JP2821040B2 - 細胞固相化容器の製造方法 - Google Patents
細胞固相化容器の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、赤血球、リンパ球、血
小板等の細胞が安定固相化された容器の製造方法に関す
る。
小板等の細胞が安定固相化された容器の製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来技術】免疫学的凝集反応に基づきサンプル中に存
在する抗原または抗体を検出する方法として混合凝集法
が報告されている（Wlener A.S及びHerman M.H.,J.Immu
nol.,36,255,1939）。そして、混合凝集法の原理を利用
した固相増感分析が、1956年Coombsらによって考案さ
れ、（Coombs R.R.A.,Marks J.and Bedford D., Speci-
fic mixed agglutination : Mixed erythrocyte platel
et anti-globulin reac-tion for the detection of pl
atelet antibodies. Br.J.Hematol. 2:84 ）、その後、
赤血球、血小板、リンパ球に対する抗体の検出に応用さ
れた。米国特許第4275053号公報には血小板およびリン
パ球の固相化について記載されている。また、Medical
Laboratory Science(1985)42, 194 〜195 の中でJane
M.Rachel らは、血小板を固相してモノレイヤーを形成
させ血小板に対する抗体を測定している。赤血球に対す
る抗体の検出に応用したのは、Richard E.Rosenfieldら
であった。米国特許第 4275053号公報、特公昭62-44221
号公報、Rosenfield R.E.,Kochwa,Kaczera Z : Solid p
hase serology for the study of human erythrocytica
ntigen-antibody reactions. Paris, Proc. 15th. Con
g. Intl. Soc. Blood Transfusion,P27,1976）。
在する抗原または抗体を検出する方法として混合凝集法
が報告されている（Wlener A.S及びHerman M.H.,J.Immu
nol.,36,255,1939）。そして、混合凝集法の原理を利用
した固相増感分析が、1956年Coombsらによって考案さ
れ、（Coombs R.R.A.,Marks J.and Bedford D., Speci-
fic mixed agglutination : Mixed erythrocyte platel
et anti-globulin reac-tion for the detection of pl
atelet antibodies. Br.J.Hematol. 2:84 ）、その後、
赤血球、血小板、リンパ球に対する抗体の検出に応用さ
れた。米国特許第4275053号公報には血小板およびリン
パ球の固相化について記載されている。また、Medical
Laboratory Science(1985)42, 194 〜195 の中でJane
M.Rachel らは、血小板を固相してモノレイヤーを形成
させ血小板に対する抗体を測定している。赤血球に対す
る抗体の検出に応用したのは、Richard E.Rosenfieldら
であった。米国特許第 4275053号公報、特公昭62-44221
号公報、Rosenfield R.E.,Kochwa,Kaczera Z : Solid p
hase serology for the study of human erythrocytica
ntigen-antibody reactions. Paris, Proc. 15th. Con
g. Intl. Soc. Blood Transfusion,P27,1976）。
【０００３】さらに、イムコア社（Immcur, Inc.）によ
って改良・実用化されＣＡＰＴＵＲＥ−Ｒという商品名
で不規則抗体の検出用試薬として市販されるに至った。
又、オリンパス光学工業（株）からも、固相化赤血球を
用いて不規則抗体の検出が可能であることが報告された
（特開平2-124464号公報、日本輸血学会雑誌 Vol.36.N
o.2. P314 '90 ）。イムコア社（Immcur, Inc.）および
オリンパス光学工業（株）の両方法ともに赤血球をＵ底
マイクロプレート容器に固相化し、その固相化赤血球表
面上で抗体と反応させ、各々抗ヒトIgＧ感作赤血球又は
抗ヒトIgＧ感作磁性体封入粒子で不規則抗体の有無を判
定しようとするものである。この赤血球層の形成状態
は、分析結果に多大な影響を与えるため、両方法とも固
相化赤血球は、単層でプレート上に赤血球の欠落がない
ように均一に形成されることが好ましい。このような赤
血球の固相化は、赤血球結合物質がコーティングされた
プレートに赤血球の浮遊液を分注し、その後、余剰赤血
球の除去のために洗浄することで達成される。従来は、
赤血球の浮遊液と洗浄液は、ともに等張である生理食塩
水が使用されていた。また場合によっては、洗浄液とし
て等張の低イオン強度溶液が使用されることもあった。
って改良・実用化されＣＡＰＴＵＲＥ−Ｒという商品名
で不規則抗体の検出用試薬として市販されるに至った。
又、オリンパス光学工業（株）からも、固相化赤血球を
用いて不規則抗体の検出が可能であることが報告された
（特開平2-124464号公報、日本輸血学会雑誌 Vol.36.N
o.2. P314 '90 ）。イムコア社（Immcur, Inc.）および
オリンパス光学工業（株）の両方法ともに赤血球をＵ底
マイクロプレート容器に固相化し、その固相化赤血球表
面上で抗体と反応させ、各々抗ヒトIgＧ感作赤血球又は
抗ヒトIgＧ感作磁性体封入粒子で不規則抗体の有無を判
定しようとするものである。この赤血球層の形成状態
は、分析結果に多大な影響を与えるため、両方法とも固
相化赤血球は、単層でプレート上に赤血球の欠落がない
ように均一に形成されることが好ましい。このような赤
血球の固相化は、赤血球結合物質がコーティングされた
プレートに赤血球の浮遊液を分注し、その後、余剰赤血
球の除去のために洗浄することで達成される。従来は、
赤血球の浮遊液と洗浄液は、ともに等張である生理食塩
水が使用されていた。また場合によっては、洗浄液とし
て等張の低イオン強度溶液が使用されることもあった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来方法で形成された
固相化細胞層は単層にはできるが、細胞の脱離部分があ
って均一さに欠けていた。その原因として、固相化後の
余剰細胞を除去するための洗浄による物理刺激が考えら
れる。このような細胞層からの細胞の欠落は、抗原また
は抗体の分析において感度・再現性の低下を生じさせ
る。本発明は、細胞固相化した後に行われる余剰細胞を
除去するための洗浄によって、上記不具合の生じない細
胞の安定固相化容器の製造方法を提供することを目的と
する。
固相化細胞層は単層にはできるが、細胞の脱離部分があ
って均一さに欠けていた。その原因として、固相化後の
余剰細胞を除去するための洗浄による物理刺激が考えら
れる。このような細胞層からの細胞の欠落は、抗原また
は抗体の分析において感度・再現性の低下を生じさせ
る。本発明は、細胞固相化した後に行われる余剰細胞を
除去するための洗浄によって、上記不具合の生じない細
胞の安定固相化容器の製造方法を提供することを目的と
する。
【０００５】
【課題を解決するための手段および作用】通常赤血球
は、浮遊状態において高張溶液中で正常の形態であるデ
ィスコサイト（Discocyte)から細胞膜が外方突出したコ
ンペイトウ状のエチノサイト（Echinocyte）を呈しやす
く、逆に低張溶液ではストマトサイト（Stomatocyte)様
になることは、以前から知られていた。低張溶液もしく
はCUP-Formerの一種である塩酸プロカインを含む溶液の
中では見かけ上、赤血球の体積は増大する。もちろん過
度に低張にしたり、CUP-Formerを添加すると溶血してし
まうことは、言うまでもない。固相化赤血球においても
同様の変化が起こることを我々は、当初予測しプレート
上でディスコサイトの状態を保った等張液で赤血球を固
相化し、低張液で洗浄すると赤血球がふくらみ赤血球間
のすき間が少ない赤血球層が形成されると考えた。しか
し、固相化赤血球においては、固相表面上での形態変化
が予測と全く逆になることを発見した。即ちプレート上
で等張の浮遊液で赤血球を固相化し、低張溶液で洗浄す
ると赤血球の固相表面での接着面積が低下し、赤血球間
にすき間が生じやすくなった。等張の浮遊液で赤血球を
固相化し、高張液で洗浄すると、固相表面での接着面積
が増大し、赤血球間のすき間が消失した。この発見に基
づき細胞の安定固相化を実現した。低張液を用いた細胞
浮遊液で細胞を固相化し等張液で洗浄あるいは等張液を
用いた細胞浮遊液で細胞を固相化し、高張液で洗浄す
る。すなわち固相化時の浸透圧より高い浸透圧の洗浄液
で洗浄することが必要である。この時に用いる浸透圧の
コントロールには、塩化カリウム、塩化ナトリウムのよ
うな無機塩類、グルコース・サッカロースなどの糖類に
若干の塩類を含んだもの、グリシンのようなアミノ酸類
あるいは無機塩類、糖類、アミノ酸の混合溶液が使用で
きる。この方法により、赤血球、リンパ球、血小板等の
細胞の単層を安定に容器内壁に形成することができる。
は、浮遊状態において高張溶液中で正常の形態であるデ
ィスコサイト（Discocyte)から細胞膜が外方突出したコ
ンペイトウ状のエチノサイト（Echinocyte）を呈しやす
く、逆に低張溶液ではストマトサイト（Stomatocyte)様
になることは、以前から知られていた。低張溶液もしく
はCUP-Formerの一種である塩酸プロカインを含む溶液の
中では見かけ上、赤血球の体積は増大する。もちろん過
度に低張にしたり、CUP-Formerを添加すると溶血してし
まうことは、言うまでもない。固相化赤血球においても
同様の変化が起こることを我々は、当初予測しプレート
上でディスコサイトの状態を保った等張液で赤血球を固
相化し、低張液で洗浄すると赤血球がふくらみ赤血球間
のすき間が少ない赤血球層が形成されると考えた。しか
し、固相化赤血球においては、固相表面上での形態変化
が予測と全く逆になることを発見した。即ちプレート上
で等張の浮遊液で赤血球を固相化し、低張溶液で洗浄す
ると赤血球の固相表面での接着面積が低下し、赤血球間
にすき間が生じやすくなった。等張の浮遊液で赤血球を
固相化し、高張液で洗浄すると、固相表面での接着面積
が増大し、赤血球間のすき間が消失した。この発見に基
づき細胞の安定固相化を実現した。低張液を用いた細胞
浮遊液で細胞を固相化し等張液で洗浄あるいは等張液を
用いた細胞浮遊液で細胞を固相化し、高張液で洗浄す
る。すなわち固相化時の浸透圧より高い浸透圧の洗浄液
で洗浄することが必要である。この時に用いる浸透圧の
コントロールには、塩化カリウム、塩化ナトリウムのよ
うな無機塩類、グルコース・サッカロースなどの糖類に
若干の塩類を含んだもの、グリシンのようなアミノ酸類
あるいは無機塩類、糖類、アミノ酸の混合溶液が使用で
きる。この方法により、赤血球、リンパ球、血小板等の
細胞の単層を安定に容器内壁に形成することができる。
【０００６】本発明は、一定の浸透圧の細胞希釈液で細
胞を所定濃度に希釈して調整した細胞浮遊液を容器に固
相化後、その余剰細胞を除去するために細胞浮遊液より
も高張に調整された洗浄液で洗浄を行うことで単層で均
一な細胞層を容器内壁に形成させた。
胞を所定濃度に希釈して調整した細胞浮遊液を容器に固
相化後、その余剰細胞を除去するために細胞浮遊液より
も高張に調整された洗浄液で洗浄を行うことで単層で均
一な細胞層を容器内壁に形成させた。
【０００７】
実施例１浸透圧の異なる、赤血球浮遊液と洗浄液による赤血球結
合状態の変化 ＷＧＡプレートの作製 96穴Ｕ底マイクロプレート（ヌンク社製 マキシソープ
タイプ）の各ウェルを赤血球固相化用の容器とした。各
ウェルに小麦胚芽レクチン（生化学工業社製、以下ＷＧ
Ａと称す）を分注する。このＷＧＡは、PH＝7.0 の0.01
Ｍリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと称す）に、10μg/mlの濃
度になるように溶解したもので、分注量は、 100μl/ウ
ェルである。ＷＧＡ溶液を分注後、室温で30分間インキ
ュベートした。次に、ウェルの内壁と結合していない未
結合のＷＧＡを除去するために 200μl/ウェルのＰＢＳ
で注入、吸引を行い各ウェルを洗浄した。この洗浄操作
を５回繰り返し、ＷＧＡプレート（以下、ＷＧＡプレー
トをウェルと略す）を作成した。赤血球の固相化 抗凝固剤ＣＤＰ（クエン酸、グルコース、リン酸）を添
加した保存Ｏ型血液中の赤血球を 0.9％塩化ナトリウム
水溶液（生理食塩水、以下 0.9％NaClaqと称す）で２回
洗浄を行ったヒトＯ型赤血球を固相化する赤血球とし
た。この洗浄済のヒトＯ型赤血球を 0.5％、 0.9％、
1.3％のNaClaqを希釈液として、 0.7％赤血球浮遊液を
作成した。浸透圧と、浸透圧調整物質である塩化ナトリ
ウムは、比例関係にあり、以下では、浸透圧調整物質の
濃度でもって浸透圧を示すこととする。NaClaqでは、大
体 0.9％が等張液で、それより下が低張液、 0.9％より
大きな濃度の溶液は高張液である。そして、 0.5％、
0.9％、 1.3％NaClで調整した各浸透圧の赤血球浮遊液2
5μl を各ウェルに分注し、室温で10分間静置して固相
化した。その後ウェルの余剰赤血球を除去するため 0.5
％、 0.7％、 0.9％、 1.1％、 1.3％、 1.5％、 1.8％
のNaClaqを洗浄液として、各浸透圧の赤血球浮遊液が分
注されたウェルを洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返
した。洗浄後、赤血球表面が乾燥しないように使用した
それぞれの濃度の洗浄液をウェル内に少量残した。そし
て、顕微鏡下および肉眼で赤血球の容器表面への結合状
態を観察した。結果を表１に示した。 0.5％NaClaqで調
整した赤血球浮遊液による固相化の場合、その各ウェル
を洗浄液の濃度の低い方からＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、
Ａ５、Ａ６、Ａ７と命名した。 0.9％NaClaqを用いた赤
血球浮遊液による固相化の場合、その各ウェルを洗浄液
の濃度の低い方からＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ
６、Ｂ７と命名した。同様に、 1.3％NaClaqを用いた赤
血球浮遊液による固相化の場合、その各ウェルを洗浄液
の濃度の低い方からＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ
６、Ｃ７と命名した。結果を表１に示した。表１におい
て、赤血球浮遊液と洗浄液の組み合せによる、赤血球結
合状態は−２から＋２までの数字で表示した。たとえば
Ａ１のウェルでは赤血球結合状態は−２である。この−
２〜＋２の赤血球結合状態は第１図を基に決定された。
第１図は赤血球浮遊液として 0.9％NaClを用いて製造し
たＢ１〜Ｂ７の容器に固相した赤血球の結合状態を示す
写真である。赤血球の形が丸く、まばらに存在する結合
状態を−２（第１図（Ａ）の状態）、赤血球の形が丸
く、ややすきまが多い結合状態を−１（第１図（Ｂ）の
状態）、赤血球の形がやや丸く、すきまが少しある、肉
眼で見ると少し茶色を帯びている状態を０（第１図
（Ｃ）の状態）、赤血球の形が変形している、すきまが
少ない、肉眼で見ると透明感がある状態を＋１（第１図
（Ｄ）の状態）、血球の形は変形している、すきまがな
い、肉眼で見ると透明感がある状態を＋２（第１図
（Ｅ）の状態）とした。第１図（Ａ）は容器Ｂ１の赤血
球結合状態を示す写真であり、第１図（Ｂ）はＢ２、第
１図（Ｃ）はＢ３、第１図（Ｄ）はＢ４、第１図（Ｅ）
はＢ５、Ｂ６、Ｂ７の各容器内の赤血球結合状態を示す
写真である。
合状態の変化 ＷＧＡプレートの作製 96穴Ｕ底マイクロプレート（ヌンク社製 マキシソープ
タイプ）の各ウェルを赤血球固相化用の容器とした。各
ウェルに小麦胚芽レクチン（生化学工業社製、以下ＷＧ
Ａと称す）を分注する。このＷＧＡは、PH＝7.0 の0.01
Ｍリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと称す）に、10μg/mlの濃
度になるように溶解したもので、分注量は、 100μl/ウ
ェルである。ＷＧＡ溶液を分注後、室温で30分間インキ
ュベートした。次に、ウェルの内壁と結合していない未
結合のＷＧＡを除去するために 200μl/ウェルのＰＢＳ
で注入、吸引を行い各ウェルを洗浄した。この洗浄操作
を５回繰り返し、ＷＧＡプレート（以下、ＷＧＡプレー
トをウェルと略す）を作成した。赤血球の固相化 抗凝固剤ＣＤＰ（クエン酸、グルコース、リン酸）を添
加した保存Ｏ型血液中の赤血球を 0.9％塩化ナトリウム
水溶液（生理食塩水、以下 0.9％NaClaqと称す）で２回
洗浄を行ったヒトＯ型赤血球を固相化する赤血球とし
た。この洗浄済のヒトＯ型赤血球を 0.5％、 0.9％、
1.3％のNaClaqを希釈液として、 0.7％赤血球浮遊液を
作成した。浸透圧と、浸透圧調整物質である塩化ナトリ
ウムは、比例関係にあり、以下では、浸透圧調整物質の
濃度でもって浸透圧を示すこととする。NaClaqでは、大
体 0.9％が等張液で、それより下が低張液、 0.9％より
大きな濃度の溶液は高張液である。そして、 0.5％、
0.9％、 1.3％NaClで調整した各浸透圧の赤血球浮遊液2
5μl を各ウェルに分注し、室温で10分間静置して固相
化した。その後ウェルの余剰赤血球を除去するため 0.5
％、 0.7％、 0.9％、 1.1％、 1.3％、 1.5％、 1.8％
のNaClaqを洗浄液として、各浸透圧の赤血球浮遊液が分
注されたウェルを洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返
した。洗浄後、赤血球表面が乾燥しないように使用した
それぞれの濃度の洗浄液をウェル内に少量残した。そし
て、顕微鏡下および肉眼で赤血球の容器表面への結合状
態を観察した。結果を表１に示した。 0.5％NaClaqで調
整した赤血球浮遊液による固相化の場合、その各ウェル
を洗浄液の濃度の低い方からＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、
Ａ５、Ａ６、Ａ７と命名した。 0.9％NaClaqを用いた赤
血球浮遊液による固相化の場合、その各ウェルを洗浄液
の濃度の低い方からＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ
６、Ｂ７と命名した。同様に、 1.3％NaClaqを用いた赤
血球浮遊液による固相化の場合、その各ウェルを洗浄液
の濃度の低い方からＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ
６、Ｃ７と命名した。結果を表１に示した。表１におい
て、赤血球浮遊液と洗浄液の組み合せによる、赤血球結
合状態は−２から＋２までの数字で表示した。たとえば
Ａ１のウェルでは赤血球結合状態は−２である。この−
２〜＋２の赤血球結合状態は第１図を基に決定された。
第１図は赤血球浮遊液として 0.9％NaClを用いて製造し
たＢ１〜Ｂ７の容器に固相した赤血球の結合状態を示す
写真である。赤血球の形が丸く、まばらに存在する結合
状態を−２（第１図（Ａ）の状態）、赤血球の形が丸
く、ややすきまが多い結合状態を−１（第１図（Ｂ）の
状態）、赤血球の形がやや丸く、すきまが少しある、肉
眼で見ると少し茶色を帯びている状態を０（第１図
（Ｃ）の状態）、赤血球の形が変形している、すきまが
少ない、肉眼で見ると透明感がある状態を＋１（第１図
（Ｄ）の状態）、血球の形は変形している、すきまがな
い、肉眼で見ると透明感がある状態を＋２（第１図
（Ｅ）の状態）とした。第１図（Ａ）は容器Ｂ１の赤血
球結合状態を示す写真であり、第１図（Ｂ）はＢ２、第
１図（Ｃ）はＢ３、第１図（Ｄ）はＢ４、第１図（Ｅ）
はＢ５、Ｂ６、Ｂ７の各容器内の赤血球結合状態を示す
写真である。
【０００８】赤血球浮遊液が低張液（ 0.5％NaClaq）の
場合、洗浄液が固相液（赤血球浮遊液）より高張である
場合の赤血球結合形態（Ａ２〜Ａ７）は、洗浄液と固相
液の浸透圧が同じ場合の赤血球結合形態（Ａ１）よりも
密で均一な赤血球層を形成している。赤血球浮遊液が等
張液（ 0.9％NaClaq）の場合、洗浄液が固相液より高張
である場合の赤血球結合形態（Ｂ４〜Ｂ７）は、洗浄液
と固相液の浸透圧が同じ場合の赤血球結合形態（Ｂ３）
よりも密で均一な赤血球層を形成している。赤血球浮遊
液が高張液（ 1.3％NaClaq）の場合、洗浄液が固相液よ
り高張である場合の赤血球結合形態（Ｃ６、Ｃ７）は洗
浄液と固相液の浸透圧が同じ場合の赤血球結合形態（Ｃ
５）よりも密で均一な赤血球層を形成している。
場合、洗浄液が固相液（赤血球浮遊液）より高張である
場合の赤血球結合形態（Ａ２〜Ａ７）は、洗浄液と固相
液の浸透圧が同じ場合の赤血球結合形態（Ａ１）よりも
密で均一な赤血球層を形成している。赤血球浮遊液が等
張液（ 0.9％NaClaq）の場合、洗浄液が固相液より高張
である場合の赤血球結合形態（Ｂ４〜Ｂ７）は、洗浄液
と固相液の浸透圧が同じ場合の赤血球結合形態（Ｂ３）
よりも密で均一な赤血球層を形成している。赤血球浮遊
液が高張液（ 1.3％NaClaq）の場合、洗浄液が固相液よ
り高張である場合の赤血球結合形態（Ｃ６、Ｃ７）は洗
浄液と固相液の浸透圧が同じ場合の赤血球結合形態（Ｃ
５）よりも密で均一な赤血球層を形成している。
【０００９】赤血球固相化容器を用いた分析 上述の実施例で作成した、 0.9％NaClaqの希釈液による
赤血球浮遊液を固相液として 0.5％〜 1.3％の各種のNa
Claqを洗浄液として洗浄した赤血球結合容器B1〜B5を凝
集反応によるサンプルの測定に用いた。Ｂ３のウェルは
従来方法で固相化されたものに該当する。各ウェルに検
体希釈液として等張の低イオン強度メディウム（ＬＩＳ
Ｓ）75μl を分注し、そこにサンプルとして不規則抗体
陰性の血漿25μl を分注し、37℃で10分間インキュベー
トした。各容器Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それ
ぞれ 0.5％、 0.7％、 0.9％、 1.1％、 1.3％のNaClaq
で洗浄した。洗浄回数は６回で洗浄液は赤血球を固相
化、洗浄した時の洗浄液の濃度に対応する。洗浄後、抗
ヒトIgＧ感作磁性体封入ゼラチン粒子を25μl/ウェル分
注し磁石上で、パターンを形成した。この抗ヒトIgＧ感
作の磁性体封入ゼラチン粒子は、 0.3％の磁性体封入ゼ
ラチン粒子にCappele社製の抗ヒトIgＧを感作させたも
のである。
赤血球浮遊液を固相液として 0.5％〜 1.3％の各種のNa
Claqを洗浄液として洗浄した赤血球結合容器B1〜B5を凝
集反応によるサンプルの測定に用いた。Ｂ３のウェルは
従来方法で固相化されたものに該当する。各ウェルに検
体希釈液として等張の低イオン強度メディウム（ＬＩＳ
Ｓ）75μl を分注し、そこにサンプルとして不規則抗体
陰性の血漿25μl を分注し、37℃で10分間インキュベー
トした。各容器Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５は、それ
ぞれ 0.5％、 0.7％、 0.9％、 1.1％、 1.3％のNaClaq
で洗浄した。洗浄回数は６回で洗浄液は赤血球を固相
化、洗浄した時の洗浄液の濃度に対応する。洗浄後、抗
ヒトIgＧ感作磁性体封入ゼラチン粒子を25μl/ウェル分
注し磁石上で、パターンを形成した。この抗ヒトIgＧ感
作の磁性体封入ゼラチン粒子は、 0.3％の磁性体封入ゼ
ラチン粒子にCappele社製の抗ヒトIgＧを感作させたも
のである。
【００１０】結果を表２に示す。この表２に示されたＢ
１′〜Ｂ５′は、それぞれ 0.5〜 1.3％のNaClaqの洗浄
液で洗浄されたウェルである。サンプルは、不規則抗体
陰性であり、その陰性パターンは、理想的にはボタン状
となる。洗浄液の浸透圧による比較をすると、固相液よ
り高張液で洗浄した場合、（Ｂ４′、Ｂ５′）は、本来
の分析結果であるボタン状のパターンを呈した。固相液
と同じ浸透圧の場合（Ｂ３′）はややゆがんだボタン状
のパターンを呈した。固相液より低張液の場合（Ｂ
１′、Ｂ２′）は等張液の場合よりもさらに大きく広が
ったパターンを呈した。この実施例１によれば、赤血球
の固相化において、固相液よりも高張の洗浄液で洗浄す
ることにより、固相液と洗浄液が同じ浸透圧である従来
例に比べて良好な固相状態にすることができる。さら
に、この実施例によって作製した赤血球固相化容器を用
いて凝集パターンを容器底面に形成させることができ
た。
１′〜Ｂ５′は、それぞれ 0.5〜 1.3％のNaClaqの洗浄
液で洗浄されたウェルである。サンプルは、不規則抗体
陰性であり、その陰性パターンは、理想的にはボタン状
となる。洗浄液の浸透圧による比較をすると、固相液よ
り高張液で洗浄した場合、（Ｂ４′、Ｂ５′）は、本来
の分析結果であるボタン状のパターンを呈した。固相液
と同じ浸透圧の場合（Ｂ３′）はややゆがんだボタン状
のパターンを呈した。固相液より低張液の場合（Ｂ
１′、Ｂ２′）は等張液の場合よりもさらに大きく広が
ったパターンを呈した。この実施例１によれば、赤血球
の固相化において、固相液よりも高張の洗浄液で洗浄す
ることにより、固相液と洗浄液が同じ浸透圧である従来
例に比べて良好な固相状態にすることができる。さら
に、この実施例によって作製した赤血球固相化容器を用
いて凝集パターンを容器底面に形成させることができ
た。
【００１１】実施例２濃度の異る４種類の洗浄液と赤血球の結合状態の変化 ＷＧＡプレートの作製 実施例１のＷＧＡプレート作製と同様の方法で作製し
た。赤血球の固相化 抗凝固剤ＣＰＤを添加した保存Ｏ型血液中の赤血球を、
等張の 0.9％塩化ナトリウム水溶液（生理食塩水）で２
回洗浄し得られたヒトＯ型赤血球を固相化する赤血球と
した。この洗浄済のヒトＯ型赤血球を等張の生理食塩水
で約 0.7％に希釈して、赤血球浮遊液とした。この赤血
球浮遊液25μl を前記ＷＧＡプレートに分注し、室温で
10分間静置し固相化した。次に 0.5％、 0.7％、 0.9
％、 1.1％、 1.3％NaCl相当の５種の浸透圧の洗浄液20
0 μl/ウェルで各ウェルを洗浄して赤血球固相化容器を
作成した。この洗浄液の浸透圧調整物質としては、グリ
シン、塩化カリウム、若干の塩類を含むグルコース、グ
リシンと塩化ナトリウムをそれぞれ用いた。
た。赤血球の固相化 抗凝固剤ＣＰＤを添加した保存Ｏ型血液中の赤血球を、
等張の 0.9％塩化ナトリウム水溶液（生理食塩水）で２
回洗浄し得られたヒトＯ型赤血球を固相化する赤血球と
した。この洗浄済のヒトＯ型赤血球を等張の生理食塩水
で約 0.7％に希釈して、赤血球浮遊液とした。この赤血
球浮遊液25μl を前記ＷＧＡプレートに分注し、室温で
10分間静置し固相化した。次に 0.5％、 0.7％、 0.9
％、 1.1％、 1.3％NaCl相当の５種の浸透圧の洗浄液20
0 μl/ウェルで各ウェルを洗浄して赤血球固相化容器を
作成した。この洗浄液の浸透圧調整物質としては、グリ
シン、塩化カリウム、若干の塩類を含むグルコース、グ
リシンと塩化ナトリウムをそれぞれ用いた。
【００１２】そして各物質の等張濃度は、Merck Index
により、グリシン 2.2％、塩化カリウム1.19％、グルコ
ース5.51％である。グリシンと塩化ナトリウムの場合
は、 0.9％NaClaqにグリシンを添加し、 1.3％NaClaq相
当とした。洗浄後、容器表面への赤血球結合状態を顕微
鏡および肉眼で観察した。結果を表３に示した。
により、グリシン 2.2％、塩化カリウム1.19％、グルコ
ース5.51％である。グリシンと塩化ナトリウムの場合
は、 0.9％NaClaqにグリシンを添加し、 1.3％NaClaq相
当とした。洗浄後、容器表面への赤血球結合状態を顕微
鏡および肉眼で観察した。結果を表３に示した。
【００１３】表３に示されたＤ１〜Ｄ５、Ｅ１〜Ｅ５、
Ｆ１〜Ｆ５、Ｇ１〜Ｇ５は、グリシン、塩化カリウム、
グルコース、塩化ナトリウム＋グリシンそれぞれの 0.5
％〜1.3％のNaClaq相当の浸透圧の洗浄液で洗浄したウ
ェルである。洗浄液の浸透圧調整物質がグリシンの場合
は、高張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｄ４、Ｄ
５）は等張液での洗浄による赤血球結合状態（Ｄ３）と
比べ、赤血球間のすきまが少なく、形は平らであった。
低張液での洗浄による赤血球結合状態（Ｄ１、Ｄ２）は
等張液での洗浄による赤血球結合状態（Ｄ３）よりもさ
らに赤血球間のすきまが多く、形は丸味をおびている。
洗浄液の浸透圧調整物質が塩化カリウムの場合は、高張
液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｅ４、Ｅ５）は等張
液での洗浄の場合（Ｅ３）と比べ、赤血球間のすきまが
少なく、形は平らであった。低張液での洗浄による赤血
球結合状態Ｅ１、Ｅ２は、等張液での洗浄の場合（Ｅ
３）よりもさらに赤血球間のすきまが多く形は丸味をお
びている。洗浄液の浸透圧調整物質がグルコースと塩類
の場合は、高張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｆ
４、Ｆ３）は、等張液で洗浄した場合（Ｆ３）と比べ赤
血球間のすきまはないが、血球どうしが融合した状態と
なっている。低張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｆ
１、Ｆ２）は、等張液で洗浄した場合（Ｆ３）よりも、
さらに赤血球間のすきまが多く形も丸味をおびている。
洗浄液の浸透圧調整物質が塩化ナトリウムとグリシンの
場合は、高張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｇ４、
Ｇ５）は、等張液での洗浄の場合（Ｇ３）と比べ、赤血
球間のすきまが少なく、形は平らであった。低張液での
洗浄による赤血球結合状態（Ｇ１、Ｇ２）は等張液での
洗浄の場合（Ｇ３）よりもさらに赤血球間のすきまが多
く、形は丸味をおびている。
Ｆ１〜Ｆ５、Ｇ１〜Ｇ５は、グリシン、塩化カリウム、
グルコース、塩化ナトリウム＋グリシンそれぞれの 0.5
％〜1.3％のNaClaq相当の浸透圧の洗浄液で洗浄したウ
ェルである。洗浄液の浸透圧調整物質がグリシンの場合
は、高張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｄ４、Ｄ
５）は等張液での洗浄による赤血球結合状態（Ｄ３）と
比べ、赤血球間のすきまが少なく、形は平らであった。
低張液での洗浄による赤血球結合状態（Ｄ１、Ｄ２）は
等張液での洗浄による赤血球結合状態（Ｄ３）よりもさ
らに赤血球間のすきまが多く、形は丸味をおびている。
洗浄液の浸透圧調整物質が塩化カリウムの場合は、高張
液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｅ４、Ｅ５）は等張
液での洗浄の場合（Ｅ３）と比べ、赤血球間のすきまが
少なく、形は平らであった。低張液での洗浄による赤血
球結合状態Ｅ１、Ｅ２は、等張液での洗浄の場合（Ｅ
３）よりもさらに赤血球間のすきまが多く形は丸味をお
びている。洗浄液の浸透圧調整物質がグルコースと塩類
の場合は、高張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｆ
４、Ｆ３）は、等張液で洗浄した場合（Ｆ３）と比べ赤
血球間のすきまはないが、血球どうしが融合した状態と
なっている。低張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｆ
１、Ｆ２）は、等張液で洗浄した場合（Ｆ３）よりも、
さらに赤血球間のすきまが多く形も丸味をおびている。
洗浄液の浸透圧調整物質が塩化ナトリウムとグリシンの
場合は、高張液で洗浄した時の赤血球結合状態（Ｇ４、
Ｇ５）は、等張液での洗浄の場合（Ｇ３）と比べ、赤血
球間のすきまが少なく、形は平らであった。低張液での
洗浄による赤血球結合状態（Ｇ１、Ｇ２）は等張液での
洗浄の場合（Ｇ３）よりもさらに赤血球間のすきまが多
く、形は丸味をおびている。
【００１４】洗浄液の浸透圧調整物質の種類と赤血球結合状態 等張液で洗浄した場合の赤血球結合状態（Ｄ３、Ｅ３、
Ｆ３、Ｇ３）は、調整物質の種類に関係なく、それぞれ
同程度の均一さと形態を呈している。高張液で洗浄した
場合の赤血球結合状態（Ｄ４、Ｄ５、Ｅ４、Ｅ５、Ｇ
４、Ｇ５、Ｆ４、Ｆ５）はそれぞれ同程度の均一さと形
態を呈している。低張液で洗浄した場合の赤血球結合状
態（Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ
２）は調整物質の種類に関係なく同程度の均一さと形態
を呈している。この実施例によれば、浸透圧調整物質と
しては特に塩化ナトリウムに限ることなく、グリシン、
塩化カリウム、グルコース、塩化ナトリウム＋グリシン
等種々の浸透圧調整物質を使用することができる。
Ｆ３、Ｇ３）は、調整物質の種類に関係なく、それぞれ
同程度の均一さと形態を呈している。高張液で洗浄した
場合の赤血球結合状態（Ｄ４、Ｄ５、Ｅ４、Ｅ５、Ｇ
４、Ｇ５、Ｆ４、Ｆ５）はそれぞれ同程度の均一さと形
態を呈している。低張液で洗浄した場合の赤血球結合状
態（Ｄ１、Ｄ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ１、Ｇ
２）は調整物質の種類に関係なく同程度の均一さと形態
を呈している。この実施例によれば、浸透圧調整物質と
しては特に塩化ナトリウムに限ることなく、グリシン、
塩化カリウム、グルコース、塩化ナトリウム＋グリシン
等種々の浸透圧調整物質を使用することができる。
【００１５】赤血球固相化容器を用いたサンプル分析 前に作製したＤ１〜Ｄ５、Ｅ１〜Ｅ５、Ｆ１〜Ｆ５、Ｇ
１〜Ｇ５を不規則抗体陰性のサンプルを用いて分析を行
った。Ｄ１〜Ｄ５は赤血球固相化の際の洗浄液がグリシ
ン溶液であり、Ｅ１〜Ｅ５は塩化カリウム溶液であり、
Ｆ１〜Ｆ５は若干の塩類を含んだグルコース溶液であ
り、Ｇ１〜Ｇ５は、塩化ナトリウムとグリシンの混合溶
液である。サンプルは、等張のＬＩＳＳで不規則抗体陰
性の血漿を希釈したものである。具体的には、各ウェル
にＬＩＳＳ75μl を分注し、次に不規則抗体陰性の血漿
25μl を分注した。これを37℃で10分間インキュベート
した。そして４種類の洗浄液で、それぞれ固相化の際に
使用されたものと同じ洗浄液で作製された容器に対応す
る容器を洗浄する。洗浄回数は６回で、洗浄液の濃度は
赤血球を固相化・洗浄した時の洗浄液の濃度に対応す
る。洗浄後、抗ヒトIgＧ感作磁性体封入ゼラチン粒子を
25μl/ウェル分注し、磁石上で、パターンを形成した。
この抗ヒトIgＧ感作の磁性体封入ゼラチン粒子は、 0.3
％の磁性体封入ゼラチン粒子に Cappele社製の抗ヒトIg
Ｇを感作させたものである。結果は、グリシン、塩化カ
リウム、グルコース、塩化ナトリウム＋グリシンいずれ
の場合も、塩化ナトリウムで行った実施例１と同様であ
った。すなわち、固相液より高張液で未結合の抗体を除
去する洗浄を行った場合は、本来の陰性結果を示すボタ
ン状のパターンを呈したが、等張液の場合は、ややゆが
んだボタン状のパターンを呈した。低張液の場合は、等
張の場合よりもさらに大きく広がったパターンを呈し
た。赤血球の固相化において、洗浄液が固相液よりも高
張である場合の固相化は、洗浄液と固相液が同じ浸透圧
である場合の固相化よりも良好な状態となる。また、糖
類の場合は、固相化において高張液で洗浄を行うと、赤
血球同志が融合してしまうので、糖類＋塩の併用の形で
高張液として使用すれば塩類と同様の効果がある。
１〜Ｇ５を不規則抗体陰性のサンプルを用いて分析を行
った。Ｄ１〜Ｄ５は赤血球固相化の際の洗浄液がグリシ
ン溶液であり、Ｅ１〜Ｅ５は塩化カリウム溶液であり、
Ｆ１〜Ｆ５は若干の塩類を含んだグルコース溶液であ
り、Ｇ１〜Ｇ５は、塩化ナトリウムとグリシンの混合溶
液である。サンプルは、等張のＬＩＳＳで不規則抗体陰
性の血漿を希釈したものである。具体的には、各ウェル
にＬＩＳＳ75μl を分注し、次に不規則抗体陰性の血漿
25μl を分注した。これを37℃で10分間インキュベート
した。そして４種類の洗浄液で、それぞれ固相化の際に
使用されたものと同じ洗浄液で作製された容器に対応す
る容器を洗浄する。洗浄回数は６回で、洗浄液の濃度は
赤血球を固相化・洗浄した時の洗浄液の濃度に対応す
る。洗浄後、抗ヒトIgＧ感作磁性体封入ゼラチン粒子を
25μl/ウェル分注し、磁石上で、パターンを形成した。
この抗ヒトIgＧ感作の磁性体封入ゼラチン粒子は、 0.3
％の磁性体封入ゼラチン粒子に Cappele社製の抗ヒトIg
Ｇを感作させたものである。結果は、グリシン、塩化カ
リウム、グルコース、塩化ナトリウム＋グリシンいずれ
の場合も、塩化ナトリウムで行った実施例１と同様であ
った。すなわち、固相液より高張液で未結合の抗体を除
去する洗浄を行った場合は、本来の陰性結果を示すボタ
ン状のパターンを呈したが、等張液の場合は、ややゆが
んだボタン状のパターンを呈した。低張液の場合は、等
張の場合よりもさらに大きく広がったパターンを呈し
た。赤血球の固相化において、洗浄液が固相液よりも高
張である場合の固相化は、洗浄液と固相液が同じ浸透圧
である場合の固相化よりも良好な状態となる。また、糖
類の場合は、固相化において高張液で洗浄を行うと、赤
血球同志が融合してしまうので、糖類＋塩の併用の形で
高張液として使用すれば塩類と同様の効果がある。
【００１６】表１は、浸透圧の異なる赤血球浮遊液、洗
浄液による赤血球結合形態の変化を示している。
浄液による赤血球結合形態の変化を示している。
【００１７】
【表１】
【００１８】表２は、表１に示されている赤血球固相化
容器を用いたサンプル測定の際の洗浄液の塩化ナトリウ
ムの濃度による陰性パターン。
容器を用いたサンプル測定の際の洗浄液の塩化ナトリウ
ムの濃度による陰性パターン。
【００１９】
【表２】
【００２０】表３は、赤血球固相化の際の洗浄液の浸透
圧調整物質としてグリシン、塩化カリウム、若干の塩類
を含んだグルコース、塩化ナトリウムとグリシンを用い
各物質の濃度による赤血球層の形態を示している。
圧調整物質としてグリシン、塩化カリウム、若干の塩類
を含んだグルコース、塩化ナトリウムとグリシンを用い
各物質の濃度による赤血球層の形態を示している。
【００２１】
【表３】
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、細胞を固相化する際
に、細胞浮遊液より高張の洗浄液を用いることで細胞の
単一層が固相化された容器を製造することができる。
に、細胞浮遊液より高張の洗浄液を用いることで細胞の
単一層が固相化された容器を製造することができる。
【図１】０．９％のＮａＣｌａｑを希釈液として作成し
た赤血球浮遊液を固定液とし、（Ａ）０．５％、（Ｂ）
０．７％、（Ｃ）０．９％、（Ｄ）１．１％、（Ｅ）
１．３％の各種濃度のＮａＣｌａｑを洗浄液として製造
した赤血球固相化容器表面の赤血球の粒子構造の写真で
ある。
た赤血球浮遊液を固定液とし、（Ａ）０．５％、（Ｂ）
０．７％、（Ｃ）０．９％、（Ｄ）１．１％、（Ｅ）
１．３％の各種濃度のＮａＣｌａｑを洗浄液として製造
した赤血球固相化容器表面の赤血球の粒子構造の写真で
ある。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/80 G01N 33/48 G01N 33/556
Claims (1)
- 【請求項１】 一定の浸透圧の細胞希釈液で細胞を所定
濃度に希釈して調整した細胞浮遊液を容器に分注して細
胞を前記容器内壁に固相化する工程と、前記細胞浮遊液
よりも浸透圧の高い洗浄液で前記容器を洗浄し、容器内
壁に未結合の細胞を除去する工程とを有することを特徴
とする細胞固相化容器の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6887291A JP2821040B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 細胞固相化容器の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6887291A JP2821040B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 細胞固相化容器の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0627114A JPH0627114A (ja) | 1994-02-04 |
| JP2821040B2 true JP2821040B2 (ja) | 1998-11-05 |
Family
ID=13386190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6887291A Expired - Lifetime JP2821040B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 細胞固相化容器の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2821040B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4536968B2 (ja) * | 2001-09-12 | 2010-09-01 | ベックマン・コールター・インコーポレーテッド | 血液検査装置 |
-
1991
- 1991-03-08 JP JP6887291A patent/JP2821040B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0627114A (ja) | 1994-02-04 |
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