JP2907388B2 - 骨髄再生促進剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
化合物の新規用途、特に医薬用途に関するものである。
特に、細胞傷害性（cytotoxic）であるが幹細胞倹約性
（stem cell sparing）である薬剤および顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子の連続使用用途に属してい
る。なお、本明細書において、薬剤に関連して使用され
た「幹細胞倹約性（stem cell sparing）」なる言葉
は、当該薬剤が細胞に対して毒性を有するが、幹細胞に
対しては致死的（lethal）ではないこと、すなわち幹細
胞に対して傷害を与えないが、幹細胞の成長を停止また
は遅らせるものであることをいう。

［従来技術］ 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以後GM−CS
Fとする）は、公知であり、組換え体DNA法によるその製
造方法と共に、例えば欧州公開特許0188,479号（出願番
号85903275号）および各国の同等出願に記載されてい
る。

欧州特許188,478号の記載によると、GM−CSFは種々の
動物源から由来することが知られている。しかしなが
ら、この発明は特に、霊長類GM−CSFおよびさらに特に
ひとGM−CSFに関係している。

この発明のGM−CSFは、当業界公知の任意の方法によ
って製造することができる。例えば、上記欧州特許188,
479号の記載の通り、組換え体DNAの発現の結果として生
成し得る。別法として、天然源から分離するかまたは合
成で製造し得る。

GM−CSFは、成熟顆粒球およびマクロファージの形成
が予定された骨髄前駆細胞の生存、増殖および分化のた
めに必要とされる因子であることが知られている（CFU
−GMs）。従ってGM−CSFは、悪性腫瘍（がん）に対する
化学療法的または照射処置によって起こる骨髄抑制を処
置するのに使用されることが示唆されている。この場
合、骨髄で見られる骨髄前駆細胞の増殖および分化を刺
激するために、予め取り出した骨髄再注入（自己骨髄）
の後、上記環境下で、化学的または照射療法で処理した
患者にGM−CSFを投与する。また、３〜５日間GM−CSFを
投与してから後記再注入のための骨髄を取出し得る。

細胞傷害性であるが幹細胞倹約性である薬剤は、例え
ばシクロホスホアミド［N,N−ビス（２−クロロエチ
ル）テトラヒドロ−2H−1,3,2−オキサゾホスホリン−
２−アミン−２−オキシド］であり、アーノルドらによ
り最初に製造が報告された（ナツールビッセンシャフテ
ン（Naturwiss）45巻、（1957年）、64頁）公知化合物
である。他の適当な剤としては、ケーラー−ジュステン
らによって製造が報告された（ジャーナル・オブ・メジ
シナル・ケミストリー（J Med Chem）14巻、（1971年）
936頁）エトポシド（VP−16）を含む。

シクロホスホアミドのような細胞傷害剤の投与は、骨
髄細胞の増殖を停止する効果を有することが知られる。
しかしながら、正常に増殖を促進する細胞における細胞
傷害効果は、長く持続するので、そのため処置から回復
したときの骨髄増殖は迅速で制御されにくい。従って、
化学療法または放射線療法後に再注入するために骨髄を
取り出す14日前に、シクロホスホアミドのような、細胞
傷害であるが幹細胞倹約性である薬剤を用いて患者を処
置し、その結果、取り出した際に骨髄が活発に増殖して
いる状態にあるようにすることが提案された。

骨髄がこの活発に増殖している状態にある場合、多く
の前駆幹細胞が、末梢血液循環内に現れることを発見し
た。細胞傷害剤を用いた処置後の期間に、GM−CSFを用
いた処置によって、これらの循環幹細胞の分化を刺激し
得る。さらに細胞傷害剤/GM−CSF処置後、末梢血液を骨
髄と同時に取り出し、その後この血液またはこの血液か
ら得られた白血球を骨髄と共に再注入した場合、骨髄再
生は通常の場合に比べて顕著に速いことを発見した。

［図面の説明］ 第１図 高用量のシクロホスホアミド（０日目に7g/m²）を投
与した後の14名の対照患者（□）およびGM−CSF（１日
目から10日目または14日目に８μg/kg/日）で処置を受
けた５名の患者（◆）における顆粒数（平均値）。

上図：直線目盛 下図：対数目盛 第２図 処置（シクロホスホアミド、０日目に7g/m²）の終わ
りから測定した14名の対照患者（□）およびGM−CSFで
処置を受けた５名の患者（◆）での好中球減少期間の分
布。曲線は、指示区間内に1000好中球以上（上図）およ
び2500好中球以上（下図）に達している患者の累積比率
を現している。

第３図 循環CFU−GM割合（上図）および血液濃度（下図）に
対するGM−CSF（◆）または偽薬注入（□）の効果。シ
クロホスホアミド（7g/m²）注入後、１日目から始めてG
M−CSFを10日間連続して注入した。

第４図 ２名の患者における、骨髄除去処置を行い、その後骨
髄と末梢血液幹細胞の自己移植を行った際の顆粒球
（□）および血小板（◆）数。患者Ａはメルファランの
みを受け（200mg/m²）、患者Ｂは全身照射（12.5Gy、３
日間に分割して）とメルファラン（160mg/m²）を受け
た。高用量のシクロホスホアミドおよびGM−CSF注入を
行った後、各患者に対して２回、循環幹細胞を採取した
（実施例参照）。

［発明の記載］ この発明は、 ａ）高用量の細胞傷害性であるが幹細胞倹約性である薬
剤を投与し、 ｂ）その後の期間GM−CSFを投与し、 ｃ）骨髄が活発に増殖する状態にあり、先駆幹細胞が末
梢血液中に存在する時、骨髄および所定容量の末梢血液
またはそこから得られた白血球を取り出し、 ｄ）化学療法および放射線療法による充分な骨髄除去
（myeloablative）法を行い、 ｅ）その後直ぐに、骨髄および末梢血液、またはそれら
から得られた白血球を再注入し、さらに所望により、 ｆ）それから骨髄再生が得られるまでの期間GM−CSFを
投与し続ける 段階から成る、自己骨髄移植による救済と共に、悪性腫
瘍に対する高用量の化学療法または放射線療法を必要と
する患者の処置方法を提供する。

ここで、細胞傷害性であるが、幹細胞倹約性である薬
（または生かしておく）とは骨髄造血幹細胞以外の細胞
を選択的に傷害する薬剤である。

この発明の好ましい実施態様では、細胞毒性をもつが
幹細胞を倹約性薬剤としてシクロホスホアミドを用い
る。

驚くべきことに、骨髄細胞に少量の循環幹細胞を補足
した場合、14日かそれ以上どころか平均10日後に化学的
または放射性治療後骨髄再生が起こることを発見した。
充分に解明されていないが、GM−CSFが末梢血液中の前
駆体細胞に作用すること、それらを刺激して分化させ、
細胞傷害であるが幹細胞を容赦する剤を用いて処置して
から12〜21日後に単分化能前駆体（CFU−GM´ｓ）が極
度に高い量で存在することが信じられている。これらの
CFU−GM´ｓはインビトロの培養において、７〜10日後
に子孫の成熟を生じる。この細胞傷害剤/GM−CSF処置末
梢血液の再注入の結果顕著に迅速な再生期間を得た。

この発見は、末梢血液および骨髄移植後のGM−CSF注
入の用途も予見する。CFU−GM´ｓはGM−CSFの主要標的
であるので、上記移植後注入によって循環顆粒球発現の
促進を起こすことが予想される。注入CFU−GM´ｓに対
するGM−CSFの上記活性は、循環顆粒球が安全基準500/
μ１以下に落ちることを防ぐことが期待される。この結
果は、骨髄で見られる前駆体が主としてより長い熟成期
を有する早期前駆体であるため、骨髄のみを注入した後
に起こることは予想されない。

この発明によるGM−CSFの使用は、難治性の悪性腫
瘍、すなわち通常の腫瘍処置プログラムを終えた患者に
おいて、およびその結果腫瘍が除去されない患者におい
て、化学的または放射性治療後に特に好適である。固体
腫瘍、例えば胸部がん、リンパ腫、および白血病の治療
後に上記使用を行い得ることが予見される。

段階ａ）において、細胞傷害剤としてシクロホスホアミ
ドを用いる場合、シクロホスホアミドを４〜５回の注射
で1.4g/m²（最終用量６〜7g/m²）の用量を投与するのが
適当である。

段階ｂ）において、継続静脈内注入として、６および24
μg/kg/日、好ましくは８μg/kg/日の範囲の用量で、10
から14日間GM−CSFを投与するのが適当である。注入法
として皮下経路は同様に適当であり得る。

段階ｃ）において、連続流血液細胞分離機（IBM2997
等）を使用する白血球搬出法（leukapheresis）によっ
て末梢血液の白血球を取り出すのが好ましい。白血球が
1000/μｌを越え、および血小板が100,000/μｌを越え
た時点で循環幹細胞を回収するのが好ましい。シクロホ
スホアミドおよびGM−CSF注入を行った後、初期再生期
の間に総計２から４の白血球搬出法を行う（通常シクロ
ホスホアミド処理後14日目から21日目の間）。１工程あ
たりの生成総血液量は、流速35〜70ミリリットル／分で
約５〜10リットルである。

段階ｄ）で行なわれる化学的または放射性治療は、任意
の標準または試験的治療法、例えばTBI12.5Gyとメルフ
ァラン160mg/m²であり得る。

３〜24時間後、骨髄と白血球を再注入する（段階
ｅ）。段階ｆ）で段階ｂ）と同様の方法のGM−CSF処置
を用いるのが適当である。

この発明の別の目的においては、骨髄をとらないこ
と、および骨髄再生がシクロホスホアミド/GM−CSFで処
理した末梢血液由来の白血球の再注入によってのみ達成
される。

上記記述は、この発明を一般的に記載している。以下
の説明のみを目的とし、この発明の範囲を限定しないも
のとして提供される個別の実施例を参照すると、さらに
完全な理解が得られ得る。

［実施例］ 実施例１ 骨髄再生におけるシクロホスホアミドおよびGM−CSF
の効果を示すために、14名の対照および５名の試験患者
との比較を行った。平均年齢41.5歳（22〜55歳の範囲）
で、その内４名は高い度合で予後の悪い非ホジキン氏リ
ンパ腫を有し、７名は炎症性胸部がんを有し、３名は小
細胞性肺がんを有している、５名の男性および９名の女
性患者を対照として用い、平均年齢45歳（39〜53歳の範
囲）で、その内１名は高い度合の非ホジキン氏リンパ腫
を有し、４名は炎症性の胸部がんを有している、１名の
男性および４名の女性を試験患者として用いた。

19名の患者全部に、 ａ）０日目にシクロホスホアミド（7g/m²）、 ｂ）21〜25日目にビンクリスチン（1.4mg/m²）、ロイコ
ボリン援助を加えたメソトレクセイト（8g/m²）、シス
プラチン（120mg/m²）、さらに、 ｃ）42〜45日目にメルファラン（120〜180mg/m²）に加
えて全身照射（総量12.5Gy）または炎症性の胸部がん患
者に対してはメルファラン（200mg/m²）のみを 一連に投与することから成る、同一の高用量の化学的治
療プログラムを行った。

５名の試験患者については、シクロホスホアミド注入
の24時間後に開始して、３名の患者には14日間および２
名の患者には10日間８μg/kg/日で、中心カテーテルを
介した連続輸液としてGM−CSFを与えた。

メルファラン注入翌日に末梢血液と骨髄をもどした。

標準技術を用いて骨髄獲得および白血球搬出法を行
い、凍結制御技術を使用して液体窒素温度に幹細胞およ
び骨髄細胞を投入した。

血液標本を処置前、およびシクロホスホアミド注入後
２−３日毎に得た。CFU−GMを測定するための詳細な技
術はランフランコンら著、ジャーナル・オブ・セル・フ
ィジオロジー（J.CELL PHYSIOL）122巻、（1985年）７
頁に記載されている。

［高用量のシクロホスホアミドの血清学的毒性およびGM
−CSFの効果］ 血清学的毒性の結果は第１図の通りで、（□）が対照
を示し、（◆）が試験療法を示す。

［対照］ ひどい白血球減少（＜500好中球／μｌ）が８日目ま
でに起こった。17〜24日（平均18日）で＞1000/μｌま
でに、さらに19〜28日（平均21.5日）で＞2500/μｌま
でに好中球が回復した。

［試験］ 好中球数は、２〜３日間続く、開始レベルより高い明
白な初期上昇を示し、頂点は１−２日早かった。再生期
は、GM−CSF停止後３〜４日で徐々に解消される顕著な
白血球増加症（25,000白血球／μｌまで）を伴ってい
た。11〜15日で＞1000/μｌまでに好中球の再生が達し
（平均13日）、さらに12〜19日で＞2500/μｌに達した
（平均14日）（第２図）。対照およびGM−CSF処置患者
の間の血小板またはヘモグロビン値における差異はなか
った。

［循環造血前駆細胞に対するシクロスルホアミドを用い
た治療後のGM−CSFの効果］ ランフランコンらの上述文献の技術を使用して、平静
な状態での循環コロニー形成単位数量は、約40CFU−GM/
10⁶単核細胞および40〜60CFU−GM/mlの末梢血液であ
る。シクロスルホアミド処置を行なうと、コロニー形成
単位の比率（CFU−GM/単核細胞）および絶対数（末梢血
液のCFU−GM/ml）の両方で約100倍高いピーク値が観察
された（第３図）。GM−CSF（シクロスルホアミドを与
えてから１日目から10日目まで８μg/kg/日）を加える
と、CFU−GMがそれぞれさらに３倍（ピーク濃度）およ
び５倍（ピーク濃度）まで上昇した。注目すべきこと
に、これらの高いピーク値は、対照およびGM−CSF処置
患者の両方において数日間保持された。したがって、健
常対象と比較した場合、幹細胞の膨張する数日間の末梢
血液内を循環するCFU−GMの総数（曲線の下側の領域）
はシクロスルホアミドとGM−CSFを与えた後では約30倍
高い。最適な長さのGM−CSF注入を行なうとさらに増加
が期待され得る。

実施例２ 実施例１の２名の特定患者における造血再構成を第４
図に示した。

患者Ａは、高用量メルファラン（200mg/m²）を受けた
後で２×10⁸/kgの骨髄細胞および1.8×10⁸/kgの循環単
核細胞の注入を行なった。６日目に、顆粒球数は、500
μｌ以下に落ち５日間だけこの域値以下に保った。血小
板数は30,000/μｌ以下に落ちることなく、輸血を必要
としなかった。補足されない血小板数は12日目に79,000
/μｌまで増加し、14日目には120,000/μｌまで増加し
た。

患者Ｂは、高度の非ホジキン氏リンパ腫を有してお
り、高用量処置の完了（12.5Gy分別全身照射および160m
g/m²のメルファラン（静脈内投与））後24時間で4.7×1
0⁸/kgの骨髄細胞と8.8×10⁸/kgの末梢血液単核細胞を受
けた。３日目に、顆粒球数は、500/μｌ以下に低下し
た。５日目から始まって、患者は、白色細胞数において
安定した増加を示し、８日目には＞500好中球／μｌに
達し、10日目には＞1000/μｌさらに12日目には10,000/
μｌ以上に達した。患者の血小板数は、９日目には１単
位の血小板輸血を必要とする20,000/μｌ以下に低下し
た。非補足血小板数は、それぞれ12日目に＞50、000/μ
ｌまで上昇し、さらに13日目には＞100、000/μｌまで
に上昇した。

（１）ａ）高用量の細胞傷害性であるが幹細胞を容赦す
る剤を投与し、 ｂ）その後の期間GM−CSFを投与し、 ｃ）骨髄が活発に増殖する状態にあり、前駆幹細胞が末
梢血液中に存在する時、骨髄および所定容量の末梢血液
またはそこから得られた白血球を取り出し、 ｄ）化学療法および放射線療法による充分な骨髄除去法
を行い、 ｅ）その後直ぐに、骨髄および末梢血液、またはそれら
から得られた白血球を再注入し、さらに所望により、 ｆ）それから骨髄再生が起るまでの期間GM−CSFを投与
し続ける 段階から成る、自己骨髄移植による救済と共に、悪性腫
瘍に対する高用量の化学療法または放射線療法を必要と
する患者の処置方法。

（２）細胞傷害性であるが幹細胞を容赦する剤の投与後
24時間に、段階ｂ）のGM−CSFをする、請求項１記載の
方法。

（３）骨髄および所定量の末梢血液、またはそこから得
られた白血球の取出を、細胞傷害性であるが幹細胞を容
赦する剤の投与後12〜21日に行なう、請求項２記載の方
法。

（４）白血球が1000/μｌを越え、血小板が100,000/μ
ｌを越えた際に骨髄および所定量の末梢血液、またはそ
こから得られた白血球の取出を行なう、請求項３記載の
方法。

（５）骨髄除去が全身照射とメルファランを包含する、
請求項１から４の何れか１項記載の方法。

（６）骨髄および末梢血液、またはそこから得られた白
血球の再注入を、化学療法または放射線療法後３〜24時
間に行なう、請求項５記載の方法。

（７）細胞傷害性であるが幹細胞を容赦する剤がシクロ
スルホアミドである、請求項１から６の何れか１項記載
の方法。

（８）６〜7g/m²の用量でシクロスルホアミドを投与す
る、請求項７記載の方法。

（９）継続注入としてGM−CSFを投与する、請求項１か
ら８の何れか１項記載の方法。

（10）GM−CSFの用量が６および24μg/kg/日の間の範囲
である、請求項９記載の方法。

（11）GM−CSFの用量が８μg/kg/日である、請求項10記
載の方法。

（12）ａ）高用量の細胞傷害性であるが幹細胞を容赦す
る剤を投与し、 ｂ）その後の期間GM−CSFを投与し、 ｃ）前駆幹細胞が末梢血液中に存在する時、所定量の末
梢血液またはそこから得られた白血球を取り出し、 ｄ）化学療法および放射線療法による充分な骨髄除去法
を行い、 ｅ）その後直ぐに、末梢血液、またはそれらから得られ
た白血球を再注入し、さらに所望により、 ｆ）それから骨髄再生が得られるまでの期間GM−CSFを
投与し続ける 段階から成る白血球注入による救済と共に、悪性腫瘍に
対する高用量の化学療法または放射線療法を必要とする
患者の処置方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、高用量のシクロスルホアミド（０日目に7g/m
²）を投与した後の14名の対照患者（□）およびGM−CSF
（１日目から10日目または14日目に８μg/kg/日）で処
置を受けた５名の患者（◆）における顆粒数（平均値）
を示す図である。 Ａは直線目盛、Ｂは対数目盛の図である。 第２図は、 処置（シクロスルホアミド、０日目に7g/m
²）の終わりから測定した14名の対照患者（□）およびG
M−CSFで処置を受けた５名の患者（◆）での好中球減少
期間の分布を示す図である。Ａは、指示区間内に1000好
中球以上の患者の累積比率、Ｂは2500好中球以上に達し
ている患者の累積比率を現している。 第３図は、循環CFU−GM割合および血液濃度に対するGM
−CSF（◆）または偽薬注入（□）の効果を示す図であ
る。ＡはCFU−GM割合に対する効果、Ｂは血液濃度に対
する効果である。 第４図は、２名の患者における、骨髄除去処置を行い、
その後骨髄と末梢血液幹細胞の自己移植を行った際の顆
粒球（□）および血小板（◆）数を示す図である。Ａは
メルファランのみを受けた患者、Ｂは照射とメルファラ
ンを受けた患者の場合を示す。 1.a）高用量の細胞傷害性であるが幹細胞倹約性である
薬剤を投与し、 ｂ）その後の期間GM−CSFを投与し、 ｃ）骨髄が活発に増殖する状態にあり、前駆幹細胞が末
梢血液中に存在する時、骨髄および所定容量の末梢血液
またはそれから得られた白血球を取り出し、 ｄ）化学療法または放射線療法による充分な骨髄除去法
を行い、 ｅ）その後直ぐに、骨髄および末梢血液、またはそれか
ら得られた白血球を再注入し、さらに所望により、 ｆ）それから骨髄再生が起るまでの期間GM−CSFを投与
し続ける 段階を含むことを特徴とする、自己骨髄移植による救済
と共に、悪性腫瘍に対する高用量の化学療法または放射
線療法を必要とする患者の処置に用いるためのGM−CSF
を含む医薬組成物。 2.段階ｂ）のGM−CSFの注入が細胞傷害性であるが幹細
胞倹約性である薬剤の投与後24時間に行われる、１記載
の組成物。 3.骨髄および所定量の末梢血液、またはそこから得られ
た白血球の取出が、細胞傷害性であるが幹細胞倹約性で
ある薬剤の投与後12〜21日に行なわれる、２記載の組成
物。 4.白血球が1000/μｌを越え、血小板が100,000/μｌを
越えた際に、骨髄および所定量の末梢血液、またはそこ
から得られた白血球の取出が行なわれる、３記載の組成
物。 5.骨髄除去法が全身照射とメルファランを包含する、１
から４の何れか１項記載の組成物。 6.骨髄および末梢血液、またはそこから得られた白血球
の再注入が、化学療法または放射線療法後３〜24時間に
行なわれる、５記載の組成物。 7.細胞傷害性であるが幹細胞倹約性である薬剤がシクロ
スルホアミドである、１から６の何れか１項記載の組成
物。 8.シクロスルホアミドが６〜7g/m²の用量で投与され
る、７記載の組成物。 9.GM−CSFが継続注入で投与される、１から８の何れか
１項記載の組成物。 10.GM−CSFの用量が６および24μg/kg/日の間の範囲で
ある、９記載の組成物。 11.GM−CSFの用量が８μg/kg/日である、10記載の組成
物。 12.a）高用量の細胞傷害性であるが幹細胞倹約性である
薬剤を投与し、 ｂ）その後の期間GM−CSFを投与し、 ｃ）前駆幹細胞が末梢血液中に存在する時、所定量の末
梢血液またはそれから得られた白血球を取り出し、 ｄ）化学療法または放射線療法による充分な骨髄除去を
行い、 ｅ）その後直ぐに、末梢血液、またはそれから得られた
白血球を再注入し、さらに所望により、 ｆ）それから骨髄再生が起きるまでの期間GM−CSFを投
与し続ける 段階を含むことを特徴とする、白血球注入による救済と
共に、悪性腫瘍に対する高用量の化学療法または放射線
療法を必要とする患者の処置に用いるためのGM−CSFを
含む医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アレッサンドロ・エム・ジアンニ イタリア国 20123 ミラノ、ムラトリ 29 カップ、ヴィア・ルドヴィコ （番地の表示なし) (56)参考文献 欧州公開183350（ＥＰ，Ａ１) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．72，Ｎｏ．４ （1988）Ｐ．1310−1315 Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈ ｅｒ．，Ｖｏｌ．42，Ｎｏ．７（1988) Ｐ．473−481 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃ ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．45 （1988）Ｐ．104−111

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】GM−CSFを必須成分として含むことを特徴
   とする、悪性腫瘍処置のための化学または放射線療法に
   付随して行われる自己骨髄移植において、当該療法の後
   で実施される骨髄と末梢血液（またはそれから得られた
   白血球）の再注入による骨髄再生を促進するために、当
   該骨髄と末梢血液の採取に先立って投与される、細胞傷
   害性、幹細胞倹約性薬剤による投与処置後に使用するた
   めの、骨髄再生促進用医薬組成物。