JP2598651B2 - 核酸及び核酸関連物質と蛋白質との分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は核酸及び核酸関連物質と蛋白質との改善され
た分離方法に関するものである。

〔従来の技術〕

細胞抽出液中には種々の有用タンパク質が含まれてい
る。最近バイオテクノロジーの発展に伴い、細胞の抽出
液や破砕液から、有用な蛋白質やアミノ酸などを抽出し
て利用する技術が求められている。また、遺伝子組換え
技術など応用分野においても、例えば大腸菌などの菌体
から核酸を分離する場合などがあり、核酸や核酸関連物
質と、蛋白質との分離技術の高度化が求められている。

一般に、核酸や核酸関連物質と、蛋白質との分離方法
としてはイオン交換による方法が多く用いられている。
例えば特開昭54−15488号で開示されているように、セ
ルロースが疎水性重合体に埋められ、そしてセルロース
の比較的大きな部分が、装入される巨大分子を自由に吸
着する凝集した繊維状イオン交換セルロース複合体を用
いる方法、また、特開昭57−57197号で開示されている
ようにＤ−アラビノースの水溶液をモリブデン酸イオン
の存在下加熱エピメリ化してＤ−リボースを含有するプ
ントース混合水溶液を得る工程と、このペントース混合
水溶液を２価又は３価の金属型陽イオン交換体のカラム
に通液してＤ−リボースを分画分離する工程からなる方
法などがある。

しかし、用途の拡大に伴い、より純度の高い製品、経
済性の高い分離技術が求められるようになってきた。

従来のイオン交換体を、核酸や核酸関連物質と、蛋白
質との分離に用いた場合には、その選択性、及び結合容
量（吸着容量）が十分ではない場合があり、また、イオ
ン交換体に吸着した物質を高収率で脱離させて回収する
ことができない場合があるので、対策が求められてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明が上記事情に鑑みてなされたものであって、核
酸、及び核酸関連物質と、蛋白質とを簡単な操作によっ
て、改善された高い選択性を保ちながら分離することが
でき、しかも結合容量が十分であり、また分離剤に吸着
した物質を高収率で脱離させて回収することができる、
改善された、核酸及び核酸関連物質と蛋白質との分離方
法を提供することを目的とする。

〔問題を解決するための手段〕

即ち本発明は、架橋したカチオン化ヒドロキシアルキ
ルセルロースを用いて核酸及び核酸関連物質と、蛋白質
とを分離し、架橋したカチオン化ヒドロキシアルキルセ
ルロースに吸着した物質を、塩を用いて脱離することを
特徴とする、核酸及び核酸関連物質と、蛋白質との分離
方法を提供する。

本発明において分離する対象となる核酸とは、リン
酸、ペントース、および塩基からなるポリヌクレオチド
である。ペントレースとしてリボースか、またはデオキ
シリボースの一方だけを含み、前者をリボ核酸（RN
A）、後者をデオキシリボ核酸（DNA）と呼ぶ。核酸は構
造的にも機能的にもDNAとRNAに２大別される。いずれも
４種の主要塩基の組成で特徴づけられ、アデニン、グア
ニンおよびシトシンはDN,RNAに共通な塩基成分で、他に
DNAはチミン、RNAはウラシルを含んでいる。高等細胞内
でDNAは細胞核の染色体に局材し、遺伝子本体となり、R
NAは細胞全体に分布して見出され、遺伝子の形質発現で
ある蛋白質の生合成の働き手となっている。

本発明において分離する対象となる核酸関連物質と
は、核酸の構成成分であるヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、及びその誘導体のことであり、調味料や医薬として
重要な位置を占めている。これらのものは、発酵法や合
成法で工業生産されているが、例えば５′−イノシン
酸、５′−グアニル酸が調味料として、イノシン、AT
P、CDP−コリン、FAD、NAD、coenzymeAなどが医薬とし
て広く用いられている。核酸誘導体の中には細胞のDNA
合成に影響を与えるものがあり、特に変異誘起作用を持
つものは、安全性の点から、不純物として除去する必要
のあるものがある。

本発明において核酸及び核酸関連物質から分離される
蛋白質とは、生体細胞の細胞質ならびに細胞核の主要成
分をしめる高分子の含窒素有機化合物の一群の総称であ
り、通常20種あまりのＬ−α−アミノ酸から成るもので
ある。タンパク質の適当な分類法はまだないが慣用的に
次のように取り扱われている。（１）アルブミン、グロ
ブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、プロタミ
ン、硬タンパク質などの加水分解でα−アミノ酸だけを
生ずる単純蛋白質。（２）核タンパク質、糖タンパク
質、色素タンパク質、リンタンパク質等の単純蛋白質と
他の有機原子団との結合物である複合蛋白質。（３）ゼ
ラチン、プロテオース、ペプトンなどの天然タンパク質
の軽い処理で誘導生成された非天然蛋白質である誘導蛋
白質。本発明における蛋白質とは上記のような通常蛋白
質と呼ばれる全てのものを含む。

本発明において使用する、架橋したカチオン性ヒドロ
キシアルキルセルロースは、ヒドロキシアルキルロース
をカチオン化して架橋したものである。カチオン化反
応、及び架橋反応の順序はどちらでもよく、また同時で
もよい。

本発明に用いるヒドロキシアルキルセルロースの例と
してはヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルセルロース、ヒドロキシブチルセルロースを挙げるこ
とができる。

本発明に用いる架橋されたカチオン性ヒドロキシアル
キルセルロースの製造法についは、特に限定はなく、例
えば特願昭61−217672号に示されたカチオン化ヒドロキ
シアルキルセルロースの製造法において、カチオン化剤
の添加時に架橋剤を加えて反応させれば反応性・経済性
の点で有利である。また特開昭56−62801で開示される
ように、セルロースエーテルを水と可溶性有機溶媒とか
らなる混合溶媒中で、グリシジルトリアルキルアンモニ
ウムハライドと反応せしめて、得られるカチオン性セル
ロースエーテルを、架橋剤で架橋させて用いてもよい。

架橋されたカチオン性ヒドロキシアルキルセルロース
の製造に用いられるアルキレンオキシドとしては、エチ
レンオキシド、プロピレンオキシド並びに各種ブテンオ
キシドが挙げられる。

このアルキレンアキシドの添加量を変えることによ
り、種々の置換度を持ったヒドロキシアルキルセルロー
スを得ることができる。

こうして得られるカチオン性ヒドロキシアルキルセル
ロースの中では架橋されたカチオン性ヒドロキシエチル
セルロースが最も好ましく、取扱いが簡単で、最も高い
分離効果が得られる。また、架橋されたカチオン性ヒド
ロキシアルキルセルロースの製造に用いるカチオン化剤
としては、グリシジルトリアルキルアンモニウムハライ
ドあるいはそのハロヒドリン型のものが使用できる。例
えばグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド、グリ
シジルトリエチルアンモニウムクロリド、グリシジルト
リメチルアンモニウムブロミド、３−クロロ−２−ヒド
ロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドなどで
ある。

また、カチオン性ヒドロキシアルキルセルロースの架
橋剤としてはエピクロルヒドリン、1,3−ジクロル−２
−プロパノール、1,4−ビス−（2,3−エポキシプロポキ
シ）−ブタンなどが挙げられる。

また、架橋剤の使用量は一般にグルコースのモル数に
対して１％から20％程度のモル数が望ましい。架橋剤の
使用量が、この範囲外の場合は分離する性能や、分離体
の安定性が十分ではない。

本発明に用いる塩は特に限定がなく、無機塩、有機塩
のどちらでもよい。塩の例としては塩化ナトリウム、塩
化セシウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウムなど
を挙げることができる。

架橋したカチオン化ヒドロキシアルキルセルロースを
用いて、核酸及び核酸関連物質と蛋白質とを分離する方
法としては、例えば前述の架橋したカチオン化ヒドロキ
シアルキルセルロースを主成分とした充填剤をカラムに
充填し、分離する被処理液を通過させる。被処理液中の
核酸や核酸関連物質は、カラムの充填剤に吸着されてカ
ラムからほとんど流出しないが、蛋白質はカラムから流
出する。その後カラムに洗浄水を通過させてカラムを洗
浄し、カラムに残留した蛋白質を完全に除去する。その
後、カラムの充填剤に吸着した核酸や核酸関連物質を塩
溶液で抽出して、充填剤に吸着した核酸を脱離させる。

〔発明の効果〕

本発明の架橋したカチオン化ヒドロキシアルキルセル
ロースを用いて核酸及び核酸関連物質と蛋白質とを分離
し、架橋したカチオン化ヒドロキシアルキルセルロース
に吸着した物質を、塩を用いて脱離することを特徴とす
る、核酸及び核酸関連物質と、蛋白質との分離方法は実
施例において明らかになるように、簡単な操作によって
高い選択性を保ちながら核酸や核酸関連物質と、蛋白質
とを分離することができ、しかも結合容量が十分であ
り、また分離剤（充填剤）に吸着した物質を高収率で脱
離させて回収することができる。

すなわち、核酸や核酸関連物質は従来のイオン交換担
体（分離剤）よりも高い効率で、本発明で使用する架橋
したカチオン化ヒドロキシアルキルセルロースを主成分
とした分離剤（充填剤）に吸着されてほとんど流出しな
いので、高純度で核酸や核酸関連物質と蛋白質を分離す
ることができる。またその後水で洗浄し、蛋白質を完全
に除去した後、塩溶液で抽出すれば従来のイオン交換体
に比べ、吸着した核酸を脱離させることが容易にでき、
核酸や核酸関連物質の脱離・回収の収率を高めることが
可能である。

（比較例１） 市販のイオン交換担体をつめたミニカラムBond Elut
SAX,Analytichem International社製シリカゲルの担体
にトリメチルアミノプロピル基を結合した樹脂を充填し
たもの）の上部より0.15M NaCl 13mlを流して洗浄した
後、仔牛の胸線核酸0.5mgと卵白アルブミン0.5mgを0.15
M NaCl、10ccに溶解した液を3ml流して、その流出液を
回収した。この流出液中にはアルブミンの全量と共に核
酸の５％が流出しており、タンパクと核酸の分離が不十
分であった。

次にミニカラムを蒸留水3mlで洗浄した後、2Mの酢酸
アンモニウム溶液3mlを流してその流出液を回収した。
この流出液中には最初に加えた核酸の20％しか含まれて
おらず、核酸の脱離による回収の収率が低い。

（実施例１） カチオン化剤としてグリシジルトリメチルアンモニウ
ムクロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロ
ース（カチオン化剤の置換度1.1、ヒドロキシエチル基
の置換度1.7）に架橋剤である1,3−ジクロル−２−プロ
パノールをグルコースのモル数に対して２％加えて反応
させ、架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース
0.1gをプラスチック製のミニカラムに充填し、上部より
0.15M、NaCl、3mlを流して洗浄した後、仔牛の胸線核酸
0.5mgと卵白アルブミン0.5mgを0.15M、NaCl、10ccに溶
解した液を3ml流して、その流出液を回収した。この流
出液中にはアルブミンの全量が含まれているが核酸は全
く流出しなかった。

次にミニカラムを蒸留水3mlで洗浄した後、2Mの酢酸
アンモニウム溶液3mlを流してその流出液を回収した。
この流出液中には最初に加えた核酸の70％が含まれてお
り、核酸の回収の収率が高い。

（実施例２） カチオン化剤として３−クロロ−２−ヒドロキシプロ
ピルトリメチルアンモニウムブロミドを用いたカチオン
化ヒドロキシエチルセルロース（カチオン化剤の置換度
0.6、ヒドロキシエチル基の置換度1.7）に架橋剤である
1.3−ジクロル−２−プロパノールをグルコースのモル
数に対して２％加えて反応させ架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース
0.1gをプラスチック製のミニカラムに充填し、上部より
0.15M NaCl、3mlを流して洗浄した後、仔牛の胸線核酸
0.5mgと卵白アルブミン0.5mgを0.15M NaCl、10ccに溶解
した液を3ml流して、その流出液を回収した。この流出
液中にはアルブミンの全量が含まれているが核酸は全く
流出しなかった。

次にミニカラムを蒸留水3mlで洗浄した後、2Mの核酸
アンモニウム溶液3mlを流してその流出液を回収した。
この流出液中には最初に加えた核酸の65％が含まれてお
り、核酸の回収の収率が高い。

（実施例３） カチオン化剤として３−クロロ−２−ヒドロキシプロ
ピルトリメチルアンモニウムブロミドを用いたカチオン
化ヒドロキシエチルセルロース（カチオン化剤の置換度
0.6、ヒドロキシエチル基の置換度1.7）に架橋剤である
1,3−ジクロル−２−プロパノールをグルコースのモル
数に対して２％加えて反応させ架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース
0.1gをプラスチック製のミニカラムに充填し、上部より
0.15M NaCl、3mlを流して洗浄した後、仔牛の胸線核酸
0.5mgと卵白アルブミン0.5mgを0.15M NaCl、10ccに溶解
した液を3ml流して、その流出液を回収した。この流出
液中にはアルブミンの全量が含まれているが核酸は全く
流出しなかった。

次にミニカラムを蒸留水3mlで洗浄した後、2Mの塩化
セシウム溶液3mlを流してその流出液を回収した。この
流出液中には最初に加えた核酸の55％が含まれており、
核酸の回収の収率が高い。

（実施例４） カチオン化剤として３−クロロ−２−ヒドロキシプロ
ピルトリメチルアンモニエムブロミドを用いたカチオン
化ヒドロキシエチルセルロース（カチオン化剤の置換度
0.6、ヒドロキシエチル基の置換度1.7）に架橋剤である
1,3−ジクロル−２−プロパノールをグルコースのモル
数に対して２％加えて反応させ架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース
0.1gをプラスチック製のミニカラムに充填、上部より0.
15M NaCl、3mlを流して洗浄した後、仔牛の胸線核酸0.5
mgと卵白アルブミン0.5mgを0.15 NaCl、10ccに溶解した
液を3ml流して、その流出液を回収した。この流出液中
にはアルブミンの全量が含まれているが核酸は全く流出
しなかった。

次にミニカラムを蒸留水3mlで洗浄した後、3Mの酢酸
アンモニウム溶液3mlを流してその流出液を回収した。
この流出液中には最初に加えた核酸の80％が含まれてお
り、核酸の回収の収率が高い。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】架橋したカチオン化ヒドロキシアルキルセ
   ルロースと、塩と、を用いることを特徴とする、核酸及
   び核酸関連物質と、蛋白質との分離方法。