JP2675774B2 - 単離された内部核マトリックス・タンパク質及びその利用方法 - Google Patents
単離された内部核マトリックス・タンパク質及びその利用方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願は、発明の名称「腫
瘍細胞の由来組織及び悪性度を決定する方法」で、１９
８５年１２月２４日に出願した我々の同時係属米国特許
出願第812,955号の一部継続出願である。 【０００２】本発明は、腫瘍細胞、ウイルス感染で形質
転換された細胞及び遺伝的に欠陥のある又は欠失した細
胞の由来組織及び異常段階、等を決定する方法等に有用
なタンパク質に関する。 【０００３】 【従来の技術】米国政府は、国立衛生研究所援助番号5R
01 CA08416-20及び1R01 CA37330-01及び国立科学財団援
助番号PCM 8309334に基づいて本発明にある種の権利を
有する。 【０００４】ウイルス感染、がん、染色体の欠陥又は自
己免疫疾患の診断は、しばしば困難であると共に不正確
である。これまで、がん細胞や他の異常細胞の性質決定
は臨床病理学者の分野であった。診断は一般に組織標本
における細胞の形態に基づく。かかる診断は重大な制限
があって、腫瘍の種類と由来組織を必ずしも区別できな
かった。細胞の種類及び悪性や異常性の段階を同定する
別の手段の要求が大である。染色体の欠陥は、全体の形
態学的欠陥の場合、又は欠けていたり、欠陥のある遺伝
子によりコードされたタンパク質が既知であって、分析
できる場合のみ検出できる。ウイルス感染は一般に抗体
レベルの測定、細胞の検査及び臨床の症状の存在によっ
てのみ診断することができる。 【０００５】また、目標の細胞がわかっている場合の自
己免疫疾患のみならず、例えば、細胞の分解生成物が尿
や血液流に放出され得る膀胱感染や心筋梗塞において、
組織の損傷場所を同定する手段が必要である。 【０００６】全細胞抽出のタンパク質組成を分析するこ
とによって細胞の種類を決定する研究は行われてきた。
しかしながら、これらの抽出物は大多数が細胞の種類間
で変わらない多数の異なるタンパク質を含む。タンパク
質間の高分解能を提供する方法、例えば極く最近の２次
元のゲル電気泳動法でも、かかる努力は、細胞及び組織
の種類の同定に対する規準として信頼して役立ちうるタ
ンパク質における、有意義の相違を見い出すのに概ね失
敗してきた。感染や悪性のためにタンパク質に変化があ
り得る場合でも、現在の方法は新しい又は変化したタン
パク質とバックグラウンドのタンパク質とを区別できな
い。 【０００７】植物及び動物の細胞は全て細胞質に囲まれ
た核を有する。その核はタンパク質と複合しクロマチン
（染色質）と呼ばれる細胞ＤＮＡを含む。クロマチンは
その会合したタンパク質と共に核部の主タンパク質を構
成する。クロマチンはここで核マトリックスと呼ばれる
核の内部骨格によって有機的に構成される。核マトリッ
クスは細胞の種類に特異のタンパク質と全ＤＮＡ小パー
セントを含むことが知られているが、最近の電子顕微鏡
技術は核マトリックスを映像化しないし、極めて大量の
クロマチン・タンパク質と特異の非クロマチン・マトリ
ックス・タンパク質を分離する信頼性のある方法がな
い。用いられている方法は、可溶性タンパク質を分離し
て不溶性タンパク質を捨てるか、或いはこれらの核マト
リックスのタンパク質を抽出するために高濃度の塩（２
ＭのNaCl又は２ＭのLiCl）及び他の強い溶媒を使用す
る。 【０００８】中間フィラメントから成る細胞レベル以下
の（subcellular）部分のタンパク質の組成を分析する
ことによって、細胞を生化学的に同定する方法は十分に
成功しているとは言えない。中間フィラメントは全ての
細胞に存在するタンパク質であって、５クラスの主細
胞：すなわち上皮細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞
及び間葉細胞を判別するために使用することができる。
これらの細胞に対する標識化抗体はこれらの広範囲の細
胞クラス間の区別に役立つのみである（上皮細胞に関し
てはさらに判別が可能であるが）。上皮細胞において
は、中間フィラメント、シトケラチンは複雑であって、
多種類の上皮間で異なる。しかしながら、シトケラチン
は化学的に特別に区別することができるのみである：抗
体はこれまで２、３よりも多くのシトケラチン間を正確
に判別できないことを証明している。また、シトケラチ
ンは悪性度によって変わる場合があり、従って細かい判
別にそれらを使用することは不正確になると報告されて
いる。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、腫瘍細胞、ウイルスにより形質転換された細胞、お
よび遺伝的に欠陥のある又は欠失した細胞の由来組織お
よび異常段階を決定する方法を提供することである。 【００１０】本発明の別の目的は、自己免疫疾患、心筋
梗塞及び細菌感染を含む細胞破壊を包含する疾患状態に
おける由来組織及び組織損傷の度合を同定する方法を提
供することである。 【００１１】さらに本発明の目的は、比較的容易にかつ
迅速にできる方法を提供することである。 【００１２】さらに本発明の目的は、極めて再現性があ
り、客観的で、標準化することができる、由来組織を分
析する方法を提供することである。 【００１３】さらに、本発明の別の目的は、従来の方法
よりも著しく優れた分解能をもって、細胞又は組織に特
異的な核マトリックス・タンパク質および核マトリック
スと会合したＤＮＡの単離及び分析をするための抗体及
びハイブリッド形成プローブを含む生化学的方法を提供
することである。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝的に欠陥
又は欠失のある細胞、ウイルス感染細胞、又は腫瘍細胞
の異常状態及び由来組織を分析する方法に関する。本法
は、自己免疫疾患を含む細胞破壊及び分解生成物の体液
中への放出をもたらす疾患状態における、由来組織及び
細胞損傷の度合を同定又は画像化する手段も提供する。 【００１５】本発明法の一実施態様において、細胞核が
単離され、細胞骨格のタンパク質及びクロマチンが除去
され、核マトリックスが単離され、そして核マトリック
スの「内部」成分と「外部」成分が分離される。「核マ
トリックス」、全タンパク質の５％以下そして細胞の全
ＤＮＡの６％を構成する細胞タンパク質の特定のフラク
ションは、従来の方法では検出できない細胞のタイプお
よび形質転換に特異的なタンパク質を含めて、細胞の種
類（タイプ）によって異なり、かつ細胞タイプに特異的
な抗原で著しく富化されている多くのタンパク質を含有
する。本法は核マトリックスの独特な性質を利用して高
度のマトリックス純度を得ることができ、本質的に種々
の細胞の全てに応用でき、マトリックスの形態を壊わす
ことなく、生化学的に重要なマトリックス成分の大部分
を生成することができる。核マトリックスのタンパク質
を単離する方法を要約すると次の通りである： 【００１６】１．細胞の単離及び分離。 【００１７】２．非イオン性界面活性剤−生理的塩類溶
液での膜脂質及び可溶性タンパク質の抽出による、核及
び細胞骨格からの可溶性細胞タンパク質の分離。 【００１８】３．0.25Ｍの硫酸アンモニウム（pH6.
8）、界面活性剤−デオキシコール酸ナトリウム溶液、
または他の弱い抽出緩衝液中での、工程２からの不溶性
細胞物質の可溶化による、核からの細胞骨格タンパク質
の分離。 【００１９】４．工程３からの不溶性物質の生理的緩衝
液中のＤＮＡアーゼＩ及びＲＮＡアーゼでの消化によ
る、核マトリックスからのクロマチンの分離、及び緩衝
剤でpH6.8に処理した0.25Ｍの硫酸アンモニウム溶液又
は他の弱い抽出緩衝液によるＤＮＡ含有ヌクレオソーム
の溶離。 【００２０】５．５〜10Ｍの尿素（望ましくは８Ｍの尿
素）又は他の適当な可溶化剤を含有する緩衝液中での工
程４からの不溶性物質の溶解、及び生理的緩衝液中への
透析による外部タンパク質の集合による「内部」および
「外部」核マトリックス・タンパク質の分離。 【００２１】「内部」及び「外部」タンパク質について
選択的に富化された部分（フラクション）のそれ以上の
精製は、HPLC、FPLC、クロマトフォーカシング、及び当
業者に公知の他の方法を用いて行うことができる。 【００２２】本法の変化した方法では、細胞骨格のタン
パク質とクロマチンは、工程２からの不溶性物質をＤＮ
Ａアーゼ及びＲＮＡアーゼで消化し、0.25Ｍの硫酸アン
モニウム（pH6.8）で抽出することによって一緒に除去
される。 【００２３】本法の別の実施態様において、核マトリッ
クスに会合したＤＮＡは単独又は核マトリックス・タン
パク質と共に単離して分析される。この方法では工程２
からの不溶性物質をＤＮＡアーゼ、次に0.25Ｍの硫酸ア
ンモニウム（生理学的pHで）で処理して、クロマチン除
去する。次にフェノール抽出および／またはCsCl2にお
ける遠心分離を行って、残留するタンパク質を全て除去
する。本法の変化において、工程２からの不溶性物質は
適当な緩衝液中の制限酵素で消化させ、クロマチンを0.
25Ｍの硫酸アンモニウム（pH6.8）で抽出し、次にフェ
ノール抽出および／またはCsCl2における遠心分離によ
って残留タンパク質を全て除去する。 【００２４】この方法で得られたマトリックスの精製度
ゆえに、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、染色体欠陥又は
遺伝子の欠失をもった細胞、或いは自己免疫疾患のよう
な特殊な細胞損傷を含む疾患をもった細胞の臨床診断に
有用であって、これまで知られていなかったいくつかの
核マトリックス・タンパク質の性質が発見された。マト
リックス・タンパク質の組成は、細抱のタイプ毎に異な
り、その上細胞が悪性の状態に形質転換されたり、遺伝
子が異常であるときに変わる。これらのタンパク質は次
のことに使用することができる： 【００２５】１．一般的な細胞の種類（例えば、上皮細
胞、神経細胞、等）の同定。 【００２６】２．特定細胞の種類（例えば、結腸の上
皮、乳房の上皮、等）の同定。これは、転移の起点又は
細胞損傷の場所の同定を可能にする。 【００２７】３．使用せんとする純粋抗原の供給によ
る、免疫検定法、各種疾患の診断および治療に使用する
組織特異的な抗体の生成（抗体は放射性物質、核磁気共
鳴対比剤、ホウ素誘導体、又は生物学的活性剤と結合で
きる）。 【００２８】４．悪性、遺伝子の欠失又は欠陥、或いは
疾患の特性及び程度の決定。 【００２９】５．ステロイド受容体を含む核マトリック
ス・タンパク質に結合させる薬剤、他の物質又は化合物
のスクリーニング。 【００３０】６．遺伝子の表現及び細胞分化を変えたり
制御するＤＮＡの結合座位の同定。 【００３１】核マトリックス会合ＤＮＡ、特に核マトリ
ックス会合ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ・フラグメ
ントの分析及び比較によって、さらなる特徴づけが達成
される。ハイブリッド形成プローブは、細胞の種類、由
来組織、悪性度、感染または遺伝子の異常、等広範囲の
分析に用いられる単離、合成又はクローニングされたＤ
ＮＡから調整することができる。 【００３２】 【発明の実施の形態】本発明は、悪性度、ウイルス又は
細菌感染、或いは遺伝子の欠陥によって一部が変化した
特定組織の特異細胞に独特な核マトリックス・タンパク
質及び核マトリックス会合ＤＮＡを単離及び同定する方
法である。連続抽出によって、ほんの少しの生化学的に
異なる細胞タンパク質及びＤＮＡ、並びに形態的に異な
る核マトリックスの組織が得られる。 【００３３】本発明の一実施形態において、核マトリッ
クスは生検材料又は血液試料から調製した細胞浮遊体か
ら精製し、その「内部」と「外部」の部分に分離し、２
次元のゲル電気泳動法によって分析される。本発明の前
までは、著しい分解を起こさない方法で、これらの内部
及び外部の部分を分離することも、核マトリックス・タ
ンパク質を抽出することもできなかった。核マトリック
ス・タンパク質は全細胞タンパク質の約５％以下であ
る。その核マトリックス・タンパク質の多くは細胞が悪
性腫瘍へ形質転換されるとき変化する。「内部」タンパ
ク質は全タンパク質の１％以下、そして「外部」又は
「中間フィラメント」タンパク質が残りを形成する。用
語「内部」及び「外部」は若干任意であるが、一般に核
内のタンパク質の場所を意味する。内部マトリックスは
検査する細胞の組織（structure）及び組成を表わす。
外部マトリックス・タンパク質は、中間フィラメントを
含有することによって、検査する細胞のクラス（神経細
胞、上皮細胞、等）を表わす。 【００３４】外部タンパク質を内部マトリックス・タン
パク質から分離することは２つの重要な利点がある。１
つは、内部マトリックス・タンパク質を同定する感度及
び特異性が著しく増大される。なぜならば外部マトリッ
クス・タンパク質はこの部分の全タンパク質の1/2以上
であり、それらの存在が少量であるけれども重要な内部
マトリックス・タンパク質を不明確にするからである。
第２に、組織のタイプの決定には不適当であるが、外部
タンパク質自身は２つの分析手段を提供する。中間フィ
ラメントのタンパク質は分析せんとする細胞のクラスの
迅速な同定に有用であり、中間フィラメント会合（asso
ciated）タンパク質は疾患の同定に役立つ。 【００３５】これらの抗体が比色、免疫（例えば、標識
抗−抗体）、螢光、酵素又は放射能の標識と複合される
と、それらは組織学の部門の細胞株として、或いは２次
元のゲル電気泳動によって分離された体液とタンパク質
の分析用に使用することができ、有用な診断情報を提供
する。それらの抗体は、腫瘍やウイルスの抗原、例えば
不完全な染色体や遺伝子の欠失のために異常なタンパク
質又はそれらの不在、およびある種の感染、心筋梗塞、
および自己免疫疾患におけるような細胞の分解中に放出
されるタンパク質の存在を検出することができる。放射
性物質、核磁気共鳴対比剤、又はホウ素或いはホウ素化
合物で標識を付けた抗体は、特に診断の映像化（検出又
は監視）又は種々の疾患の治療に有用である。薬剤、生
物学的モディファイアー、脈管形成又は抗脈管形成要素
等をもった抗体は、それらの物質（剤）をヒトの体内の
所定の場所ヘ、現在知られている方法により送られるよ
りも速い速度かつ高い効率で送るのに使用することがで
きる。 【００３６】これらの核マトリックス・タンパク質は、
特定の疾患の治療のための候補として多数の化合物の効
能を直接比較するのにも有用である（薬剤のスクリーニ
ング）。例えば、ステロイドは核マトリックス受容体機
構によって核マトリックスに結合すると思われる。エス
トロゲンやフェノール・レッドの結合は細胞増殖を刺激
することができる。核マトリックス受容体やタンパク質
への結合は特定遺伝子の発現を変えると思われる。核マ
トリックスと相互作用をして核マトリックスに影響を与
える薬剤は、多くの治療的用途がある。本発明はこれら
薬剤の作用効果を比較する手段を提供する。核マトリッ
クス・タンパク質は前述のように単離され、試験せんと
する化合物にさらして、結合の存在を検定される。結合
の検定は当業者には周知である。化合物が一旦in vitro
で結合することがわかったら、それは遺伝子発現、増殖
又は阻害に及ぼす特定の効果をin vivoで試験すること
ができる。しかしながら、迅速なin vitro検定の利点は
明白である、すなわち結合する薬剤のみを以後の試験を
受けさせるだけでよい。 【００３７】本法によって抽出された核マトリックス会
合ＤＮＡは同様の用途を有する。 【００３８】 【実施例】内部および外部の核マトリックス・タンパク
質及び核マトリックス会合ＤＮＡを単離する方法は次の
通りである：細胞の調製 この方法は懸濁液中の単一細胞（single cells）を用い
る。血液試料中の細胞や細胞培養からの細胞は既に分離
されている。生検により得られた組織は弱い機械的均一
化、続いてコラゲナーゼやトリプシンのようなタンパク
質分解酵素での消化によって分散される。これらの酵素
は細胞間の結合繊維を内容物に影響を与えることなく消
化する。場合によっては、最初に細胞のタイプを部分的
に分離することが望ましい。迅速な細胞分離は、遠心分
離、密度こう配、又は化学的相互作用なしに細胞を迅速
に分離する他の手段によって行う。 【００３９】核マトリックスの精製タンパク質及び会合ＤＮＡ 核マトリックスは一連の連続抽出によって他の細胞構成
要素から分離される。細胞懸濁液は抽出溶液に１〜２分
さらした後、不溶性物質を遠心分離（1000gで約１〜２
分間）、ろ過（穴の大きさ約５μ）、または当業者に公
知の他の方法によって分離される。連続的分別を図１に
模式的に示す。この抽出プロセスの重要な特徴の１つ
は、２ＭのNaClのような強い抽出溶媒を回避することで
ある。第２は、尿素や他の適当な可溶化剤を使用して内
部及び外部のタンパク質を溶解し、続いて外部のタンパ
ク質を再重合させることである。 【００４０】それらの工程は次の通りである： １．可溶性細胞タンパク質の除去 細胞質量の70％になる可溶性タンパク質１４は、そのま
まの細胞１０を非イオン性界面活性剤溶液（例えば、0.
5％トリトンＸ−１００）で抽出することによって除去
される。生理的pH及びイオン強度の緩衝液中の非イオン
性界面活性剤は最初に膜脂質、次に可溶性タンパク質を
抽出する。界面活性剤はタンパク質を変性することな
く、脂質を可溶化し、従って細胞組織の完全性を乱すの
を回避する。生理学的食塩溶液は、細胞組織の形態の維
持及び構成要素の除去に必須である。有用な緩衝液は、
例えば０℃における100mM NaCl，300mM スクロース、
10mMPIPES（pH68）、３mM MgCl2，0.5％ トリトンＸ
−１００，１，２mMフッ化フェニルメチルスルホニルで
ある。 【００４１】可溶性部分の２次元のゲル分析は主タンパ
ク質の複合、濃密パターンを示す。多くのタンパク質は
この部分では独特であると思われるが、ゲル上のタンパ
ク質スポットの密度がさらに正確な分析を妨げる。 【００４２】残りの骨格基質は、一般に従来のエポン
（Epon）包埋切片にマスクされるが、Feyら（Fey et a
l, in the J. Cell Biol., 98, 1973-1984 (1984)）の
方法を用いて非包埋全マウントとして３次元で見ること
ができる。走査電子顕微鏡に対しては、細胞はカバーガ
ラス上で成長され、本発明の方法によって分別される。
細胞は、種々の分別段階において、０℃において2.5％
のグルタルアルデヒドを含有する適当な緩衝溶液中で30
分間固定化され、続いて0.1Ｍのカコジル酸ナトリウム
中、次に０℃で５分間0.1Ｍのカコジル酸ナトリウム中
１％のＯｓＯ4で洗浄する。まだカバーガラス上にある
細胞は、エタノールで連続的に脱水し、ＣＯ2の臨界点
を通して乾燥して、金−パラジウムでスパッター・コー
ティングする。透過電子顕微鏡検査は、前もってホルム
バール（商品名であってポリビニル・アルコールから誘
導した熱可塑性樹脂である）で被覆し、炭素を塗工した
金の格子上で成長した細胞で行う。細胞は前述のように
2.5％グルテルアルデヒド中で固定化して処理する。 【００４３】２．細胞骨格タンパク質の除去 密集した細胞質フィラメント網、細胞間結合複合体およ
び頂端微少細胞組織から成る細胞骨格タンパク質２０
は、次に緩衝剤でpH6.8に処理した0.25Ｍの硫酸アンモ
ニウム溶液１６、例えば0.25Ｍの硫酸アンモニウム、0.
3Ｍのスクロース、10mMのPIPES（pH6.8）、フッ化フェ
ニルメチルスルホニル、0.5％トリトンＸ−１００、ま
たは１％トゥイーン（Tween）−４０、0.5％デオキシコ
ール酸ナトリウム溶液１８を用いた、細胞タンパク質の
質量の20％になる細胞骨格タンパク質の選択的可溶化に
よって、核から分離される。中間フィラメントの全てが
まだ結合しかつ細胞タンパク質の約５％になる核が残
る。 【００４４】３．クロマチン・タンパク質の除去 次に核との会合がＤＮＡおよびＲＮＡの完全さに依存す
るクロマチン・タンパク質２６が核マトリックスから分
離される。核は、最初にほぼ生理的な消化緩衝液中のＤ
ＮＡアーゼ及びＲＮＡアーゼ２２、例えば50mM NaCl，
0.3Ｍ スクロース、10mM PIPES（pH6.8）、３mM MgCl
2、0.5％トリトンＸ−１００、1.2mMフッ化フェニルメ
チルスルホニルを伴う100μgのウシ膵臓ＤＮＡアーゼ
（EC 3.1.4.5,Worthington Biochemical Corp., Freeho
ld, NJ）及び100μg/ml膵臓ＲＮＡアーゼＡ（EC 3.1.4.
22., Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）で消化され
る。この酵素はＤＮＡを主としてクロマチン又はヌクレ
オソームの基本単位間で切断する。そのＤＮＡ含有ヌク
レオソームは、次に援衝化でpH6.8にした0.25Ｍの硫酸
アンモニウム２４を用いて２０℃で約５分間溶離させ
る。0.25Ｍの硫酸アンモニウムが望ましいけれども、同
じような緩衝液も使用可能である。 【００４５】４．マトリックスの内部及び外部タンパク
質の分離 核マトリックスは細胞タンパク質の質量の５％以下を構
成する。 【００４６】核マトリックスはさらに異なる２つの部
分、すなわち内部と外部（又は中間フィラメント）に分
かれる。外部は中間フィラメントと中間フィラメント会
合タンパク質からなる。それらのフィラメントは細胞質
においてマトリックスの外側にあるけれども、それらは
物理的に核の表面に結合し、生埋的には核マトリックス
の一部分としての挙動をする。それら及びそれらの会合
タンパク質はマトリックス調製物におけるタンパク質の
1/2以上になる。 【００４７】内部及び外部マトリックスのタンパク質で
選択的に富化された部分は、緩衝化した５〜10Ｍ（望ま
しくは８Ｍ）の尿素溶液２８、又は核マトリックス・タ
ンパク質を完全に溶解するために必要とされる他の適当
な可溶化剤、例えばジヨードサリチル酸リチウムに、マ
トリックスのタンパク質を完全に溶解させ、次にタンパ
ク質を生理的緩衝液３０に透析して戻すことによって生
成される。内部のタンパク質３２は溶液に残る。中間フ
ィラメントのタンパク質及び会合タンパク質は、透析中
に大きな不活性フィラメント３４に再構成されて、可溶
化剤が除去される。尿素や同じような可溶化剤は一般に
全く不溶性であるタンパク質を溶解させるのに必須であ
る。透析などによる可溶化剤の除去は、中間フィラメン
ト部分を再形成させ分離するためには必須である。 【００４８】前述の核マトリックス・タンパク質を単離
する方法の変法において、細胞骨格タンパク質２０とク
ロマチン２６は一緒に除去される。可溶性タンパク質１
４は非イオン性界面活性剤緩衝化溶液１２での抽出によ
って最初に除去される。不溶性の物質は緩衝化溶液中の
ＤＮＡアーゼ及びＲＮＡアーゼ２２で消化し、次に細胞
骨格タンパク質２０とクロマチン２６は生理的pHにおけ
る0.25Ｍの硫酸アンモニウム28で抽出する。 【００４９】選択的に富化された部分は、さらに電気泳
動法、「クロマトフォーカシング」（BioRad Laborator
ies, Richmond, CA)、HPLCおよび関連技術、例えばFPLC
（fast protein liquid chromatography)、等電点電気
泳動法および従来のイオン交換又はアフィニティークロ
マトグラフィーによって分離することができる。特定の
タンパク質が一旦分離されると、それらのタンパク質
は、さらに別のタンパク質の精製並びに分析に使用する
ためにマトリックスに結合できる単クローン性抗体の作
製に使用することができる。 【００５０】タンパク質の分析 高精製マトリックス・タンパク質は、従来の２次元のア
クリルアミド・ゲル電気泳動法によって分析する。タン
パク質は最切に電気泳動移動度又は等電点に従ってｐＨ
こう配のゲル内で分離される。このゲルは次に標準の10
％アクリルアミド・スラブゲル上に置いて、分子量に従
ってタンパク質を分離する。２次元のゲル電気泳動法の
１つはオフアレル（P.H. O'Farrell in J. Biol. Chem.
250. 4007-4021 (1975)）によって教示され、90％のpH
５〜７（0.4％両性電解質）と10％のpH３〜10（1.6％両
性電界質）から成る両性電解質のこう配を用いている。
タンパク質は銀染色法やオートラジオグラフィーによっ
て検出できるスポット（点）のパターン（模様）を形成
する、そしてその模様は細胞のタイプおよび形質転換の
状態又は異常の特性を表示する。 【００５１】イムノブロット（Immunoblot）電気泳動法
も、ビメンチン、細胞ケラチン接着斑タンパク質、およ
び特殊な核マトリックス・タンパク質を含む核マトリッ
クス−中間フィラメント骨格部分におけるタンパク質の
同定に用いることができる。イムノブロット電気泳動法
は次の通りである。１次元のポリアクリルアミド・ゲル
はラエムリ（Laemmli in Nature (Lond.), 227, 680-68
5 (1970)）の方法に従って実験する。それぞれの部分を
比較するために等タンパク質濃度で装てんする。抗体の
タンパク質バンドヘの反応は、トウビン（H.Towbin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (19
79)）らの方法に従ってニトロセルロース紙上で可視化
される。ニトロセルロース紙はＰＢＳ（リン酸緩衝溶
液）中２％ヘモグロビン中で12時間培養し、ＰＢＳ中で
３回すすぎ、適当な濃度で検出すべきタンパク質への抗
体と共に20℃で２時間培養する。過剰の抗体はＰＢＳで
洗浄（２０分間の洗浄を４回）することにより除去す
る。それらのストリップは次にセイヨウワサビ・ペルオ
キシダーゼに結合させたヤギの抗−ウサギ（又は抗−マ
ウス）ＩｇＧで培養し、ＰＢＳで洗浄（４回、全体で80
分間）し、次にホークスら（R.Hawkes et al., in Ana
l. Biochem., 119, 142-147 (1982)）の方法を用いて0.
01％（体積／体積）Ｈ2Ｏ2中0.4mg/ml ４−クロロ−１
−ナフトール中で現像する。 【００５２】マトリックスの調製物はいくつかの生化学
的特徴（又は規準）によって生化学的及び形態学的に純
枠である。それはマトリックスに特異的な構成要素の大
部分を保持する。汚染されていないので、ゲル電気泳動
法によってマトリックス・タンパク質の正確で詳細な分
析ができる。 【００５３】図１に示すように、核マトリックス会合Ｄ
ＮＡ４４は、生理的緩衝化溶液１２における非イオン界
面活性剤での可溶性タンパク質１４の抽出、生理的緩衝
液中のＤＮＡアーゼ３６での消化によるクロマチン２６
及び細胞骨格タンパク質２０の可溶化、生理的pHの0.25
Ｍの硫酸アンモニウム24中への抽出、およびフェノール
抽出３８、塩化セシウムこう配４０における遠心分離又
は当業者に公知の他の方法によって、そのままの細胞１
０から単離される。ＲＮＡアーゼと組み合わせたＤＮＡ
アーゼ２２の代りにＤＮＡアーゼ３６で不溶性物質を消
化すると、約98％の代りに約94％の細胞ＤＮＡが除去さ
れる。 【００５４】やはり図１に示すように、本法の別の実施
態様において、核マトリックス会合ＤＮＡ４８のフラグ
メントは、適当な緩衝液４６における１種又は１種以上
の制限エンドヌクレアーゼでの、可溶性タンパク質１４
の抽出後に残留する不溶性細胞物質の消化、続いて生理
的pHの0.25Ｍの硫酸アンモニウム24中における細胞骨格
タンパク質２０及びクロマチン２６の抽出、およびフェ
ノール抽出３８、塩化セシウムの遠心分離４０、または
当業者に公知の他の方法による残留タンパク質４２の除
去によって調製される。 【００５５】２次元のゲル電気泳動法および他の精製法
は抗体の生成に用いる純枠なタンパク質を生成する。検
出せんとする抗原及び利用する方法に依存して、ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体が望ましい。モノク
ローナル抗体（又は単クローン性抗体）は、ガルフレら
（G. Galfre et al., in Nature (Lond.) 266, 550-552
(1977)）の方法のような当業者に公知の免疫感作およ
び融合プロトコールによって生成されたハイブリドーマ
細胞系によって分泌される。 【００５６】マトリックス・タンパク質の細胞タイプ特
異性は実験培養細胞系を使用して示された。これらは繊
維芽細胞、HeLa細胞、等のような普通の実験系を含む。
臨床用途に最も関係するのは、ヒトの生検材料から誘導
された多数のがん（癌）種系からの結果である。図２か
ら図５までに示すように、これらは結腸、肺、副腎皮質
および膀胱の細胞系を含む。電気泳動図のパターンは細
胞の種類によって著しく異なる（それぞれのタイプの細
胞は独特なタンパク質並びに共通のタンパク質を含有す
る）けれども、それぞれの細胞の種類についてのパター
ンは特異的でかつ再現性がある。同様の結果が、マウス
の組織を用いて示されたように、動物の組織で得られ
る。 【００５７】核マトリックス・タンパク質の由来組織の
同定の外に、マトリックス・タンパク質のパターン（模
様）は細胞の形質転換、ウイルス感染、及び遺伝子の欠
陥を表わす。これは、一次繊維芽細胞の自然形質転換、
樹立された繊維芽細胞のウイルス形質転換、ラス腫瘍遺
伝子でのトランスフェクションによる腎臓細胞系の形質
転換、および最終発がん物質、ＢＡＰジオール・エポキ
シドによる腎臓細胞系の形質転換において、それぞれの
場合に多数のクローニングされた細胞系を使用して示さ
れた。それぞれがそれらのマトリックス・タンパク質パ
ターンにおいて異なる著しい変動を示したが、由来した
細胞を決定するのに十分な情報を保持した。 【００５８】形質転換又は感染のタイプ及び程度はマト
リックス・タンパク質の組成における変化にも密接に関
係する。特に興味のあるのは、完全な発がん物質による
形質転換とラス遺伝子トランスフェクションとの間の定
性的な相違である。ラス・トランスフェクションにより
形質転換された細胞の６つのクローニングされた単離体
と、発がん物質で形質転換させた細胞の１０の単離体を
分析した。それらの結果を要約すると次の通りである： 【００５９】ａ．化学的発がん物質による形質転換はマ
トリックスに１２〜１５の新しい又はこれまでに検出さ
れなかったタンパク質の発現をもたらす。 【００６０】ｂ．ラス遺伝子によるトランスフェクショ
ンは約６つのタンパク質の消失をもたらし、ある場合は
２又は３つの新しいタンパク質の発現をもたらす。 【００６１】形態的逸脱度とマトリックス・タンパク質
の変化の数との間に相関があると思われる。 【００６２】形質転換した細胞からのデータは固有の特
徴をもった異なるタイプの形質転換事象を示している。 【００６３】核マトリックス会合ＤＮＡの分析は、さら
に細胞のタイプ、由来組織、および細胞の異常度を決め
るための情報を与える。細胞において「活動的(activel
y)」に転写されたＤＮＡは一般に核マトリックスのタン
パク質と会合する。このＤＮＡは細胞全体のＤＮＡの約
６％を表わす。約1/3（全ＤＮＡの２％）がマトリック
スのタンパク質部分に直接結合し、約2/3（全ＤＮＡの
４％）が核マトリックスのＲＮＡ成分に結合する。異な
る量のＤＮＡ並びに特異的配列のＤＮＡが、細胞のタイ
プ及び細胞の異常性と異常度に左右されて核マトリック
ス及び核マトリックスのタンパク質と会合するであろ
う。単離されたＤＮＡは、ゲル電気泳動法および特定の
独特な配列又は反復配列に特異的なプローブでのブロッ
ト・ハイブリッド形成を用いて分析及び同定することが
できる。プローブは、当業者に公知の方法によって問題
の配列（合成配列又は問題の遺伝子の一部）を組換え体
プラスミドに挿入することによって作ることができる。
プローブは、核マトリックス・タンパク質をコードする
ｃＤＮＡについて、ＧＴ１１ライブラリーのような商業
的に利用できるライブラリーをスクリーニングするため
に使用することができる。ライブラリーはまたタンパク
質に対する抗体を用いてスクリーニングすることができ
る。それらのプローブはまた、放射性標識と結合、ビオ
チン化、又はソラリン（psoralin）及びその誘導体と架
橋させて二本鎖プローブとして使用したり、検定、画像
化、単離及び同定法に利用することができる。 【００６４】単離されたＤＮＡは核マトリックス・タン
パク質の発現のためのベクターに挿入し、又はカエル卵
母細胞の直接発現系の１つのような系において直接発現
させることができる。 【００６５】タンパク質又はＤＮＡの分折は、染色体の
欠陥や遺伝子の欠矢の存在を決定する手段を提供する。
１つの用途は羊水穿刺によって得られた細胞の分析であ
り、もう１つは自己免疫疾患の同定及び査定である。抗
体及びハイブリッド形成プローブは、in vivo（組織の
画像化）及びin vitroにおいて、核マトリックス・タン
パク質についての細胞物質及び体液の分析に使用するこ
とができる。しかながら、検出に適切なレベルを保証す
るために、体液中の抗原レベルを濃くする又は高めるた
めの工程を要し得る。例えば、がん腫に特異的なタンパ
ク質に対してプローブ又は抗体が生じたら、それらは標
識を付けてパプ・スミアのような組織切片や体液を迅速
にスクリーニングするのに使用することができる。 【００６６】 【発明の効果】本発明の極めて迅速で簡潔な抽出及び分
析方法は、正常及び異常な細胞の由来組織、およびそれ
らの分解生成物を決定する手段を提供し、それによって
正常な細胞の形質転換又は感染が生じたかどうか、転移
がどの程度あるか、そしてヒトが自己免疫疾患を有する
かどうかを示す。 【００６７】以上、本発明を特定の実施態様に関して記
載したが、組織の種類又は異常の状態、感染又は異常度
が未知の細胞からの核マトリックス・タンパク質及び会
合ＤＮＡを単離及び診断する方法の種々の改良法及び変
法は当業者には明白である。
瘍細胞の由来組織及び悪性度を決定する方法」で、１９
８５年１２月２４日に出願した我々の同時係属米国特許
出願第812,955号の一部継続出願である。 【０００２】本発明は、腫瘍細胞、ウイルス感染で形質
転換された細胞及び遺伝的に欠陥のある又は欠失した細
胞の由来組織及び異常段階、等を決定する方法等に有用
なタンパク質に関する。 【０００３】 【従来の技術】米国政府は、国立衛生研究所援助番号5R
01 CA08416-20及び1R01 CA37330-01及び国立科学財団援
助番号PCM 8309334に基づいて本発明にある種の権利を
有する。 【０００４】ウイルス感染、がん、染色体の欠陥又は自
己免疫疾患の診断は、しばしば困難であると共に不正確
である。これまで、がん細胞や他の異常細胞の性質決定
は臨床病理学者の分野であった。診断は一般に組織標本
における細胞の形態に基づく。かかる診断は重大な制限
があって、腫瘍の種類と由来組織を必ずしも区別できな
かった。細胞の種類及び悪性や異常性の段階を同定する
別の手段の要求が大である。染色体の欠陥は、全体の形
態学的欠陥の場合、又は欠けていたり、欠陥のある遺伝
子によりコードされたタンパク質が既知であって、分析
できる場合のみ検出できる。ウイルス感染は一般に抗体
レベルの測定、細胞の検査及び臨床の症状の存在によっ
てのみ診断することができる。 【０００５】また、目標の細胞がわかっている場合の自
己免疫疾患のみならず、例えば、細胞の分解生成物が尿
や血液流に放出され得る膀胱感染や心筋梗塞において、
組織の損傷場所を同定する手段が必要である。 【０００６】全細胞抽出のタンパク質組成を分析するこ
とによって細胞の種類を決定する研究は行われてきた。
しかしながら、これらの抽出物は大多数が細胞の種類間
で変わらない多数の異なるタンパク質を含む。タンパク
質間の高分解能を提供する方法、例えば極く最近の２次
元のゲル電気泳動法でも、かかる努力は、細胞及び組織
の種類の同定に対する規準として信頼して役立ちうるタ
ンパク質における、有意義の相違を見い出すのに概ね失
敗してきた。感染や悪性のためにタンパク質に変化があ
り得る場合でも、現在の方法は新しい又は変化したタン
パク質とバックグラウンドのタンパク質とを区別できな
い。 【０００７】植物及び動物の細胞は全て細胞質に囲まれ
た核を有する。その核はタンパク質と複合しクロマチン
（染色質）と呼ばれる細胞ＤＮＡを含む。クロマチンは
その会合したタンパク質と共に核部の主タンパク質を構
成する。クロマチンはここで核マトリックスと呼ばれる
核の内部骨格によって有機的に構成される。核マトリッ
クスは細胞の種類に特異のタンパク質と全ＤＮＡ小パー
セントを含むことが知られているが、最近の電子顕微鏡
技術は核マトリックスを映像化しないし、極めて大量の
クロマチン・タンパク質と特異の非クロマチン・マトリ
ックス・タンパク質を分離する信頼性のある方法がな
い。用いられている方法は、可溶性タンパク質を分離し
て不溶性タンパク質を捨てるか、或いはこれらの核マト
リックスのタンパク質を抽出するために高濃度の塩（２
ＭのNaCl又は２ＭのLiCl）及び他の強い溶媒を使用す
る。 【０００８】中間フィラメントから成る細胞レベル以下
の（subcellular）部分のタンパク質の組成を分析する
ことによって、細胞を生化学的に同定する方法は十分に
成功しているとは言えない。中間フィラメントは全ての
細胞に存在するタンパク質であって、５クラスの主細
胞：すなわち上皮細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞
及び間葉細胞を判別するために使用することができる。
これらの細胞に対する標識化抗体はこれらの広範囲の細
胞クラス間の区別に役立つのみである（上皮細胞に関し
てはさらに判別が可能であるが）。上皮細胞において
は、中間フィラメント、シトケラチンは複雑であって、
多種類の上皮間で異なる。しかしながら、シトケラチン
は化学的に特別に区別することができるのみである：抗
体はこれまで２、３よりも多くのシトケラチン間を正確
に判別できないことを証明している。また、シトケラチ
ンは悪性度によって変わる場合があり、従って細かい判
別にそれらを使用することは不正確になると報告されて
いる。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、腫瘍細胞、ウイルスにより形質転換された細胞、お
よび遺伝的に欠陥のある又は欠失した細胞の由来組織お
よび異常段階を決定する方法を提供することである。 【００１０】本発明の別の目的は、自己免疫疾患、心筋
梗塞及び細菌感染を含む細胞破壊を包含する疾患状態に
おける由来組織及び組織損傷の度合を同定する方法を提
供することである。 【００１１】さらに本発明の目的は、比較的容易にかつ
迅速にできる方法を提供することである。 【００１２】さらに本発明の目的は、極めて再現性があ
り、客観的で、標準化することができる、由来組織を分
析する方法を提供することである。 【００１３】さらに、本発明の別の目的は、従来の方法
よりも著しく優れた分解能をもって、細胞又は組織に特
異的な核マトリックス・タンパク質および核マトリック
スと会合したＤＮＡの単離及び分析をするための抗体及
びハイブリッド形成プローブを含む生化学的方法を提供
することである。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明は、遺伝的に欠陥
又は欠失のある細胞、ウイルス感染細胞、又は腫瘍細胞
の異常状態及び由来組織を分析する方法に関する。本法
は、自己免疫疾患を含む細胞破壊及び分解生成物の体液
中への放出をもたらす疾患状態における、由来組織及び
細胞損傷の度合を同定又は画像化する手段も提供する。 【００１５】本発明法の一実施態様において、細胞核が
単離され、細胞骨格のタンパク質及びクロマチンが除去
され、核マトリックスが単離され、そして核マトリック
スの「内部」成分と「外部」成分が分離される。「核マ
トリックス」、全タンパク質の５％以下そして細胞の全
ＤＮＡの６％を構成する細胞タンパク質の特定のフラク
ションは、従来の方法では検出できない細胞のタイプお
よび形質転換に特異的なタンパク質を含めて、細胞の種
類（タイプ）によって異なり、かつ細胞タイプに特異的
な抗原で著しく富化されている多くのタンパク質を含有
する。本法は核マトリックスの独特な性質を利用して高
度のマトリックス純度を得ることができ、本質的に種々
の細胞の全てに応用でき、マトリックスの形態を壊わす
ことなく、生化学的に重要なマトリックス成分の大部分
を生成することができる。核マトリックスのタンパク質
を単離する方法を要約すると次の通りである： 【００１６】１．細胞の単離及び分離。 【００１７】２．非イオン性界面活性剤−生理的塩類溶
液での膜脂質及び可溶性タンパク質の抽出による、核及
び細胞骨格からの可溶性細胞タンパク質の分離。 【００１８】３．0.25Ｍの硫酸アンモニウム（pH6.
8）、界面活性剤−デオキシコール酸ナトリウム溶液、
または他の弱い抽出緩衝液中での、工程２からの不溶性
細胞物質の可溶化による、核からの細胞骨格タンパク質
の分離。 【００１９】４．工程３からの不溶性物質の生理的緩衝
液中のＤＮＡアーゼＩ及びＲＮＡアーゼでの消化によ
る、核マトリックスからのクロマチンの分離、及び緩衝
剤でpH6.8に処理した0.25Ｍの硫酸アンモニウム溶液又
は他の弱い抽出緩衝液によるＤＮＡ含有ヌクレオソーム
の溶離。 【００２０】５．５〜10Ｍの尿素（望ましくは８Ｍの尿
素）又は他の適当な可溶化剤を含有する緩衝液中での工
程４からの不溶性物質の溶解、及び生理的緩衝液中への
透析による外部タンパク質の集合による「内部」および
「外部」核マトリックス・タンパク質の分離。 【００２１】「内部」及び「外部」タンパク質について
選択的に富化された部分（フラクション）のそれ以上の
精製は、HPLC、FPLC、クロマトフォーカシング、及び当
業者に公知の他の方法を用いて行うことができる。 【００２２】本法の変化した方法では、細胞骨格のタン
パク質とクロマチンは、工程２からの不溶性物質をＤＮ
Ａアーゼ及びＲＮＡアーゼで消化し、0.25Ｍの硫酸アン
モニウム（pH6.8）で抽出することによって一緒に除去
される。 【００２３】本法の別の実施態様において、核マトリッ
クスに会合したＤＮＡは単独又は核マトリックス・タン
パク質と共に単離して分析される。この方法では工程２
からの不溶性物質をＤＮＡアーゼ、次に0.25Ｍの硫酸ア
ンモニウム（生理学的pHで）で処理して、クロマチン除
去する。次にフェノール抽出および／またはCsCl2にお
ける遠心分離を行って、残留するタンパク質を全て除去
する。本法の変化において、工程２からの不溶性物質は
適当な緩衝液中の制限酵素で消化させ、クロマチンを0.
25Ｍの硫酸アンモニウム（pH6.8）で抽出し、次にフェ
ノール抽出および／またはCsCl2における遠心分離によ
って残留タンパク質を全て除去する。 【００２４】この方法で得られたマトリックスの精製度
ゆえに、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、染色体欠陥又は
遺伝子の欠失をもった細胞、或いは自己免疫疾患のよう
な特殊な細胞損傷を含む疾患をもった細胞の臨床診断に
有用であって、これまで知られていなかったいくつかの
核マトリックス・タンパク質の性質が発見された。マト
リックス・タンパク質の組成は、細抱のタイプ毎に異な
り、その上細胞が悪性の状態に形質転換されたり、遺伝
子が異常であるときに変わる。これらのタンパク質は次
のことに使用することができる： 【００２５】１．一般的な細胞の種類（例えば、上皮細
胞、神経細胞、等）の同定。 【００２６】２．特定細胞の種類（例えば、結腸の上
皮、乳房の上皮、等）の同定。これは、転移の起点又は
細胞損傷の場所の同定を可能にする。 【００２７】３．使用せんとする純粋抗原の供給によ
る、免疫検定法、各種疾患の診断および治療に使用する
組織特異的な抗体の生成（抗体は放射性物質、核磁気共
鳴対比剤、ホウ素誘導体、又は生物学的活性剤と結合で
きる）。 【００２８】４．悪性、遺伝子の欠失又は欠陥、或いは
疾患の特性及び程度の決定。 【００２９】５．ステロイド受容体を含む核マトリック
ス・タンパク質に結合させる薬剤、他の物質又は化合物
のスクリーニング。 【００３０】６．遺伝子の表現及び細胞分化を変えたり
制御するＤＮＡの結合座位の同定。 【００３１】核マトリックス会合ＤＮＡ、特に核マトリ
ックス会合ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ・フラグメ
ントの分析及び比較によって、さらなる特徴づけが達成
される。ハイブリッド形成プローブは、細胞の種類、由
来組織、悪性度、感染または遺伝子の異常、等広範囲の
分析に用いられる単離、合成又はクローニングされたＤ
ＮＡから調整することができる。 【００３２】 【発明の実施の形態】本発明は、悪性度、ウイルス又は
細菌感染、或いは遺伝子の欠陥によって一部が変化した
特定組織の特異細胞に独特な核マトリックス・タンパク
質及び核マトリックス会合ＤＮＡを単離及び同定する方
法である。連続抽出によって、ほんの少しの生化学的に
異なる細胞タンパク質及びＤＮＡ、並びに形態的に異な
る核マトリックスの組織が得られる。 【００３３】本発明の一実施形態において、核マトリッ
クスは生検材料又は血液試料から調製した細胞浮遊体か
ら精製し、その「内部」と「外部」の部分に分離し、２
次元のゲル電気泳動法によって分析される。本発明の前
までは、著しい分解を起こさない方法で、これらの内部
及び外部の部分を分離することも、核マトリックス・タ
ンパク質を抽出することもできなかった。核マトリック
ス・タンパク質は全細胞タンパク質の約５％以下であ
る。その核マトリックス・タンパク質の多くは細胞が悪
性腫瘍へ形質転換されるとき変化する。「内部」タンパ
ク質は全タンパク質の１％以下、そして「外部」又は
「中間フィラメント」タンパク質が残りを形成する。用
語「内部」及び「外部」は若干任意であるが、一般に核
内のタンパク質の場所を意味する。内部マトリックスは
検査する細胞の組織（structure）及び組成を表わす。
外部マトリックス・タンパク質は、中間フィラメントを
含有することによって、検査する細胞のクラス（神経細
胞、上皮細胞、等）を表わす。 【００３４】外部タンパク質を内部マトリックス・タン
パク質から分離することは２つの重要な利点がある。１
つは、内部マトリックス・タンパク質を同定する感度及
び特異性が著しく増大される。なぜならば外部マトリッ
クス・タンパク質はこの部分の全タンパク質の1/2以上
であり、それらの存在が少量であるけれども重要な内部
マトリックス・タンパク質を不明確にするからである。
第２に、組織のタイプの決定には不適当であるが、外部
タンパク質自身は２つの分析手段を提供する。中間フィ
ラメントのタンパク質は分析せんとする細胞のクラスの
迅速な同定に有用であり、中間フィラメント会合（asso
ciated）タンパク質は疾患の同定に役立つ。 【００３５】これらの抗体が比色、免疫（例えば、標識
抗−抗体）、螢光、酵素又は放射能の標識と複合される
と、それらは組織学の部門の細胞株として、或いは２次
元のゲル電気泳動によって分離された体液とタンパク質
の分析用に使用することができ、有用な診断情報を提供
する。それらの抗体は、腫瘍やウイルスの抗原、例えば
不完全な染色体や遺伝子の欠失のために異常なタンパク
質又はそれらの不在、およびある種の感染、心筋梗塞、
および自己免疫疾患におけるような細胞の分解中に放出
されるタンパク質の存在を検出することができる。放射
性物質、核磁気共鳴対比剤、又はホウ素或いはホウ素化
合物で標識を付けた抗体は、特に診断の映像化（検出又
は監視）又は種々の疾患の治療に有用である。薬剤、生
物学的モディファイアー、脈管形成又は抗脈管形成要素
等をもった抗体は、それらの物質（剤）をヒトの体内の
所定の場所ヘ、現在知られている方法により送られるよ
りも速い速度かつ高い効率で送るのに使用することがで
きる。 【００３６】これらの核マトリックス・タンパク質は、
特定の疾患の治療のための候補として多数の化合物の効
能を直接比較するのにも有用である（薬剤のスクリーニ
ング）。例えば、ステロイドは核マトリックス受容体機
構によって核マトリックスに結合すると思われる。エス
トロゲンやフェノール・レッドの結合は細胞増殖を刺激
することができる。核マトリックス受容体やタンパク質
への結合は特定遺伝子の発現を変えると思われる。核マ
トリックスと相互作用をして核マトリックスに影響を与
える薬剤は、多くの治療的用途がある。本発明はこれら
薬剤の作用効果を比較する手段を提供する。核マトリッ
クス・タンパク質は前述のように単離され、試験せんと
する化合物にさらして、結合の存在を検定される。結合
の検定は当業者には周知である。化合物が一旦in vitro
で結合することがわかったら、それは遺伝子発現、増殖
又は阻害に及ぼす特定の効果をin vivoで試験すること
ができる。しかしながら、迅速なin vitro検定の利点は
明白である、すなわち結合する薬剤のみを以後の試験を
受けさせるだけでよい。 【００３７】本法によって抽出された核マトリックス会
合ＤＮＡは同様の用途を有する。 【００３８】 【実施例】内部および外部の核マトリックス・タンパク
質及び核マトリックス会合ＤＮＡを単離する方法は次の
通りである：細胞の調製 この方法は懸濁液中の単一細胞（single cells）を用い
る。血液試料中の細胞や細胞培養からの細胞は既に分離
されている。生検により得られた組織は弱い機械的均一
化、続いてコラゲナーゼやトリプシンのようなタンパク
質分解酵素での消化によって分散される。これらの酵素
は細胞間の結合繊維を内容物に影響を与えることなく消
化する。場合によっては、最初に細胞のタイプを部分的
に分離することが望ましい。迅速な細胞分離は、遠心分
離、密度こう配、又は化学的相互作用なしに細胞を迅速
に分離する他の手段によって行う。 【００３９】核マトリックスの精製タンパク質及び会合ＤＮＡ 核マトリックスは一連の連続抽出によって他の細胞構成
要素から分離される。細胞懸濁液は抽出溶液に１〜２分
さらした後、不溶性物質を遠心分離（1000gで約１〜２
分間）、ろ過（穴の大きさ約５μ）、または当業者に公
知の他の方法によって分離される。連続的分別を図１に
模式的に示す。この抽出プロセスの重要な特徴の１つ
は、２ＭのNaClのような強い抽出溶媒を回避することで
ある。第２は、尿素や他の適当な可溶化剤を使用して内
部及び外部のタンパク質を溶解し、続いて外部のタンパ
ク質を再重合させることである。 【００４０】それらの工程は次の通りである： １．可溶性細胞タンパク質の除去 細胞質量の70％になる可溶性タンパク質１４は、そのま
まの細胞１０を非イオン性界面活性剤溶液（例えば、0.
5％トリトンＸ−１００）で抽出することによって除去
される。生理的pH及びイオン強度の緩衝液中の非イオン
性界面活性剤は最初に膜脂質、次に可溶性タンパク質を
抽出する。界面活性剤はタンパク質を変性することな
く、脂質を可溶化し、従って細胞組織の完全性を乱すの
を回避する。生理学的食塩溶液は、細胞組織の形態の維
持及び構成要素の除去に必須である。有用な緩衝液は、
例えば０℃における100mM NaCl，300mM スクロース、
10mMPIPES（pH68）、３mM MgCl2，0.5％ トリトンＸ
−１００，１，２mMフッ化フェニルメチルスルホニルで
ある。 【００４１】可溶性部分の２次元のゲル分析は主タンパ
ク質の複合、濃密パターンを示す。多くのタンパク質は
この部分では独特であると思われるが、ゲル上のタンパ
ク質スポットの密度がさらに正確な分析を妨げる。 【００４２】残りの骨格基質は、一般に従来のエポン
（Epon）包埋切片にマスクされるが、Feyら（Fey et a
l, in the J. Cell Biol., 98, 1973-1984 (1984)）の
方法を用いて非包埋全マウントとして３次元で見ること
ができる。走査電子顕微鏡に対しては、細胞はカバーガ
ラス上で成長され、本発明の方法によって分別される。
細胞は、種々の分別段階において、０℃において2.5％
のグルタルアルデヒドを含有する適当な緩衝溶液中で30
分間固定化され、続いて0.1Ｍのカコジル酸ナトリウム
中、次に０℃で５分間0.1Ｍのカコジル酸ナトリウム中
１％のＯｓＯ4で洗浄する。まだカバーガラス上にある
細胞は、エタノールで連続的に脱水し、ＣＯ2の臨界点
を通して乾燥して、金−パラジウムでスパッター・コー
ティングする。透過電子顕微鏡検査は、前もってホルム
バール（商品名であってポリビニル・アルコールから誘
導した熱可塑性樹脂である）で被覆し、炭素を塗工した
金の格子上で成長した細胞で行う。細胞は前述のように
2.5％グルテルアルデヒド中で固定化して処理する。 【００４３】２．細胞骨格タンパク質の除去 密集した細胞質フィラメント網、細胞間結合複合体およ
び頂端微少細胞組織から成る細胞骨格タンパク質２０
は、次に緩衝剤でpH6.8に処理した0.25Ｍの硫酸アンモ
ニウム溶液１６、例えば0.25Ｍの硫酸アンモニウム、0.
3Ｍのスクロース、10mMのPIPES（pH6.8）、フッ化フェ
ニルメチルスルホニル、0.5％トリトンＸ−１００、ま
たは１％トゥイーン（Tween）−４０、0.5％デオキシコ
ール酸ナトリウム溶液１８を用いた、細胞タンパク質の
質量の20％になる細胞骨格タンパク質の選択的可溶化に
よって、核から分離される。中間フィラメントの全てが
まだ結合しかつ細胞タンパク質の約５％になる核が残
る。 【００４４】３．クロマチン・タンパク質の除去 次に核との会合がＤＮＡおよびＲＮＡの完全さに依存す
るクロマチン・タンパク質２６が核マトリックスから分
離される。核は、最初にほぼ生理的な消化緩衝液中のＤ
ＮＡアーゼ及びＲＮＡアーゼ２２、例えば50mM NaCl，
0.3Ｍ スクロース、10mM PIPES（pH6.8）、３mM MgCl
2、0.5％トリトンＸ−１００、1.2mMフッ化フェニルメ
チルスルホニルを伴う100μgのウシ膵臓ＤＮＡアーゼ
（EC 3.1.4.5,Worthington Biochemical Corp., Freeho
ld, NJ）及び100μg/ml膵臓ＲＮＡアーゼＡ（EC 3.1.4.
22., Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）で消化され
る。この酵素はＤＮＡを主としてクロマチン又はヌクレ
オソームの基本単位間で切断する。そのＤＮＡ含有ヌク
レオソームは、次に援衝化でpH6.8にした0.25Ｍの硫酸
アンモニウム２４を用いて２０℃で約５分間溶離させ
る。0.25Ｍの硫酸アンモニウムが望ましいけれども、同
じような緩衝液も使用可能である。 【００４５】４．マトリックスの内部及び外部タンパク
質の分離 核マトリックスは細胞タンパク質の質量の５％以下を構
成する。 【００４６】核マトリックスはさらに異なる２つの部
分、すなわち内部と外部（又は中間フィラメント）に分
かれる。外部は中間フィラメントと中間フィラメント会
合タンパク質からなる。それらのフィラメントは細胞質
においてマトリックスの外側にあるけれども、それらは
物理的に核の表面に結合し、生埋的には核マトリックス
の一部分としての挙動をする。それら及びそれらの会合
タンパク質はマトリックス調製物におけるタンパク質の
1/2以上になる。 【００４７】内部及び外部マトリックスのタンパク質で
選択的に富化された部分は、緩衝化した５〜10Ｍ（望ま
しくは８Ｍ）の尿素溶液２８、又は核マトリックス・タ
ンパク質を完全に溶解するために必要とされる他の適当
な可溶化剤、例えばジヨードサリチル酸リチウムに、マ
トリックスのタンパク質を完全に溶解させ、次にタンパ
ク質を生理的緩衝液３０に透析して戻すことによって生
成される。内部のタンパク質３２は溶液に残る。中間フ
ィラメントのタンパク質及び会合タンパク質は、透析中
に大きな不活性フィラメント３４に再構成されて、可溶
化剤が除去される。尿素や同じような可溶化剤は一般に
全く不溶性であるタンパク質を溶解させるのに必須であ
る。透析などによる可溶化剤の除去は、中間フィラメン
ト部分を再形成させ分離するためには必須である。 【００４８】前述の核マトリックス・タンパク質を単離
する方法の変法において、細胞骨格タンパク質２０とク
ロマチン２６は一緒に除去される。可溶性タンパク質１
４は非イオン性界面活性剤緩衝化溶液１２での抽出によ
って最初に除去される。不溶性の物質は緩衝化溶液中の
ＤＮＡアーゼ及びＲＮＡアーゼ２２で消化し、次に細胞
骨格タンパク質２０とクロマチン２６は生理的pHにおけ
る0.25Ｍの硫酸アンモニウム28で抽出する。 【００４９】選択的に富化された部分は、さらに電気泳
動法、「クロマトフォーカシング」（BioRad Laborator
ies, Richmond, CA)、HPLCおよび関連技術、例えばFPLC
（fast protein liquid chromatography)、等電点電気
泳動法および従来のイオン交換又はアフィニティークロ
マトグラフィーによって分離することができる。特定の
タンパク質が一旦分離されると、それらのタンパク質
は、さらに別のタンパク質の精製並びに分析に使用する
ためにマトリックスに結合できる単クローン性抗体の作
製に使用することができる。 【００５０】タンパク質の分析 高精製マトリックス・タンパク質は、従来の２次元のア
クリルアミド・ゲル電気泳動法によって分析する。タン
パク質は最切に電気泳動移動度又は等電点に従ってｐＨ
こう配のゲル内で分離される。このゲルは次に標準の10
％アクリルアミド・スラブゲル上に置いて、分子量に従
ってタンパク質を分離する。２次元のゲル電気泳動法の
１つはオフアレル（P.H. O'Farrell in J. Biol. Chem.
250. 4007-4021 (1975)）によって教示され、90％のpH
５〜７（0.4％両性電解質）と10％のpH３〜10（1.6％両
性電界質）から成る両性電解質のこう配を用いている。
タンパク質は銀染色法やオートラジオグラフィーによっ
て検出できるスポット（点）のパターン（模様）を形成
する、そしてその模様は細胞のタイプおよび形質転換の
状態又は異常の特性を表示する。 【００５１】イムノブロット（Immunoblot）電気泳動法
も、ビメンチン、細胞ケラチン接着斑タンパク質、およ
び特殊な核マトリックス・タンパク質を含む核マトリッ
クス−中間フィラメント骨格部分におけるタンパク質の
同定に用いることができる。イムノブロット電気泳動法
は次の通りである。１次元のポリアクリルアミド・ゲル
はラエムリ（Laemmli in Nature (Lond.), 227, 680-68
5 (1970)）の方法に従って実験する。それぞれの部分を
比較するために等タンパク質濃度で装てんする。抗体の
タンパク質バンドヘの反応は、トウビン（H.Towbin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (19
79)）らの方法に従ってニトロセルロース紙上で可視化
される。ニトロセルロース紙はＰＢＳ（リン酸緩衝溶
液）中２％ヘモグロビン中で12時間培養し、ＰＢＳ中で
３回すすぎ、適当な濃度で検出すべきタンパク質への抗
体と共に20℃で２時間培養する。過剰の抗体はＰＢＳで
洗浄（２０分間の洗浄を４回）することにより除去す
る。それらのストリップは次にセイヨウワサビ・ペルオ
キシダーゼに結合させたヤギの抗−ウサギ（又は抗−マ
ウス）ＩｇＧで培養し、ＰＢＳで洗浄（４回、全体で80
分間）し、次にホークスら（R.Hawkes et al., in Ana
l. Biochem., 119, 142-147 (1982)）の方法を用いて0.
01％（体積／体積）Ｈ2Ｏ2中0.4mg/ml ４−クロロ−１
−ナフトール中で現像する。 【００５２】マトリックスの調製物はいくつかの生化学
的特徴（又は規準）によって生化学的及び形態学的に純
枠である。それはマトリックスに特異的な構成要素の大
部分を保持する。汚染されていないので、ゲル電気泳動
法によってマトリックス・タンパク質の正確で詳細な分
析ができる。 【００５３】図１に示すように、核マトリックス会合Ｄ
ＮＡ４４は、生理的緩衝化溶液１２における非イオン界
面活性剤での可溶性タンパク質１４の抽出、生理的緩衝
液中のＤＮＡアーゼ３６での消化によるクロマチン２６
及び細胞骨格タンパク質２０の可溶化、生理的pHの0.25
Ｍの硫酸アンモニウム24中への抽出、およびフェノール
抽出３８、塩化セシウムこう配４０における遠心分離又
は当業者に公知の他の方法によって、そのままの細胞１
０から単離される。ＲＮＡアーゼと組み合わせたＤＮＡ
アーゼ２２の代りにＤＮＡアーゼ３６で不溶性物質を消
化すると、約98％の代りに約94％の細胞ＤＮＡが除去さ
れる。 【００５４】やはり図１に示すように、本法の別の実施
態様において、核マトリックス会合ＤＮＡ４８のフラグ
メントは、適当な緩衝液４６における１種又は１種以上
の制限エンドヌクレアーゼでの、可溶性タンパク質１４
の抽出後に残留する不溶性細胞物質の消化、続いて生理
的pHの0.25Ｍの硫酸アンモニウム24中における細胞骨格
タンパク質２０及びクロマチン２６の抽出、およびフェ
ノール抽出３８、塩化セシウムの遠心分離４０、または
当業者に公知の他の方法による残留タンパク質４２の除
去によって調製される。 【００５５】２次元のゲル電気泳動法および他の精製法
は抗体の生成に用いる純枠なタンパク質を生成する。検
出せんとする抗原及び利用する方法に依存して、ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体が望ましい。モノク
ローナル抗体（又は単クローン性抗体）は、ガルフレら
（G. Galfre et al., in Nature (Lond.) 266, 550-552
(1977)）の方法のような当業者に公知の免疫感作およ
び融合プロトコールによって生成されたハイブリドーマ
細胞系によって分泌される。 【００５６】マトリックス・タンパク質の細胞タイプ特
異性は実験培養細胞系を使用して示された。これらは繊
維芽細胞、HeLa細胞、等のような普通の実験系を含む。
臨床用途に最も関係するのは、ヒトの生検材料から誘導
された多数のがん（癌）種系からの結果である。図２か
ら図５までに示すように、これらは結腸、肺、副腎皮質
および膀胱の細胞系を含む。電気泳動図のパターンは細
胞の種類によって著しく異なる（それぞれのタイプの細
胞は独特なタンパク質並びに共通のタンパク質を含有す
る）けれども、それぞれの細胞の種類についてのパター
ンは特異的でかつ再現性がある。同様の結果が、マウス
の組織を用いて示されたように、動物の組織で得られ
る。 【００５７】核マトリックス・タンパク質の由来組織の
同定の外に、マトリックス・タンパク質のパターン（模
様）は細胞の形質転換、ウイルス感染、及び遺伝子の欠
陥を表わす。これは、一次繊維芽細胞の自然形質転換、
樹立された繊維芽細胞のウイルス形質転換、ラス腫瘍遺
伝子でのトランスフェクションによる腎臓細胞系の形質
転換、および最終発がん物質、ＢＡＰジオール・エポキ
シドによる腎臓細胞系の形質転換において、それぞれの
場合に多数のクローニングされた細胞系を使用して示さ
れた。それぞれがそれらのマトリックス・タンパク質パ
ターンにおいて異なる著しい変動を示したが、由来した
細胞を決定するのに十分な情報を保持した。 【００５８】形質転換又は感染のタイプ及び程度はマト
リックス・タンパク質の組成における変化にも密接に関
係する。特に興味のあるのは、完全な発がん物質による
形質転換とラス遺伝子トランスフェクションとの間の定
性的な相違である。ラス・トランスフェクションにより
形質転換された細胞の６つのクローニングされた単離体
と、発がん物質で形質転換させた細胞の１０の単離体を
分析した。それらの結果を要約すると次の通りである： 【００５９】ａ．化学的発がん物質による形質転換はマ
トリックスに１２〜１５の新しい又はこれまでに検出さ
れなかったタンパク質の発現をもたらす。 【００６０】ｂ．ラス遺伝子によるトランスフェクショ
ンは約６つのタンパク質の消失をもたらし、ある場合は
２又は３つの新しいタンパク質の発現をもたらす。 【００６１】形態的逸脱度とマトリックス・タンパク質
の変化の数との間に相関があると思われる。 【００６２】形質転換した細胞からのデータは固有の特
徴をもった異なるタイプの形質転換事象を示している。 【００６３】核マトリックス会合ＤＮＡの分析は、さら
に細胞のタイプ、由来組織、および細胞の異常度を決め
るための情報を与える。細胞において「活動的(activel
y)」に転写されたＤＮＡは一般に核マトリックスのタン
パク質と会合する。このＤＮＡは細胞全体のＤＮＡの約
６％を表わす。約1/3（全ＤＮＡの２％）がマトリック
スのタンパク質部分に直接結合し、約2/3（全ＤＮＡの
４％）が核マトリックスのＲＮＡ成分に結合する。異な
る量のＤＮＡ並びに特異的配列のＤＮＡが、細胞のタイ
プ及び細胞の異常性と異常度に左右されて核マトリック
ス及び核マトリックスのタンパク質と会合するであろ
う。単離されたＤＮＡは、ゲル電気泳動法および特定の
独特な配列又は反復配列に特異的なプローブでのブロッ
ト・ハイブリッド形成を用いて分析及び同定することが
できる。プローブは、当業者に公知の方法によって問題
の配列（合成配列又は問題の遺伝子の一部）を組換え体
プラスミドに挿入することによって作ることができる。
プローブは、核マトリックス・タンパク質をコードする
ｃＤＮＡについて、ＧＴ１１ライブラリーのような商業
的に利用できるライブラリーをスクリーニングするため
に使用することができる。ライブラリーはまたタンパク
質に対する抗体を用いてスクリーニングすることができ
る。それらのプローブはまた、放射性標識と結合、ビオ
チン化、又はソラリン（psoralin）及びその誘導体と架
橋させて二本鎖プローブとして使用したり、検定、画像
化、単離及び同定法に利用することができる。 【００６４】単離されたＤＮＡは核マトリックス・タン
パク質の発現のためのベクターに挿入し、又はカエル卵
母細胞の直接発現系の１つのような系において直接発現
させることができる。 【００６５】タンパク質又はＤＮＡの分折は、染色体の
欠陥や遺伝子の欠矢の存在を決定する手段を提供する。
１つの用途は羊水穿刺によって得られた細胞の分析であ
り、もう１つは自己免疫疾患の同定及び査定である。抗
体及びハイブリッド形成プローブは、in vivo（組織の
画像化）及びin vitroにおいて、核マトリックス・タン
パク質についての細胞物質及び体液の分析に使用するこ
とができる。しかながら、検出に適切なレベルを保証す
るために、体液中の抗原レベルを濃くする又は高めるた
めの工程を要し得る。例えば、がん腫に特異的なタンパ
ク質に対してプローブ又は抗体が生じたら、それらは標
識を付けてパプ・スミアのような組織切片や体液を迅速
にスクリーニングするのに使用することができる。 【００６６】 【発明の効果】本発明の極めて迅速で簡潔な抽出及び分
析方法は、正常及び異常な細胞の由来組織、およびそれ
らの分解生成物を決定する手段を提供し、それによって
正常な細胞の形質転換又は感染が生じたかどうか、転移
がどの程度あるか、そしてヒトが自己免疫疾患を有する
かどうかを示す。 【００６７】以上、本発明を特定の実施態様に関して記
載したが、組織の種類又は異常の状態、感染又は異常度
が未知の細胞からの核マトリックス・タンパク質及び会
合ＤＮＡを単離及び診断する方法の種々の改良法及び変
法は当業者には明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明による核マトリックス・タンパ
ク質及び会合ＤＮＡの単離及び分析の略図である。 【図２】 図２は、ヒトの肺（黒丸）からの核マトリッ
クス・タンパク質（副腎皮質と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。 【図３】 図３は、ヒトの副腎皮質（白丸）からの核マ
トリックス・タンパク質（肺と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。 【図４】 第４図は、ヒトの結腸（黒丸）からの核マト
リックス・タンパク質（膀胱と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。 【図５】 第５図は、ヒトの膀胱（白丸）からの核マト
リックス・タンパク質（結腸と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。
ク質及び会合ＤＮＡの単離及び分析の略図である。 【図２】 図２は、ヒトの肺（黒丸）からの核マトリッ
クス・タンパク質（副腎皮質と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。 【図３】 図３は、ヒトの副腎皮質（白丸）からの核マ
トリックス・タンパク質（肺と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。 【図４】 第４図は、ヒトの結腸（黒丸）からの核マト
リックス・タンパク質（膀胱と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。 【図５】 第５図は、ヒトの膀胱（白丸）からの核マト
リックス・タンパク質（結腸と共通するタンパク質は半
分黒丸で示す）の図式（ａ）および実際（ｂ）による２
次元の電気泳動図（pI vs. m.w.）である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｑ 1/04 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/04
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．外部核マトリックス・タンパク質を含有しないよう
に単離された内部核マトリックス・タンパク質；ここ
で、内部核マトリックス・タンパク質は、細胞骨格のタ
ンパク質および染色質タンパク質を含有しない核マトリ
ックス・タンパク質の８Ｍ尿素溶液を生理的緩衝液に透
析したとき可溶性を維持するタンパク質であり、外部核
マトリックス・タンパク質は、同様の条件下で不溶性と
なるタンパク質である。 ２．請求項１に記載の内部核マトリックス・タンパク質
であって、真核細胞から以下の工程： （ａ）生理的ｐＨおよびイオン強度において非イオン性
界面活性剤溶液で真核細胞を抽出することによって、核
および細胞骨格から可溶性タンパク質を分離する工程； （ｂ）工程（ａ）からの不溶性物質中の細胞骨格のタン
パク質を可溶化することによって、細胞骨格のタンパク
質から核を分離する工程； （ｃ）工程（ｂ）からの不溶性物質をＤＮＡアーゼおよ
びＲＮＡアーゼで消化させ、染色質タンパク質を緩衝化
硫酸アンモニウム溶液で溶離することによって、核マト
リックスから染色質タンパク質を分離する工程；および （ｄ）工程（ｃ）からの不溶性物質を可溶化剤中に溶解
させ、溶解したタンパク質を透析して生理的緩衝液に戻
すことによって、核マトリックスの内部および外部タン
パク質を分離する工程により単離される、タンパク質。 ３．請求項２に記載の内部核マトリックス・タンパク質
であって、前記単離工程において、核マトリックスの内
部および外部タンパク質が尿素中に可溶化される、タン
パク質。 ４．請求項２に記載の内部核マトリックス・タンパク質
であって、前記単離工程において、細胞骨格タンパク質
および染色質タンパク質が、工程（ａ）からの不溶性物
質をＤＮＡアーゼおよびＲＮＡアーゼで消化させること
によって、核マトリックスから一緒に除去される、タン
パク質。 ５．外部核マトリックス・タンパク質を含有しないよう
に単離された内部核マトリックス・タンパク質（ここ
で、内部核マトリックス・タンパク質は、細胞骨格のタ
ンパク質および染色質タンパク質を含有しない核マトリ
ックス・タンパク質の８Ｍ尿素溶液を生理的緩衝液に透
析したとき可溶性を維持するタンパク質であり、外部核
マトリックス・タンパク質は、同様の条件下で不溶性と
なるタンパク質である）と結合する化合物を検出する方
法であって、以下の工程： （ａ）単離された内部核マトリックス・タンパク質を、
選択された化合物と反応させる工程；および （ｂ）該タンパク質と該化合物との結合の存在を検出す
る工程； を包含する、方法。 ６．請求項１に記載の内部核マトリックス・タンパク質
であって、形質転換した動物細胞の核から単離されたこ
とをさらなる特徴とする、タンパク質。 ７．請求項６に記載の内部核マトリックス・タンパク質
であって、前記形質転換した動物細胞が、肺、結腸、副
腎皮質、膀胱または腎臓の細胞に由来する、タンパク
質。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/812,955 US4882268A (en) | 1985-12-24 | 1985-12-24 | Method for determining tissue of origin and degree of malignancy of tumor cells |
| US812,955 | 1985-12-24 |
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|---|---|---|---|
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ID=25211074
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