取り、前記候補のモノク
ローナル抗体をプローブとして添加してハイブリッドを
形成させる。候補のモノクローナル抗体の中には、交差
反応を起こしてバンドが複数になるものもあるが、バン
ドの数が一本として現れたものを回収し、これを単一の
ＦＧＦ−１のみを認識することが可能な本発明のＦＧＦ
−１モノクローナル抗体とする。

【００２２】

〔実施例１〕

(1) モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調
製 抗原として使用するＦＧＦ−１は、公知の方法により健
康な成体のウシの脳から得た（Burgess W.H.et al.J.Bi
ol.Chem.260,11389-11392(1985))。BALB/Cマウス（８週
齢）１匹あたり100μｇの量のＦＧＦ−１を、二週間お
きに皮下及び腹腔内投与により合計３回免疫し、最終免
疫から３日後に、脾臓細胞を採取した。脾臓細胞15×10
⁷ 個及びミエローマ細胞３×10⁷ 個を培地中で混合し、
遠心して得られた細胞の混合沈殿を50mlのRPMI-1640 培
地中に再懸濁し、再び遠心沈殿させる。上清を完全に除
去した後、細胞沈殿物に一分間かけて１mlの摂氏37度に
保温した50％ポリエチレングリコール溶液を加えなが
ら、激しく攪拌して懸濁する。50％ポリエチレングリコ
ール溶液とは、平均分子量4,000のポリエチレングリコ
ール溶液とRPMI-1640溶液とを１容：１容で混合したも
のである。次に、細胞を均一に懸濁しながらRPMI-1640
培地を８ml加えた後、遠心によって細胞を沈殿させる。
このとき、既に一定の割合で融合細胞ができている。細
胞をＨＡＴ培地に懸濁し、96ウェルプレートの一つのウ
ェルあたり、脾臓細胞１×10⁵ 個／100μlの濃度で巻き
込む。そして37℃、５％CO₂ の条件のもと、インキュベ
ーターで培養する。

【００２３】培養開始後４日目、６日目にそれぞれ１ウ
ェルあたり50μlのＨＡＴ培地を追加して栄養補給をし
ながら細胞を観察する。通常、９日目ごろに細胞の増殖
の活発なウェルが判定できるようになるので、それぞれ
の培養上清を一定量採集し、まず免疫グロブリンの産生
量について一次スクリーニングを行う。産生量が多いウ
ェルについて、限界希釈法による単クローンの選択及び
二次スクリーニングを行う。すなわち、単クローンの選
択については、ウェル中の細胞数を測定し、計算上細胞
0.1個が１ウェルに入るように細胞を懸濁した培地を多
数のウェルに注入し、培養する。この結果、細胞が増殖
してきたウェルは理論的に単クローンであるが、本発明
の場合は再度限界希釈法によって増殖性の高いクローン
を選択した。二次スクリーニングについては、以下の
「モノクローナル抗体の調製」に述べるように行った。

【００２４】(2) モノクローナル抗体の調製 抗体特異性検討用の試料は次のように調製した。まず、
ＦＧＦ−１ｃＤＮＡを強制発現させているＮＩＨ３Ｔ３
細胞をそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに
て溶解し、94℃で20分間加熱し、これを15％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にて分離した。泳動時に１レーン
あたり細胞１×10⁷ 個相当になるように量を調節した。
泳動分離後のＦＧＦ−１を含む細胞総タンパク質をニト
ロセルロース膜に転写した。そして１レーン毎にスリッ
プ状に切り放し、1.5％スキムミルクを含む緩衝液でブ
ロッキングした。

【００２５】尚、ここで用いたＦＧＦ−１ｃＤＮＡを強
制発現させているＮＩＨ３Ｔ３細胞は以下のように調製
した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を10％仔ウシ血清を含むＤＭＥ
Ｍ培地にて培養し、サブコンフルエントの細胞密度に達
したときにトリプシン処理により通常の方法で回収し
た。細胞密度を50mＭグルコースを含むＰＢＳで１×10
⁷ 個／mlに調製し、そのうち150μlを10μｇのＦＧＦ−
１ｃＤＮＡを含む動物細胞発現ベクターＤＮＡと混合
後、2,000 V/cmの電気パルスを３回にわたって細胞に与
え、遺伝子の細胞内導入を行った。細胞をその後24時
間、通常の増殖培地と同じ条件で培養した後、培地をＧ
418を含む増殖培地に置き換え、その後約二週間培養す
ることによってＦＧＦ−１のｃＤＮＡが細胞遺伝子に安
定に組み込まれた組み換え体を得た。実際にＦＧＦ−１
タンパク質を発現していることの確認は、細胞を溶解
し、総タンパク質混合物から一定のヘパリンアフィニテ
ィーを有するタンパク質を精製し、これを電気泳動、タ
ンパク染色をすることによって行った。

【００２６】それぞれのモノクローナル抗体を含む培養
上清を採取し、準備しておいたニトロセルロース膜スリ
ップとインキュベートし、ペルオキシダーゼ標識された
抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ、これをペルオキシダー
ゼの発光基質と反応させ、Ｘ線フィルムを感光させるこ
とにより、抗体のＦＧＦ−１反応性とＦＧＦ−１以外の
タンパクとの無反応性を検討した。特異的と判定された
ものについて、単クローン細胞を大量培養し、培養上清
から抗体を精製することによりＦＧＦ−１特異的モノク
ローナル抗体が得られた。

【００２７】必要に応じて細胞をBALB/Cマウスの腹腔内
に投与し、腹腔内で細胞が増殖して抗体を含む腹水が蓄
積した後にこれを採集し、抗体を精製した。以上の結
果、ＦＧＦ−１モノクローナル抗体を一定に産生するこ
とができる２クローン（ＴＲＨＤ1.2Ｄ及びＴＲＨＤ15.
5Ｇ）を得ることができた。本発明のＦＧＦ−１モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＴＲＨＤ1.2Ｄ
についてはFERM P-14860、ＴＲＨＤ15.5ＧについてはFE
RM P-14861として寄託されている。

【００２８】次に、このハイブリドーマ２クローン（Ｔ
ＲＨＤ1.2Ｄ及びＴＲＨＤ15.5）の産生する抗体（それ
ぞれ「ｍＡｂ1.2Ｄ」、「ｍＡｂ15.5Ｇ」と称する）を
用いて、ＦＧＦ−１を強制発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞
総タンパク質の免疫ブロッティングを行った。結果を図
１に示す。

【００２９】レーン１は、大腸菌で発現させ精製した純
ＦＧＦ−１タンパク質を、ＳＤＳ−15％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）
後ニトロセルロースに転写し、ｍＡｂ1.2Ｄで免疫染色
したもの、レーン２は、ＦＧＦ−１を強制発現させたＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞１×10⁷ 個に由来する総タンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後ニトロセルロースに転写し、ｍＡｂ1.
2Ｄで免疫染色したもの、レーン３は、ＦＧＦ−１を含
まない発現ベクターのみで形質転換させたＮＩＨ３Ｔ３
細胞１×10⁷ 個に由来する総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後ニトロセルロースに転写し、ｍＡｂ1.2Ｄで免疫
染色したもの、レーン４は、大腸菌で発現させ精製した
純ＦＧＦ−１タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニトロセ
ルロースに転写し、ｍＡｂ15.5Ｇで免疫染色したもの、
レーン５は、ＦＧＦ−１を強制発現させたＮＩＨ３Ｔ３
細胞１×10⁷ 個に由来する総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後ニトロセルロースに転写し、ｍＡｂ15.5Ｇで免疫
染色したもの、レーン６はＦＧＦ−１を含まない発現ベ
クターのみで軽震転換させたＮＩＨ３Ｔ３細胞１×10⁷
個に由来する総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニトロ
セルロースに転写し、ｍＡｂ15.5Ｇで免疫染色したもの
である。レーン２及びレーン５は、それぞれｍＡｂ1.2
Ｄ及びｍＡｂ15.5ＧがＦＧＦ−１を強制発現させたＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞由来の総タンパク質のうちＦＧＦ−１のみ
を特異的に認識し、その他の細胞タンパク質は認識しな
いことを示している。

【００３０】なお、レーン左横の短線（「−」）は、分
子量標準の泳動位置を示しており、下からそれぞれ分子
量約14.5ｋＤ、21.5ｋＤ、31ｋＤ、45ｋＤ、66ｋＤ、97
ｋＤを示す（以下同じ）。次に、ハイブリドーマスクリ
ーニングの過程で各種の異なるハイブリドーマ由来の抗
体で選択されなかったもの、すなわち、ＴＲＨＤ1.2Ｄ
及びＴＲＨＤ15.5以外の10種類のハイブリドーマによっ
て産生された抗体について電気泳動を行った。

【００３１】結果を図２に示す。レーン１〜10は、ＦＧ
Ｆ−１を強制発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞１×10⁷ 個に
由来する総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニトロセル
ロースに転写し、次いで各種候補モノクローナル抗体で
免疫染色したものである。レーン左側に示された矢印は
ＦＧＦ−１のバンドの位置を示す。図２より、ハイブリ
ドーマＴＲＨＤ1.2Ｄ及びＴＲＨＤ15.5以外のハイブリ
ドーマクローンから産生されたモノクローナル抗体は、
ＦＧＦ−１以外の多くの細胞タンパク質と交差反応して
いることを示す。このことから、単にモノクローナル抗
体がＦＧＦ−１に反応する、ということだけでは細胞総
タンパク質からＦＧＦ−１のみを選択的に検出すること
が困難であることを示している。

【００３２】〔実施例２〕本発明のモノクローナル抗体
を用いたＦＧＦ−１の検出 本発明のモノクローナル抗体は、ＦＧＦ−１を強制発現
させた細胞に存するＦＧＦ−１を特異的に検出するのみ
でなく、ＦＧＦ−１を自然発現する組織及び細胞に存す
る比較的低レベルの量のＦＧＦ−１でさえも特異的に検
出することが可能である。すなわち、自然発現している
細胞や組織におけるＦＧＦ−１の量は、ウイルスのプロ
モーターなどを用いて強制発現させたＦＧＦ−１の量よ
りも総タンパク質単位量あたり１／10程度少ないと考え
られる。

【００３３】従って、かかる少ない量のＦＧＦ−１であ
っても、本発明のモノクローナル抗体は該ＦＧＦ−１を
検出することができる点で、上記結果は、本発明のモノ
クローナル抗体が特異性及び有用性を持つことを示すも
のである。実施例１と同様にして、ハイブリドーマクロ
ーン（ＴＲＨＤ1.2Ｄ）の産生する抗体（ｍＡｂ1.2Ｄ）
を用いて、再生中の肝臓組織総タンパク質のウェスタン
ブロッティングを行った。

【００３４】結果を図３に示す。レーン１は、正常ラッ
ト肝臓組織50mgに由来する総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後ニトロセルロースに転写し、ｍＡｂ1.2Ｄで免疫
染色したもの、レーン２、３、４は、部分肝切除後それ
ぞれ６時間後、15時間後、24時間後のラット肝臓組織50
mgに由来する総タンパク質を転写し、ｍＡｂ1.2Ｄで免
疫染色したものである。

【００３５】図３の結果は、肝臓組織において部分肝切
除後に発現量が増加することがｍＲＮＡのレベルでしか
示されていなかったものを、ｍＡｂ1.2Ｄを用いること
により初めて総タンパク質レベルで示すことができたこ
とを示す。これは、ｍＡｂ1.2ＤがＦＧＦ−１以外の細
胞タンパク質と交差反応しないことから可能となったも
のである。すなわち、ｍＡｂ1.2Ｄは、正常肝臓に存在
することが知られているタンパク質、例えばアルブミ
ン、セロトランスフェリン、アクチン、ヘモグロビン、
ＨＧＦ (Hepatocyte Growth Factor； HGFは肝再生で発
現することが知られている) などのＦＧＦ−１以外の全
てのタンパク質とは反応せず、ＦＧＦ−１のみと特異的
に反応することを示すものである。

【００３６】図４は、ｍＡｂ1.2Ｄ抗体によって筋芽細
胞Ｌ６の総タンパク質のウェスタンブロッティングを行
った結果である。図４は、筋芽細胞１×10⁷個に由来す
る総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニトロセルロース
に転写し、ｍＡｂ1.2Ｄで免疫染色したものである。図
４より、ＦＧＦ−１以外の細胞タンパク質との交差反応
は認められないことが示される。すなわち、ｍＡｂ1.2
Ｄは、Ｌ６細胞で発現していることを本願発明者が見出
したタンパク質、例えばＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９などのＦＧＦ−１以外
の全てのタンパク質とは反応せず、ＦＧＦ−１のみと特
異的に反応することを示すものである。

【００３７】図５は、低濃度（20ng/ml)のＦＧＦ−１で
増殖刺激した繊維芽細胞BALB/C 3T3の総タンパク質のウ
ェスタンブロッティングを行った結果である。レーン１
及び２は、低濃度（20ng/ml)のＦＧＦ−１タンパク質を
異なるロットの繊維芽細胞BALB/C 3T3の１×10⁷個に与
えた後、その細胞の総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
ニトロセルロースに転写し、ｍＡｂ1.2Ｄで免疫染色し
たものである。レーン３は、ＦＧＦ−１未処理の繊維芽
細胞BALB/C 3T3の１×10⁷個に由来する総タンパク質を
電気泳動後ニトロセルロースに転写し、ｍＡｂ1.2Ｄで
免疫染色したものである。

【００３８】ＦＧＦ−１を吸着又は取り込んでいるBALB
/C 3T3細胞（レーン１および２）では、本発明のモノク
ローナル抗体は、ＦＧＦ−１のみと特異的に反応して１
本のバンドとして現れる。これに対し、ＦＧＦ−１を吸
着又は取り込んでいないBALB/C 3T3細胞（レーン３）で
はバンドが現れない。このことは、ＦＧＦ−１以外の他
のすべてのBALB/C 3T3細胞の細胞タンパク質とは反応し
ないことを示されている。

【００３９】図６は、特異的抗体として市販されている
ウサギポリクローナル抗体ＦＧＦ−１抗体（Ｒ＆Ｄ社
製）でＦＧＦ−１（レーン１）及びその短縮形（レーン
２）を強制発現させたＬ６細胞および未処置のＬ６細胞
（レーン３及び４）の総タンパク質のウェスタンブロッ
ティングを行った結果である。かかる市販のウサギポリ
クローナル抗体ＦＧＦ−１抗体は、ＦＧＦ−１と反応す
る他、細胞由来の多くのタンパク質との交差反応が認め
られた。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、ＦＧＦ−１のみと特異的
に反応するモノクローナル抗体が得られる。本発明のモ
ノクローナル抗体は、ＦＧＦ−１の生化学的な解析、例
えばＦＧＦ受容体に対するＦＧＦの結合様式の解析をす
るための試薬として有用である。更に、本発明のモノク
ローナル抗体は、各種疾病及び健康状態などの診断およ
び疾病の進行や治療効果の判定、さらにそれら疾病の治
療及び状態の人為的操作などに広く利用することができ
る。

【００４１】この対象の中には、ＦＧＦ−１の発現が関
与しているものをすべて含む。例えば、肝臓再生、心筋
細胞や骨格筋細胞における細胞増殖や分化、血管新生お
よびこれを含む癌の転移や進行にかかわる病変、リュー
マチ性関節炎、脳における学習中枢、脳における摂食行
動を司る中枢、脳神経系における神経細胞及びグリア細
胞の生理的および病理的神経繊維伸展やシナプス形成及
びその維持、アルツハイマー病などが含まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウェスタンブロッティングにおける電気泳動の
結果を示す写真である。

【図２】ウェスタンブロッティングにおける電気泳動の
結果を示す写真である。

【図３】ウェスタンブロッティングにおける電気泳動の
結果を示す写真である。

【図４】ウェスタンブロッティングにおける電気泳動の
結果を示す写真である。

【図５】ウェスタンブロッティングにおける電気泳動の
結果を示す写真である。

【図６】ウェスタンブロッティングにおける電気泳動の
結果を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 特許権者において、実施許諾の用意がある。 (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ 233（1986）ｐ．541 −545 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ 186（1990）ｐ．121− 126 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．260［21 ］（1985）ｐ．11389−11392 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 繊維芽細胞増殖因子−１のみと特異的に
   反応し、繊維芽細胞増殖因子−１以外の細胞タンパク質
   とは反応しないことを特徴とする繊維芽細胞増殖因子−
   １モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 受託番号がFERM P-14860又はFERM P-148
   61であるハイブリドーマにより産生される、請求項1記
   載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 繊維芽細胞増殖因子−１で免疫した哺乳
   動物の免疫細胞と骨髄種細胞との融合細胞から産生され
   るモノクローナル抗体を、繊維芽細胞増殖因子−１遺伝
   子を含む発現ベクターにより形質転換された形質転換体
   又は繊維芽細胞増殖因子−１を自然発現している細胞か
   ら産生される総タンパク質と反応させ、前記モノクロー
   ナル抗体のうち、該総タンパク質中の繊維芽細胞増殖因
   子−１のみと特異的に反応し、繊維芽細胞増殖因子−１
   以外の細胞タンパク質とは反応しないモノクローナル抗
   体を選出することを特徴とする繊維芽細胞増殖因子−１
   モノクローナル抗体の製造方法。