JP2709273B2 - ミコバクテリアの溶菌方法 - Google Patents
ミコバクテリアの溶菌方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、加熱を伴うミコバクテ
リアの溶菌方法および検出方法に関する。
リアの溶菌方法および検出方法に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】ミコバクテリア（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、巨大で、多様であり、か
つ、細胞壁の脂質含有率が高くて成長速度の遅い好気
性、非胞子形成性、非運動性の桿菌に属する、広範囲に
分散しているファミリーである。いくつかのミコバクテ
リアは無害であるが、他の幾つか、例えばミコバクテリ
アツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は
重要な病原菌である。ミコバクテリア種は、おのおのの
成長速度、色素生産、動物感染性、および生化学的反応
性により分類される。
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、巨大で、多様であり、か
つ、細胞壁の脂質含有率が高くて成長速度の遅い好気
性、非胞子形成性、非運動性の桿菌に属する、広範囲に
分散しているファミリーである。いくつかのミコバクテ
リアは無害であるが、他の幾つか、例えばミコバクテリ
アツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は
重要な病原菌である。ミコバクテリア種は、おのおのの
成長速度、色素生産、動物感染性、および生化学的反応
性により分類される。
【０００３】病原性ミコバクテリアの存在を測定するた
めの多くの検出方法は、生物の溶菌および生物中の核酸
の増幅に基づく。しかしながら、現在利用可能な溶菌方
法は、費用がかかり、労力を要し、時間を浪費し、そし
て有害試薬、特定の装置等を必要とする。これは、溶菌
のためのストリンジェントな条件を必要としない他の種
の細胞の溶菌プロトコルとは対照的である。
めの多くの検出方法は、生物の溶菌および生物中の核酸
の増幅に基づく。しかしながら、現在利用可能な溶菌方
法は、費用がかかり、労力を要し、時間を浪費し、そし
て有害試薬、特定の装置等を必要とする。これは、溶菌
のためのストリンジェントな条件を必要としない他の種
の細胞の溶菌プロトコルとは対照的である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の第１の側面は、
ミコバクテリア、例えばミコバクテリウムホルツイツム
（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）
およびミコバクテリウムツベルクロシス（Ｍｉｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を溶菌さ
せて核酸を放出させるための方法である。この方法は、
ミコバクテリアを溶菌するのに効果的な時間および温度
で水溶液中のミコバクテリアを加熱して、溶菌と同時に
ミコバクテリアから核酸を放出させることからなる。上
記水溶液は、溶菌と同時にミコバクテリアから放出され
る核酸の分解を阻害するのに効果的な量でキレート剤
（例えば、ＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ）を含む。加熱工程は、
放出された核酸の増幅および／または検出へと続く。
ミコバクテリア、例えばミコバクテリウムホルツイツム
（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）
およびミコバクテリウムツベルクロシス（Ｍｉｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を溶菌さ
せて核酸を放出させるための方法である。この方法は、
ミコバクテリアを溶菌するのに効果的な時間および温度
で水溶液中のミコバクテリアを加熱して、溶菌と同時に
ミコバクテリアから核酸を放出させることからなる。上
記水溶液は、溶菌と同時にミコバクテリアから放出され
る核酸の分解を阻害するのに効果的な量でキレート剤
（例えば、ＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ）を含む。加熱工程は、
放出された核酸の増幅および／または検出へと続く。
【０００５】上記方法の特定の態様は、ミコバクテリア
を含む疑いのある生物学的サンプルをキレート剤含有水
溶液と接触させて溶菌溶液を形成し、次に、その中に存
在するミコバクテリアを溶解するのに効果的な時間およ
び温度で該溶菌溶液を加熱することからなる。該溶液
は、溶菌と同時にミコバクテリアから放出される核酸の
分解を阻害するのに十分であるが、引き続く、溶液中の
ミコバクテリア核酸セグメントの増幅を阻害するには不
十分な量のキレート剤を含む。加熱工程の後、ミコバク
テリア核酸セグメントの増幅工程は、溶菌溶液中で実施
される（例えば、溶菌溶液に増幅試薬を加えて該増幅試
薬をミコバクテリア核酸セグメントと反応させることに
よる）。
を含む疑いのある生物学的サンプルをキレート剤含有水
溶液と接触させて溶菌溶液を形成し、次に、その中に存
在するミコバクテリアを溶解するのに効果的な時間およ
び温度で該溶菌溶液を加熱することからなる。該溶液
は、溶菌と同時にミコバクテリアから放出される核酸の
分解を阻害するのに十分であるが、引き続く、溶液中の
ミコバクテリア核酸セグメントの増幅を阻害するには不
十分な量のキレート剤を含む。加熱工程の後、ミコバク
テリア核酸セグメントの増幅工程は、溶菌溶液中で実施
される（例えば、溶菌溶液に増幅試薬を加えて該増幅試
薬をミコバクテリア核酸セグメントと反応させることに
よる）。
【０００６】本明細書では、核酸サンプル中のミコバク
テリア核酸の検出に有用なキットも開示される。キット
は、ミコバクテリアの溶菌と同時にミコバクテリア核酸
の分解を阻害するのに十分な量のキレート剤を含む溶菌
溶液を含み、そして典型的には、ミコバクテリア核酸セ
グメントを増幅することができる核酸増幅試薬も含む。
溶菌溶液および増幅試薬は典型的には別々のコンテナー
に封入される。
テリア核酸の検出に有用なキットも開示される。キット
は、ミコバクテリアの溶菌と同時にミコバクテリア核酸
の分解を阻害するのに十分な量のキレート剤を含む溶菌
溶液を含み、そして典型的には、ミコバクテリア核酸セ
グメントを増幅することができる核酸増幅試薬も含む。
溶菌溶液および増幅試薬は典型的には別々のコンテナー
に封入される。
【０００７】本明細書において用いられる単語「ミコバ
クテリア」は、抗酸性、非運動性、桿状の細菌である。
一般的には、デービス（Ｂ．Ｄａｖｉｓ）らの、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７２４−７４２（第３版、１９８
０）を参照されたい。一般的にすべてが、ミコバクテリ
ウム科ファミリーに属する。例示として、ミコバクテリ
アは、ミコバクテリウムアフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、ミコバクテリウ
ムエビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕ
ｍ）、ミコバクテリウムボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウムボビスＢＣＧ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ−ＢＣ
Ｇ）、ミコバクテリウムケロネア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｃｈｅｎｏｎａｅ）、ミコバクテリウムホル
ツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｒｔｕｉｔ
ｕｍ）、ミコバクテリウムゴルドネア（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテリウム
イントラセルラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎ
ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ミコバクテリウムカンサ
シ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉ
ｉ）、ミコバクテリウムレプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ミコバクテリウムミクロチ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ）、ミ
コバクテリウムパラツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミ
コバクテリウムスクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、およびミコバ
クテリウムツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むがこれらに限定
されない。
クテリア」は、抗酸性、非運動性、桿状の細菌である。
一般的には、デービス（Ｂ．Ｄａｖｉｓ）らの、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７２４−７４２（第３版、１９８
０）を参照されたい。一般的にすべてが、ミコバクテリ
ウム科ファミリーに属する。例示として、ミコバクテリ
アは、ミコバクテリウムアフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、ミコバクテリウ
ムエビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕ
ｍ）、ミコバクテリウムボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウムボビスＢＣＧ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ−ＢＣ
Ｇ）、ミコバクテリウムケロネア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｃｈｅｎｏｎａｅ）、ミコバクテリウムホル
ツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｒｔｕｉｔ
ｕｍ）、ミコバクテリウムゴルドネア（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ミコバクテリウム
イントラセルラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎ
ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ミコバクテリウムカンサ
シ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉ
ｉ）、ミコバクテリウムレプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ミコバクテリウムミクロチ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ）、ミ
コバクテリウムパラツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミ
コバクテリウムスクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、およびミコバ
クテリウムツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むがこれらに限定
されない。
【０００８】本明細書において用いられる単語「核酸」
は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者を意味する。本発明は、
核酸としてＤＮＡに関する使用に特に好ましい。
は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両者を意味する。本発明は、
核酸としてＤＮＡに関する使用に特に好ましい。
【０００９】本発明を実施するために用いられたミコバ
クテリアサンプルは、典型的には、ミコバクテリアを含
む疑いのある生物学的液体または生物学的組織の形態の
サンプルで得られる。適当な生物学的液体は、痰、気管
支洗浄物、胃洗浄物（飲み込まれた痰を含む）、血液、
乳、およびリンパ液を含むがこれらに限定されない。適
当な組織サンプルは、皮膚および他の柔らかい組織サン
プル（例えば、筋肉、脂肪）を含むが、これらに限定さ
れない。ミコバクテリアは人および動物種に感染するの
で、本発明は、人および家畜の診断法に適用でき、そし
てサンプルは人および動物種から集められる。例えば、
ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）はウシの結
核を引き起こし、ヒトにも伝染しうるので、本発明は、
ウシにおける感染を診断するため、およびヒトに伝染し
るうミコバクテリウムボビスの牛乳中の存在を試験する
ために用いられる。他の例としては、ミコバクテリウム
エビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）
およびミコバクテリウムイントラセルラエ（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は
鳥（例えば、チキンおよびハト）並びにブタに感染する
ので、本発明はそのような感染の検出に用いられる。さ
らに、ヒトは、さまざまなミコバクテリア、例えば以下
に限定されないが、ミコバクテリウムツベルクロシス
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）、ミコバクテリウムカンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、ミコバクテリウムエ
ビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、
ミコバクテリウムイントラセルラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ミコバ
クテリウムスクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、およびミコバクテ
リウムホルツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏ
ｒｔｕｉｔｕｍ）等に感染しやすいから、本発明は、そ
のような感染の検出に用いられる。
クテリアサンプルは、典型的には、ミコバクテリアを含
む疑いのある生物学的液体または生物学的組織の形態の
サンプルで得られる。適当な生物学的液体は、痰、気管
支洗浄物、胃洗浄物（飲み込まれた痰を含む）、血液、
乳、およびリンパ液を含むがこれらに限定されない。適
当な組織サンプルは、皮膚および他の柔らかい組織サン
プル（例えば、筋肉、脂肪）を含むが、これらに限定さ
れない。ミコバクテリアは人および動物種に感染するの
で、本発明は、人および家畜の診断法に適用でき、そし
てサンプルは人および動物種から集められる。例えば、
ミコバクテリウムボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）はウシの結
核を引き起こし、ヒトにも伝染しうるので、本発明は、
ウシにおける感染を診断するため、およびヒトに伝染し
るうミコバクテリウムボビスの牛乳中の存在を試験する
ために用いられる。他の例としては、ミコバクテリウム
エビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）
およびミコバクテリウムイントラセルラエ（Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は
鳥（例えば、チキンおよびハト）並びにブタに感染する
ので、本発明はそのような感染の検出に用いられる。さ
らに、ヒトは、さまざまなミコバクテリア、例えば以下
に限定されないが、ミコバクテリウムツベルクロシス
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ）、ミコバクテリウムカンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、ミコバクテリウムエ
ビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、
ミコバクテリウムイントラセルラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ミコバ
クテリウムスクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、およびミコバクテ
リウムホルツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏ
ｒｔｕｉｔｕｍ）等に感染しやすいから、本発明は、そ
のような感染の検出に用いられる。
【００１０】ミコバクテリアを含む疑いのあるサンプル
が痰サンプルの場合、該サンプルを、加熱工程の前また
は間に液化剤（ｌｉｑｕｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、
例えばＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）およ
び水酸化ナトリウムで消化してよい。
が痰サンプルの場合、該サンプルを、加熱工程の前また
は間に液化剤（ｌｉｑｕｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、
例えばＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）およ
び水酸化ナトリウムで消化してよい。
【００１１】ミコバクテリアを含む疑いのあるサンプル
は、通常、以下に記載されるような核酸増幅手段のよう
な次の検出のために、サンプル中のミコバクテリアを十
分に溶菌するのに効果的な時間および温度で加熱する。
そのような溶菌に効果的な量の加熱は、細胞内成分、例
えばＤＮＡ、ＲＮＡ等を放出するのに十分であるが、所
望の細胞内成分を破壊するかまたは次の使用において不
適切な（例えば、ＤＮＡ増幅、ハイブリダイゼーション
および／または検出のための基質として用いるには不適
切な）形態にするには不十分なものである。典型的に
は、サンプルを５分から１時間、より典型的には１０分
から２０分、および５０℃から１５０℃、より典型的に
は約７０℃から約１２０℃で加熱する。唯一の限定は、
検出される細胞内成分（典型的には核酸）が加熱により
破壊されないことである。加熱はあらゆる適切な手段に
より実施され、水浴、マイクロウエーブ、オーブン、炎
等を含むがこれらに限定されない。
は、通常、以下に記載されるような核酸増幅手段のよう
な次の検出のために、サンプル中のミコバクテリアを十
分に溶菌するのに効果的な時間および温度で加熱する。
そのような溶菌に効果的な量の加熱は、細胞内成分、例
えばＤＮＡ、ＲＮＡ等を放出するのに十分であるが、所
望の細胞内成分を破壊するかまたは次の使用において不
適切な（例えば、ＤＮＡ増幅、ハイブリダイゼーション
および／または検出のための基質として用いるには不適
切な）形態にするには不十分なものである。典型的に
は、サンプルを５分から１時間、より典型的には１０分
から２０分、および５０℃から１５０℃、より典型的に
は約７０℃から約１２０℃で加熱する。唯一の限定は、
検出される細胞内成分（典型的には核酸）が加熱により
破壊されないことである。加熱はあらゆる適切な手段に
より実施され、水浴、マイクロウエーブ、オーブン、炎
等を含むがこれらに限定されない。
【００１２】あらゆる適当な溶菌溶液を用いてミコバク
テリアを含む疑いのあるサンプルを加熱することができ
る。通常、溶菌溶液は水であるが、適当な緩衝液、例え
ばトリス緩衝塩溶液（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）、リン酸緩
衝塩溶液（例えば、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）、ポリメラーゼチェイ
ンリアクション緩衝液（例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，ｐＨ８．８，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｓから得られるＲＥＡＣＴ６（商標名）緩衝液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１，５０ｍＭ
ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2）、リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０からｐＨ１
２．０）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から得られ
るＴＲＩＺＭＡ（商標名）９．０（トリスヒドロキシア
ミノメチルアミン）であってもよい。溶液は付加的に界
面活性剤、例えば０．５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２
０および０．５％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ｐ−
４０を含んでよい。加熱されたサンプルは付加的に遠心
分離してよく、それにより上清および沈殿物が次の使用
において利用可能になる。
テリアを含む疑いのあるサンプルを加熱することができ
る。通常、溶菌溶液は水であるが、適当な緩衝液、例え
ばトリス緩衝塩溶液（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）、リン酸緩
衝塩溶液（例えば、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）、ポリメラーゼチェイ
ンリアクション緩衝液（例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，ｐＨ８．８，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｓから得られるＲＥＡＣＴ６（商標名）緩衝液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．１，５０ｍＭ
ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ，６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2）、リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０からｐＨ１
２．０）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から得られ
るＴＲＩＺＭＡ（商標名）９．０（トリスヒドロキシア
ミノメチルアミン）であってもよい。溶液は付加的に界
面活性剤、例えば０．５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２
０および０．５％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ｐ−
４０を含んでよい。加熱されたサンプルは付加的に遠心
分離してよく、それにより上清および沈殿物が次の使用
において利用可能になる。
【００１３】溶菌溶液は、核酸が該溶菌溶液に放出され
た後に分解されないようにするために効果的であるが、
好ましくは次の検出または増幅工程を妨害するには不十
分な量のキレート剤を含む。キレート剤の正確な量は、
用いられる特定のキレート剤および溶菌溶液に依存する
が、典型的には約１または１０ｍＭから約５０または１
００ｍＭまでである。適当なキレート剤の例としては、
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）およびＥＧＴＡ
（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ四酢酸）、ジアミノシクロヘキサ
ン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ｏ−フェナンスロリン、および
サリチル酸を含むがこれらに限定されない。ＥＤＴＡに
関しては、溶菌溶液に含まれる量は、好ましくは約５ｍ
Ｍから１５ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。Ｅ
ＧＴＡに関しては、溶菌溶液に含まれる量は、好ましく
は１または２ｍＭから２５または５０ｍＭ、最も好まし
くは約１または２ｍＭから１０ｍＭである。
た後に分解されないようにするために効果的であるが、
好ましくは次の検出または増幅工程を妨害するには不十
分な量のキレート剤を含む。キレート剤の正確な量は、
用いられる特定のキレート剤および溶菌溶液に依存する
が、典型的には約１または１０ｍＭから約５０または１
００ｍＭまでである。適当なキレート剤の例としては、
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）およびＥＧＴＡ
（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ四酢酸）、ジアミノシクロヘキサ
ン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ｏ−フェナンスロリン、および
サリチル酸を含むがこれらに限定されない。ＥＤＴＡに
関しては、溶菌溶液に含まれる量は、好ましくは約５ｍ
Ｍから１５ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。Ｅ
ＧＴＡに関しては、溶菌溶液に含まれる量は、好ましく
は１または２ｍＭから２５または５０ｍＭ、最も好まし
くは約１または２ｍＭから１０ｍＭである。
【００１４】サンプルを加熱したら、細胞内成分の次の
使用は、増幅、検出等を含みうる。さらなる工程として
は、ＤＮＡの精製、例えば有機抽出（例えば、フェノー
ル／クロロホルム抽出）またはガラスまたは珪藻のよう
なシリカ表面上での固相抽出を含む。
使用は、増幅、検出等を含みうる。さらなる工程として
は、ＤＮＡの精製、例えば有機抽出（例えば、フェノー
ル／クロロホルム抽出）またはガラスまたは珪藻のよう
なシリカ表面上での固相抽出を含む。
【００１５】本発明の方法は、一本鎖の形態で生物から
ＤＮＡおよびＲＮＡを放出させることにより、一本鎖の
形態のＤＮＡおよびＲＮＡを必要とする増幅または検出
法において次の使用に直接用いられうる。
ＤＮＡおよびＲＮＡを放出させることにより、一本鎖の
形態のＤＮＡおよびＲＮＡを必要とする増幅または検出
法において次の使用に直接用いられうる。
【００１６】ミコバクテリア核酸（例えばＤＮＡまたは
ＲＮＡ）の検出は、以下に記載されるとおり、その前に
増幅を行っても行わなくても実施することができる。検
出は、サザンブロット分析、電気泳動ゲルの視覚化等の
手段により実施されうる。検出は、ミコバクテリア核酸
に選択的に結合する核酸プローブをハイブリダイズする
ことにより実施されるが、その際、プローブは適切な検
出可能な基を結合させることにより標識される。
ＲＮＡ）の検出は、以下に記載されるとおり、その前に
増幅を行っても行わなくても実施することができる。検
出は、サザンブロット分析、電気泳動ゲルの視覚化等の
手段により実施されうる。検出は、ミコバクテリア核酸
に選択的に結合する核酸プローブをハイブリダイズする
ことにより実施されるが、その際、プローブは適切な検
出可能な基を結合させることにより標識される。
【００１７】プローブは、いくつかの方法により標識お
よび検出されうる。例えば、プローブは放射性標識され
てオートラジオグラフィーにより検出される。オートラ
ジオグラフィーに適切な標識は、3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14
Ｃおよび32Ｐを含むがこれらに限定されない。他の検出
可能な基としては、リガンド、蛍光団、化学蛍光発光
剤、電気化学によるセンサー、酵素例えばホースラディ
ッシュパーオキシダーゼ、抗体、ビオチン、アビジン、
放射性ヌクレオチド、酵素阻害剤、コエンザイム、ルシ
フェリン、パラマグネチック金属、およびスピンラベル
を含むがこれらに限定されない。標識の選択は、標識が
プローブに結合するようにするものであって、かつ、そ
のような結合が公知の技術により実施しうるものであ
る。
よび検出されうる。例えば、プローブは放射性標識され
てオートラジオグラフィーにより検出される。オートラ
ジオグラフィーに適切な標識は、3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14
Ｃおよび32Ｐを含むがこれらに限定されない。他の検出
可能な基としては、リガンド、蛍光団、化学蛍光発光
剤、電気化学によるセンサー、酵素例えばホースラディ
ッシュパーオキシダーゼ、抗体、ビオチン、アビジン、
放射性ヌクレオチド、酵素阻害剤、コエンザイム、ルシ
フェリン、パラマグネチック金属、およびスピンラベル
を含むがこれらに限定されない。標識の選択は、標識が
プローブに結合するようにするものであって、かつ、そ
のような結合が公知の技術により実施しうるものであ
る。
【００１８】選択された核酸配列または標識核酸配列の
増幅は、あらゆる適切な手段により実施してよい。一般
的には、コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）とコー（Ｔ．Ｋｗｏ
ｈ）、Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．８，１４
−２５（１９９０）を参照されたい。適切な増幅技術の
例は、ポリメラーゼチェインリアクション、ライゲース
チェインリアクション、鎖置換増幅、転写に基づく増幅
（コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７
（１９８９）を参照されたい）、自己維持（ｓｅｌｆ−
ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（グアテリ（Ｊ．Ｇｕａ
ｔｅｌｌｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ ８７，１８７４−１８７８（１９９０）
を参照されたい）、およびＱβレプリカーゼ増幅システ
ム（リザルディ（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２０２（１９８
８）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
そのようなすべての技術は、少なくとも１つの増幅プロ
ーブ、または１対の増幅プローブを含むが、該プローブ
は増幅試薬として作用し、増幅されるミコバクテリアの
核酸セグメントに特異的に結合する。次に、増幅試薬を
増幅される核酸セグメントに反応（例えば臨床的に反
応）させて、増幅させる。
増幅は、あらゆる適切な手段により実施してよい。一般
的には、コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）とコー（Ｔ．Ｋｗｏ
ｈ）、Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．８，１４
−２５（１９９０）を参照されたい。適切な増幅技術の
例は、ポリメラーゼチェインリアクション、ライゲース
チェインリアクション、鎖置換増幅、転写に基づく増幅
（コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７
（１９８９）を参照されたい）、自己維持（ｓｅｌｆ−
ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（グアテリ（Ｊ．Ｇｕａ
ｔｅｌｌｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ ８７，１８７４−１８７８（１９９０）
を参照されたい）、およびＱβレプリカーゼ増幅システ
ム（リザルディ（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２０２（１９８
８）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
そのようなすべての技術は、少なくとも１つの増幅プロ
ーブ、または１対の増幅プローブを含むが、該プローブ
は増幅試薬として作用し、増幅されるミコバクテリアの
核酸セグメントに特異的に結合する。次に、増幅試薬を
増幅される核酸セグメントに反応（例えば臨床的に反
応）させて、増幅させる。
【００１９】ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）は、公知の技術を用いて実施される。例えば、米国
特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２
号、第４，８００，１５９号および第４，９６５、１８
８号を参照されたい（これら全米国特許の開示は引用に
より本明細書の一部をなす）。
Ｒ）は、公知の技術を用いて実施される。例えば、米国
特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２
号、第４，８００，１５９号および第４，９６５、１８
８号を参照されたい（これら全米国特許の開示は引用に
より本明細書の一部をなす）。
【００２０】ライゲースチェインリアクション（ＬＣ
Ｒ）は、公知の技術を用いて実施される。例えば、バイ
ス（Ｒ．Ｗｅｉｓｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１２
９２（１９９１）を参照されたい。一般的には、反応
は、２対のオリゴヌクレオチドプローブ：１対は検出さ
れる配列の一方の鎖に結合し；他方の対は検出される配
列の他方の鎖に結合する：を用いて実施される。各対
は、共に完全に対応する鎖とオーバーラップする。反応
は、第１に、検出される配列の鎖を変成（分離）し、次
に、加熱安定性ライゲースの存在下で２対のオリゴヌク
レオチドプローブと変成した鎖とを反応させることによ
り、オリゴヌクレオチドプローブの各対が共に連結され
て、次に、反応産物を分離し、次に、配列が所望の程度
まで増幅されるまでこの工程を臨床的に繰り返す。
Ｒ）は、公知の技術を用いて実施される。例えば、バイ
ス（Ｒ．Ｗｅｉｓｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１２
９２（１９９１）を参照されたい。一般的には、反応
は、２対のオリゴヌクレオチドプローブ：１対は検出さ
れる配列の一方の鎖に結合し；他方の対は検出される配
列の他方の鎖に結合する：を用いて実施される。各対
は、共に完全に対応する鎖とオーバーラップする。反応
は、第１に、検出される配列の鎖を変成（分離）し、次
に、加熱安定性ライゲースの存在下で２対のオリゴヌク
レオチドプローブと変成した鎖とを反応させることによ
り、オリゴヌクレオチドプローブの各対が共に連結され
て、次に、反応産物を分離し、次に、配列が所望の程度
まで増幅されるまでこの工程を臨床的に繰り返す。
【００２１】鎖置換増幅（ＳＤＡ）も、公知の技術を用
いて実施される。例えば、ウオーカー（Ｇ．Ｗａｌｋｅ
ｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ８９，３９２−３９６（１９９２）；ウオーカー
（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２）を参
照されたい。ＳＤＡは、単一の増幅プライマーまたは１
対の増幅プライマーを用いて、後者の場合対数的増幅が
達成される。一般的には、ＳＤＡ増幅プライマーは、
５’から３’の方向に向かって、周辺配列（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：必須ではないＤＮＡ配
列）、反応に用いられる制限酵素の認識部位、および増
幅および／または検出される標的配列にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチド配列（例えば、本発明のオリゴ
ヌクレオチド配列）からなる。さらに、ＤＮＡサンプル
を最初に消化して制限断片を形成する工程は、ＤＮＡポ
リメラーゼの鎖置換活性を利用し、かつ、周辺位置（ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の基質に結合する
１対の「バンパー」プライマーを各増幅プライマーが結
合する位置の５’の位置に加えることにより除くことが
できる。
いて実施される。例えば、ウオーカー（Ｇ．Ｗａｌｋｅ
ｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ８９，３９２−３９６（１９９２）；ウオーカー
（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２）を参
照されたい。ＳＤＡは、単一の増幅プライマーまたは１
対の増幅プライマーを用いて、後者の場合対数的増幅が
達成される。一般的には、ＳＤＡ増幅プライマーは、
５’から３’の方向に向かって、周辺配列（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：必須ではないＤＮＡ配
列）、反応に用いられる制限酵素の認識部位、および増
幅および／または検出される標的配列にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチド配列（例えば、本発明のオリゴ
ヌクレオチド配列）からなる。さらに、ＤＮＡサンプル
を最初に消化して制限断片を形成する工程は、ＤＮＡポ
リメラーゼの鎖置換活性を利用し、かつ、周辺位置（ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の基質に結合する
１対の「バンパー」プライマーを各増幅プライマーが結
合する位置の５’の位置に加えることにより除くことが
できる。
【００２２】核酸サンプル中のミコバクテリア核酸を検
出するためのキットは、（ａ）ミコバクテリアサンプル
から放出された核酸サンプルを得るための上記濃度のキ
レート剤を含有するひとつまたは複数の溶菌溶液、およ
び／または（ｂ）プローブと核酸サンプルの間のハイブ
リダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション
溶液を含む。プローブは、溶液に懸濁されて提供されて
も、凍結乾燥の形態で別に提供されてもよい。適切なハ
イブリダイゼーション緩衝液の一例としては、６×ＳＳ
Ｃ（０．９Ｍの塩化ナトリウム、０．０９Ｍのクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液
［０．１％（ｗｅ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ Ｔｙｐｅ ４０
０、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１
％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン］および１００μｇ／
ｍｌのきざまれた変成サケ精子ＤＮＡ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８７７，ＵＳＡからカ
タログ番号５５６５ＵＡとして市販されている）を含
む。また、マニアティス（Ｔ／Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３８７−３８８（１９８２）
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）を参照されたい。キットの成分は、典型的
には共通のコンテナーに共にパッケージされる（例え
ば、破りやすいシールでシールされたコンテナー）。キ
ットは、典型的には、本明細書に記載されているよう
な、本発明の方法を実施するための指示書を含む（例え
ば、パッケージまたはコンテナー上にプリントされた指
示書のシート）。採用されるアッセイフォーマットに依
存して、キットの付加的成分として、検出プローブを用
いた次の検出のためのサンプル中のミコバクテリア核酸
セグメント増幅用のひとつ以上または１対の増幅プロー
ブ、ミコバクテリア核酸セグメントを検出するためのひ
とつ以上の検出プローブ（増幅するかしないかに拘わら
ず）、および検出工程を実施するための手段（例えば、
検出可能なマーカーで標識した本発明のプローブ、およ
び該検出可能マーカーが酵素である場合の付加的な酵素
基質）を含む。
出するためのキットは、（ａ）ミコバクテリアサンプル
から放出された核酸サンプルを得るための上記濃度のキ
レート剤を含有するひとつまたは複数の溶菌溶液、およ
び／または（ｂ）プローブと核酸サンプルの間のハイブ
リダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション
溶液を含む。プローブは、溶液に懸濁されて提供されて
も、凍結乾燥の形態で別に提供されてもよい。適切なハ
イブリダイゼーション緩衝液の一例としては、６×ＳＳ
Ｃ（０．９Ｍの塩化ナトリウム、０．０９Ｍのクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液
［０．１％（ｗｅ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ Ｔｙｐｅ ４０
０、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１
％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン］および１００μｇ／
ｍｌのきざまれた変成サケ精子ＤＮＡ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８７７，ＵＳＡからカ
タログ番号５５６５ＵＡとして市販されている）を含
む。また、マニアティス（Ｔ／Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３８７−３８８（１９８２）
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）を参照されたい。キットの成分は、典型的
には共通のコンテナーに共にパッケージされる（例え
ば、破りやすいシールでシールされたコンテナー）。キ
ットは、典型的には、本明細書に記載されているよう
な、本発明の方法を実施するための指示書を含む（例え
ば、パッケージまたはコンテナー上にプリントされた指
示書のシート）。採用されるアッセイフォーマットに依
存して、キットの付加的成分として、検出プローブを用
いた次の検出のためのサンプル中のミコバクテリア核酸
セグメント増幅用のひとつ以上または１対の増幅プロー
ブ、ミコバクテリア核酸セグメントを検出するためのひ
とつ以上の検出プローブ（増幅するかしないかに拘わら
ず）、および検出工程を実施するための手段（例えば、
検出可能なマーカーで標識した本発明のプローブ、およ
び該検出可能マーカーが酵素である場合の付加的な酵素
基質）を含む。
【００２３】使用に際し、本発明の好ましい態様におい
ては、ミコバクテリアを含む疑いのある生物学的サンプ
ルを溶菌溶液に加え、そして加熱することにより溶菌さ
せて核酸を放出させる。次に、増幅試薬を直接溶菌溶液
に加えて溶菌溶液中で増幅反応を実施する。増幅試薬は
いかなる適切な形態であってよく、例えば水溶液として
運ばれるか、乾燥しているか、凍結乾燥されているか、
またはフリーズドライの形態であってよい。溶菌溶液中
で直接増幅できることは、すべての検出方法を大きく単
純化させて、前の反応からのアンプリコンとの反応物の
混入の可能性を大きく減少させるのに役立つ。増幅され
たミコバクテリア核酸セグメントは、次に、あらゆる適
切な手段により検出できる（アンプリコンの混入の可能
性は、増幅後にはほとんど問題ない）。
ては、ミコバクテリアを含む疑いのある生物学的サンプ
ルを溶菌溶液に加え、そして加熱することにより溶菌さ
せて核酸を放出させる。次に、増幅試薬を直接溶菌溶液
に加えて溶菌溶液中で増幅反応を実施する。増幅試薬は
いかなる適切な形態であってよく、例えば水溶液として
運ばれるか、乾燥しているか、凍結乾燥されているか、
またはフリーズドライの形態であってよい。溶菌溶液中
で直接増幅できることは、すべての検出方法を大きく単
純化させて、前の反応からのアンプリコンとの反応物の
混入の可能性を大きく減少させるのに役立つ。増幅され
たミコバクテリア核酸セグメントは、次に、あらゆる適
切な手段により検出できる（アンプリコンの混入の可能
性は、増幅後にはほとんど問題ない）。
【００２４】本発明は、以下の実施例においてより詳細
に説明されるが、その際、ｍｇはミリグラムを表し、ｍ
ｌはミリリットルを表し、μｌはマイクロリットルを表
し、ｍＭはミリモラーを表し、ｋｂはキロベースを表
し、そして、温度は摂氏温度で表される。以下の実施例
は、本発明の例示であり、本発明を限定するためのもの
ではない。
に説明されるが、その際、ｍｇはミリグラムを表し、ｍ
ｌはミリリットルを表し、μｌはマイクロリットルを表
し、ｍＭはミリモラーを表し、ｋｂはキロベースを表
し、そして、温度は摂氏温度で表される。以下の実施例
は、本発明の例示であり、本発明を限定するためのもの
ではない。
【００２５】
実施例１ ミコバクテリアＤＮＡの加熱処理による低分子断片の生
成 この実施例の目的は、加熱によるミコバクテリアの溶菌
が断片化された低分子のＤＮＡを生成することを示すこ
とである。この実施例において用いられた物質は、ラム
ダパージＤＮＡ標準（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られた）；ミコ
バクテリウムホルツイツム（加熱失活、ＢＡＣＴＥＣ
（商標名）培養）、約１０8生物／ｍｌ；１％アガロー
スゲル；およびエチジウムブロマイドである。
成 この実施例の目的は、加熱によるミコバクテリアの溶菌
が断片化された低分子のＤＮＡを生成することを示すこ
とである。この実施例において用いられた物質は、ラム
ダパージＤＮＡ標準（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られた）；ミコ
バクテリウムホルツイツム（加熱失活、ＢＡＣＴＥＣ
（商標名）培養）、約１０8生物／ｍｌ；１％アガロー
スゲル；およびエチジウムブロマイドである。
【００２６】この実施例は、以下のとおりに実施され
た：１ｍｌのミコバクテリウムホルツイツムを５分間の
ミクロ遠心分離により濃縮し、そしてその結果得られた
細菌沈殿物を１００μｌの２５ｍＭ ＫＰＯ4，ｐＨ
７．５（「緩衝液」）に懸濁した。これは、以下の反応
物を調製するための保存溶液であった：（１）２０μｌ
のミコバクテリウムホルツイツム＋２μｌの緩衝液；
（２）２０μｌのミコバクテリウムホルツイツム＋２μ
ｌのラムダＤＮＡ標準；（３）２μｌのラムダＤＮＡ標
準＋２０μｌの緩衝液；（４）２μｌのラムダ標準＋２
０μｌのミコバクテリウムホルツイツム；（５）２０μ
ｌのミコバクテリウムホルツイツム＋２μｌのラムダＤ
ＮＡ標準；（６）２μｌのラムダ標準＋２０μｌの緩衝
液。
た：１ｍｌのミコバクテリウムホルツイツムを５分間の
ミクロ遠心分離により濃縮し、そしてその結果得られた
細菌沈殿物を１００μｌの２５ｍＭ ＫＰＯ4，ｐＨ
７．５（「緩衝液」）に懸濁した。これは、以下の反応
物を調製するための保存溶液であった：（１）２０μｌ
のミコバクテリウムホルツイツム＋２μｌの緩衝液；
（２）２０μｌのミコバクテリウムホルツイツム＋２μ
ｌのラムダＤＮＡ標準；（３）２μｌのラムダＤＮＡ標
準＋２０μｌの緩衝液；（４）２μｌのラムダ標準＋２
０μｌのミコバクテリウムホルツイツム；（５）２０μ
ｌのミコバクテリウムホルツイツム＋２μｌのラムダＤ
ＮＡ標準；（６）２μｌのラムダ標準＋２０μｌの緩衝
液。
【００２７】上記６つの反応調製物を以下のとおりに処
理した：調製物１−３は１５分間９５℃にて加熱し；調
製物４は１５分間９５℃にて加熱してから冷やし、次に
２μｌのラムダＤＮＡを加え；そして調製物５および６
は加熱しなかった。次に、サンプルを簡単にミクロ遠心
分離して、エチジウムブロマイド染色した１％アガロー
スゲル上で分析した。反応１および２は、２．３から
０．１ｋｂの範囲の大きさのＤＮＡ蛍光を示した。明瞭
な高分子量のバンドは、約９ｋｂにおける薄いバンドを
除いて観察されなかった。反応３−６は、分子量標準か
ら判断して、２３．１、９．９，６．６，４．４，２．
３およひ２．０ｋｂの明瞭なＤＮＡバンドを示した。
理した：調製物１−３は１５分間９５℃にて加熱し；調
製物４は１５分間９５℃にて加熱してから冷やし、次に
２μｌのラムダＤＮＡを加え；そして調製物５および６
は加熱しなかった。次に、サンプルを簡単にミクロ遠心
分離して、エチジウムブロマイド染色した１％アガロー
スゲル上で分析した。反応１および２は、２．３から
０．１ｋｂの範囲の大きさのＤＮＡ蛍光を示した。明瞭
な高分子量のバンドは、約９ｋｂにおける薄いバンドを
除いて観察されなかった。反応３−６は、分子量標準か
ら判断して、２３．１、９．９，６．６，４．４，２．
３およひ２．０ｋｂの明瞭なＤＮＡバンドを示した。
【００２８】完全鎖長のミコバクテリアのゲノミックＤ
ＮＡは、アガロースゲル上で約２３ｋｂとして泳動す
る。しかしながら、上記のように処理すると、ほとんど
が低分子量ＤＮＡ（≦≒２ｋｂ）としてミコバクテリア
から放出された。ラムダＤＮＡの存在下で溶菌が起こる
と、それも分断されることから、分断の工程はミコバク
テリアＤＮＡに特異的でないことが示された。ラムダＤ
ＮＡとミコバクテリアを同時に加熱しなかった場合の反
応はラムダＤＮＡの分断を示さなかったことから、加熱
およびミコバクテリアの存在または培地はミコバクテリ
アＤＮＡに特異的でないＤＮＡ分断工程を活性化したこ
とが示唆された。
ＮＡは、アガロースゲル上で約２３ｋｂとして泳動す
る。しかしながら、上記のように処理すると、ほとんど
が低分子量ＤＮＡ（≦≒２ｋｂ）としてミコバクテリア
から放出された。ラムダＤＮＡの存在下で溶菌が起こる
と、それも分断されることから、分断の工程はミコバク
テリアＤＮＡに特異的でないことが示された。ラムダＤ
ＮＡとミコバクテリアを同時に加熱しなかった場合の反
応はラムダＤＮＡの分断を示さなかったことから、加熱
およびミコバクテリアの存在または培地はミコバクテリ
アＤＮＡに特異的でないＤＮＡ分断工程を活性化したこ
とが示唆された。
【００２９】実施例２ ミコバクテリアＤＮＡの加熱溶菌に対する キレーション、還元および時間の影響 この実施例の目的は、キレーション、還元および時間
が、溶菌の間にミコバクテリアＤＮＡの分断に対して影
響するか否かを測定することであった。用いられた物質
は、上記実施例１と同じであるが、還元剤ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）も含んだ。簡単に言えば、ミコバクテリウムホル
ツイツム培養液の３つの１ｍｌアリコートを５分間ミク
ロ遠心分離した。各細菌沈殿物は、（Ａ）１００μｌの
２５ｍＭ ＫＰＯ4溶液、（Ｂ）１００μｌの５０ｍＭ
ＥＤＴＡを含有する２５ｍＭ ＫＰＯ4溶液、または
（Ｃ）１００μｌの５０ｍＭ ＤＴＴを含有する２５ｍ
Ｍ ＫＰＯ4溶液の何れかに懸濁した。次に、ミコバク
テリウムホルツイツムの各保存溶液２０μｌを以下の４
処理の何れかに供した： （Ｉ）９５℃において１５分間加熱； （ＩＩ）２μｌのラムダＤＮＡを加えて、次に、反応物
を９５℃において１５分間加熱； （ＩＩＩ）９５℃において１５分間加熱したあと、２μ
ｌのラムダＤＮＡを加えた；または （ＩＶ）２μｌのラムダＤＮＡを加えたが反応物は加熱
しなかった。
が、溶菌の間にミコバクテリアＤＮＡの分断に対して影
響するか否かを測定することであった。用いられた物質
は、上記実施例１と同じであるが、還元剤ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）も含んだ。簡単に言えば、ミコバクテリウムホル
ツイツム培養液の３つの１ｍｌアリコートを５分間ミク
ロ遠心分離した。各細菌沈殿物は、（Ａ）１００μｌの
２５ｍＭ ＫＰＯ4溶液、（Ｂ）１００μｌの５０ｍＭ
ＥＤＴＡを含有する２５ｍＭ ＫＰＯ4溶液、または
（Ｃ）１００μｌの５０ｍＭ ＤＴＴを含有する２５ｍ
Ｍ ＫＰＯ4溶液の何れかに懸濁した。次に、ミコバク
テリウムホルツイツムの各保存溶液２０μｌを以下の４
処理の何れかに供した： （Ｉ）９５℃において１５分間加熱； （ＩＩ）２μｌのラムダＤＮＡを加えて、次に、反応物
を９５℃において１５分間加熱； （ＩＩＩ）９５℃において１５分間加熱したあと、２μ
ｌのラムダＤＮＡを加えた；または （ＩＶ）２μｌのラムダＤＮＡを加えたが反応物は加熱
しなかった。
【００３０】対照反応はラムダＤＮＡのみを含み、以下
のように処理した： （Ｖ）２０μｌのＡまたは２０μｌのＢまたは２０μｌ
のＣ中の２μｌのラムダＤＮＡを加えて９５℃において
１５分間加熱した。
のように処理した： （Ｖ）２０μｌのＡまたは２０μｌのＢまたは２０μｌ
のＣ中の２μｌのラムダＤＮＡを加えて９５℃において
１５分間加熱した。
【００３１】処理後、反応溶液を４℃において一晩保存
した。
した。
【００３２】上記反応の翌日、反応溶液をエチジウムブ
ロマイド染色１％アガロースゲル上で分析した。処理Ｉ
（加熱のみ）において、ＥＤＴＡの存在（Ｂ）は約２０
−２３ｋｂの明瞭な分子量のＤＮＡをもたらした。他の
２つの条件（ＤＴＴまたは緩衝液のみ）は、２．３ｋｂ
サイズマーカー未満の低分子量スメアを生じた。ＤＴＴ
はフリーラジカルを結合すると期待され、または択一的
にその中のイオウは金属イオンを結合すると期待され、
よって、ＤＴＴの活性の欠如は驚くべきことであった。
ロマイド染色１％アガロースゲル上で分析した。処理Ｉ
（加熱のみ）において、ＥＤＴＡの存在（Ｂ）は約２０
−２３ｋｂの明瞭な分子量のＤＮＡをもたらした。他の
２つの条件（ＤＴＴまたは緩衝液のみ）は、２．３ｋｂ
サイズマーカー未満の低分子量スメアを生じた。ＤＴＴ
はフリーラジカルを結合すると期待され、または択一的
にその中のイオウは金属イオンを結合すると期待され、
よって、ＤＴＴの活性の欠如は驚くべきことであった。
【００３３】処理ＩＩ（ラムダＤＮＡおよび加熱）は、
ＥＤＴＡの存在が適切な分子量のラムダＤＮＡ標準を保
存し、緩衝液のみまたはＤＴＴの存在下においては、ラ
ムダＤＮＡマーカーは低分子量スメアとして出現した。
他のすべての処理においては、ラムダＤＮＡ標準は適切
なサイズに移動した。これらのデータから、５０ｍＭの
ＥＤＴＡの添加は、ミコバクテリウムホルツイツム由来
の低分子量ＤＮＡの出現およびラムダＤＮＡの明らかな
分断を低下させることが示される。
ＥＤＴＡの存在が適切な分子量のラムダＤＮＡ標準を保
存し、緩衝液のみまたはＤＴＴの存在下においては、ラ
ムダＤＮＡマーカーは低分子量スメアとして出現した。
他のすべての処理においては、ラムダＤＮＡ標準は適切
なサイズに移動した。これらのデータから、５０ｍＭの
ＥＤＴＡの添加は、ミコバクテリウムホルツイツム由来
の低分子量ＤＮＡの出現およびラムダＤＮＡの明らかな
分断を低下させることが示される。
【００３４】実施例３ ミコバクテリウムホルツイツムの溶菌の間の ＤＮＡ分断に対するキレーターの作用のタイトレーショ
ン この実施例において用いられた物質は、上記実施例１お
よび２と同じであり、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢
酸）およびＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（Ｂ−
アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ四酢酸）を含
んだ。
ン この実施例において用いられた物質は、上記実施例１お
よび２と同じであり、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢
酸）およびＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（Ｂ−
アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ四酢酸）を含
んだ。
【００３５】ＢＡＣＴＥＣ（商標名）で培養されたミコ
バクテリウムホルツイツムの３つの１ｍｌアリコートを
５分間ミクロ遠心分離した。その結果得られた沈殿物
は、個々に１００マイクロリットルの２５ｍＭ ＫＰＯ
4溶液（ｐＨ７．５）に懸濁して、保存した。反応物
は、２０μｌのミコバクテリウムホルツイツム＋以下の
１０倍連続希釈：０．５；０．０５；０．００５；０．
０００５；０．００００５；０．０００００５Ｍのうち
の一つの濃度のキレーター（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）
２μｌからなる（対照は２μｌの２５ｍＭ ＫＰＯ4を
加えた）。次に、反応物を９５℃において１５分間加熱
し、細胞破片を１分間のミクロ遠心分離により沈殿させ
た。各反応物は４μｌのタイプＩＩサンプル緩衝液（サ
ムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，表６．３（第２版、１９８９）（６×緩
衝液：０．２５％ブロムフェノールブルー；０．２５％
キシレンシアノールＦＦ；Ｆｉｃｏｌｌ（タイプ４０
０；ファルマシア社）の水溶液））を加えられ、１５μ
ｌに関して、エチジウムブロマイド染色１％アガロース
ゲル上で分析した。その結果得られたゲルのプロフィー
ルから、両方のキレーターがＤＮＡの分解を阻害し、Ｅ
ＧＴＡがゲノミックＤＮＡを保護するのにより良好にみ
えたことが示された。このことは、ＥＧＴＡがＭｇ2+の
良好なキレーターであることから、ミコバクテリウムホ
ルツイツム溶菌の間のＤＮＡ分断の機構がマグネシウム
依存性ではないことが示唆された。
バクテリウムホルツイツムの３つの１ｍｌアリコートを
５分間ミクロ遠心分離した。その結果得られた沈殿物
は、個々に１００マイクロリットルの２５ｍＭ ＫＰＯ
4溶液（ｐＨ７．５）に懸濁して、保存した。反応物
は、２０μｌのミコバクテリウムホルツイツム＋以下の
１０倍連続希釈：０．５；０．０５；０．００５；０．
０００５；０．００００５；０．０００００５Ｍのうち
の一つの濃度のキレーター（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）
２μｌからなる（対照は２μｌの２５ｍＭ ＫＰＯ4を
加えた）。次に、反応物を９５℃において１５分間加熱
し、細胞破片を１分間のミクロ遠心分離により沈殿させ
た。各反応物は４μｌのタイプＩＩサンプル緩衝液（サ
ムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，表６．３（第２版、１９８９）（６×緩
衝液：０．２５％ブロムフェノールブルー；０．２５％
キシレンシアノールＦＦ；Ｆｉｃｏｌｌ（タイプ４０
０；ファルマシア社）の水溶液））を加えられ、１５μ
ｌに関して、エチジウムブロマイド染色１％アガロース
ゲル上で分析した。その結果得られたゲルのプロフィー
ルから、両方のキレーターがＤＮＡの分解を阻害し、Ｅ
ＧＴＡがゲノミックＤＮＡを保護するのにより良好にみ
えたことが示された。このことは、ＥＧＴＡがＭｇ2+の
良好なキレーターであることから、ミコバクテリウムホ
ルツイツム溶菌の間のＤＮＡ分断の機構がマグネシウム
依存性ではないことが示唆された。
【００３６】実施例４ キレート剤の存在または不在下における 痰中のミコバクテリウムホルツイツムＤＮＡの加熱溶菌 この実施例の目的は、痰中のミコバクテリウムホルツイ
ツムの溶菌が分断されたＤＮＡを生成するか、およびそ
の分断がキレート剤により停止するか否かを測定するこ
とであった。
ツムの溶菌が分断されたＤＮＡを生成するか、およびそ
の分断がキレート剤により停止するか否かを測定するこ
とであった。
【００３７】この実施例において用いられた物質は、実
施例１−３において記載された物質と本質的に同一であ
り、軍人経営（Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒ
ａｔｉｏｎ）病院（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒ
ｏｌｉｎａ，米国）からの加工された臨床痰サンプルも
含む（アクセション番号９０３，９０９，９０４，９１
０，７８６，７８３，９８７，８９９，７９０，９０
６，９０１，９８４，８９８，７９１および９０２）。
施例１−３において記載された物質と本質的に同一であ
り、軍人経営（Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒ
ａｔｉｏｎ）病院（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒ
ｏｌｉｎａ，米国）からの加工された臨床痰サンプルも
含む（アクセション番号９０３，９０９，９０４，９１
０，７８６，７８３，９８７，８９９，７９０，９０
６，９０１，９８４，８９８，７９１および９０２）。
【００３８】ＢＡＣＴＥＣ（商標名）で培養されたミコ
バクテリウムホルツイツムの１ミリリットルアリコート
（約１０8生物／ｍｌ）を１．５ｍｌのＳＡＲＳＴＥＤ
Ｔ（商標名）スクリューキャップチューブに移し、５分
間ミクロ遠心分離することにより沈殿させた。上清を捨
てて、プールされていた加工された痰１ｍｌを約２０ｍ
ｇの綿と共に加えた。次に、サンプルを手およびボルテ
ックスにより撹拌し、そして５分間ミクロ遠心分離し
た。上清を再び捨てて、沈殿物を０，０．５，５または
５０ｍＭ濃度のキレーター（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）
を含む２５ｍＭＫＰＯ4（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁し
た。混合後、チューブを再び遠心分離し、上清を捨て
た。次に、チューブを１５分間９５℃において加熱し
た。約１００μｌの上清を各チューブから吸い出し、約
２秒間ミクロ遠心分離した。次に、それら上清２０μｌ
をエチジウムブロマイド染色１％アガロースゲルによる
電気泳動で分析した。
バクテリウムホルツイツムの１ミリリットルアリコート
（約１０8生物／ｍｌ）を１．５ｍｌのＳＡＲＳＴＥＤ
Ｔ（商標名）スクリューキャップチューブに移し、５分
間ミクロ遠心分離することにより沈殿させた。上清を捨
てて、プールされていた加工された痰１ｍｌを約２０ｍ
ｇの綿と共に加えた。次に、サンプルを手およびボルテ
ックスにより撹拌し、そして５分間ミクロ遠心分離し
た。上清を再び捨てて、沈殿物を０，０．５，５または
５０ｍＭ濃度のキレーター（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）
を含む２５ｍＭＫＰＯ4（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁し
た。混合後、チューブを再び遠心分離し、上清を捨て
た。次に、チューブを１５分間９５℃において加熱し
た。約１００μｌの上清を各チューブから吸い出し、約
２秒間ミクロ遠心分離した。次に、それら上清２０μｌ
をエチジウムブロマイド染色１％アガロースゲルによる
電気泳動で分析した。
【００３９】これらの実験の結果は、上記の報告された
発見と一致した。ミコバクテリアの溶菌の間、ＤＮＡは
分断され、そしていずれかのキレーターの存在下でゲノ
ミックサイズのＤＮＡが残った。最高の結果（即ち、最
も完全なゲノミックＤＮＡが残った場合）は、０．５お
よび５ｍＭのＥＧＴＡを用いた場合に観察された。
発見と一致した。ミコバクテリアの溶菌の間、ＤＮＡは
分断され、そしていずれかのキレーターの存在下でゲノ
ミックサイズのＤＮＡが残った。最高の結果（即ち、最
も完全なゲノミックＤＮＡが残った場合）は、０．５お
よび５ｍＭのＥＧＴＡを用いた場合に観察された。
【００４０】実施例５ キレーターの存在下における加熱溶菌とＤＮＡ増幅反応
の適合性 この実施例の目的は、ミコバクテリウムツベルクロシス
溶菌反応へのＥＧＴＡの添加がポリメラーゼチェインリ
アクション（ＰＣＲ）と適合することを証明することで
あった。
の適合性 この実施例の目的は、ミコバクテリウムツベルクロシス
溶菌反応へのＥＧＴＡの添加がポリメラーゼチェインリ
アクション（ＰＣＲ）と適合することを証明することで
あった。
【００４１】この実施例において用いられた物質は、ミ
コバクテリウムホルツイツムの代わりにミコバクテリウ
ムツベルクロシスを用い、そしてＰＣＲ試薬も標準技術
にしたがって用いたこと以外は、上記実施例と本質的に
同じである。簡単に言えば、１０００のミコバクテリウ
ムツベルクロシス細胞を１ｍｌのＫＰＯ4（ｐＨ７．
５）にスパイクし、そして１５分間９５℃において加熱
した。５０μｌの反応物に、０．５，０．０５，０．０
０５，０．０００５モラーのＥＧＴＡ溶液または水を加
えた。次に、ＩＳ６１１０標的セグメント（チエリー
（Ｄ．Ｔｈｉｅｒｒｙ）ら、ＩＳ６１１０、ミコバクテ
リウムツベルクロシスのＩＳ様エレメント、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，１８８（１９９
０））のプライマーを含むＰＣＲ緩衝液５０μｌを加え
て、標準的方法によりＰＣＲを実施した。
コバクテリウムホルツイツムの代わりにミコバクテリウ
ムツベルクロシスを用い、そしてＰＣＲ試薬も標準技術
にしたがって用いたこと以外は、上記実施例と本質的に
同じである。簡単に言えば、１０００のミコバクテリウ
ムツベルクロシス細胞を１ｍｌのＫＰＯ4（ｐＨ７．
５）にスパイクし、そして１５分間９５℃において加熱
した。５０μｌの反応物に、０．５，０．０５，０．０
０５，０．０００５モラーのＥＧＴＡ溶液または水を加
えた。次に、ＩＳ６１１０標的セグメント（チエリー
（Ｄ．Ｔｈｉｅｒｒｙ）ら、ＩＳ６１１０、ミコバクテ
リウムツベルクロシスのＩＳ様エレメント、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，１８８（１９９
０））のプライマーを含むＰＣＲ緩衝液５０μｌを加え
て、標準的方法によりＰＣＲを実施した。
【００４２】１０ｍＭのＥＧＴＡがＰＣＲ反応をわずか
に阻害したが、他の濃度では阻害しなかったことが見い
だされた。増幅を阻害しない１ｍＭの濃度の結果は、上
記実施例４において完全なＤＮＡを保持することが観察
された濃度の結果と一致した。したがって、ＥＧＴＡ存
在下におけるミコバクテリウムツベルクロシスの溶菌は
完全なゲノミックサイズのＤＮＡを放出し、そして約１
０ｍＭ以下のＥＧＴＡ濃度においては目に見えてＰＣＲ
増幅を阻害しないであろう。
に阻害したが、他の濃度では阻害しなかったことが見い
だされた。増幅を阻害しない１ｍＭの濃度の結果は、上
記実施例４において完全なＤＮＡを保持することが観察
された濃度の結果と一致した。したがって、ＥＧＴＡ存
在下におけるミコバクテリウムツベルクロシスの溶菌は
完全なゲノミックサイズのＤＮＡを放出し、そして約１
０ｍＭ以下のＥＧＴＡ濃度においては目に見えてＰＣＲ
増幅を阻害しないであろう。
【００４３】上記実施例は、本発明を例示するものであ
り、本発明を限定するためのものではない。本発明は、
特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定され
る。
り、本発明を限定するためのものではない。本発明は、
特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:33） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:33） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:33） (72)発明者 メリンダ・エス・フレイザー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27709，ダーラム，イースト・メイナー ド・アベニュー 104 (72)発明者 ジー・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・ボ ラス・ロード 209 (56)参考文献 特開 昭62−236478（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯ Ｌ．，29（４）（1991）Ｐ．712−717 ＡＲＣＨＳ．ＩＮＳＴ．ＰＡＳＴＥＵ Ｒ．ＴＵＮＩＳ．，655（３−４）Ｐ. 261−270 ＮＵＣＬＥＩＣ．ＡＣＩＤＳ．ＲＥＳ ＥＡＲＣＨ 17（５）（1989）Ｐ．2141
Claims (8)
- 【請求項１】 ミコバクテリアから核酸を放出させるた
めのミコバクテリアの溶菌法であって、ミコバクテリア
を溶菌するのに効果的な時間および温度で水溶液中のミ
コバクテリアを加熱することを含み、その際、該水溶液
は、溶菌に際してミコバクテリアから放出された核酸の
分解を阻害するのに効果的な量のエチレングリコール−
ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−
四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む、前記方法。 - 【請求項２】 前記加熱工程が、５分間から１時間の
間、および５０℃から１５０℃の温度で実施される、請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ミコバクテリアを含む疑いのあるサンプ
ル中のミコバクテリアの検出方法であって： 前記サンプルを、エチレングリコール−ビス（β−アミ
ノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸（ＥＧＴ
Ａ）を含む水溶液と混合して、溶菌溶液を形成し； サンプル中に存在するミコバクテリアを溶菌するのに効
果的な時間および温度で該溶菌溶液を加熱し、その際、
該溶液は、ミコバクテリアの溶菌と同時にミコバクテリ
アから放出される核酸の分解を阻害するのに十分な量の
ＥＧＴＡを含み；そして 該溶菌溶液中でＤＮＡ増幅反応によりミコバクテリアの
核酸セグメントを増幅する； 工程を含む、前記検出方法。 - 【請求項４】 溶菌溶液に増幅試薬を加え、そして該増
幅試薬をミコバクテリア核酸セグメントと反応させるこ
とにより、前記増幅工程を実施する、請求項３記載の方
法。 - 【請求項５】 前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反
応、ライゲース連鎖反応、鎖置換増幅、転写に基づく増
幅、自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複
製、およびＱβレプリカーゼ増幅からなる群から選択さ
れる、請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 前記増幅工程の後に、前記ミコバクテリ
ア核酸セグメントを検出する工程を実施する、請求項３
記載の方法。 - 【請求項７】 核酸サンプル中のミコバクテリア核酸を
検出するために有用なキットであって、 （ａ）溶菌溶液中のミコバクテリアの加熱溶菌に際し、
ミコバクテリア核酸の分解を阻害するのに効果的な量の
エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む、溶
菌溶液；および、 （ｂ）ミコバクテリア核酸セグメントを増幅するための
核酸増幅試薬を含む、核酸サンプル中のミコバクテリア
核酸を検出するために有用なキット。 - 【請求項８】 前記増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反
応、ライゲース連鎖反応、鎖置換増幅、転写に基づく増
幅、自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複
製、およびＱβレプリカーゼ増幅薬からなる群から選択
される増幅反応に使用される、請求項７記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15332593A | 1993-11-16 | 1993-11-16 | |
| US153325 | 1993-11-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07250674A JPH07250674A (ja) | 1995-10-03 |
| JP2709273B2 true JP2709273B2 (ja) | 1998-02-04 |
Family
ID=22546725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6280358A Expired - Fee Related JP2709273B2 (ja) | 1993-11-16 | 1994-11-15 | ミコバクテリアの溶菌方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5766852A (ja) |
| EP (1) | EP0655505B1 (ja) |
| JP (1) | JP2709273B2 (ja) |
| AU (1) | AU682538B2 (ja) |
| BR (1) | BR9404447A (ja) |
| CA (1) | CA2135271C (ja) |
| DE (1) | DE69423574T2 (ja) |
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| US6605434B1 (en) | 1999-03-16 | 2003-08-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Direct bacterial lysate sequencing |
| JP2003508054A (ja) * | 1999-08-31 | 2003-03-04 | ニーデルバイス，ミヒャエル | チャンネル形成性タンパク質の製造方法 |
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| US20060024776A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Mcmillian Ray | Magnetic particle capture of whole intact organisms from clinical samples |
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| AU2005271688B2 (en) * | 2004-08-03 | 2011-10-06 | Becton, Dickinson And Company | Use of magnetic material to direct isolation of compounds and fractionation of multipart samples |
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| CN101443462A (zh) * | 2006-05-15 | 2009-05-27 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 利用胃粘膜洗涤液的疾病相关标记物检测法 |
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| JP6402347B2 (ja) * | 2012-03-29 | 2018-10-10 | 株式会社シノテスト | 核酸の検出又は定量方法及び検出又は定量用試薬キット |
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