JP2640544B2 - 酵素固定化膜 - Google Patents

酵素固定化膜

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汀 安藤
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【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は化学・食品工業,医療計測,環境計測などの
分野で利用されるバイオセンサ,特に酵素固定化膜を有
する酵素センサに関する。
[従来技術及び課題] 近年,酵素センサが注目されており,例えば水溶性の
酵素を多孔質無機担体や高分子担体に固定化してなる酵
素固定化膜を用い,その酵素反応によって生ずる化学物
質等の変化をトランスデューサによって電気信号に変換
して特定基質濃度を計測するようにした酵素センサが開
発されている。
しかし,酵素固定化膜では,試料液中の特定基質に対
する酵素反応が起こる一方,トランスデューサへの反応
関連物質の拡散もなされる。そのため,低濃度の試料液
に対しても正確な測定を行なうために酵素固定化膜を厚
くして酵素の固定化量を増やすと,拡散に支承をきた
し,応答性の遅れを生ずる。特に,使用酵素が低活性で
ある場合に,酵素固定化量を増やす必要性が高く,こう
した問題を生し易い。
それ故,センサ応答性を向上させるためにはできる限
り酵素固定化膜を薄くして反応関連物質の拡散を容易に
する必要がある。
しかし,酵素固定化膜を薄くすると,酵素固定化量が
減り,出力信号が小さくなるため,感度が低下し,セン
サ小型化に支承をきたす。又,酵素固定化膜の強度低下
にもつながる。特に,ガラスや磁気などの脆い担体を用
いたものの場合,非常に破損し易く,センサ製造上(膜
自体の製作,センサ素子の組立て等),更にはセンサ使
用上障害となる。
[課題の解決手段] そこで,本発明はかかる課題を下記手段によって解決
した。
微細な気孔を多数備え酵素が担持される多孔質担体、
を有する酵素固定化膜であって、前記多孔質担体の表面
の少なくとも一部には、前記微細な気孔を多数備え、前
記多孔質担体の膜厚方向に高くされた、互いに連続する
厚膜部と、前記微細な気孔を多数備え、前記多孔質担体
の膜厚方向に低くされた、互いに独立の複数の薄膜部
と、が形成され、前記厚膜部によって前記複数の薄膜部
が個々に包囲されて、互いに独立の薄膜部とされ、前記
厚膜部と前記薄膜部とによって前記多孔質担体表面の凹
凸構造が形成されたことを特徴とする酵素固定化膜。
好ましくは、多孔をなす微細な気孔の平均気孔径は略
数μmオーダー以下とされ(例えば0.3μm)、厚膜部
を挟んで対向する薄膜部間の中心点間距離はこの平均気
孔径より遥かに長く、好ましくは略100μmオーダー以
上(より好ましくは0.4〜1.3mm)とされる。
上記構成によれば,前記厚膜部(以下「凸部」とい
う)3aと薄膜部(以下「凹部」という)3bとによって、
多孔質担体の表面に凹凸形状が形成されることになる
(第1図)。そして,凸部3aで全体的な機械強度を確保
する一方,凹部3bで試料液の拡散を容易ならしめ,しか
も全体として高感度を維持できる。
酵素固定化膜を構成する多孔質担体としては,通常使
用されるものでよく,無機質担体としては,アルミナ,
マグネシア,チタニア,ジルコニア等の酸化物セラミッ
クス;リン酸塩(水酸アパタイト等)等の複酸化物セラ
ミックス;及びシリカガラスなど,又高分子担体として
は例えばポリエチレン,ポリスチレン,ポリウレタンな
どが挙げられる。気孔率は25%以上,平均気孔径0.3μ
mにするとよい。多孔質担体は,通常の方法によって所
定の酵素を固定して酵素固定化膜とされる。
多孔質担体(従って酵素が固定化された酵素固定化
膜)の少なくとも片面が繰返し凹凸構造となっている。
トランスデューサ等に取付けられる面は通常のように平
面とし,反応関連物質の拡散距離が極力増大しないよう
に,又トランスデューサ等との結合に支承をきたさない
ようにすることが好ましい。酵素固定化膜の少なくとも
作動部位において繰返し凹凸構造となっていればよい。
「作動部位」とは酵素固定化膜がその使用時において有
効に酵素反応に寄与し得る部分を指し,残りの部位例え
ば基板への接合部位などは必ずしも該構造であることを
要しない。凹凸構造は繰返して存在すればよく,凹部
(薄膜部)と凸部(厚膜部)との存在比率を例えば3/7
〜7/3程度の範囲から選択するとよい。但し,酵素固定
化膜の強度を保つため凸部が少なくとも連続して存在
し,各凹部を取り囲むようにすることが望ましい(第2,
5〜8図参照)。ここで,「凹部」とは標準厚より薄い
部分(薄膜部),「凸部」とは標準厚より厚い部分(厚
膜部)を意味するものとする。又,「標準厚」とは酵素
固定化膜ないしはその多孔質担体について一般的に用い
られている厚みをいう。その標準厚は,酵素固定化膜用
多孔質担体の場合,通常0.05〜0.5mm,特に0.1〜0.7mmの
範囲とされる。尚,酵素が固定化された後の状態である
酵素固定化膜についても,若干厚くなる(10μm以下)
が略同一範囲内の厚みとなっている。
凹部の最小厚は標準厚に対して好ましくは0.5倍以
下,より好ましくは0.3倍以下にするとよい。一方,凸
部の最大厚は標準厚に対して好ましくは2倍以上、より
好ましくは4倍以上にするとよい。即ち、凸部の最大厚
は、凹部の最小厚に対して、4倍以上であることが好ま
しい。例えば,凹部の最小厚は0.01〜0.15mm,一方凸部
の最大厚は0.2〜2mmにする。凸部を挟んで対向する凹部
間の中心点間距離は、平均して好ましくは、0.4〜1.3m
m、より好ましくは0.5〜1.0mmにするとよい。又,一の
凸部の幅ないし径は好ましくは0.3〜0.8mm,より好まし
くは0.5〜0.7mmにするとよい。
トランスデューサとしては,酵素固定化膜における酵
素反応の物質変化を電気信号に変換する電極(いわゆる
電極型酵素センサ)が好ましく,反応関連物質濃度との
相関がとり易い。酵素固定化膜と電極とは密着している
ことが好ましい。但し0.1mm程度の隙間があっても差支
えない。
酵素固定化膜の一側ないしは両側には,測定誤差をも
たらす有害物質(例えば血液中のグルコース測定におけ
るアルコルビン酸や尿酸)が電極などに付着するのを防
止するために,選択透過膜を存在させることが好まし
い。その選択透過膜は酢酸セルロース,アルミナゲル,
シリカゲル等からなり,厚さ0.1〜3μm,気孔率40〜80
%程度にするとよい。
[実施例] 以下,グルコール(糖)センサを例にとって説明す
る。
(1)固定化用多孔質担体の成形 ・アルミナ 100g (粒径0.5μm,純度99.9%市販品) ・メチルセルロース 10g(市販品) ・ポリエチレングリコール 5g(市販品) ・水 63g 以上を10φmmのアルミナ球石300gと共に容積500mlの
ポリエチレン容器に入れ,120rpmで24時間,溶解混合す
る。こうして得られたスラリーを真空脱泡した後,あら
かじめ用意した凹凸模様のあるポリエチレンシート(市
販品)上に薄く拡げる。その後,15時間自然乾燥し,次
いでポリエチレンシートをはがし,片面に凹凸模様の付
いたアルミナ生シートを得た。これをサイズ5.4×5.4mm
にナイフで切り出し,1250℃で0.5時間焼成し,酵素固定
化用多孔質担体を得た(5×5×0.5tmm)。
次に,この多孔質担体の平面側に,あらかじめ調製し
ておいたアルミナゾルを薄く塗布し800℃で1時間焼付
け選択透過膜を形成した。
これら多孔質担体及び選択透過膜の特性を第1表及び
第2図に示す。
(2)酵素の固定化 この多孔質担体(選択透過膜を形成したもの)に,次
の手順で固定化処理を施す。
(イ) ・γ−アミノプロピルトリエトキシシラン10ml ・トルエン 90ml 上記溶液中へ15時間浸す。
(ロ) ・トルエン100ml中で10分洗浄 ・エタノール100ml中で10分洗浄 ・純粋 100ml中で30分洗浄 (ハ) これを1時間自然乾燥した後, ・グルタルアルデヒド 2.5ml ・リン酸塩緩衝液 97.5ml 上記溶液中へ2時間浸す。
(ニ) ・酵素(グルコースオキシダーゼ) 0.5g ・リン酸塩緩衝液 99.5g 上記溶液中へ1時間浸す。
(ホ) リン酸塩緩衝液100ml中に2時間浸して洗浄
し,酵素固定化処理を完了させる。
(3)センサ素子の組立て 第3図に示すように,あらかじめ白金電極2を蒸着し
たアルミナ基板(10×10×0.6tmm)1を用意し,その白
金電極2の上へ前記酵素固定化膜3を,凹凸面を外側に
してかぶせる。その周囲をエポキシ接着剤でシールす
る。
(4)測定 リン酸塩緩衝液に,所定量のグルコースを溶解し,種
々の濃度の試験液を調製する。測定は,電極2の端子に
エレクトロメータを接続し0.6Vの電圧を印加した状態で
0.03mlの試験液を滴下し,電流値を測定した。又,JIS R
I601に準じて(三点曲げ,L:20mm,w:10mm)曲げ強さを測
定した。
比較のため,酵素固定化膜の厚みについて,細心の注
意を払って作製した凹部を及び凸部を有する表面構造を
持たない表面の平滑な、厚さ0.1mmのもの(比較例1)
及び0.5mmのもの(比較例2)を同様な測定に供した。
それらの試験結果を第2表及び第4図に示す。
第2表及び第4図から明らかなように,凸部(最大厚
0.5mm)と凹部(最小厚0.1mm)とを併存させることによ
り,応答性及び感度について優れたセンサ素子となるこ
とが判明した。
即ち,実施例のグルコースセンサは,比較例1(膜厚
0.1mm)のものに比して,応答時間を略同レベルに維持
しつつ,計測電流値を大幅に高め,従って抵濃度試料に
対しても高感度測定が可能である。しかも,センサ素子
製作にあたり,この比較例1のように細心の注意を払う
必要が無い。他方,比較例2(膜厚0.5mm)のものに比
して,応答時間を大幅に短縮しながら,計測電流値を略
同レベルに維持できた。しかも試料液のグルコース濃度
300mg/dl以上では,比較例2のものに比しても計測電流
値が高くなる。加えて,グルコース濃度と計測電流との
関係について,広範囲の濃度において優れた直線性を示
し,何ら補正をすることなく正確なグルコース濃度の策
定が可能である。又,本実施例のように酵素固定化膜
(本体)と計測用電極との曲に選択透過膜を介在させた
場合であっても,十分な応答性を維持できることも併せ
て確認できた。
本実施例のセンサ素子は,試料液中に挿入して測定を
行なうバッチシステム,又通液型のセル中に装着して試
料液を注入することにより測定を行なうフローシステ
ム,更には試料液滴下システムのいずれにも適用可能で
ある。
本発明は上記実施例に限定されるものではない。例え
ば酸素固定化用多孔質担体の断面形状については,凹凸
断面となっている限り,種々のもの(第5図〜第8図)
を採用できる。尚,第7,8図のように凹部が貫通孔とな
ったものであっても差支えない。
更に,多孔質担体への酵素の固定化法として,共有結
合法,架橋化法,包括法等種々のものを使用できること
も勿論である。又,グルコールセンサに限らず,他の糖
センサ,更にはアルコールセンサ(エタノール等の測
定),脂質センサ(コレステロール等の測定)にも本発
明のバイオセンサは適用される。又,酵素固定化膜にお
ける酵素反応によって生じる変化に応じて,電極以外の
トランスデューサ,例えば熱計測デバイスとしてのサー
ミスタ等を使用するバイオセンサにも本発明を適用でき
ることは自明であろう。
[効果] 従来の酵素固定化膜は、表面が平滑な、多孔質無機担
体又は高分子担体に酵素を固定化していたため、その機
械的強度、試料の拡散の容易化、及び固定化酵素の多量
化の両立が難しく、酵素固定化膜の高感度化が困難であ
った。しかしながら、本願発明による酵素固定化膜にお
いては、凸部により酵素固定化膜自身の機械的強度を強
化し、凹部により試料の拡散を容易化、及び固定化され
る酵素を多量化することによって、極めて頑丈、かつ応
答性に優れるイオン感応体となる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の作用を説明するための一例図, 第2図は本発明に係るバイオセンサ素子の多孔質担体
(酵素固定化膜)の一実施例を示す図であって,第2図
(イ)は斜視図,第2図(ロ)は断面における各寸法を
示した断面図, 第3図は上記実施例のセンサ素子を示す図であって,第
3図(イ)は酵素固定化膜(及び選択透過膜)の取付前
の状態を示した平面図,第3図(ロ)は酵素固定化膜の
取付後の状態を示した平面図,及び第3図(ハ)は同じ
く断面図, 第4図は実施例及び比較例のセンサ素子を用いた比較試
験の結果を示すグラフであって,グルコース濃度と計測
電流との関係を示したもの, 第5〜8図は本発明に係る多孔質担体(酵素固定化膜)
の他の実施例を示す図であって,第5図(イ)及び第6
図(イ)は斜視図をもって示したもの(第5図(ロ)及
び第6図(ロ)はその対応断面図),他は断面図をもっ
て示したもの, を夫々表わす。 A……バイオセンサ素子 3……酵素固定化膜、3a……凸部(厚膜部) 3b……凹部(薄膜部)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 青木 秀保 愛知県名古屋市瑞穂区高辻町14番18号 日本特殊陶業株式会社内 (72)発明者 大蔵 常利 愛知県名古屋市瑞穂区高辻町14番18号 日本特殊陶業株式会社内 (72)発明者 黒川 朱 愛知県名古屋市瑞穂区高辻町14番18号 日本特殊陶業株式会社内 (72)発明者 安藤 汀 愛知県名古屋市瑞穂区高辻町14番18号 日本特殊陶業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭54−102193(JP,A) 特開 昭57−122797(JP,A) 特開 昭61−145448(JP,A) 実開 昭59−21756(JP,U)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】微細な気孔を多数備え酵素が担持される多
    孔質担体、を有する酵素固定化膜であって、 前記多孔質担体の表面の少なくとも一部には、 前記微細な気孔を多数備え、前記多孔質担体の膜厚方向
    に高くされた、互いに連続する厚膜部と、 前記微細な気孔を多数備え、前記多孔質担体の膜厚方向
    に低くされた、互いに独立の複数の薄膜部と、が形成さ
    れ、 前記厚膜部によって前記複数の薄膜部が個々に包囲され
    て互いに独立の薄膜部とされ、 前記厚膜部と前記薄膜部とによって前記多孔質担体表面
    の凹凸構造が形成されたことを特徴とする酵素固定化
    膜。
  2. 【請求項2】前記厚膜部の前記膜厚方向の厚みは、前記
    薄膜部のそれの4倍以上であることを特徴とする請求項
    1記載の酵素固定化膜。
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