JP2580533B2 - 遺伝子突然変異検出用トランスジェニックマウス - Google Patents
遺伝子突然変異検出用トランスジェニックマウスInfo
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子突然変異の検出
に有用な新しいトランスジェニックマウスに関するもの
である。
に有用な新しいトランスジェニックマウスに関するもの
である。
【０００２】
【技術的背景】近年 産業界で使用される化学物質の種
類は増加の一途をたどり、わが国の産業界において利用
されている化学物質は５０，０００種を越えると言われ
ている。ところで、化学物質のヒト遺伝子ＤＮＡに対す
る毒作用を予知することを目的とした試験法として変異
原性試験があるがこの試験については、バクテリアから
マウスに至るまでさまざまな生物種を用いる試験系が標
準化され、労働安全衛生法、薬事法、化学物質審査法に
おいてその実施が義務付けられている。
類は増加の一途をたどり、わが国の産業界において利用
されている化学物質は５０，０００種を越えると言われ
ている。ところで、化学物質のヒト遺伝子ＤＮＡに対す
る毒作用を予知することを目的とした試験法として変異
原性試験があるがこの試験については、バクテリアから
マウスに至るまでさまざまな生物種を用いる試験系が標
準化され、労働安全衛生法、薬事法、化学物質審査法に
おいてその実施が義務付けられている。
【０００３】この変異原性試験を大別すると染色体の
異常を検出する染色体異常試験と点突然変異を検出す
る遺伝子突然変異試験とに分けることができる。染色体
異常試験は細胞遺伝学的手法を用いるものであり、この
方法により、哺乳類培養細胞はもとより実験動物やヒト
の染色体異常をも検出することが可能であり、マウスを
用いる染色体異常試験や小核試験は変異原性試験の標準
的な試験法として各国のガイドラインで推奨されてい
る。これに対し遺伝子突然変異試験はエームステスト
などの微生物試験系や哺乳類細胞を用いる培養細胞系
は盛んに用いられているが、動物個体を用いる試験とし
てはマウス・スポットテストやマウス特定座位試験があ
るのみで、かねてからより簡便、迅速な個体レベルの遺
伝子突然変異検出系の開発・普及が望まれている。
異常を検出する染色体異常試験と点突然変異を検出す
る遺伝子突然変異試験とに分けることができる。染色体
異常試験は細胞遺伝学的手法を用いるものであり、この
方法により、哺乳類培養細胞はもとより実験動物やヒト
の染色体異常をも検出することが可能であり、マウスを
用いる染色体異常試験や小核試験は変異原性試験の標準
的な試験法として各国のガイドラインで推奨されてい
る。これに対し遺伝子突然変異試験はエームステスト
などの微生物試験系や哺乳類細胞を用いる培養細胞系
は盛んに用いられているが、動物個体を用いる試験とし
てはマウス・スポットテストやマウス特定座位試験があ
るのみで、かねてからより簡便、迅速な個体レベルの遺
伝子突然変異検出系の開発・普及が望まれている。
【０００４】外来遺伝子ＤＮＡをマウス授精卵に注入し
個体にまで発生させる発生工学的手法は、導入遺伝子の
個体レベルにおける機能を研究するために開発された技
術であるが、動物個体を用いて遺伝子突然変異を検出す
る系を開発する際にも有用なものである。現在、大腸菌
のｌａｃＺ，ｌａｃＩ遺伝子をマーカーとした遺伝子突
然変異検出用トランスジェニックマウスが開発され市販
されている。ｌａｃＺ遺伝子を組み込んだマウスはＭｕ
ｔａ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＨａｚｌｅｔｏｎＷａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ社より販売され、ｌａｃＩ遺伝子を組み込ん
だマウスはＢｉｇ Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社より市販されている。
個体にまで発生させる発生工学的手法は、導入遺伝子の
個体レベルにおける機能を研究するために開発された技
術であるが、動物個体を用いて遺伝子突然変異を検出す
る系を開発する際にも有用なものである。現在、大腸菌
のｌａｃＺ，ｌａｃＩ遺伝子をマーカーとした遺伝子突
然変異検出用トランスジェニックマウスが開発され市販
されている。ｌａｃＺ遺伝子を組み込んだマウスはＭｕ
ｔａ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＨａｚｌｅｔｏｎＷａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ社より販売され、ｌａｃＩ遺伝子を組み込ん
だマウスはＢｉｇ Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社より市販されている。
【０００５】これらの試験系は、同一個体から生殖細胞
を含む多くの臓器で遺伝子突然変異を検出できる優れた
特徴を持っているが、一方でプラークの色で突然変異
体を検出するため変異体を検出するのに要する労力、時
間が少なくない、試験の費用がかさむ、マーカー遺
伝子のサイズが大きい（ｌａｃＺは約３ｋｂ、ｌａｃＩ
は約１ｋｂ）ため、変異部位の同定に手間取る、などの
欠点が指摘されていた。
を含む多くの臓器で遺伝子突然変異を検出できる優れた
特徴を持っているが、一方でプラークの色で突然変異
体を検出するため変異体を検出するのに要する労力、時
間が少なくない、試験の費用がかさむ、マーカー遺
伝子のサイズが大きい（ｌａｃＺは約３ｋｂ、ｌａｃＩ
は約１ｋｂ）ため、変異部位の同定に手間取る、などの
欠点が指摘されていた。
【０００６】本発明者らは、個体レベルで遺伝子突然変
異を検出するための、より高性能なトランスジェニック
マウス試験系の開発を目的に、種々研究を行ない、先
に、マウス授精卵に導入する遺伝子突然変異検出用シャ
トルベクターの開発に成功した（特願平５−３０３１９
２号）。すなわち、本発明者らは、先にマウス授精卵に
導入することにより高性能なトランスジェニックマウス
を得ることのできる下記の特徴を有する新規なラムダー
ファージＤＮＡを提供した。ラムダーファージＤＮＡの
塩基配列において、その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配
列、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺
伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列およ
び薬剤耐性遺伝子配列を組みこんだ新規なラムダーファ
ージＤＮＡであって、それらの配列の順序が、ラムダー
ファージＤＮＡのしフトアームからライトアームに向っ
てまず、
異を検出するための、より高性能なトランスジェニック
マウス試験系の開発を目的に、種々研究を行ない、先
に、マウス授精卵に導入する遺伝子突然変異検出用シャ
トルベクターの開発に成功した（特願平５−３０３１９
２号）。すなわち、本発明者らは、先にマウス授精卵に
導入することにより高性能なトランスジェニックマウス
を得ることのできる下記の特徴を有する新規なラムダー
ファージＤＮＡを提供した。ラムダーファージＤＮＡの
塩基配列において、その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配
列、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺
伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列およ
び薬剤耐性遺伝子配列を組みこんだ新規なラムダーファ
ージＤＮＡであって、それらの配列の順序が、ラムダー
ファージＤＮＡのしフトアームからライトアームに向っ
てまず、
【０００７】（１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次
に、（２） ｌｏｘＰ配列、次に、（３） 大腸菌ｇｐ
ｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列
および薬剤耐性遺伝子配列の３つの配列を任意の順序の
組み合わせにより位置させた配列、次に、（４） 前記
のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、次に、（５）
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組みこまれ
ていることを特徴とする新規なラムダーファージＤＮ
Ａ。
に、（２） ｌｏｘＰ配列、次に、（３） 大腸菌ｇｐ
ｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列
および薬剤耐性遺伝子配列の３つの配列を任意の順序の
組み合わせにより位置させた配列、次に、（４） 前記
のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、次に、（５）
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組みこまれ
ていることを特徴とする新規なラムダーファージＤＮ
Ａ。
【０００８】本発明は、上記の新規なラムグーファージ
ＤＮＡをマウス授精卵に注入し、個体に発生させ全身に
当該ＤＮＡを持つマウス（＝トランスジェニックマウ
ス）を提供するものである。
ＤＮＡをマウス授精卵に注入し、個体に発生させ全身に
当該ＤＮＡを持つマウス（＝トランスジェニックマウ
ス）を提供するものである。
【０００９】
【発明の開示】本発明は、化学物質の遺伝子に対する変
異原性を迅速・簡便に検出しうる下記の新規なトランス
ジェニックマウスを提供するものである。体細胞と生殖
細胞に下記のラムダファージＤＮＡを有することを特徴
とするトランスジェニックマウス。ラムダーファージＤ
ＮＡの塩基配列において、その塩基配列中に２つのｌｏ
ｘＰ配列、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇ
ｐｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配
列および薬剤耐性遺伝子配列を組みこんだ新規なラムダ
ーファージＤＮＡであって、それらの配列の順序が、ラ
ムダーファージＤＮＡのレフトアームからライトアーム
に向ってまず、（１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次
に、（２） ｌｏｘＰ配列、次に、（３） 大腸菌ｇｐ
ｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列
および薬剤耐性遺伝子配列の３つの配列を任意の順序の
組み合わせにより位置させた配列、次に、（４） 前記
のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、次に、（５）
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組みこまれ
ていることを特徴とする新規なラムダーファージＤＮ
Ａ。
異原性を迅速・簡便に検出しうる下記の新規なトランス
ジェニックマウスを提供するものである。体細胞と生殖
細胞に下記のラムダファージＤＮＡを有することを特徴
とするトランスジェニックマウス。ラムダーファージＤ
ＮＡの塩基配列において、その塩基配列中に２つのｌｏ
ｘＰ配列、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇ
ｐｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配
列および薬剤耐性遺伝子配列を組みこんだ新規なラムダ
ーファージＤＮＡであって、それらの配列の順序が、ラ
ムダーファージＤＮＡのレフトアームからライトアーム
に向ってまず、（１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次
に、（２） ｌｏｘＰ配列、次に、（３） 大腸菌ｇｐ
ｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列
および薬剤耐性遺伝子配列の３つの配列を任意の順序の
組み合わせにより位置させた配列、次に、（４） 前記
のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、次に、（５）
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組みこまれ
ていることを特徴とする新規なラムダーファージＤＮ
Ａ。
【００１０】このトランスジェニックマウスを用いて、
医薬品、食品添加物など種々の化学物質の遺伝子に対す
る突然変異誘発性を調べることにより種々の化学物質の
安全性に関する試験法を確立することができるので本発
明のトランスジェニックマウスは極めて有用なものであ
る。
医薬品、食品添加物など種々の化学物質の遺伝子に対す
る突然変異誘発性を調べることにより種々の化学物質の
安全性に関する試験法を確立することができるので本発
明のトランスジェニックマウスは極めて有用なものであ
る。
【００１１】この試験法の手順の概要は以下のとおりで
ある。 本発明に係る前記のラムダーファージＤＮＡを全身
に持つトランスジェニックマウスに試験化学物質を投与
する。 このトランスジェニックマウスの臓器あるいは血液
からラムダーファージＤＮＡを抽出し、染色体上のｇｐ
ｔ遺伝子配列を欠損した大腸菌の菌体内あるいは菌体外
でｇｐｔ遺伝子を含むＤＮＡを環状プラスミドとする。 ｇｐｔ遺伝子を上記の環状プラスミド上に持つ大腸
菌を６−チオグアニンと抗生物質（アンピシリンあるい
はクロラムフェニコール）を含む培地上に塗布し、２−
３日間、３７℃で培養し、培地上に生じたコロニー数を
計測する。また、ｇｐｔ遺伝子をプラスミド上に持つ大
腸菌を抗生物質のみを含む培地上に塗布し、同様に培養
し、培地上に生じたコロニー数を計測する。
ある。 本発明に係る前記のラムダーファージＤＮＡを全身
に持つトランスジェニックマウスに試験化学物質を投与
する。 このトランスジェニックマウスの臓器あるいは血液
からラムダーファージＤＮＡを抽出し、染色体上のｇｐ
ｔ遺伝子配列を欠損した大腸菌の菌体内あるいは菌体外
でｇｐｔ遺伝子を含むＤＮＡを環状プラスミドとする。 ｇｐｔ遺伝子を上記の環状プラスミド上に持つ大腸
菌を６−チオグアニンと抗生物質（アンピシリンあるい
はクロラムフェニコール）を含む培地上に塗布し、２−
３日間、３７℃で培養し、培地上に生じたコロニー数を
計測する。また、ｇｐｔ遺伝子をプラスミド上に持つ大
腸菌を抗生物質のみを含む培地上に塗布し、同様に培養
し、培地上に生じたコロニー数を計測する。
【００１２】上記の大腸菌は染色体上のｇｐｔ遺伝子配
列が欠損しているため、大腸菌のグアニシ・フォスフォ
リボシル転移酵素（これはｇｐｔ遺伝子の産物である）
活性はプラスミド上のｇｐｔ遺伝子のみに依存する。グ
アニン・フォスフォリボシル転移酵素は６−チオグアニ
ンを代謝しＤＮＡに取り込まれるようにするため、グア
ニン・フォスフォリボシル転移酵素活性の高い大腸菌は
６−チオグアニンを含む培地上で生育することができな
い。突然変異を起こしていない野生型のｇｐｔ遺伝子を
プラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォスフォリ
ボシル転移酵素活性が高いため、培地上にコロニーを形
成することができず、突然変異を起こしたｇｐｔ遺伝子
配列をプラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォス
フォリボシル転移酵素活性が低いため、６−チオグアニ
ンを効率よく代謝できず、培地上にコロニーを形成す
る。
列が欠損しているため、大腸菌のグアニシ・フォスフォ
リボシル転移酵素（これはｇｐｔ遺伝子の産物である）
活性はプラスミド上のｇｐｔ遺伝子のみに依存する。グ
アニン・フォスフォリボシル転移酵素は６−チオグアニ
ンを代謝しＤＮＡに取り込まれるようにするため、グア
ニン・フォスフォリボシル転移酵素活性の高い大腸菌は
６−チオグアニンを含む培地上で生育することができな
い。突然変異を起こしていない野生型のｇｐｔ遺伝子を
プラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォスフォリ
ボシル転移酵素活性が高いため、培地上にコロニーを形
成することができず、突然変異を起こしたｇｐｔ遺伝子
配列をプラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォス
フォリボシル転移酵素活性が低いため、６−チオグアニ
ンを効率よく代謝できず、培地上にコロニーを形成す
る。
【００１３】したがって、化学物質によつマウス体内で
ｇｐｔ遺伝子配列に沢山突然変異が起これば、６−チオ
グアニンと抗生物質を含む培地上に沢山のコロニーが形
成される。換言すれば、化学物質がマウス体内にあるｇ
ｐｔ遺伝子に突然変異を起こした程度は、培地上に生じ
たコロニー数を数えることにより推測することができ
る。また、コロニーからプラスミドを単離し、プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子の塩基配列を決定することにより、
突然変異の種類および場所を正確に決定することができ
る。
ｇｐｔ遺伝子配列に沢山突然変異が起これば、６−チオ
グアニンと抗生物質を含む培地上に沢山のコロニーが形
成される。換言すれば、化学物質がマウス体内にあるｇ
ｐｔ遺伝子に突然変異を起こした程度は、培地上に生じ
たコロニー数を数えることにより推測することができ
る。また、コロニーからプラスミドを単離し、プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子の塩基配列を決定することにより、
突然変異の種類および場所を正確に決定することができ
る。
【００１４】培地中に加える抗生物質は、プラスミドを
持たない大腸菌が培地上で増殖することを防いでいる。
プラスミドを持たない大腸菌は、たとえ６−チオグアニ
ンが含まれていなくても、抗生物質が存在すると培地上
で、コロニーを形成することができない。プラスミド上
に薬剤耐性遺伝子を持つ大腸菌だけが、抗生物質を含む
培地上にコロニーを作ることができる。
持たない大腸菌が培地上で増殖することを防いでいる。
プラスミドを持たない大腸菌は、たとえ６−チオグアニ
ンが含まれていなくても、抗生物質が存在すると培地上
で、コロニーを形成することができない。プラスミド上
に薬剤耐性遺伝子を持つ大腸菌だけが、抗生物質を含む
培地上にコロニーを作ることができる。
【００１５】突然変異の頻度は抗生物質と６−チオグ
アニンを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数を抗
生物質のみを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数で
除して求めることができる。この突然変異頻度を表わす
数値が高いほど、試験に用いた化学物質の突然変異を起
こす力が強いと言うことができる。突然変異を起こす力
の強い物質は、ヒトに対し潜在的な危険性を持つ物質で
あるので、上記の試験方法はヒトに対する化学物質の安
全性を調べる上で重要な役割を果たすものである。
アニンを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数を抗
生物質のみを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数で
除して求めることができる。この突然変異頻度を表わす
数値が高いほど、試験に用いた化学物質の突然変異を起
こす力が強いと言うことができる。突然変異を起こす力
の強い物質は、ヒトに対し潜在的な危険性を持つ物質で
あるので、上記の試験方法はヒトに対する化学物質の安
全性を調べる上で重要な役割を果たすものである。
【００１６】本発明に係る新規なラムダーファージの作
製方法は、前記の特願平５−３０３１９２号明細書中に
も記載されているが、本明細書中においても繰り返し、
以下に述べる。ラムダーファージの右腕（ライトアー
ム）、左腕（しフトアーム）およびｌｏｘＰ配列はラム
ダー・イエス・ベクターより調製した。ラムダー・イエ
ス・ベクターはスタンフォード大学医学部Ｒｏｎａｌｄ
Ｗ．Ｄａｖｉｓ博士よつ供与を受けた。ベクターから
各部品すなわち右腕、左腕およびｌｏｘＰ配列を取り出
し遺伝子突然変異検出用ベクターの作製に用いることに
ついては、Ｄａｖｉｓ博士の了承を得て行った。
製方法は、前記の特願平５−３０３１９２号明細書中に
も記載されているが、本明細書中においても繰り返し、
以下に述べる。ラムダーファージの右腕（ライトアー
ム）、左腕（しフトアーム）およびｌｏｘＰ配列はラム
ダー・イエス・ベクターより調製した。ラムダー・イエ
ス・ベクターはスタンフォード大学医学部Ｒｏｎａｌｄ
Ｗ．Ｄａｖｉｓ博士よつ供与を受けた。ベクターから
各部品すなわち右腕、左腕およびｌｏｘＰ配列を取り出
し遺伝子突然変異検出用ベクターの作製に用いることに
ついては、Ｄａｖｉｓ博士の了承を得て行った。
【００１７】１） ラムダーＥＧ１、同ＥＧ２の作製
（図１参照） ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄ ＩＩＩで切断したｐＢＲ３２
２ベクターに、ｐＳＶ２ｇｐｔプラスミドから調製した
大腸菌のｇｐｔ遺伝子を含む０．８ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３１プラスミドを作製した。 ｐＹＧ１３１プラスミドをＳａｌＩとＢａｍＨＩで切
断後、ｐＳＥ９３６プラスミドから調製したｌｏｘＰ配
列をタンデムに２コピー含む０．４ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３３プラスミドを得た。なお、上記のｐＳ
Ｅ９３６プラスミドは、ラムダ・イエス・ベクターをＮ
ｏｔＩで切断した後、環状プラスミドとしたものであ
る。 ｐＹＧ１３３プラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断
後、ＤＮＡポリメラーゼを用い末端を平滑にし、セルフ
・ライゲーションしてＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を持たない
ｐＹＧ１３５プラスミドを作製した。
（図１参照） ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄ ＩＩＩで切断したｐＢＲ３２
２ベクターに、ｐＳＶ２ｇｐｔプラスミドから調製した
大腸菌のｇｐｔ遺伝子を含む０．８ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３１プラスミドを作製した。 ｐＹＧ１３１プラスミドをＳａｌＩとＢａｍＨＩで切
断後、ｐＳＥ９３６プラスミドから調製したｌｏｘＰ配
列をタンデムに２コピー含む０．４ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３３プラスミドを得た。なお、上記のｐＳ
Ｅ９３６プラスミドは、ラムダ・イエス・ベクターをＮ
ｏｔＩで切断した後、環状プラスミドとしたものであ
る。 ｐＹＧ１３３プラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断
後、ＤＮＡポリメラーゼを用い末端を平滑にし、セルフ
・ライゲーションしてＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を持たない
ｐＹＧ１３５プラスミドを作製した。
【００１８】ｐＹＧ１３５プラスミドをＮｏｔＩで線
状にした後、ＮｏｔＩ部位をＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に変
換する合成オリゴヌクレオチド・リンカーおよびラムダ
ー・ファージの右腕、左腕とともにＴ４ ＤＮＡ ｌｉ
ｇａｓｅで処理した。 パッケージングにより、連結したＤＮＡをファージと
して回収した後、大腸菌ＬＥ３９２に感染させプラーク
を得た。 プラークからＤＮＡを調製し、調製したファージが目
的とする構造を有していることを制限酵素を用い確認し
た。
状にした後、ＮｏｔＩ部位をＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に変
換する合成オリゴヌクレオチド・リンカーおよびラムダ
ー・ファージの右腕、左腕とともにＴ４ ＤＮＡ ｌｉ
ｇａｓｅで処理した。 パッケージングにより、連結したＤＮＡをファージと
して回収した後、大腸菌ＬＥ３９２に感染させプラーク
を得た。 プラークからＤＮＡを調製し、調製したファージが目
的とする構造を有していることを制限酵素を用い確認し
た。
【００１９】２） ラムダーＥＧ３の作製（図２参照） ラムダーＥＧ３は上述のラムダーＥＧ１、ＥＧ２と同様
の方法で作製したが、出発材料のプラスミドとしてｐＢ
Ｒ３２２の代わりにｐＡＣＹＣ１８４を用いた。したが
ってラムダーＥＧ３ではプラスミドの複製開始点がｐＡ
ＣＹＣ１８４由来のものとなっているほか、薬剤耐性因
子がクロラムフェニコール耐性となっている。
の方法で作製したが、出発材料のプラスミドとしてｐＢ
Ｒ３２２の代わりにｐＡＣＹＣ１８４を用いた。したが
ってラムダーＥＧ３ではプラスミドの複製開始点がｐＡ
ＣＹＣ１８４由来のものとなっているほか、薬剤耐性因
子がクロラムフェニコール耐性となっている。
【００２０】３） ラムダーＥＧ５、同６、同７の作製
（図３参照） ラムダーＥＧ１およびＥＧ２の開発過程で作製したプラ
スミドｐＹＧ１３５をＳｃａＩで切断した後、クロラム
フェニコール耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂＤＮＡ断片
を挿入し、クロラムフェニコール耐性遺伝子の方向が異
なる２種類のプラスミドｐＹＧ１３７とｐＹＧ１３８を
作製した。これらのプラスミドをＮｏｔＩで線状にした
後、ラムダーＥＧ１およびＥＧ２を作製したのと同一の
方法でラムダー・ファージの右腕、左腕に達結し、ｐＹ
Ｇ１３７から作製したものをラムダーＥＧ５、ＥＧ６そ
してｐＹＧ１３８から作製したものをラムダーＥＧ７と
した各ラムダーＥＧの配列構造は下記のとおりである
（図４参照）。
（図３参照） ラムダーＥＧ１およびＥＧ２の開発過程で作製したプラ
スミドｐＹＧ１３５をＳｃａＩで切断した後、クロラム
フェニコール耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂＤＮＡ断片
を挿入し、クロラムフェニコール耐性遺伝子の方向が異
なる２種類のプラスミドｐＹＧ１３７とｐＹＧ１３８を
作製した。これらのプラスミドをＮｏｔＩで線状にした
後、ラムダーＥＧ１およびＥＧ２を作製したのと同一の
方法でラムダー・ファージの右腕、左腕に達結し、ｐＹ
Ｇ１３７から作製したものをラムダーＥＧ５、ＥＧ６そ
してｐＹＧ１３８から作製したものをラムダーＥＧ７と
した各ラムダーＥＧの配列構造は下記のとおりである
（図４参照）。
【００２１】上記で作製したラムダーＥＧ１、２、３、
５、６、７はラムダー・ファージを基本としたシャトル
型ベクターで、ファージの右腕と左腕の間に、両端にｌ
ｏｘＰ配列を同方向に持つｐＢＲ３２２系（ＥＧ３の場
合にはｐＡＣＹＣ１８４系）のプラスミドＤＮＡが線状
になって挿入されている。このプラスミドＤＮＡ領域に
はクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＥＧ１、ＥＧ２で
はアンピシリン耐性遺伝子）、プラスミドの複製開始点
（ｏｒｉ）および遺伝子突然変異検出のマーカーとなる
大腸菌のグアニン・フォスフォリボシル転移酵素遺伝子
（ｇｐｔ）が含まれている。またプラスミド領域とファ
ージの右腕および左腕の連結部位には、それぞれ制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの認識部位が作られている。各ラム
ダーＥＧの回収方法は下記のとおりである（図５参
照）。
５、６、７はラムダー・ファージを基本としたシャトル
型ベクターで、ファージの右腕と左腕の間に、両端にｌ
ｏｘＰ配列を同方向に持つｐＢＲ３２２系（ＥＧ３の場
合にはｐＡＣＹＣ１８４系）のプラスミドＤＮＡが線状
になって挿入されている。このプラスミドＤＮＡ領域に
はクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＥＧ１、ＥＧ２で
はアンピシリン耐性遺伝子）、プラスミドの複製開始点
（ｏｒｉ）および遺伝子突然変異検出のマーカーとなる
大腸菌のグアニン・フォスフォリボシル転移酵素遺伝子
（ｇｐｔ）が含まれている。またプラスミド領域とファ
ージの右腕および左腕の連結部位には、それぞれ制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの認識部位が作られている。各ラム
ダーＥＧの回収方法は下記のとおりである（図５参
照）。
【００２２】上述の各ラムダーＥＧは遺伝子突然変異検
出用トランスジェニックマウスの作製に極めて有用であ
る。上述の新規なラムダーファージＤＮＡをマウス授精
卵に導入して得られたトランスジェニックマウスを試験
化合物で処理したマウスの臓器からＤＮＡを単離し、そ
の中に含まれる目的遺伝子の回収を行う。トランスジェ
ニックマウスからの遺伝子の回収方法は例えば以下の３
とおりの方法を行うことができる。
出用トランスジェニックマウスの作製に極めて有用であ
る。上述の新規なラムダーファージＤＮＡをマウス授精
卵に導入して得られたトランスジェニックマウスを試験
化合物で処理したマウスの臓器からＤＮＡを単離し、そ
の中に含まれる目的遺伝子の回収を行う。トランスジェ
ニックマウスからの遺伝子の回収方法は例えば以下の３
とおりの方法を行うことができる。
【００２３】１） 単離したＤＮＡをパッケージング・
エクストラクトで処理しファージとした後、Ｃｒｅ蛋白
質を発現している大隅菌に感染させ大腸菌の菌体内でフ
ァージをプラスミドに変換する。 ２） 単離したＤＮＡをＣｒｅ蛋白質と試験管内で反応
させ、プラスミドに変換し、次いで電気的に大腸菌に導
入する。 ３） 単離したＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで処理し、次
いで、Ｔ４ ＤＮＡＩｉｇａｓｅによりプラスミドに変
換し、電気的に大腸菌に導入する。
エクストラクトで処理しファージとした後、Ｃｒｅ蛋白
質を発現している大隅菌に感染させ大腸菌の菌体内でフ
ァージをプラスミドに変換する。 ２） 単離したＤＮＡをＣｒｅ蛋白質と試験管内で反応
させ、プラスミドに変換し、次いで電気的に大腸菌に導
入する。 ３） 単離したＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで処理し、次
いで、Ｔ４ ＤＮＡＩｉｇａｓｅによりプラスミドに変
換し、電気的に大腸菌に導入する。
【００２４】次に変異体の検出方法について述べる（図
５参照）。突然変異の検出は、トランスジェニックマウ
スから回収したプラスミドを上記した３方法のいずれか
で大腸菌に導入し、６−チオグアニンを含む培地上に塗
布し、６−チオグアニン耐性となった変異株（プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子に変異を持つ株）を選抜することに
より行う。生存菌数の測定は、大腸菌を希釈してから６
−チオグアニンを含まない培地上に塗布し、生存菌数当
たりの突然変異体数を計測する。更に突然変異体につい
てはそのプラスミドを単離し、ｇｐｔ遺伝子の塩基配列
決定を行い、突然変異部位の同定を行う。
５参照）。突然変異の検出は、トランスジェニックマウ
スから回収したプラスミドを上記した３方法のいずれか
で大腸菌に導入し、６−チオグアニンを含む培地上に塗
布し、６−チオグアニン耐性となった変異株（プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子に変異を持つ株）を選抜することに
より行う。生存菌数の測定は、大腸菌を希釈してから６
−チオグアニンを含まない培地上に塗布し、生存菌数当
たりの突然変異体数を計測する。更に突然変異体につい
てはそのプラスミドを単離し、ｇｐｔ遺伝子の塩基配列
決定を行い、突然変異部位の同定を行う。
【００２５】本発明の遺伝子突然変異検出用マウスを使
用することにより、以下の利点を備えた試験系が得られ
る。第１の利点は、大腸菌のｇｐｔ遺伝子を突然変異検
出のマーカー遺伝子としているため、６−チオグアニン
を用いるポジティブ・セレクションが可能であるという
点である。突然変異は希な現象であり、自然突然変異頻
度は１０−５−１０−６である。ｌａｃＩやｌａｃＺを
用いるトランスジェニックマウス試験系では、１０万個
以上の多数のプラークの中から色調の変化した変異体を
検索する（カラー・セレクション）ため、変異体の検出
には多数の細菌培養用シャーレと高価な色素（Ｘ−Ｇａ
ｌ）が必要である。
用することにより、以下の利点を備えた試験系が得られ
る。第１の利点は、大腸菌のｇｐｔ遺伝子を突然変異検
出のマーカー遺伝子としているため、６−チオグアニン
を用いるポジティブ・セレクションが可能であるという
点である。突然変異は希な現象であり、自然突然変異頻
度は１０−５−１０−６である。ｌａｃＩやｌａｃＺを
用いるトランスジェニックマウス試験系では、１０万個
以上の多数のプラークの中から色調の変化した変異体を
検索する（カラー・セレクション）ため、変異体の検出
には多数の細菌培養用シャーレと高価な色素（Ｘ−Ｇａ
ｌ）が必要である。
【００２６】これに対し、６−チオグアニンを用いるポ
ジティブ・セレクション法では、ｇｐｔ遺伝子に変異を
おこした大腸菌のみが培地上でコロニーを形成するた
め、１０万個以上の多数の大腸菌を１枚のシャーしに蒔
いて変異体を検索することが可能である。したがって、
ポジティブ・セレクション法を用いれば迅速かつ簡便
に、多数の化合物について変異原性の検索を行うことが
可能となる。また６−チオグアニンは廉価な試薬であ
り、Ｘ−Ｇａｌを使うカラー・セレクション法に比べ、
変異体検出に要する費用を軽減することができる。
ジティブ・セレクション法では、ｇｐｔ遺伝子に変異を
おこした大腸菌のみが培地上でコロニーを形成するた
め、１０万個以上の多数の大腸菌を１枚のシャーしに蒔
いて変異体を検索することが可能である。したがって、
ポジティブ・セレクション法を用いれば迅速かつ簡便
に、多数の化合物について変異原性の検索を行うことが
可能となる。また６−チオグアニンは廉価な試薬であ
り、Ｘ−Ｇａｌを使うカラー・セレクション法に比べ、
変異体検出に要する費用を軽減することができる。
【００２７】第２の利点は、ファージとして回収した遺
伝子を大腸菌の菌体内で自動的にプラスミドに変換する
ことができることである。本発明に係る上記のファージ
の中央部分に配置された２つのｌｏｘＰ配列は、それぞ
れ３４塩基対の短いＤＮＡ配列で、Ｃｒｅと呼ばれる部
位特異的組換え蛋白質により認識される。２つの同方向
ｌｏｘＰ部位に挟まれたＤＮＡ領域は、Ｃｒｅ蛋白質が
存在すると直鎖ＤＮＡから環状プラスミドとして切つ出
される。したがって回収したファージをＣｒｅ蛋白質を
発現している大腸菌に感染させると、ファージはプラス
ミドに変換し、プラスミドを持った大腸菌のみがクロラ
ムフェニコールあるいはアンピシリンの入った培地上で
コロニーを形成する。このため、その後の操作、すなわ
ちプラスミドの単離および塩基配列の決定が容易であ
る。
伝子を大腸菌の菌体内で自動的にプラスミドに変換する
ことができることである。本発明に係る上記のファージ
の中央部分に配置された２つのｌｏｘＰ配列は、それぞ
れ３４塩基対の短いＤＮＡ配列で、Ｃｒｅと呼ばれる部
位特異的組換え蛋白質により認識される。２つの同方向
ｌｏｘＰ部位に挟まれたＤＮＡ領域は、Ｃｒｅ蛋白質が
存在すると直鎖ＤＮＡから環状プラスミドとして切つ出
される。したがって回収したファージをＣｒｅ蛋白質を
発現している大腸菌に感染させると、ファージはプラス
ミドに変換し、プラスミドを持った大腸菌のみがクロラ
ムフェニコールあるいはアンピシリンの入った培地上で
コロニーを形成する。このため、その後の操作、すなわ
ちプラスミドの単離および塩基配列の決定が容易であ
る。
【００２８】第３の利点は、突然変異検出のマーカーと
なる遺伝子（ｇｐｔ）のサイズが小さく（４５６ ｂ
ｐ）塩基配列の決定が容易であることである。ｇｐｔの
大きさはｌａｃＺ遺伝子の１／６、ｌａｃＩ遺伝子の約
半分であり、したがって、塩基配列決定により多数の変
異体について突然変異部位を同定することが可能であ
る。
なる遺伝子（ｇｐｔ）のサイズが小さく（４５６ ｂ
ｐ）塩基配列の決定が容易であることである。ｇｐｔの
大きさはｌａｃＺ遺伝子の１／６、ｌａｃＩ遺伝子の約
半分であり、したがって、塩基配列決定により多数の変
異体について突然変異部位を同定することが可能であ
る。
【００２９】第４の利点は、遺伝子を回収するのに前述
した３つの方法をとることが可能であることである。し
たがって、ファージのパッケージングが何らかの理由で
達成し得ない場合には、第２、第３の方法によって目的
遺伝子を回収することができる。これはトランスジェニ
ックマウスから回収した貴重なＤＮＡがロスなく分析さ
れることを可能にする。
した３つの方法をとることが可能であることである。し
たがって、ファージのパッケージングが何らかの理由で
達成し得ない場合には、第２、第３の方法によって目的
遺伝子を回収することができる。これはトランスジェニ
ックマウスから回収した貴重なＤＮＡがロスなく分析さ
れることを可能にする。
【００３０】第５の利点は、培養細胞で得られた変異原
性試験の結果を個体レベルで検討する際に特に有用であ
るという点である。大腸菌のｇｐｔ遺伝子を組み込んだ
チャイニーズハムスターＡＳ５２細胞は培養細胞を用い
た遺伝子突然変異の検出系として広く用いられている。
このため、同じ遺伝子を組み込んだトランスジェニック
・マウスは培養細胞系で得られた結果を、個体レベルで
確認するのに有用となる。
性試験の結果を個体レベルで検討する際に特に有用であ
るという点である。大腸菌のｇｐｔ遺伝子を組み込んだ
チャイニーズハムスターＡＳ５２細胞は培養細胞を用い
た遺伝子突然変異の検出系として広く用いられている。
このため、同じ遺伝子を組み込んだトランスジェニック
・マウスは培養細胞系で得られた結果を、個体レベルで
確認するのに有用となる。
【００３１】本発明に係わる新規なトランスジェニック
マウスの作製方法を以下に述べる。マウスは、遺伝的に
均一にした「近交系マウス」が使用される。
マウスの作製方法を以下に述べる。マウスは、遺伝的に
均一にした「近交系マウス」が使用される。
【００３２】 ９週齢以上の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウ
スに排卵誘導剤を投与し、同系統の無処理の雄マウスと
交配後、膣栓が確認された雌マウスの卵管膨大部より授
精卵をＷｈｉｔｔｅｎ培養液（下記注１）に回収し、Ｄ
ＮＡを注入するまで５％濃度のＣＯ２イシキュベーター
内で培養した。 注１：参考文献、Ｗｈｉｔｔｅｎ，Ｗ，Ｋ，（１９７
１）Ｅｍｂｒｙｏ ｍｅｄｉｕｍ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ ｏｆ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍ
ｂｒｙｏｓ ｉｎＶｉｔｒｏ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｓｃ
ｉ．，６：１２９−１４１。
スに排卵誘導剤を投与し、同系統の無処理の雄マウスと
交配後、膣栓が確認された雌マウスの卵管膨大部より授
精卵をＷｈｉｔｔｅｎ培養液（下記注１）に回収し、Ｄ
ＮＡを注入するまで５％濃度のＣＯ２イシキュベーター
内で培養した。 注１：参考文献、Ｗｈｉｔｔｅｎ，Ｗ，Ｋ，（１９７
１）Ｅｍｂｒｙｏ ｍｅｄｉｕｍ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ ｏｆ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍ
ｂｒｙｏｓ ｉｎＶｉｔｒｏ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｓｃ
ｉ．，６：１２９−１４１。
【００３３】 修正Ｗｈｉｔｔｅｎ培養液（下記注
２）に授精卵を移し、授精卵の雄性前核に約２ｐ１（約
５００−１０００コピー）のＤＮＡ溶液を排卵推定後９
−１６時間の間にマイクロインジェクション法（下記注
３）により導入し、再度Ｗｈｉｔｔｅｎ培養液に移しＣ
Ｏ２インキュベーター内で一晩培養した。 注２：Ｓａｔｏｓｈｉ Ｔａｋｅｄａ ａｎｄ Ｙｕｔ
ａｋａ Ｔｏｙｏｄａ（１９９１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｏｆ ＳＶ ４０−ｌａｃＺ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍ
ｏｕｓｅ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍｂｒ
ｙｏ ａｆｔｅｒｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｃｒｏｉ
ｎｊｅｃｔｌｏｎ。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３０，
９０−９４。 注３：１） 授精卵へのＤＮＡ注入、発生工学実験マニ
ュアル（野村達次 監修、勝木元也 編）４１−４６ペ
ージ、講談社、１９８９年 ２） Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ
ｉｎｔｏ ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ，Ｉｎ：Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ（ｅｄ
ｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔ
ｉｎｉ ａｎｄ Ｅ．Ｌａｃｙ），ｐｐ．１５７−１８
２。Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６。
２）に授精卵を移し、授精卵の雄性前核に約２ｐ１（約
５００−１０００コピー）のＤＮＡ溶液を排卵推定後９
−１６時間の間にマイクロインジェクション法（下記注
３）により導入し、再度Ｗｈｉｔｔｅｎ培養液に移しＣ
Ｏ２インキュベーター内で一晩培養した。 注２：Ｓａｔｏｓｈｉ Ｔａｋｅｄａ ａｎｄ Ｙｕｔ
ａｋａ Ｔｏｙｏｄａ（１９９１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｏｆ ＳＶ ４０−ｌａｃＺ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍ
ｏｕｓｅ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍｂｒ
ｙｏ ａｆｔｅｒｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｃｒｏｉ
ｎｊｅｃｔｌｏｎ。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３０，
９０−９４。 注３：１） 授精卵へのＤＮＡ注入、発生工学実験マニ
ュアル（野村達次 監修、勝木元也 編）４１−４６ペ
ージ、講談社、１９８９年 ２） Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ
ｉｎｔｏ ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ，Ｉｎ：Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ（ｅｄ
ｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔ
ｉｎｉ ａｎｄ Ｅ．Ｌａｃｙ），ｐｐ．１５７−１８
２。Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６。
【００３４】 ２細胞胚に発生した卵を修正Ｗｈｉｔ
ｔｅｎ培養液に移し、精管印断した雄マウスと交配さ
せ、朝、腟栓が確認された偽妊娠雌マウスに各々の卵管
膨大部に発生した２細胞胚を８−１５個移植した。
ｔｅｎ培養液に移し、精管印断した雄マウスと交配さ
せ、朝、腟栓が確認された偽妊娠雌マウスに各々の卵管
膨大部に発生した２細胞胚を８−１５個移植した。
【００３５】 自然分娩させ、生育させた小マウスの
目から採血し、ＤＮＡを抽出した。
目から採血し、ＤＮＡを抽出した。
【００３６】 大腸菌ｇｐｔ遺伝子検出用プライマー
を用いてＰＣＲ法（下記注４）によりｇｐｔ遺伝子が導
入されている小マウスの検索を行った。ｇｐｔ遺伝子が
確認された小マウスについては更にドット・プロット法
（下記注５）により導入された遺伝子のコピー数（下記
注６）の測定を行った。 注４：ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ法）耐熱性のＤＮＡ複製酵素を用い、
遺伝子を増幅する方法であって、この方法によりトラシ
スジェニックマウスのＤＮＡのなかに、導入したラムダ
ーファージＤＮＡの存在を定性的に調べることができ
る。 注５：ドットプロット法：ＤＮＡ同士の相補性を利用
し、試料となるＤＮＡの中に探している遺伝子が存在す
るか否か、また存在するとすればどの程度存在するかを
調べる方法であり、調査対象遺伝子を放射能で標識して
から熱変性させ１本鎖にし、同じく熱変性により１本鎖
にした試料ＤＮＡとゆっくりと会合させ、試料ＤＮＡに
放射能標識が結合するか否か、また結合した場合にはそ
の放射活性を調べることにより遺伝子の量が推定され
る。 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｂｙ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄ
ｉｔｅｄ ｂｙＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎ
ｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，
Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓ
ｔｒｕｈｌ）．ｐｐ．２，９．１．−２，９．１７．Ｇ
ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ
ｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９２。 注６：コピー数：ＤＮＡを授精卵に導入すると、通常Ｄ
ＮＡがいくつかつながった状態でマウスの染色体のある
１カ所に導入される。導入されたラムダーファージの１
個分をさして１コピーと称する。例えば、ＥＧ３ファー
ジを組み込んだトランスジェニックマウスはこのファー
ジを４０−５０個直列に持っており、コピー数は４０−
５０である。コピー数が増加すると、個体あたりの突然
変異の標的となる遺伝子の数が増加するので、より高い
感度で突然変異を検出することができる。
を用いてＰＣＲ法（下記注４）によりｇｐｔ遺伝子が導
入されている小マウスの検索を行った。ｇｐｔ遺伝子が
確認された小マウスについては更にドット・プロット法
（下記注５）により導入された遺伝子のコピー数（下記
注６）の測定を行った。 注４：ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ法）耐熱性のＤＮＡ複製酵素を用い、
遺伝子を増幅する方法であって、この方法によりトラシ
スジェニックマウスのＤＮＡのなかに、導入したラムダ
ーファージＤＮＡの存在を定性的に調べることができ
る。 注５：ドットプロット法：ＤＮＡ同士の相補性を利用
し、試料となるＤＮＡの中に探している遺伝子が存在す
るか否か、また存在するとすればどの程度存在するかを
調べる方法であり、調査対象遺伝子を放射能で標識して
から熱変性させ１本鎖にし、同じく熱変性により１本鎖
にした試料ＤＮＡとゆっくりと会合させ、試料ＤＮＡに
放射能標識が結合するか否か、また結合した場合にはそ
の放射活性を調べることにより遺伝子の量が推定され
る。 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｂｙ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄ
ｉｔｅｄ ｂｙＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎ
ｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，
Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓ
ｔｒｕｈｌ）．ｐｐ．２，９．１．−２，９．１７．Ｇ
ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ
ｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９２。 注６：コピー数：ＤＮＡを授精卵に導入すると、通常Ｄ
ＮＡがいくつかつながった状態でマウスの染色体のある
１カ所に導入される。導入されたラムダーファージの１
個分をさして１コピーと称する。例えば、ＥＧ３ファー
ジを組み込んだトランスジェニックマウスはこのファー
ジを４０−５０個直列に持っており、コピー数は４０−
５０である。コピー数が増加すると、個体あたりの突然
変異の標的となる遺伝子の数が増加するので、より高い
感度で突然変異を検出することができる。
【図１Ａ】本発明に係るトランスジェニックマウスに導
入する新規ラムダーファージＤＮＡの作製の２つの実施
例（ラムダーＥＧ１、ラムダーＥＧ２）を図示したもの
である。
入する新規ラムダーファージＤＮＡの作製の２つの実施
例（ラムダーＥＧ１、ラムダーＥＧ２）を図示したもの
である。
【図１Ｂ】図１Ａのつづき。本発明に係るトランスジェ
ニックマウスに導入する新規ラムダーファージＤＮＡの
作製の２つの実施例（ラムダーＥＧ１、ラムダーＥＧ
２）を図示したものである。
ニックマウスに導入する新規ラムダーファージＤＮＡの
作製の２つの実施例（ラムダーＥＧ１、ラムダーＥＧ
２）を図示したものである。
【図２Ａ】上記の新規ラムダーファージＤＮＡの作製の
他の実施例（ラムダーＥＧ３）を図示したものである。
他の実施例（ラムダーＥＧ３）を図示したものである。
【図２Ｂ】図２Ａのつづき。上記の新規ラムダーファー
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ３）を図示
したものである。
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ３）を図示
したものである。
【図３Ａ】上記の新規ラムダーファージＤＮＡの作製の
他の実施例（ラムターＥＧ４）を図示したものである。
他の実施例（ラムターＥＧ４）を図示したものである。
【図３Ｂ】図３Ａのつづき。上記の新規ラムダーファー
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ４）を図示
したものである。
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ４）を図示
したものである。
【図３Ｃ】図３Ｂのつづき。上記の新規ラムダーファー
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ４）を図示
したものである。
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ４）を図示
したものである。
【図４Ａ】ラムダーＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ３の各配列構
造を示す図である。
造を示す図である。
【図４Ｂ】ラムダーＥＧ５、ＥＧ６、ＥＧ７の各配列構
造を示す図である。
造を示す図である。
【図５Ａ】上記の新規ラムダーファージをマウス授精卵
に導入し、トランスジェニックマウスを作製し、このト
ランスジェニックマウスからＤＮＡを抽出し、大腸菌の
菌体内あるいは菌体外で環状プラスミドを形成させ、そ
の環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ遺伝子配列を欠損
した大腸菌に導入し、その大腸菌を６−チオグアニンと
抗生物質を含む培地上に塗布、培養して、環状プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を持つ大腸菌細胞を
検出する方法を図示したものである。
に導入し、トランスジェニックマウスを作製し、このト
ランスジェニックマウスからＤＮＡを抽出し、大腸菌の
菌体内あるいは菌体外で環状プラスミドを形成させ、そ
の環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ遺伝子配列を欠損
した大腸菌に導入し、その大腸菌を６−チオグアニンと
抗生物質を含む培地上に塗布、培養して、環状プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を持つ大腸菌細胞を
検出する方法を図示したものである。
【図５Ｂ】図５Ａのつづき。上記の新規ラムダーファー
ジをマウス授精卵に導入し、トランスジェニックマウス
を作製し、このトランスジェニックマウスからＤＮＡを
抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体外で環状プラスミ
ドを形成させ、その環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ
遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入し、その大腸菌を６
−チオグアニンと抗生物質を含む培地上に塗布、培養し
て、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を
持つ大腸菌細胞を検出する方法を図示したものである。
ジをマウス授精卵に導入し、トランスジェニックマウス
を作製し、このトランスジェニックマウスからＤＮＡを
抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体外で環状プラスミ
ドを形成させ、その環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ
遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入し、その大腸菌を６
−チオグアニンと抗生物質を含む培地上に塗布、培養し
て、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を
持つ大腸菌細胞を検出する方法を図示したものである。
【図５Ｃ】図５Ｂのつづき。上記の新規ラムダーファー
ジをマウス授精卵に導入し、トランスジェニックマウス
を作製し、このトランスジェニックマウスからＤＮＡを
抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体外で環状プラスミ
ドを形成させ、その環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ
遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入し、その大腸菌を６
−チオグアニンと抗生物質を含む培地上に塗布、培養し
て、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を
持つ大腸菌細胞を検出する方法を図示したものである。
ジをマウス授精卵に導入し、トランスジェニックマウス
を作製し、このトランスジェニックマウスからＤＮＡを
抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体外で環状プラスミ
ドを形成させ、その環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ
遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入し、その大腸菌を６
−チオグアニンと抗生物質を含む培地上に塗布、培養し
て、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を
持つ大腸菌細胞を検出する方法を図示したものである。
【図５Ｄ】図５Ｃのつづき。上記の新規ラムダーファー
ジをマウス授精卵に導入し、トランスジェニックマウス
を作製し、このトランスジェニックマウスからＤＮＡを
抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体外で環状プラスミ
ドを形成させ、その環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ
遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入し、その大腸菌を６
−チオグアニンと抗生物質を含む培地上に塗布、培養し
て、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を
持つ大腸菌細胞を検出する方法を図示したものである。
ジをマウス授精卵に導入し、トランスジェニックマウス
を作製し、このトランスジェニックマウスからＤＮＡを
抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体外で環状プラスミ
ドを形成させ、その環状プラスミドを染色体上のｇｐｔ
遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入し、その大腸菌を６
−チオグアニンと抗生物質を含む培地上に塗布、培養し
て、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を
持つ大腸菌細胞を検出する方法を図示したものである。
【図６】上記の新規ラムダーファージがＣｒｅ蛋白質に
より、２つのｌｏｘＰ配列部位において切り出され、そ
の間のＤＮＡ領域が環状プラスミドを形成する趣旨を図
示したものである。
より、２つのｌｏｘＰ配列部位において切り出され、そ
の間のＤＮＡ領域が環状プラスミドを形成する趣旨を図
示したものである。
Claims (5)
- 【請求項１】 体細胞と生殖細胞に下記のラムダファー
ジＤＮＡを有することを特徴とするトランスジェニック
マウス。ラムダーファージＤＮＡの塩基配列において、
その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配列、２つのＨｉｎｄ
ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プラスミ
ド複製開始点を有する塩基配列および薬剤耐性遺伝子配
列を組みこんだ新規なラムダーファージＤＮＡであっ
て、それらの配列の順序が、ラムダーファージＤＮＡの
レフトアームからライトアームに向ってまず、 （１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次に、 （２） ｌｏｘＰ配列、次に、 （３） 大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始
点を有する塩基配列および薬剤耐性遺伝子配列の３つの
配列を任意の順序の組み合わせにより位置させた配列、
次に、 （４） 前記のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、
次に、 （５） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列 の順序において組みこまれている新規なラムダーファー
ジＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１記載のマウスを使用し、そのマ
ウスからＤＮＡを抽出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージ
ング法によりマウス体内に導入したラムダーファージＤ
ＮＡをファージ粒子として回収し、Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｓｅを発現する大腸菌であって、染色体上のｇ
ｐｔ遺伝子配列が欠損している大腸菌に感染させ、その
大腸菌内においてＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅによ
ってラムダーファージＤＮＡ配列中のｌｏｘＰ配列部位
を切断、結合せしめることにより環状ＤＮＡ（＝プラス
ミド）を生成させ、その大腸菌を６−ｔｈｉｏｇｕａｎ
ｉｎｅおよび抗生物質を含む培地上に塗布し、培養する
ことにより環状ＤＮＡ（＝プラスミド）上のｇｐｔ遺伝
子配列に突然変異を持つ大腸菌細胞を検出する方法。 - 【請求項３】 請求項１記載のマウスを使用し、そのマ
ウスからＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩに
よって切断した後、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ切断部位を
ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅにより結合せしめて環状ＤＮＡ
（＝プラスミド）を生成させ、その環状ＤＮＡを染色体
上のｇｐｔ遺伝子配列が欠損している大腸菌に導入した
後、その大腸菌を６−ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅおよび抗
生物質を含む培地上に塗布し、培養することにより環状
ＤＮＡ（＝プラスミド）上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変
異を持つ大腸菌細胞を検出する方法。 - 【請求項４】 請求項１記載のマウスを使用し、そのマ
ウスに変異原物質あるいは発癌物質であることが疑われ
る物質を投与した後、請求項２あるいは請求項３記載の
方法を用いてｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を持つ大腸菌
細胞を検出し、マウス体内で起きた突然変異の表示とし
て６−ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ耐性大腸菌コロニー数を
計測することにより化学物質の突然変異原性を評価する
ための試験方法。 - 【請求項５】 請求項１記載のマウスを使用し、そのマ
ウスの細胞を培養することにより得た細胞に、変異原物
質、あるいは発癌物質であることが疑われる物質を投与
し、請求項２あるいは請求項３記載の方法を用いてｇｐ
ｔ遺伝子配列に突然変異を持つ大腸菌細胞を検出し、培
養細胞内で起きた突然変異の表示として６−ｔｈｉｏｇ
ｕａｎｉｎｅ耐性大腸菌コロニー数を計測することによ
り化学物質の突然変異原性を評価するための試験方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6096826A JP2580533B2 (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 遺伝子突然変異検出用トランスジェニックマウス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6096826A JP2580533B2 (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 遺伝子突然変異検出用トランスジェニックマウス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07274770A JPH07274770A (ja) | 1995-10-24 |
| JP2580533B2 true JP2580533B2 (ja) | 1997-02-12 |
Family
ID=14175370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6096826A Expired - Lifetime JP2580533B2 (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 遺伝子突然変異検出用トランスジェニックマウス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2580533B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115438654B (zh) * | 2022-11-07 | 2023-03-24 | 华东交通大学 | 文章标题生成方法、装置、存储介质及电子设备 |
-
1994
- 1994-03-31 JP JP6096826A patent/JP2580533B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07274770A (ja) | 1995-10-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |