JP2866865B2 - 酵素センサの製造方法 - Google Patents
酵素センサの製造方法Info
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- JP2866865B2 JP2866865B2 JP1076218A JP7621889A JP2866865B2 JP 2866865 B2 JP2866865 B2 JP 2866865B2 JP 1076218 A JP1076218 A JP 1076218A JP 7621889 A JP7621889 A JP 7621889A JP 2866865 B2 JP2866865 B2 JP 2866865B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酸素電極を用いた酵素センサの製造方法に
係り、特に酵素反応により消費される酸素（O2）量に比
例した酸化還元応答電流値の変化を検出して被検物質の
濃度を測定する酵素センサの製造方法に関する。
係り、特に酵素反応により消費される酸素（O2）量に比
例した酸化還元応答電流値の変化を検出して被検物質の
濃度を測定する酵素センサの製造方法に関する。
［従来の技術］ 従来、バイオセンサとしてよく知られているものに、
酵素反応で生成する酸素の消費量を測定して血液中のグ
ルコース濃度を測定する酵素センサが知られている。
酵素反応で生成する酸素の消費量を測定して血液中のグ
ルコース濃度を測定する酵素センサが知られている。
従来、この酵素センサの検知部分には、カソードに白
金、アノードに銀または銀／塩化銀を用い、内部液に塩
化物を添加した標準緩衝溶液を封入し、その外側を酸素
ガス選択透過膜を被覆した所謂クラーク型酸素電極がも
っぱら使用されてきた。
金、アノードに銀または銀／塩化銀を用い、内部液に塩
化物を添加した標準緩衝溶液を封入し、その外側を酸素
ガス選択透過膜を被覆した所謂クラーク型酸素電極がも
っぱら使用されてきた。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、上述のクラーク型酸素電極では、その
微小化が困難であり、また内部液室を保有しているため
に漏れや汚染問題が生じ易く、応答速度が遅かった。さ
らに、分離型酸素電極では応答が迅速となるが、カソー
ドの白金電極はH+イオン濃度の影響を受け易く、このた
めpH濃度が大きく変化する流動系では、真の酸素分圧
（PO2）濃度との区別が困難であった。
微小化が困難であり、また内部液室を保有しているため
に漏れや汚染問題が生じ易く、応答速度が遅かった。さ
らに、分離型酸素電極では応答が迅速となるが、カソー
ドの白金電極はH+イオン濃度の影響を受け易く、このた
めpH濃度が大きく変化する流動系では、真の酸素分圧
（PO2）濃度との区別が困難であった。
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであっ
て、微小化が容易であるとともに、汚染問題が生ずるこ
とがなく、しかもH+イオン濃度や酸素分圧の影響を受け
ることがなく、応答速度が向上し、流動系における連続
モニタリング測定に好適な酵素センサの製造方法を提供
することを目的とする。
て、微小化が容易であるとともに、汚染問題が生ずるこ
とがなく、しかもH+イオン濃度や酸素分圧の影響を受け
ることがなく、応答速度が向上し、流動系における連続
モニタリング測定に好適な酵素センサの製造方法を提供
することを目的とする。
［課題を解決するための手段］ 上記課題を解決するために、本発明による酵素センサ
の製造方法は、導電性基体の表面に、酵素還元触媒機能
を有する配位子化合物を酵素とともに固定化試薬として
グルタルアルデヒドを用いて不溶化して固定化する工程
と、未反応の該固定化試薬をグリシンを用いて除去して
酵素固定化膜を形成する工程と、からなることを特徴と
する。
の製造方法は、導電性基体の表面に、酵素還元触媒機能
を有する配位子化合物を酵素とともに固定化試薬として
グルタルアルデヒドを用いて不溶化して固定化する工程
と、未反応の該固定化試薬をグリシンを用いて除去して
酵素固定化膜を形成する工程と、からなることを特徴と
する。
このような構成によれば、固体型であるため、従来セ
ンサのような液漏れや汚染等の問題は生じない。また、
微小化（たとえば0.01cm2以下）が容易であり、H+イオ
ン濃度の影響を受けにくく、したがってpH濃度が大きく
変化する流動系において使用しても精度よく測定を行う
ことができる。
ンサのような液漏れや汚染等の問題は生じない。また、
微小化（たとえば0.01cm2以下）が容易であり、H+イオ
ン濃度の影響を受けにくく、したがってpH濃度が大きく
変化する流動系において使用しても精度よく測定を行う
ことができる。
前記酸素還元触媒機能を有する配位子化合物として
は、環状の窒素含有化合物からなるものが好ましく、特
に、ポルフィリン誘導体、フタロシアニン誘導体、シク
ラム誘導体またはフェナントロリン誘導体であることが
好ましい。
は、環状の窒素含有化合物からなるものが好ましく、特
に、ポルフィリン誘導体、フタロシアニン誘導体、シク
ラム誘導体またはフェナントロリン誘導体であることが
好ましい。
ポルフィリン誘導体としては、たとえばメソテトラ
（Ｏ−アミノフェニル）コバルトポルフィンがある。ま
た、フタロシアニン誘導体としては、たとえばテトラア
ミノフタロシアニン、またフェナントロリン誘導体とし
てはジアミノフェナントレンがある。
（Ｏ−アミノフェニル）コバルトポルフィンがある。ま
た、フタロシアニン誘導体としては、たとえばテトラア
ミノフタロシアニン、またフェナントロリン誘導体とし
てはジアミノフェナントレンがある。
なお、上記配位子化合物に取り込まれる遷移金属は、
酸素還元触媒機能を有するものであれば、よく、たとえ
ばコバルト、鉄、ニッケル、クロム、モリブデン、ルテ
ニウム等が用いられる。
酸素還元触媒機能を有するものであれば、よく、たとえ
ばコバルト、鉄、ニッケル、クロム、モリブデン、ルテ
ニウム等が用いられる。
また、導電性基体は、酸素濃度やH+イオン濃度の影響
を受けない材料、たとえば導電性炭素材料により形成す
ることが好ましい。
を受けない材料、たとえば導電性炭素材料により形成す
ることが好ましい。
［実施例］ 以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明
する。
する。
（実施例１） 導電性炭素材料（BPG;Basal plane pyrolytic carbo
n,UCC社製）からなる円柱状（または円板状）の基体
（直径0.525mm）を用意し、その一端に導電性接着剤を
用いてリード線を接続し、その回りを絶縁テフロンチュ
ーブで覆い、その隙間に絶縁性接着剤（スリーボンド社
製,TB2067）を充填して電気的に絶縁させて、キャピラ
リ電極を作製した。次に、このキャピラリー電極の先端
の一部を切断して研磨し、第１図（ａ）に示すような微
小炭素ディスク型の電極基体１を作製した。この電極１
を２個用意し、それぞれその上に、次の（Ａ），（Ｂ）
の溶液をマイクロシリンジ２で滴下し、針先で混ぜた。
n,UCC社製）からなる円柱状（または円板状）の基体
（直径0.525mm）を用意し、その一端に導電性接着剤を
用いてリード線を接続し、その回りを絶縁テフロンチュ
ーブで覆い、その隙間に絶縁性接着剤（スリーボンド社
製,TB2067）を充填して電気的に絶縁させて、キャピラ
リ電極を作製した。次に、このキャピラリー電極の先端
の一部を切断して研磨し、第１図（ａ）に示すような微
小炭素ディスク型の電極基体１を作製した。この電極１
を２個用意し、それぞれその上に、次の（Ａ），（Ｂ）
の溶液をマイクロシリンジ２で滴下し、針先で混ぜた。
（Ａ）5mMメソテトラ（Ｏ−アミノフェニル）コバルト
ポルフィリン （C0−TAPP） 2.4μ （CH3CN（溶媒）中） ＋ 15％牛血清アルブミン（BSA）を含む50mMリン酸
緩衝液 2.0μ （Ｂ）5mMメソテトラ（Ｏ−アミノフェニル）コバルト
ポルフィリン （C0−TAPP） 2.4μ （CH3CN（溶媒）中） ＋ 0.2mg/mlグルコースオキシダーゼ（GOx） および15％牛血清アルブミン（BSA）を含む50mM
リン酸緩衝液 2.0μ 次に、同図（ｂ）に示すようにマイクロシリンジ３に
て25重量％グルタルアルデヒド1.2μをその上に滴下
し、これらの溶液を再度同図（ｃ）に示すように針先４
により均一に混ぜ合せて、大気中で15分間反応させた。
次いで、10mMリン酸緩衝液（pH＝7.0）中で12時間反応
させ、さらに10重量％グリシン水溶液中に15分間浸漬
し、未反応グルタルアルデヒドを除去した。
ポルフィリン （C0−TAPP） 2.4μ （CH3CN（溶媒）中） ＋ 15％牛血清アルブミン（BSA）を含む50mMリン酸
緩衝液 2.0μ （Ｂ）5mMメソテトラ（Ｏ−アミノフェニル）コバルト
ポルフィリン （C0−TAPP） 2.4μ （CH3CN（溶媒）中） ＋ 0.2mg/mlグルコースオキシダーゼ（GOx） および15％牛血清アルブミン（BSA）を含む50mM
リン酸緩衝液 2.0μ 次に、同図（ｂ）に示すようにマイクロシリンジ３に
て25重量％グルタルアルデヒド1.2μをその上に滴下
し、これらの溶液を再度同図（ｃ）に示すように針先４
により均一に混ぜ合せて、大気中で15分間反応させた。
次いで、10mMリン酸緩衝液（pH＝7.0）中で12時間反応
させ、さらに10重量％グリシン水溶液中に15分間浸漬
し、未反応グルタルアルデヒドを除去した。
実験例１ 実施例１で製作した酵素電極を用いて、10mMリン酸緩
衝液（pH＝7.0）中の酸素濃度に対するサイクリックボ
ルタモグラムを求めた。第２図（ａ）がグルコースオキ
シダーゼ（GOx）を含まない電極Ａ、同図（ｂ）がグル
コースオキシダーゼを含む電極Ｂの結果をそれぞれ示す
ものである。その結果、一定電位（−0.8V対飽和塩化ナ
トリウムカロメロ電極（SSCE））において、グルコース
オキシダーゼを含む電極Ｂの方が、電極Ａの場合に比べ
て電流変化が大きいことが明らかとなった。
衝液（pH＝7.0）中の酸素濃度に対するサイクリックボ
ルタモグラムを求めた。第２図（ａ）がグルコースオキ
シダーゼ（GOx）を含まない電極Ａ、同図（ｂ）がグル
コースオキシダーゼを含む電極Ｂの結果をそれぞれ示す
ものである。その結果、一定電位（−0.8V対飽和塩化ナ
トリウムカロメロ電極（SSCE））において、グルコース
オキシダーゼを含む電極Ｂの方が、電極Ａの場合に比べ
て電流変化が大きいことが明らかとなった。
また、電流密度（A/cm2）は、電極Ｂが2.12×10-3A/c
m2、電極Ａが1.34×10-3A/cm2であり、電極Ｂの方が1.5
8倍大きかった。
m2、電極Ａが1.34×10-3A/cm2であり、電極Ｂの方が1.5
8倍大きかった。
実験例２ 実験例１のグルコースオキシダーゼを含む電極Ｂとグ
ルコースオキシダーゼを含まない電極Ａを用いてグルコ
ース濃度に対する電流値変化を検討した。
ルコースオキシダーゼを含まない電極Ａを用いてグルコ
ース濃度に対する電流値変化を検討した。
実験は、10mMリン酸緩衝液（pH＝7.00）に1g/dlのグ
ルコース溶液を加え、空気バブリング（速度0.2／
分）を行い、スターラ（撹拌器）で撹拌し、一定電位
（−0.6V対SSCE）の時の電流値変化を調べた。その結果
を第３図（ａ），（ｂ）に示す。同図（ａ）は作製後４
日目、また同図（ｂ）は作製後20日目の結果をそれぞれ
示すものである。
ルコース溶液を加え、空気バブリング（速度0.2／
分）を行い、スターラ（撹拌器）で撹拌し、一定電位
（−0.6V対SSCE）の時の電流値変化を調べた。その結果
を第３図（ａ），（ｂ）に示す。同図（ａ）は作製後４
日目、また同図（ｂ）は作製後20日目の結果をそれぞれ
示すものである。
この結果、作製後４日目の電極では、グルコース濃度
５〜100mg/dl迄の電流値は約100〜39.29nA、さらに作製
後20日では、約110〜33.3nAに直線的に変化する良好な
酵素センサが得られることがわかった。
５〜100mg/dl迄の電流値は約100〜39.29nA、さらに作製
後20日では、約110〜33.3nAに直線的に変化する良好な
酵素センサが得られることがわかった。
（実施例２） 実施例１の電極Ｂのメソテトラ（Ｏ−アミノフェニ
ル）コバルトポルフィリンの濃度を10mMに変えた以外は
実施例１と同様にグルコースオキシダーゼを含む酵素電
極を作製した。
ル）コバルトポルフィリンの濃度を10mMに変えた以外は
実施例１と同様にグルコースオキシダーゼを含む酵素電
極を作製した。
実験例３ 実施例２で作製した電極を、実験例２と同様に20日後
にグルコース濃度（５〜100mg/dl）に対する電流値変化
を調べた。その結果、電流値は110〜10nAの範囲で直線
的に変化し、良好な酵素センサを作製できることが明ら
かとなった。なお、電流密度は一定電位（−0.8V対SSC
E）において1.62×10-3A/cm2であった。
にグルコース濃度（５〜100mg/dl）に対する電流値変化
を調べた。その結果、電流値は110〜10nAの範囲で直線
的に変化し、良好な酵素センサを作製できることが明ら
かとなった。なお、電流密度は一定電位（−0.8V対SSC
E）において1.62×10-3A/cm2であった。
尚、上記実施例においては、導電性基体部を円板（デ
ィスク）電極としたが、本発明はこれに限定されるもの
ではなく、微小なバンド型電極やアレー型電極、あるい
は柱状または溝型電極を用いてもよいことは勿論であ
る。
ィスク）電極としたが、本発明はこれに限定されるもの
ではなく、微小なバンド型電極やアレー型電極、あるい
は柱状または溝型電極を用いてもよいことは勿論であ
る。
なお、本実施例では、酵素としてグルコースオキシダ
ーゼについて説明したが、酸素を受容体とし、過酸化水
素を反応生成物として生ずる酵素、グルコレートオキシ
ダーゼ、マレートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ、アリル−アルコール
オキシダーゼ、Ｌ−グルコノラクトンオキシダーゼ、ガ
ラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、Ｌ
−ソルボースオキシダーゼ、ピリドキシン４−オキシダ
ーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルベートオキシダー
ゼ、オキサレートオキシダーゼ、グリオキシレートオキ
シダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ラトステ
ロールオキシダーゼ、Ｄ−アスパテートオキシダーゼ、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダー
ゼ、アミンオキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸オキシダー
ゼ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、エタノールアミン
オキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、プトレッシンオ
キシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、Ｌ−
リシンα−オキシダーゼ、Ｎ−メチルアミノ酸オキシダ
ーゼ、N6−メチルリシンオキシダーゼ、６−ヒドロキシ
−Ｄ−ニコチンオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシ
ダーゼ、ニトロエタンオキシダーゼ、サルファイトオキ
シダーゼについても摘要できることは明らかである。
ーゼについて説明したが、酸素を受容体とし、過酸化水
素を反応生成物として生ずる酵素、グルコレートオキシ
ダーゼ、マレートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ、アリル−アルコール
オキシダーゼ、Ｌ−グルコノラクトンオキシダーゼ、ガ
ラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、Ｌ
−ソルボースオキシダーゼ、ピリドキシン４−オキシダ
ーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルベートオキシダー
ゼ、オキサレートオキシダーゼ、グリオキシレートオキ
シダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ラトステ
ロールオキシダーゼ、Ｄ−アスパテートオキシダーゼ、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダー
ゼ、アミンオキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸オキシダー
ゼ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、エタノールアミン
オキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、プトレッシンオ
キシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、Ｌ−
リシンα−オキシダーゼ、Ｎ−メチルアミノ酸オキシダ
ーゼ、N6−メチルリシンオキシダーゼ、６−ヒドロキシ
−Ｄ−ニコチンオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシ
ダーゼ、ニトロエタンオキシダーゼ、サルファイトオキ
シダーゼについても摘要できることは明らかである。
［発明の効果］ 以上説明したように、本発明に係る酵素センサの製造
方法によれば、従来のセンサに比べて、汚染等の問題が
生ずることがなく、しかも作製が容易であるとともに微
小化が容易である。従って、応答速度が非常に速くなる
とともにH+イオン濃度等の影響を受けることがなく、流
動系においても精度良く測定することができ、更に触媒
物質と酵素との混合割合を変化させることにより、基質
の透過制御や応答速度等の制御が容易になる等の種々の
効果が得られるものである。
方法によれば、従来のセンサに比べて、汚染等の問題が
生ずることがなく、しかも作製が容易であるとともに微
小化が容易である。従って、応答速度が非常に速くなる
とともにH+イオン濃度等の影響を受けることがなく、流
動系においても精度良く測定することができ、更に触媒
物質と酵素との混合割合を変化させることにより、基質
の透過制御や応答速度等の制御が容易になる等の種々の
効果が得られるものである。
第１図（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ本発明の実施例１に係
る酵素センサの製造方法を示す斜視図、第２図（ａ），
（ｂ）は第１図の方法で製造したセンサのサイクリック
ボルタモグラムを示す図で、同図（ａ）はグルコースオ
キシダーゼを含まない電極Ａの特性図、同図（ｂ）はグ
ルコースオキシダーゼを含む電極Ｂの特性図、第３図
（ａ），（ｂ）はそれぞれ電極Ｂのグルコース濃度に対
する電流値の変化を示すもので、同図（ａ）は作製後４
日目の特性図、同図（ｂ）は作製後20日目の特性図であ
る。 １……電極基体、2,3……マイクロシリンジ
る酵素センサの製造方法を示す斜視図、第２図（ａ），
（ｂ）は第１図の方法で製造したセンサのサイクリック
ボルタモグラムを示す図で、同図（ａ）はグルコースオ
キシダーゼを含まない電極Ａの特性図、同図（ｂ）はグ
ルコースオキシダーゼを含む電極Ｂの特性図、第３図
（ａ），（ｂ）はそれぞれ電極Ｂのグルコース濃度に対
する電流値の変化を示すもので、同図（ａ）は作製後４
日目の特性図、同図（ｂ）は作製後20日目の特性図であ
る。 １……電極基体、2,3……マイクロシリンジ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−3552（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−54344（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−88952（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−149050（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/327
Claims (1)
- 【請求項１】導電性基体の表面に、酵素還元触媒機能を
有する配位子化合物を酵素とともに固定化試薬としてグ
ルタルアルデヒドを用いて不溶化して固定化する工程
と、未反応の該固定化試薬をグリシンを用いて除去して
酵素固定化膜を形成する工程と、 からなることを特徴とする酵素センサの製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1076218A JP2866865B2 (ja) | 1989-03-28 | 1989-03-28 | 酵素センサの製造方法 |
| US07/487,372 US5205920A (en) | 1989-03-03 | 1990-03-02 | Enzyme sensor and method of manufacturing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1076218A JP2866865B2 (ja) | 1989-03-28 | 1989-03-28 | 酵素センサの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02253149A JPH02253149A (ja) | 1990-10-11 |
| JP2866865B2 true JP2866865B2 (ja) | 1999-03-08 |
Family
ID=13599041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1076218A Expired - Lifetime JP2866865B2 (ja) | 1989-03-03 | 1989-03-28 | 酵素センサの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2866865B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT407199B (de) * | 1992-09-16 | 2001-01-25 | Gerald Dipl Ing Dr Urban | Ph-sensor |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS643552A (en) * | 1987-06-26 | 1989-01-09 | Terumo Corp | Enzyme sensor |
-
1989
- 1989-03-28 JP JP1076218A patent/JP2866865B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02253149A (ja) | 1990-10-11 |
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