JPH06506103A - 試験ｄｎａ配列を担持するトランスジェニック非ヒト動物を使用する変異誘発性試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 試験ＤＮＡ配列を担持するトランスジェニック非ヒト動物を使用する変異誘発性 試験 関連出願の相互参照 この出願は、「試験ＤＮＡ配列を担持するトランスジェニック非ヒト動物を使用 する変異誘発性試験」について１９８７年５月１日こ出願した米国特許出願番号 第０４５．０３７号の一部継続出願である１９９０年４月５日こ出願した米国特 許出願番号第５０５，６７６号の一部継続出願であり、その開示を参考として特 にここに取り入れる。

この発明は、トランスジェニック動物、および生きた動物内で変異誘発性要因を 監視する試験に関する。更に詳しくは、この発明は、試験ＤＮＡ配列を担持する トランスジェニック非ヒト動物の創出、およびトランスジェニック動物を１以上 の疑わしい変異原に露呈し、必要に応じて試験ＤＮＡ配列を回収し、変異につい て試験ＤＮＡ配列を検査することにより変異誘発性潜在性を監視し評価する方法 に関するものである。試験ＤＮＡ配列回収の効率を増加させる方法および特定の 試験ＤＮＡ変異の迅速な分析についても併せて述べる。

異常のような種々の要因（ａｇｅｎｔ）はＤＮＡにおける変異を与え得る。代表 的な研究の結果により、女性において進展するガンの６０％までが、また男性に おいて進展するものの４０％までが食餌摂取に由来する変異原への回避し得る露 呈に起因することが示されている。ポートら、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｕｔａｇｅｎ 、７　：５７７−５９８　（１９８５）。自動車排気中に認められるニトロ芳香 族化合物、飲料水に使用される塩素化副生物、および工場の研究室で盛んに使用 されるアクリルアミドやホルムアルデヒドのような環境的変異原への露呈も主要 に関連するものである。疑わしい変異原の効果の定量的測定は、有害な要因への 露呈を制御するのに必須である。加えて、例えば新しい化学物質、薬物または食 品添加物が研究室から市場に出るたびに、その毒性やガンを起こす潜在性につい て試験されなければならない。この結果、種々の化合物の変異誘発性潜在性を検 出する検定法の開発に多大の努力が傾けられている。

物質の変異誘発性潜在性を評価する既存の試験は、培養細胞または細菌における ＤＮＡの変化、または試験動物の健康の変化に焦点を当てたものである。しかし ながら、生きた動物を試験に供する要因に対して実際に露呈する、ＤＮＡの変化 を監視する試験は殆どない。これは、多数の異なる器官で遺伝コードの変化を同 時に迅速に監視するのは極めて困難なためである。これらの変異を検出する試験 は極めて鋭敏でなければならない。これらは、数百万の正常な遺伝的単位の中の 単一の変異を検出することができる必要がある。この課題は困難であるため、現 在では生きた動物の研究についてのこのアプローチは不可能な程高価で、更に時 間がかかるものとなっている。したがって、現在の生きた動物による遺伝的毒性 試験の大半は、疾患の形成や遺伝子変化の検定として大規模な染色体変化を使用 するものである。

潜在的な変異誘発性要因により生起される小規模のＤＮＡ変化を容易に検出する という問題は、培養した原核または真核細胞の研究を行うことによって一般にア プローチがなされている（試験管内検定）。周知のエームス試験は、これらの変 異を検出する特定の株の細菌を使用するものである。エームスら、変異原および 発ガン原の検出と分類のための改良された細菌試験系、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、、７０ニア８２−８６　（１９７３）、この試験および他の種類 の細菌または動物細胞を使用する多数の類似物は、変化した表現型の出現につい て極めて多数の細胞の迅速な検索を可能とするものである。この変化した特性の 出現は試験遺伝子内の変異の存在を反映する。しかしながら、これらの試験は、 検索に供される要因の代謝的活性化に起因する多（の変異原については感受性が ないか非特異的である。肝臓や他の抽出物を用いてこの種の代謝物を活性化する ことによりその感受性や特異性を増加させる試みがなされているが、例えばこれ らの抽出物により生成される代謝物は、生きた動物の組織におけるようには同一 の濃度で存在しないことが多いことが示されている。他の器官でのみ生成される 代謝物は全く検出されない。

変異を検出するために真核細胞ラインも使用されている。例えば、グレーザーら 、λフアージシャトルベクタを使用する哺乳動物細胞ＤＮＡにおけるＵＶ誘導変 異の検出と分析、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｃｌ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３　 ：　１０４１−１０４４　（１９８６）がある。この試験では、標的試験遺伝子 、バクテリオファージシャトルベクタにおけるイー・コリのアンバーサプレッサ チロシンｔＲＮＡ遺伝子が、試験管内での培養細胞のＤＮＡ　トランスフェクシ ョンによりゲノム宿主哺乳動物細胞ラインに組込まれた。宿主細胞ラインを推定 される変異誘発性要因に露呈した後、試験遺伝子を再単離し、細菌中で増殖させ 、変異について分析するものとした。宿主は哺乳動物細胞ラインのみであり、生 きた動物ではないため、この試験では、分化した細胞または生きた動物の組織に よってのみ適切な濃度で生産される試験に供する要因の変異誘発性代謝物を正確 に監視することは不可能である。

ＮＩＨによる２年間の研究の結論では、４つの異なる原核および真核試験管内検 定により得られたデータは、全身動物による発ガン研究と６０％一致したのみで あった。テナントら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３６：９３３−９４１　（１９８７） 。

この研究は、高率の誤差は試験管内系と全身動物との間の遺伝的感受性における 潜在的な変動に起因し得ることを示唆するものである。例えば、プロ変異原の活 性化にしばしば関連する代謝物は試験管内系には存在せず、変異誘発能は検出さ れないこととなる。更に、原核生物と真核生物との間のＤＮＡ修復機構の相異を 、結果の不一致の幾つかについて考慮し得る。

試験管内検定に使用する試験遺伝子および大規模スクリーニングアッセイは、生 きた動物の研究には利用可能ではない。腫瘍、器官障害、被膜の色等のような同 定し得るのに長時間を要する表現型の変化を検出する長期間の動物の研究に信頼 するものが少ないため、現在の試験はＤＮＡの器官特異的変異を監視する手段を 提供するものではない。よって、試験ＤＮＡ配列を動物内に配し、その後変異に ついて大規模に検定する系に対する必要性が存する。また、試験に供する要因の 化学的代謝物により生起された変異を検出する方法に対する必要性が存する。

最も効果的なものとするため、系は可能な限り多くの動物の組織内で、容易、迅 速かつ低廉に遺伝的変化を監視することができる必要がある。

本発明は新規なトランスジェニック非ヒト哺乳動物、およびこの種の哺乳動物を 変異誘発試験に利用する方法を提供するものであり、これらの必要性を満たすも のである。更に詳しくは、本発明は疑わしい要因の変異誘発性の鋭敏な検索を提 供するものであり、この種の要因の変異誘発効果およびこの種の要因の代謝物の 変異誘発効果を監視することを可能とする。加えて、この発明は変異の性状、例 えばＤＮＡ転移、転換、欠失また点もしくはフレームシフト変異の同定を可能と するものである。更に、この発明の方法は、迅速に実施される顕著な利点を与え 、これにより他の試験が完了し得るより十分前に潜在的な変異原の同定を可能と し、他の全身動物試験と比較して低廉なものである。また、本発明は、変異誘発 試験に使用しなければならない動物の数を実質的に低減するものである。

発明の要旨 本発明は、要因（ａｇｅｎｔ）の変異誘発能（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ　ｐｏｔｅｎ ｔｉａｌ）を検定する方法を企図する。この方法は、切除可能に組込んだλファ ージの存在を特徴とするゲノムを有する細胞を含有する動物に所定量の要因を投 与することからなる。このファージは、原核発現シグナルに機能的に連結された 標的遺伝子を含有する。露呈された動物は典型的には所定期間の時間、通常は数 時間〜数か月、好ましくは数日〜数週間、例えば約４日〜２週間生存を維持させ る。切除可能に組込んだλファージの所定量を、その後維持した動物から集めた 細胞から回収する。回収したλファージは、その後制限系欠損微生物に導入して 発現させる。

好適な態様では、動物はトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックネ ズミ、好ましくはトランスジェニックラットまたはマウスとする。

他の好適な態様では、細胞は５ＣＩＤマウス中に存在するヒト細胞とする。

後記するように、好適な方法は、変異誘発性、発ガン性または奇形性活性を有す る化合物を検索するため動物または動物細胞に組込まれた２つの遺伝子、試験遺 伝子およびレボータ遺伝子の組からなる標的遺伝子系を使用するものとして開発 された。これらのいずれかの活性を有する化合物に動物または動物細胞を露呈す ると変異が生起し、レポータ遺伝子の発現の変化に帰着する。標的遺伝子および レポータ遺伝子構成物の両者は、原核プロモータに機能的に連結される。

この方法は、変異誘発性または奇形性活性を有する化合物を検索する従来技術の 方法を越えて幾つかの利点を有するものである。最も有意義な利点は、検出の容 易性および偽陽性の数の減少である。レボータ蛋白質をコードする遺伝子の変異 は変異誘発活性を検定するのに先に使用されたが、変異の事実は結果的に発現さ れない蛋白質を与えた。蛋白質を発現する細胞に囲まれながら蛋白質を発現しな い単一の細胞、あるいは少数の細胞を検出することは困難、単調かつ高いパーセ ントの誤差を伴う傾向がある。これに対して本方法では、変異の事実は究極的に 他の場合は発現され得ないレポータ分子の発現に帰着し、これは容易に検出され るものである。

ここで使用するように、他に特に記載しない場合、「動物細胞」は、細胞培養、 胚子および分化した動物の細胞を包含すべく使用する。またここで使用するよう に、「変異原」は、他に記載しない限り、毒素、発ガン原、奇形原、および他の ＤＮＡまたはＲＮＡ配列または発現を変化させる要因を包含すべく使用する。

レポータ遺伝子の選択は次の評価基準に基くものとする：　（ｉ）レポータ遺伝 子産物は形質転換細胞に対して有害または致死的となり得ない、（ｉｉ）遺伝子 産物はその定量のために簡単で鋭敏な検出系を与えなければならない、（ｉ　ｉ 　ｉ）非形質転換細胞は検定される遺伝子産物または活性の構成的バックグラン ドが低いものでなければならない。生化学的技術により容易に監視できる酵素、 抗原または他の生物学的に活性な蛋白質をコードするレポータ遺伝子が好適であ る。これらにはβ−ガラクトシダーゼ（ツートン・ピー・ニーとコフィン・ジエ イ・エム、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５　：２８１−２９０　（１９８５） ）、パーオキシダー七およびルシフェラーゼ（デ・ウェット・ジエイ・アールら 、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７：７２５−７３７　（１９８７））が包含される。

試験遺伝子は、レポータ遺伝子発現を調節する配列に結合する制御分子をコード する配列の群から選択する。これらは、アンチ−センスＲＮＡを含むリプレッサ または他の制御分子とすることができる。最も好適な態様では、ＩａｃＩリプレ ッサ遺伝子を変異誘発標的として使用する。変異誘発によるリプレッサ遺伝子の 不活性化は、β−ガラクトシダーゼをコードするレポータ遺伝子１ａｃｚ遺伝子 の発現をもはや抑制し得ない欠損リプレッサ蛋白質の転写および翻訳までも生起 する。リプレッサ蛋白質の結合を妨害するようにレポータ遺伝子についてのオペ レータ領域が変化することにより同一の効果が与えられる。レポータ遺伝子の脱 抑制は、その後遺伝子産物の特定の機能を検定することにより監視することがで きる。

細菌１ａｃオペレーターリプレツサ系は、コウロンドレとミラー、Ｍｏ１．Ｂｉ ｏｌ、１１７：５７７（＋９７７）およびミラー、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ 。

１７：２１５　（１９８３）に記載されているように、遺伝子の転写を制御する 蛋白質−核酸相互作用の最も基本的で徹底的に研究された例の１であるため好適 である。この細菌の制御系は哺乳動物細胞にトランスフェクトされ、インデュー サ、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって発現が検出され たものであり、ヒュとダビッドソン、Ｃｅ１１．４８：５５５　（１９８７）お よびブラウンら、Ｃｅｌ！、４９：６０３　（１９８７）により報告された通り である。

ｌａｃオペレーターリプレッサ系の従来の使用と本方法との間の重要な差異は、 誘導より寧ろ変異を使用してレポータ遺伝子を脱抑制し、その機能が全て指標と して働く蛋白質を発現させる点である。他の差異は、好適な態様では、標的遺伝 子系が感染性λファージとして切除可能な点である。

レポータ遺伝子の発現を調節するレプレッサ蛋白質については、オペレータ配列 は、転写開始部位と開始コドンＡＴＧとの間の位置でレポータ遺伝子に組入れら れなければならない。本来のｌａｃオペレータ配列（５’　−ＧＧＡＡＴＴＧＴ ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣ−３’　）または変異種１ａｃオペレータ（ １ａｃｌｑ）、たとえばリプレッサに８倍強く結合する配列（５’　−ＡＴＴＧ ＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴ−３’）をベクタの構築に使用することができる 。

発明の詳細な説明 本発明は、標的遺伝子系を含有する切除可能に組込まれたλファージの存在を特 徴とするゲノムを有する操作された動物細胞、動物胚子（ｅｍｂｒｙｏ）および 分化した動物を企図するものである。標的遺伝子系は、試験遺伝子（転写可能、 および好ましくは翻訳可能ＤＮＡ配列）からなる。好ましくは、試験遺伝子は原 核発現シグナル、例えばプロモータ、リポソーム結合部位、停止コドン等に機能 的に連結される。

この発明のｒＤＮＡ（主題ｒＤＮＡ）は、λファージに対する原核発現のための 標的遺伝子系機能結合を含有する。標的遺伝子系は典型的にはλファージに機能 的に連結され、試験遺伝子のヌクレオチド配列における変異が検出し得る表現型 または遺伝子型を測定可能に変化させた場合にその転写が検出可能な表現型また は遺伝子型を結果的に与える種々の試験遺伝子のいずれかからなるものとするこ とができる。典型的な試験遺伝子には、薬剤耐性または他の選択上の利点を与え る遺伝子、またはその発現により第２のレポータ遺伝子の発現が変化する遺伝子 が包含される。例示的な薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン、クロ ラムフェニコール等に対する耐性を与えるものである。

好適な試験遺伝子はリプレッサまたはアクチベータ遺伝子産物であり、その発現 はレポータ遺伝子の発現を直接変化させる。例として、１ａｃｌ遺伝子によりコ ードされるリプレッサ蛋白質、および１ａｃＺ遺伝子の発現シグナルのオペレー タ領域に結合することによりβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）の転写を 遮断するよう機能する１ａｃＩ遺伝子の遺伝的変種がある。この系においてＩａ ｃＺがレポータ遺伝子である。好適な１ａｃＩ遺伝子は、８〜ｌＯ倍高いレベル のリプレッサ蛋白質を発現し、１ａｃＺ遺伝子の発現をより強固に抑制する１ａ ｃｌｑ変種である。

レポータ遺伝子は、試験遺伝子内の変異を検出する手段を与える。典型的なレポ ータ遺伝子は、試験遺伝子が変異していない場合に発現され、試験遺伝子が発現 される場合に発現されないものである。よってレポータ遺伝子は、検出し得る表 現型または遺伝子型をコードし、その発現が試験遺伝子の制御の下にある遺伝子 である。

検出し得る表現型をコードする遺伝子には、薬剤耐性マーカ、その活性により検 出し得る反応生成物を与える酵素等が包含される。好適なレポータ遺伝子はβ− ガラクトシダーゼ遺伝子（ＩａｃＺ）である。

好適な１ａｃＺ遺伝子は、ここに記載するようにα相補を利用するものであり、 これにより機能的なＩａｃＺ活性が、ＩａｃＺ遺伝子産物のα蛋白質とＩａｃＺ ムＭ１５遺伝子産物として言及する１ａｃＺの相補的部分との会合を要求するも のとなる。

試験遺伝子は原核発現シグナルに機能的に連結され、本発明による変異の迅速な 検出を促進するものである。標的遺伝子系の切除回収に際して、試験遺伝子系を 細菌細胞ローンのような原核発現系に導入すると、試験遺伝子の希釈物を発現さ せることができ、これにより試験遺伝子変異の程度を観察（レポート）して定量 する。

細菌細胞のような原核発現系で試験遺伝子の発現を測定する限り、試験遺伝子の 構造部分、または試験遺伝子を発現させる原核プロモータのような発現調節シグ ナルのいずれかで変異が生起し得ると理解される。よって好適な態様では、試験 遺伝子はＩａｃｒまたはＩａｃＩＱ遺伝子からなり、Ｉａｃｌプロモータ領域を 包含するものとする。

この発明のλファージは、動物細胞または胚子のゲノムに切除可能に組込まれた 標的遺伝子系からなる。切除可能に組込むとは、λファージが、可能性のある変 異の発生を評価する目的で変異誘発条件に供された動物、細胞または胚子ゲノム から試験遺伝子系を便利に除去する手段を与えるゲノムに機能的に連結された切 除要素からなることを意図する。

例示的な切除要素は標的遺伝子に当接するヌクレオチド配列であり、また存在す る場合レポータ遺伝子、また標的遺伝子系の他の要素であり、これは標的遺伝子 系が機能的に連結された（組込まれた）ゲノムからの部位特異的切除を可能とす るものである。好適なヌクレオチド配列はＣＯＳ部位、ｆｌｐリコンビナーゼ認 識部位、またはＣｒｅ蛋白質により認識される１ｏｘＰ部位であり、これらの全 てについてここにより十分に説明する。

ここに記載するようにλバクテリオファージ試験管内パッケージング抽出物を利 用する場合に２つのＣＯ５部位ヌクレオチド配列の間に含有される遺伝子の切除 の便利性および効率のため、好適なのはＣＯＳ部位切除要素である。

標的遺伝子系の切除要素は、変異露呈条件からレポータ遺伝子を測定する原核発 現媒体へと標的遺伝子系を容易に回収する能力を与えるものである。

例示的な好適な試験遺伝子系はここに記載するようにλＬＩＺαベクタであり、 この場合、１ａｃｌｑ試験遺伝子はα−相補に基（ｌａｃＺα遺伝子に機能的に 連結され、そこで試験およびレポータ遺伝子の両者は原核発現シグナル、すなわ ち１ａｃＩプロモータおよび１ａｃＺプロモ一タ／オペレータ配列の制御下にあ る。

この好適な系は、試験遺伝子における変異の性状の迅速な決定のために試験遺伝 子がｒｆｌ−型」核酸配列決定ベクタに容易に形質転換され得るよう、原核複製 開始点、選択マーカ（ａｍｐ”　）およびフィラメント状ファージ複製開始点を 特定する試験遺伝子に機能的に連結されたヌクレオチド配列を更に含む。この後 者の特徴は、ショートら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６：７５８３−７６ ００（１９８８）の教示により与えられ、この場合、ｆｌ遺伝子内領域のターミ ネータおよびイニシエータドメインは分離され、回収され配列決定されるべきこ の発明の試験遺伝子配列に当接するものである。

プロモータは、結果的に転写のプロセスの開始を与え、これにより遺伝子が転写 されてメツセンジャーリポ核酸（ｍＲＮＡ）分子を形成するＲＮＡポリメラーゼ 結合の部位を与えることにより遺伝子の発現を調節する構造遺伝子転写単位の要 素を形成するヌクレオチドの配列である。

オペレータは、特異的なリプレッサ結合の部位を形成するヌクレオチドの配列で ある。よって、オペレータは特定のリプレッサに特異的である。

オペレータへのリプレッサ結合についての平衡結合定数が１０−”モル（Ｍ）よ り大きい、好ましくは１０−１０Ｍより大きい、更に好ましくはｌ　Ｏ−”Ｍよ り大きい場合、リプレッサ結合部位は特異的であると考えられる。オペレータへ のリプレッサ結合についての平衡結合定数は、周知の平衡透析法、またはニトロ セルロースフィルタ結合検定（この場合、リプレッサはニトロセルロース上に固 定化され、５ｘｐ−ラベルしたオペレータ含有ＤＮＡ断片を固定化リプレッサへ の結合のため溶液中に与える）によって容易に測定することができる。ミラー「 分子遺伝学の実験Ｊ、ｐ３６７−３７０、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ ボラトリイ、ニューヨーク、１９７２を参照することができる。

Ｉａｃリプレッサのためのオペレータは十分に特性化されており、ここに例示的 に使用するものである。ミラーら、　「オペロン」中、コールド・スプリング・ ハーバ−・ラポラトリイ、ニューヨーク（１９８０）を詳細な検討に参照するこ とができる。その他のヌクレオチド配列が、リプレッサに特異的に結合する±且 Ｃリプレッサオペレータについて記載されている。例えば、サルトリウスら、Ｅ ＭＢＯＪ、８：１２６５−１２７０　（１９８９）およびサドラーら、Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８０：６７８５−６７８９　（１９ ８３）により報告された多数のＩａｃオペレータ変種およびこれらのりプレッサ 結合活性を特徴付ける方法の記載を参照することができる。ｌａｃリプレッサに 特異的に結合する全ゆるヌクレオチド配列を本発明に使用することができるが、 野生型および至適化されたオペレータが好適であり、ここで例示的に使用するも のである。Ｉａｃオペロンから誘導された２つの至適化されたオペレータは、次 のようなＳＥＱ、ＩＤ番号ｌおよび番号２で示されるヌクレオチド配列を包含す るものである： （ＳＥＱ、ＩＤ番号り　５’−ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＡＧＣＧＣＴ 　ＣＡＣＡＡＴ　ＴＣＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ、ＩＦ番号２）　５’−ＡＴＴ　 ＧＴＧ　ＡＧＣＧＣＴ　ＣＡＣＡＡＴ−３’ オペレータは、種々の機構により構造遺伝子についてプロモータを調節するよう 機能する。リプレッサの結合によりＲＮＡポリメラーゼについてのプロモータの 結合部位をカバーし、これによりＲＮＡポリメラーゼがプロモータ結合部位に接 近するのを排除するよう、プロモータ内にオペレータを位置させることができる 。また、プロモータ結合部位より下流にオペレータを位置させることができ、こ れによりＲＮＡポリメラーゼが転写単位を通過して下方に移動するのを遮断する 。

多重のオペレータをｒＤＮＡ分子上に配置し、１以上のリプレッサと結合させる ことができる。多重オペレータの利点は数倍となる。第１に、ＲＮＡポリメラー ゼ結合または遺伝子を下る転移のより強固な遮断を行うことができる。第２に、 少な（とも約７０ヌクレオチド、典型的には約１０００ヌクレオチド以下により 離間した場合、好ましくは約２００〜５００ヌクレオチドにより離間した場合、 ２つのオペレータ部位に結合したリプレッサ蛋白質間の相互作用により核酸中に ループを形成することができる。この形成されたループ構造は、プロモータがル ープ内に存在する場合、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータとの相互作用の強力な 阻害を与え、またループがプロモータの下流に位置する場合は、転写単位を下る ＲＮＡポリメラーゼの転移の阻害を与える。

好適な態様では、本発明により企図されるベクタには、原核レプリコン、すなわ ち原核宿主、例えばこれにより形質転換された細菌宿主細胞中で直接自動的な複 製および組換えＤＮＡ分子の染色体外維持の能力を有するＤＮＡ配列が包含され る。この種のレプリコンは当業界で周知であり、ここに記載するように０ｒｉＣ を包含するものである。更に、原核レプリコンを包含するこれらの態様は、周知 のように、その発現がこれにより形質転換された細菌宿主に対してアミノ酸栄養 依存性や薬剤耐性のような選択的利点を与える遺伝子を包含し得るものであり、 形質転換されたクローンの選択を可能とすることを図るものである。典型的な細 菌薬剤耐性遺伝子は、ここで使用するようにアンピシリン、テトラサイクリン、 カナマイシン等に対する耐性を与えるものである。

原核レプリコンを含むこれらのベクタは、これにより形質転換された遺伝子の発 現（転写および翻訳）を指向し得る原核プロモータも包含することができる。

プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が生起することを可能とす るＤＮＡ配列により形成された発現調節要素である。細菌宿主と和合性のプロモ ータ配列は、典型的には本発明のＤＮＡ断片の挿入のための便利な制限部位を含 有するプラスミドベクタ中において与えられる。細菌の発現系、およびこれらの 系におけるベクタの選択と使用は、「遺伝子発現技術Ｊ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ ｏｌ、Ｖｏ１１８５、ゴエデル編、アカデミツク・プレス、ＮＹ（１９９０）に 詳細に記載されている。この種のベクタプラスミドの典型にはｐＵＣ８、ｐＵＣ ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９があり、バイオ−ラド・ラボラトリイズ、 （リッチモンド、ＣＡ）から入手可能であり、またｐＰＬおよびｐＫＫ２３３− ２があり、ファルマシア、（ビスカタウエイ、ＮＪ）またはクローン・チク（パ ロ・アルド、Ｃａ）から入手可能である。

トランスジェニック動物およびその使用１つの態様では、本発明は新規なトラン スジェニック非ヒト動物および潜在的な変異誘発性要因の変異誘発効果を監視す る方法を提供するものである。この発明によれば、少なくとも１つの標的試験Ｄ ＮＡ配列の少な（とも１つのコピーを非ヒト哺乳動物の細胞に導入した後、飼育 して試験動物を作成する。好ましくは実質的に全ての細胞が試験ＤＮＡ配列を含 有し得る。その後試験トランスジェニック動物を変異誘発性であると疑わしい要 因に露呈し、その後試験ＤＮＡ配列をトランスジェニック動物の個々の組織から 回収することができる。試験ＤＮＡ配列は微生物に移すことができるが、この種 の回収および移動は必須ではなく、また変異について検定して多重組織特異的遺 伝的変異の迅速な検査を可能とするものである。試験ＤＮＡにおける変異を監視 するための方法は回収に依存する必要がなく、その場での試験ＤＮＡの直接検査 、試験ＤＮＡのＰＣＲ増幅、試験ＤＮＡのＲＮＡ転写産物または前記ＲＮＡの蛋 白質翻訳産物、または前記蛋白質についての前記蛋白質または基質の効果の検査 を包含するものである。

理論的には、変異誘発試験に適切な全ゆる動物を出発生物として使用することが できる。新規な試験配列の随所の挿入を可能とするため、単細胞動物胚子を回収 するが、分化した動物の細胞中のマーカＤＮＡの取込みおよび究極的な随所にお ける存在を促進する他の細胞もあり得る。

この発明によれば、変異に際して検出し得る表現型または遺伝子型をコードする 多数の種々の配列を、この発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物への導入に 使用することができる。宿主哺乳動物細胞からの試験ＤＮＡ配列の回収を促進す ることができ、また細菌宿主中でその配列の複製および発現を可能とし得るベク タを、標的試験ＤＮＡ配列のキャリヤとして好ましくは使用する。よって、この 種のベクタおよび挿入物の構成は、好ましくは哺乳動物宿主ゲノムからの切除の ための領域、および細菌宿主細胞中での複製を可能とする領域、並びに試験ＤＮ Ａ配列の発現および検定を可能とする領域を含有すべきものである。宿主ゲノム への組込みが必要でない場合は、動物宿主細胞における試験ＤＮＡ配列の複製を 可能とする所望の領域が存在すべきである。エルブレヒトら、トランスジェニッ クマウスにおけるウシパピローマウィルスベクタのエピゾーム維持、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７：１２７６−１２７９　（１９８７）。

更に本発明によれば、好ましくは（しかし必須ではない）単細胞胚子段階で試験 ＤＮＡ配列を宿主哺乳動物に導入し、分化した動物の細胞全体における試験配列 の安定な存在を与えるものとする。キメラ動物の使用もここに企図するものであ る。典型的には、これには試験ＤＮＡ配列の哺乳動物宿主ゲノムへの組込みが包 含されるが、自動的複製ベクタの使用による試験配列の安定かつ遺伝的な存在を 可能とする方法も有用たり得る。エルブレヒトら、トランスジェニックマウスに おけるウシパピローマウィルスベクタのエピゾーム維持、Ｍｏ　１．　Ｃｅ　１ １゜Ｂｉｏｌ、７：１２７６−１２７９　（１９ｇ？）。細胞レベルでは、マイ クロインジェクション、エレクトロポーレーション、ジエレクトロフォーレシス の技術または種々の化学的に媒介された形質転換技術を使用してこれを達成する ことができ、これらは全て当業界で周知である。分化した組織のレベルでは、他 の技術が必要たり得る。

試験ＤＮＡ配列の導入およびゲノムまたは細胞への組込みの後、ｌまたは複数の トランスジェニック細胞を全体的な生物に分化させる必要がある。これは例えば 、偽妊娠メスへの胚子移植により、またはトランスジェニック胚子の成熟を可能 とする他の技術により達成することができる。この種の成熟および分化が一旦生 起したならば、試験ＤＮＡ配列の存在について動物を検定する。典型的には、こ れには組織の小部分を動物から除去し、標準的なりＮＡハイブリダイゼーション 検定技術を使用して試験ＤＮＡ配列の存在を検出することが包含される。

試験ＤＮＡ配列を担持するトランスジェニック動物をその後飼育し、試験ＤＮＡ 配列を担持する子孫を変異誘発試験につき選択することができる。この発明によ れば、選択したトランスジェニック哺乳動物を、適切な条件下で問題とする要因 または物質に露呈する。この種の条件は、例えば要因または物質の性状、変異誘 発研究の目的および所望とするデータの種類に依存し得る。

所望の条件下で試験トランスジェニック動物を試験に供する要因に露呈した後、 所望の組織を試験動物から除去し得る。好適な態様では試験ＤＮＡ配列は主とし て全ての組織に存在するため、試験される組織の種類は、試験ＤＮＡ配列の挿入 のプロセスによって限定されるものではない。全ゆる所望の組織を除去すること ができ、種々の方法によりＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質または基質／生成物レベルで 検定することができ、限定されるものではないが、ＤＮＡまたはＲＮＡに対する その場でのハイブリダイゼーション、ＰＣＲ１蛋白質または酵素的検定が包含さ れる（ＰＣＲプロトコール、方法および応用の指針、イニス・エムら編、アカデ ミツク・プレス・インコ、１９９０、マニアティスら、分子クローン化、実験室 マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、１９８２）。

その他、ゲノムＤＮＡを組織から精製することができる。組込まれた標的試験Ｄ ＮＡ配列は、その後宿主の全ゲノムＤＮＡから回収し得る。これを宿主ゲノムか ら切除することにより、または大きさ、重量または荷電密度による分離を可能と する適切な手順によりこれを達成することができる。回収の方法は、試験ＤＮＡ 配列がゲノムに挿入されているか否か、当接領域が切除を可能とするものである か否か、試験ＤＮＡ配列が分離技術を用い得る複製要素の一部であるか否かに依 存する。

回収した試験ＤＮＡ配列をその後接して、大規模検索技術に適切な微生物により 発現させることができる。好適な態様では、これにはバクテリオファージパッケ ージング技術を用いて試験ＤＮＡ配列をパッケージすることによりゲノムＤＮＡ から試験ＤＮＡ配列ベクタを切除することが包含される。これは試験ＤＮＡ配列 を適切なベクタ内に連結することを要する場合もあるが、単に微生物への直接的 形質転換のみを含む場合もある。

試験ＤＮＡ配列ベクタを含有する微生物を、その後指標平板または選択培地上で 生育させる。これらの生物は、試験ＤＮＡ配列の変異を示す表現型を有し、変異 した試験ＤＮＡ配列を含有すると考えられるものである。試験ＤＮＡ配列を含有 する生物の合計数に対する試験配列の変異した表現型を発現するこれらの生物の 比率は、試験組織中に存在する要因およびその代謝物の変異誘発性の尺度である 。

バクテリオファージパッケージング技術は、外来起源由来のバクテリオファージ ＤＮＡをカプシド化するのに必要な蛋白質および前駆体の混合物を供給するため にバクテリオファージ感染宿主細胞抽出物を使用することを含む。試験ＤＮＡ配 列の回収効率は、パッケージング抽出物を調製するのに使用される宿主微生物の 株、並びにプレートして変異誘発性を検出するにの使用する微生物の両者におい て制限系を除去することにより顕著に増加させ得ることを最近突き止めた。加え て、他の回収系、例えば単離したゲノムＤＮＡのＤＮＡ形質転換は、この種の制 限系または活性を除去することにより改良し得る。

外来ＤＮＡを認識し不活性化するこれらの制限系を除去することにより、回収効 率は少なくとも１２，０００ｐｆｕ／μｇゲノムＤＮＡまで増加させることがで きる。これらの回収効率により、それぞれの組織に由来する数百万の標的遺伝子 の分析が可能となり、多数のデータ点を与え、より大きな統計的意義をもって変 異誘発性試験に必要な動物の数を結果的に顕著に低減するものである。

よって、組込まれた標的試験ＤＮＡ配列は、好ましくは外来ＤＮＡを認識し不活 性化する制限系を欠損するλパッケージング抽出物を使用して宿主哺乳動物の全 ゲノムＤＮＡから回収する。回収した試験ＤＮＡ配列は、その後制限系欠損微生 物に移して発現させる。

また、試験ＤＮＡ配列の迅速な分析を与えるシャトルベクタ系を構成することが できる。試験ＤＮＡ配列は、試験ＤＮＡ配列の切除および再環化を可能とする系 内に含有されるものとすることができ、この系はバクテリオファージゲノムに含 有される。パッケージング抽出物を使用する試験ＤＮＡ配列を含有するバクテリ オファージゲノムの回収の後、試験ＤＮＡをバクテリオファージゲノムから更に 切除し、再環化して迅速な変異分析を与えるものとする。

更に、本発明は、試験ＤＮＡ配列を細胞から回収することなく、試験ＤＮＡ配列 を含有する細胞の表現型を検査することにより変異誘発性試験の実行を企図する ものである。これは、潜在的な変異誘発要因に露呈した後にこの発明のトランス ジェニック哺乳動物の組織を切断し、その場でのハイブリダイゼーションまたは たとえば組織切断物の染色により試験ＤＮＡ配列の遺伝子型または表現型を検定 することにより達成することができる。

本発明は、有性生殖、すなわち配偶子細胞の合体による性的複製を行う多細胞真 核生物の遺伝的形質転換に用途を有する。好適な生物には、非ヒト哺乳動物、鳥 類、魚類、裸子植物および被子植物が包含される。

よって本発明は、哺乳動物の体細胞および胚細胞のゲノムに切除可能に組込まれ た本発明の修飾されたλバクテリオファージ（ｒＤＮＡ）を含有する非ヒト哺乳 動物、すなわちトランスジェニック哺乳動物を企図するものである。本発明のｒ ＤＮＡを含有する哺乳動物は、典型的にはホーガンら、マウス胚子の操作：実験 室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ（１９８７）およびパル ミターら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０　：　４６５−４９９　（１９８ ６）に記載された標準的なトランスジェニック技術を使用して調製するが、その 方法はここに更に説明する。トランスジェニック哺乳動物の製造は、キャベシ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：２８８−２９２　（１９８９）により記載された相同 組換えトランスジェニック系を使用しても可能である。トランスジェニック哺乳 動物の調製は、米国特許第４．７３６．８６６号、４，８７０，００９号、４， ８７３゜１９１号および４，８７３，３１６号にも記載されている。

トランスジェニック的に哺乳動物を改変する技術の１つは、受精した哺乳動物の 卵のオス前核にｒＤＮＡをマイクロインジェクトして、発生しつつある哺乳動物 の細胞に保持されるｒＤＮＡの１以上のコピーを与えるものである。通常はイン ジェクトされた卵から発生する哺乳動物の４０パーセントまでが、その組織中に ｒＤＮＡの少なくとも１つのコピーを含有する。これらのトランスジェニック哺 乳動物は、通常は胚細胞ラインを介してその遺伝子を次の世代に伝える。トラン スジェニック的に操作された胚子の子孫は、組織の断片のサザンプロット解析に よりその構成物の存在について試験することができる。典型的には、尾部の小部 分をこの目的のために使用する。トランスジェニック胚子のゲノムへのｒＤＮＡ の安定な組込みにより、確立されるべきｒＤＮＡを担持する永久的なトランスジ ェニック哺乳動物ラインが可能となる。

本発明のｒＤＮＡを含有する非ヒト哺乳動物を製造する他の方法には、受精卵の 感染、胚子誘導幹細胞、全能圧力ルシノーマ（Ｅｃ）細胞、またはｒＤＮＡを含 有するウィルス発現ベクタによる初期開裂圧が包含される。例えばパルミターら 、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０　：　４６５−４９９　（１９８６）およ びキャペシ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４　：１２８８−１２９２　（１９８９）を 参照することができる。

トランスジェニック哺乳動物は哺乳動物の如何なる種類ともすることができ、農 業上意義ある種、例えばヒツジ、ウシ、ラム、ウマ等が包含される。好適なのは 科学的目的に有意義な動物であり、限定されるものではないがウサギ、霊長類お よびネズミ、例えばマウス、ラット等が包含される。トランスジェニック哺乳動 物はヒトとしない。

標的遺伝子系を有する生物内で細胞を遺伝的にプログラムする方法本発明は、標 的遺伝子系を細胞に導入する方法、すなわち本発明の標的遺伝子系を含有する修 飾λゲノムを遺伝的に改変された接合子を産生ずるために接合子のゲノムに、ま たは生物内の個々の体細胞のゲノムに導入することにより生物内で細胞を遺伝的 にプログラミングすることをも企図するものである。遺伝的に改変された接合子 は、その後妊娠期間に等しい時間の間、または遺伝的に改変された接合子がｒＤ ＮＡの少なくともｌコピーを含有するトランスジェニック生物に発生するのに十 分な妊娠期間の実質的部分の間、適切な生物学的条件下で維持する。

ここで使用するように「遺伝的にプログラミングする」という用語は、哺乳動物 のような生物内で細胞のＤＮＡの内容を永久的に改変し、その際に原核標的遺伝 子系が生物の細胞のゲノムに導入されたことを意味する。

配偶子細胞の合体により性的複製を行う多細胞真核生物は、本発明のｒＤＮＡを 使用して遺伝的にプログラムすることができる。この種の多細胞真核生物の例に は、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物、硬骨魚、軟骨魚、円口類、節足動物、物 および被子植物である。

トランスジェニック生物は、組換え核酸分子のそのゲノムへの導入により形質転 換された生物である。典型的には、組換え核酸分子は、トランスジェニック生物 の全ての胚細胞および体細胞中に存在し得る。トランスジェニック生物の例には 、トランスジェニック哺乳動物、トランスジェニック魚類、トランスジェニック マウス、トランスジェニックラットおよび単子葉植物および双子葉植物を含むト ランスジェニック植物が包含される。例えばガサ−ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４ ：１２９３−１２９９　（１９８９）、デ・う・ペナらにより１９８７年８月１ ３Ｂｉこ出願されたヨーロッパ特許出願第０２５７４７２号、トルルソンらによ り１９８７年ＩＯ月１日に出願されたＰＣＴ公開ＷＯ３８１０２４０５号、ベル マにより１９８６年７月１６日に出願されたＰＣＴ公開ＷＯ３７１００５５１号 、およびドブファーらにより１９８８年５月２０田；出願されたＰＣＴ公開ＷＯ ３８１０９３７４号を参照することができる。

本発明のｒＤＮＡを含有するトランスジェニック生物を製造する方法には、標準 的なトランスジェニック技術、レトロウィルスを含むウィルスによる接合子また は生物の感染、ウィルスによる組織の感染後の組織の動物への再導入、およびｒ ＤＮＡの哺乳動物の胚幹細胞への導入後に胚幹細胞の適切な操作を行うことによ るトランスジェニック動物の産生が包含される。例えばワグナ−ら、米国特許第 ４，８７３，１９１号（１９８９年ｌＯ月ｌＯ日）、ロジャースら、Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３：２５３−２７７　（１９８７）、ベルマら、Ｐ ＣＴ公開ＷＯ３７１００５５１号、コツキングら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３６　： １２５９−１２６２　（１９８７）、およびルスキンら、Ｎｅｕｒｏｎ　ｌ：６ ３５−６４７　（１９８８）を参照することができる。

本発明の原核遺伝子制御系のｒＤＮＡを含有する少な（とも１つの細胞を有する トランスジェニック哺乳動物は、当業界で周知の方法を使用して製造することが できる。例えばワグナ−ら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９年ｌＯ 月ｌＯ日）、ホーガンら、マウス胚の操作：実験室マニュアル、コールド・スプ リング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８７）、キャペシ、５ｃｉｅｎｃｅ。

２４４：２８８−２９２　（１９８９）、およびルスキンら、Ｎｅｕｒｏｎ　ｌ ：６３．５−６４７　（１９８８）を参照することができる。

好適な態様では、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、１）対象ｒＤＮＡを 受精した哺乳動物卵にマイクロインジェクトして遺伝的に改変されだ補乳動物卵 を産生じ、 ２）遺伝的に改変された哺乳動物卵を宿主メス哺乳動物に移植し、３）前記哺乳 動物の妊娠期間の実質的部分に等しい時間の間宿主メス哺乳動物を維持し、 ４）遺伝的に改変された哺乳動物卵から発生したｒＤＮＡを含有する少なくとも １つの細胞を有するトランスジェニック哺乳動物を回収することにより製造され るものである。

受精した晴乳動物卵は、ゴナドトロピンを用いて排卵過度を誘導することにより 適切なメス哺乳動物から得ることができる。典型的には、黄体形成ホルモン（Ｌ Ｈ）を模倣するヒト漿膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）と組合せて妊娠メス血清を使 用して卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）を模倣する。周知のように、マウスにお ける排卵過度の効率的な誘導は、メスの月齢および体重、ゴナドトロピン投与の 投与量およびタイミング、および使用するマウスの特定の種を含む幾つかの変数 に依存する。更に、受精されるに至る排卵過度卵の数は、種メスの繁殖性能に依 存する。たとえば、胚子の操作：実験室マニュアル、ホーガンら編、コールド・ スプリング・ハーバ−１ＮＹ（１９８６）を参照することができる。

周知の技術を使用し、ｒＤＮＡを補乳動物卵にマイクロインジェクトして遺伝的 に改変された卵を製造することができる。典型的には、ゴートンら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：７３８０−７３８４　（１９８０ ）により記載されたように、ｒＤＮＡを受精したマウス卵の前核に直接マイクロ インジェクトする。これにより、生存する胚子の約１０〜４０パーセントにおい てｒＤＮＡの安定な染色体組込みが行われる。例えば、プリンスターら、Ｐ　ｒ 　ｏ　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２　：４４３８−４４４２　（１９８ ５）を参照することができる。大半の場合、組込みはｌ細胞段階で生起すると認 められ、この結果ｒＤＮＡは原始胚細胞の全てを含むトランスジェニック動物の 全ての細胞に存在する。それぞれの細胞で保持される外来ｒＤＮＡのコピー数は １〜数百の範囲となり得るが、周知のように卵にインジェクトされたｒＤＮＡの 数に依存するとは認められない。

マウス胚ラインに遺伝子を導入する他の方法は、ウィルスベクタによる胚子の感 染である。野生型または組換えウィルスによって胚子を感染させることができ、 宿主染色体へのウィルスゲノムの安定な組込みを与える。例えば、ジェニッシュ ら、Ｃｅ１ｌ、２４：５１９−５２９　（１９８１）を参照することができる。

ウィルスベクタの特に有用な種類は、レトロウィルスから誘導されたウィルスベ クタである。レトロウィルスの岨込みは正確な機構を介して生起し、宿主染色体 上へのウィルスの単一コピーの挿入を与える。胚子のレトロウィルス感染により トランスジェニック動物を得る頻度は、ｒＤＮＡのマイクロインジェクションに より得られるものと同様に高くすることができ、使用するウィルスの滴定値に大 きく依存することが認められる。例えば、ファン・デル・ブテンら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２：６１４８−６１５２　（ １９８５）を参照することができる。

新たな遺伝的情報をマウス胚子に移す他の方法には、ｒＤＮＡを胚幹細胞に導入 した後に胚幹細胞を胚子に導入するものが包含される。胚幹細胞は正常な胚盤胞 から誘導することができ、これらの細胞は胚子に導入された場合に胚細胞ライン および体組織を規則的にコロニー形成することが示されている。例えば、プラト レイら、Ｎａｔｕｒｅ、３０９：２５５−２５６　（１９８４）を参照すること ができる。典型的には、胚子誘導幹細胞はｒＤＮＡにより感染され、胚子誘導幹 細胞は、ｒＤＮＡが細胞のゲノムに組込まれるのに十分な時間の間培養される。

幾つかの状況では、この組込みは、胚子誘導幹細胞のゲノムに存在する遺伝子に よる相同組換えによって生起し得る。例えば、キヤベツ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４ ４　：　＋２８８−１２９２　（＋　９８９）を参照することができる。ｒＤＮ Ａをそのゲノムに組込んだ胚子幹細胞を選択して使用し、精製された遺伝的に改 変された胚子誘導幹細胞集団を産生ずることができる。例えば、マンサーら、Ｎ ａｔｕｒｅ、３３６：３４８　（１９８８）を参照することができる。胚子誘導 幹細胞をその後予備移植マウス胚子の胞胚腔に注入し、胚芽細胞を養育母親の子 宮に外科的に移し、そこで所定期間発生の進行を図る。この結果得られる動物は 、供与体胚子誘導幹細胞および宿主胚芽細胞の両者から誘導された細胞から構成 される点でキメラである。ヘテロ接合体子孫を相互飼育してｒＤＮＡに対してホ モ接合体である動物を産生ずる。たとえば、キヤベツ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４ ：１２８８−１２９２　（＋９８９）を参照することができる。

遺伝的に改変しだ補乳動物卵を宿主メス補乳動物に移植する。遺伝的に改変した 補乳動物卵を宿主メスに移植する方法は周知である。例えば、ホーガンら、マウ ス胚子の操作：実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リイ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８６）を参照する ことができる。偽妊娠受容体メスは、精管切除または遺伝的に不稔のオスを用い て自然の発情期においてメスと対合させることにより産生ずることができる。

不稔のオスとの対合の後、メスの生殖管は、それ自身の受精していない卵が縮退 するにも拘らず、移された胚子に対して受容性となる。遺伝的に改変した哺乳動 物卵を、その後偽妊娠受容体の膨大部または子宮角に移す。遺伝的に改変した哺 乳動物卵を膨大部に移す場合、透明帯膜においてこれを封止しなければならない 。

これを子宮角に移す場合、遺伝的に改変した哺乳動物卵は、透明帯膜を必要とし ない。

遺伝的に改変された移植された哺乳動物卵を含有する宿主メス補乳動物は、遺伝 的に改変された哺乳動物卵から発生した本発明のｒＤＮＡを含有する細胞を少な （とも１つ有するトランスジェニック哺乳動物が誕生するのに十分な時間の間維 持する。典型的には、この妊娠期間は、特定のマウス種により１９〜２０日であ る。マウスの飼育および世話は周知である。例えば、マウス胚子の操作：実験室 マニュアル、ホーガンら編、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（ １９８６）を参照することができる。

複製非コンピテントレトロウィルスベクタを使用する動物内での細胞の感染につ いては、ルスキンら、Ｎｅｕｒｏｎ、ｌ：６３５−６４７　（１９８８）に記載 されている。

１つの態様では、特定の組織または細胞内に標的遺伝子系を含有する動物を使用 し、特定の組織に対して発ガン原であると疑わしい材料、組成物または化合物の 効果を試験する。動物を特定の材料または化合物に露呈し、化合物または材料の 発ガン性の指標としてオペレータ制御レボータ遺伝子断片の脱抑制により、動物 に対する変異誘発効果を決定する。

発ガン活性を有すると疑わしい化合物を、注射、または摂取または局所投与を含 む全ゆる適切な方法により動物に導入する。

その後、標的遺伝子系のえ！伝子に対して組成物が変異誘発効果を与えるのに十 分な所定時間の間、動物を維持する。典型的には、この時間期間は数分〜数日の 範囲であり、組成物が遺伝子に変異を起こすのに必要な時間に依存する。

変異誘発の指標として検定する生理的プロセスまたはパラメータは、レボータ遺 伝子の発現により与えられる特定の生理的変化に依存する。

生理的パラメータの変化は、組成物を動物に導入する前にそのパラメータを測定 し、その測定値と組成物を動物に導入した後に同一様式で測定した測定値とを比 較することにより決定する。

トランスジェニック動物中の試験遺伝子のコピー数により、疑わしい発ガン原の 効果に対するトランスジェニック動物の感度が変化する。したがって、試験遺伝 子のトランス遺伝子コピー数を変動させつつトランスジェニック動物を選択する ことにより、疑わしい発ガン原に対するトランスジェニックマウスの感度を変化 させ得る。

実施例 以下の実施例は本発明を説明することを意図するものであり、限定するものでは ない。よって、現在知られているか将来開発される当業者の視野の範囲内にある 改変物や均等物は、この発明の範囲内に該当すると考えるべきであり、これは添 付する請求の範囲の記載によってのみ限定されるものである。

１、イー・コリＲｅｃＡ−溶原株の構成受容体としてそれぞれイー・コリ株ＢＨ Ｂ２６８８およびＢＨＢ２６９０のｒｅｃＡ十形質転換体、および供与体として ｍｃ　ｒＡ中に（または近くに）ＴｎｌＯ（テトラサイクリン耐性）を担持する いずれかのイー・コリに一１２株（関連する遺伝子型＝ｍｃｒＡ：ＴｎｌＯ（ｔ ｅｔ”　））を使用し、株ＢＨＢ２６８８Ｒ−およびＢＨＢ２６９ＯＲ−を構成 する。Ｅ−であるＢＨＢ２６８８、およびＤ−であるＢＨＢ２６９０は、それぞ れ受託番号３５１３１および３５１３２によりアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（ＡＴＣＣ）　、ロックビル、ＭＤから入手可能である。Ｒｅｃ Ａ＋形質転換は標準的な方法により行うが、典型的にはｒｅｃＡ発現プラスミド を使用する。工程ｌ：前記したイー・コリに一１２株からＰＬ溶解物を作成する 。工程２：ＢＨＢ２６８８およびＢＨＢ２６９０をＰｉ溶解物を用いて形質導入 する（ミラー・ジエイ、分子遺伝学の実験、コールド・スプリング・ハーバ−・ ラボ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９７２）　）。工程 ３：テトラサイクリン（ｔ　ｅ　ｔ”　）耐性コロニーを選択し精製する。工程 ４：ボフナー乎板上でテトラサイクリン耐性の喪失を選択しくポフナー・ビー・ アールら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４３：９２６−９３３（１９８０））、 コロニーを精製する。工程５：ＨｐａＩＩメチラーゼ（ラレイ、前記）により試 験管内でメチル化したｐＢＲ３２２に対して非メチル化ｐＢＲ３２２の形質転換 効率を比較することにより、ｍｃｒＡ制限活性の欠如を試験する。ｍｃｒＡ十株 はメチル化されたプラスミドにより大きく低減された効率を示し得る。ｍｃ　ｒ Ａ活性がない場合、この株をＢＨＢ２６８８ｍｃｒＡ−およびＢＨＢ２６９０ｍ ｃｒＡ−と呼ぶこととする。

前記ｍｃｒＡ−株のｍｃｒＢ座を欠損させるため、関連する遺伝子型ｍｃｒＢ： ：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ”）、ｍｒｒ：　：Ｔｎ５　（ｋａｎ”）を有する供与体イ ー・コリに一１２株を使用した。ｍｃｒＢ遺伝子内にＴｎｔＯ（ｔｅｔ”）を担 持するイー・コリに一１２株からＰｌ溶解物を作成する。この株は、ｍｒｒ遺伝 子内にＴｎ５　（ｋａｎ’）も有する筈である。工程７　：　ＢＨＢ２６８８ｍ ｃｒＡ−およびＢＨＢ２６９０ｍｃｒＡ−ｒｅｃＡ＋　（ｔｅｔ’）株を形質導 入する。工程８：ｔｅｔ”コロニーを選択する。ｋａｎ”でもある１つのコロニ ーを精製する。

工程９：ポフナー平板（ポフナー、前記）上でｔｅｔ”の喪失を選択する。工程 １０：幾つかのコロニーを精製し、テトラサイクリンおよびカナマイシンに対す る感受性について試験する。ｔｅｔｓおよびｋａｎ’の両者であるコロニーを選 択する。工程１１：ｍｃｒＡ試験について行ったようにｍｃｒＢ制限活性の欠失 を試験するが、ただしこの場合、ＡＩｕＩメチラーセによりｐＢＲ３２２を試験 官内メチル化しなければならない（ラレイ、前記、ロス、前記）。ｍｃｒＢ十株 は、メチル化されたプラスミドにより大きく低減された効率を示すこととなる。

ＰｓｔＩメチラーゼ（ハイドマン、前記）により生体内メチル化したλに対して λのプレート効率を比較することによりｍｒｒ制限活性を試験する。ｍｒｒ十株 は、メチル化されたλにより低減された効率を示すこととなる。ｈｓｄＭメチラ −ゼ（ウッド・ダブリュ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６：１１８−１３３　（１ ９６６）、アダムス、バクテリオファージ、ニューヨーク：インターサイエンス １９５９、バイクル、前記、ｐｐ、９５−１００）により試験管内メチル化され たλに対してλのプレート効率を比較することにより、ｈｓｄＲ制限活性につい て試験する。ｈｓｄＲ十株は、非メチル化λにより低減された効率を示すことと なる。株（精製したコロニー）が全ての制限活性、ｍｃｒＡ、ｍｅｒＢ、ｍｒｒ 、ｈｓｄＲを欠失し、この方法によって構成されたならば、それはｍｃｒＢ領域 （ムｒｌｃｒＢ）全体の欠損を含む筈である。これらの株はＢＨＢ２６８８”− およびＢＨＢ２６９０”−である。

バクテリオファージＰｉ溶解物（ＰＩと後記する）を、テトラサイクリン耐性ト ランスポゾン１０（ＴｎｌＯ）をｍｅｒＡ遺伝子中またはその近（に担持する（ ＴＮＩ　Ｏ：　：ｍｃｒＡ）イー・コリに一１２株のいずれかから作成した。す なわち、Ｋ１２の一夜培養に由来する一滴を５Ｘ１０−”モル（Ｍ）　Ｃａ　Ｃ ｌ　ｔを含有する５ｍｌのＬＢＢａス（ルリアーベルタニのブロスは、１リツト ルの脱イオン水に１０グラム（ｇ）バクトートリブトン、５ｇバクトー酵母エキ スおよび１０ｇＮａＣ１を混合して溶解することにより調製した）と混合した。

細胞が対数期増殖にあって２ＸｌＯ”細胞／ｍｌの密度に到達するまで旋回する ことにより混合物を通気した。１ｍｌの前記混合物に対して１０”のファージを 混合した後、摂氏３０度（３０℃）の水浴で２０分間維持してファージ−細胞混 合物を形成することによりＰＩを予備吸着させた。その後４５℃に維持したＬＢ 頂部寒天２．５ｍｌをファージ−細胞混合物と混合した。この結果得られた寒天 含有細胞懸濁物を新たに作成したＬＢ平板上にプレートし、これを３０℃で８時 間維持した。維持時間の終りに際して、軟寒天層を小さい遠心分離チューブに掻 き取った。

その後平板の掻き取った表面を１ｍｌのブロスで洗浄し、洗浄物を集めて掻き取 った軟寒天と混合した。５滴のクロロホルムを遠心分離チューブに添加した後、 遠心分離して細胞残渣をペレット化した。この結果得られたＰｌ溶解物を含有す る上澄を集めた。

ｂ）Ｐｉ溶解物による形質導入 この発明では、イー・コリ溶原株ＢＨＢ２６９０　（ＡＴＣＣ＃３５１３２）を 形質導入の特定の株として使用した。ＲｅｃＡ−のイー・コリＢＨＢ　２６９０ を最初にｐＪＣ８５９により形質転換して溶原株に機能性ＲｅｃＡ蛋白質を導入 した。ｐＪＣ８５９は、ＲｅｃＡをコードするヌクレオチド配列がプラスミドイ ー・コリベクタ、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ＃３１３４４）のＢａｍＨＩ部位に挿 入されたプラスミドである。マニアナイスら、分子クローン化二実験室マニュア ル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、第２編、セクション１． １２および５．８８．１９８９、および米国特許第４８４３００６号（ここでは 異種構造ポリペプチド配列に対合したＲｅｃＡプロモータ／オペレータおよびＲ ｅｃＡの１５０アミノ酸残基が記載されている）。形質転換のためイー・コリＢ ＨＢ２６９０コンピテント細胞を、当業者に馴染みのある標準的な手順に従って 調製した。マニアナイスら、前記、セクション１．７６゜また、コンピテント細 胞は市販のものを入手することができる。

形質導入に供する５ｍｌの新しい一夜培養のＢＨＢ２６９Ｑ　ｒｅｃＡ＋を、ミ ラーによる手順により０．１ＭＭｇＳＯ４および、５ｍＭＣａＣＩｔよりなる５ ｍｌの緩衝液に再懸濁した。ミラー、分子遺伝学の実験、コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリイ、１９７２゜ＢＨＢ２６９０ｒｅｃＡ十細胞懸濁物を その後３０℃で１５分間旋回することにより通気した。５つの小さい試験チュー ブのそれぞれに０．１ｍｌの通気懸濁した細胞を添加した。前記調製した１００ マイクロリツトル（μｌ）のＰＩ溶解物を第１のチューブに添加した。Ｐｌ溶解 物を連続的に１０倍希釈してＰＩを受容しない最後のチューブ（よって対照とし て働く）以外の残るチューブに添加した。Ｐｉを含有する細胞のないチューブも 更なる対照として使用した。水浴中で２０分間３０℃でチューブを維持すること によりＰ１溶解物を予備吸着させた。２００μｌの１Ｍクエン酸ナトリウムをそ の後調製したそれぞれのチューブに添加し、それぞれのチューブの内容物をその 後テトラサイタリン含有平板上にプレートし、テトラサイクリン耐性（ｔｅｔ” ）コロニーを選択した。

平板を３０℃で維持してコロニーを生育させた後、ｔｅｔ”コロニーを選択して 精製し、当業者に周知の後続する手順を行った。その後ｔｅｔ”コロニーをボフ ナー平板上に再プレートし、マロイにより記載されたようにｔｅｔ”の喪失を選 択した。マロイら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４５：１１１０−１１１２（１ ９８１）　、すなわち、ｔｅｔ−感受性、ｔｅｔ’コロニーを次のもの：１５グ ラム／リットル（ｇ／Ｉ）寒天、５ｇ／ｌトリプトンブロス、５ｇ／ｌ酵母エキ ス、４ミリリツトル／１（ｍｌ／ｌ）クロロテトラサイクリンヒドロクロリド（ １２，５ミリグラム（ｍｇ）／ｍｌ）、ｌ　Ｏｇ／１Ｎａｃｌ、ｌ　Ｏｇ／１Ｎ ａＨｆ　ＰＯ，−Ｈｔ　０１６ｍ１／１フザリン酸（２ｍｇ／ｍｌ）、および５ ｇ／ｌＺｎＣ１ｚ（２０ミリモル（ｍＭ））よりなる培地上で選択した。化学物 質はシグマから入手したくシグマ、セントルイス、ＭＯ）。

選択したｔｅｔＳコロニーをその後精製し、ｍｃｒＡ制限活性の欠失について試 験した。ｍｃ　ｒＡ−株の決定は、ＨｐａＩＩメチラーゼにより試験管内でメチ ル化したｐＢＲ３２２に対して非メチル化ｐＢＲ３２２の形質転換効率を比較す ることにより行った。ｍｅｒＡ十株は、メチル化されたプラスミドにより大きく 低減された効率を示した。ＢＨＢ２６９０ｍｃｒＡ−と後記するＢＨＢ　２６９ ０ＲｅｃＡ＋ｍｃｒＡ−をこのようにして決定し、後記するようにＢＨＢ２６９ ０ｍｃｒＢ−形質導入体を作成するのに使用した。

（２）ＢＨＢ２６９０ｍｃ　ｒＢ−を得る形質導入前記調製したＢＨＢ２６９０ ｍｃｒＡ−株を類似する形質導入において使用してＢＨＢ２６９０ｍｃｒＢ−株 を選択した。この手順のため、ｍｃｒＢ遺伝子内にＴｎｌＯ（ｔｅｔ”）を担持 する（ｍｃｒＢ：　：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ”））イー・コリに一１２株のいずれか から前記したようにＰＩ溶解物を調製した。選択した株も、ｍｒｒ遺伝子内にカ ナマイシン（抗生物質）耐性遺伝子（ｋａｎ”）を有するＴｎ５を担持していた （ｍｒｒ　：　：Ｔｎ５　（ｋａｎ”　））。

その後イー・コリＢＨＢ２６９０ｍｃｒＡ−（ｔｅｔｓ）株に対し、前記実施例 １ａに記載したように、Ｐｉ溶解物［（ｍｃｒＢ：　：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ”）お よび（ｍｒｒ　：　：Ｔｎ５　（ｋａｎ”　）を用いて形質導入した。ｋａｎ” でもあるｔｅｔ”コロニーを選択して精製した。ポフナー平板上におけるｔｅｔ ”の喪失を前記したように測定した。ボフナー平板上での選択後ｔｅｔ’および ｋａｎ’の両者であるコロニーを精製した。

ＡｌｕｌメチラーゼによってｐＢＲ３２２を試験官内でメチル化した以外は、ｍ ｃｒＡ活性の欠失を決定する際に記載したようにｍｃｒＢ制限活性の欠失を行っ た。ｍｃｒＢ＋株は、メチル化されたプラスミドにより大きく低減された効率を 示した。ｍｒｒ制限活性についての試験は、（Ｐｓｔｌメチラーゼにより）生体 内でメチル化されたλに対してλのプレート効率を比較することにより行った。

ｍｒｒ十株はメチル化されたλにより低減された効率を示した。ｈｓｄＲ制限活 性についての別の試験も、活性の欠失により全ｍｃｒＢ領域の欠損を確認したよ うに行った。ｈｓｄＲ制限活性試験は、ｈｓｄＭメチラーゼにより生体内でメチ ル化したλに対してλのプレート効率を比較することにより行った。ｈｓｄＲ＋ 株は、非メチル化λにより低減された効率を示した。これらの試験により、全て の制限活性、ｍｅｒＡ、ｍｅｒＢ、ｍｒｒおよびｈｓｄＲを欠失し、この形質導 入法を使用して構成された選択コロニーは、ｍｃｒＢ領域に渡って欠損を有する ことが示された。この株をＢＨＢ２６９ＯＲ−と命名し、実施例２ａで説明する ようにプレヘッドの抽出物の調製に使用した。

Ｂ、イー・コリＢＨＢ２６８８Ｒ− ＲｅｃＡ＋を含有するがｍｃｒＡ、ｍｅｒＢ、ｍｒｒおよびｈｓｄＲを欠失する イー・コリＢＨＢ２６８８株を、イー・コリＢＨＢ２６９ＯＲ−の調製について 前記したアプローチを使用して調製した。形質導入のため、イー・コリ溶原株Ｂ ＨＢ２６８８　（ＡＴＣＣ＃３５１３１）を使用した。この結果得られた株は、 ＢＨＢ２６８８Ｒ−と命名し、以下の実施例２で説明するように蛋白質供与体の 抽出物の調製に使用した。

２．２つの溶原株からのパッケージング抽出物の調製イー・コリ溶原株、実施例 １ａで調製した株ＢＨＢ２６９０Ｒ−（プレヘッド供与体）の超音波処理抽出物 を調製するため、この株の遺伝子型を大規模培養の前に最初に確認する。バクテ リオファージｃＩ遺伝子産物を温度感受性とする変異の存在を、イー・コリＢＨ Ｂ２６９０Ｌ−のマスター保存物から２つのＬＢ寒天平板上にストリークするこ とにより決定する。平板の１つを３２℃に維持しつつ、他方を４５℃に維持する 。無傷のｃＩを有する細菌は、３２℃で維持された平板上でのみ生育する。イー ・コリＢＨＢ２６９ＯＲ−の単−小コロニーを拾い、３２℃および４５℃で一夜 維持する。ＢＨＢ株内に存在するｒｅｃＡ−変異のため、変異を有する細菌は３ ２℃でのみ生育し、かつ遅く生育する。イー・コリ株ＢＨＢ２６９０Ｒ−の確認 したマスター保存物の１００ｍ１の二次培養物をその後調製し３２℃に一夜維持 する。

イー・コリＢＨＢ２６９０Ｒ−培養物を一夜維持した後、６００ｎｍの波長で光 学密度（ＯＤ）を測定する。−夜培養物の画分を５００ｍ１のＮ２Ｍブロス（Ｎ ２Ｍプロ又は、９５０ｍ１の脱イオン水に対して、ｌ　ＯｇＮＺアミン、５ｇＮ ａＣ１および２ｇＭｇ５Ｏ＜　−７Ｈｔ　Ｏを混合することにより調製する。溶 解した溶質を含有する溶液のｐＨは、５ＮのＮａＯＨによりｐＨ７，０に調整す る）に混合し、２リツトルフラスコ中で３２℃に予備加熱し、結果的に約０．１ の出発ＯＤ、。。を与えるものとする。その後、約０．３のＯＤ、。。に到達す るまで激しく攪拌しながら（ロータリーシェーカーで３００サイクル／分）、細 菌混合物を３２℃に維持する。０．３のＯＤ、。。には、一般に培養物の維持２ 〜３時間以内に到達する。後記する誘導の前に、培養物は生育の対数期の途上に なければならない。

４５℃に予備加熱した水浴にフラスコを配置することにより溶原株を誘導する。

フラスコを１５分間連続的に旋回させる。溶原株を誘導する他の方法は、６５℃ に設定した振盪水浴にフラスコを浸漬するものである。フラスコの流体内容物の 温度を監視する。流体が４５℃に達したならば、その後フラスコを４５℃に設定 した水浴に移し、１５分間維持する。その後、前記したように激しく攪拌しなが ら誘導した細胞を３８〜３９℃に２〜３時間維持する。誘導が成功したことは、 培養物に滴下したクロロホルムの目視によるクリアランスによって確認する。

２〜３時間の維持期間の後、４℃で１０分間４０００ｇの遠心分離により細胞を 混合物から回収する。この結果得られる上澄をデカントし、パスツールピペット および綿棒を用いて全ゆる残留する液体を除去する。遠心分離ボトルの壁をタオ ルで拭いて乾燥させる。ペレット化した誘導細菌細胞に対し、３．６ｍｌの新た に調製した超音波処理緩衝液を混合する。超音波処理緩衝液は、２０ｍＭ）’Ｊ スーＨＣＩ、ｐＨ８，０（トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタンヒドロク ロリド）、１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０（エチレンジアミンテトラ酢酸）およ び５ｍＭβ−メルカプトエタノールよりなる。細菌細胞ペレットを混合すること により超音波処理緩衝液に再懸濁して均一化した細胞懸濁物を形成する。

この結果得られる懸濁物を、後続する超音波処理のため小さい清浄なプラスチッ クチューブ（フアシヨン２０５４または２０５７、フアシヨン、オクスナード、 カリホルニア）に移す。マイクロチッププローブを使用して最大出力で１０秒間 衝撃により超音波処理によって細胞を破壊する。超音波処理のため、懸濁物を含 有するチューブを氷水に浸漬し、超音波処理緩衝液の温度が４℃を越えないもの とする。それぞれの超音波処理衝撃の間でサンプルを３０秒間冷却する。チュー ブ内の溶液が清澄となり、その粘度が減少するまで超音波処理手順を続ける。超 音波処理した細菌サンプルを遠心分離チューブに移し、４℃で１ｏ分間１２，０ ００ｇの遠−Ｃ，Ｊｙ＋離により残渣をペレット化して清澄な上澄を形成する。

プレヘッドを含有する得られた上澄を除去し、等量の超音波処理緩衝液および１ ／６容量の新たに調製したパッケージング緩衝液と混合して希釈したプレヘッド 混合物を形成する。パッケージング緩衝液は次のものよりなる：６ｍＭトリスー ＨＣＬ　ｐＨ８，０，５０ｍＭスペルミジン、５０ｍＭプトレシン、２０ｍＭＭ ｇＣｌｚ　、３０ｍＭＡＴＰ、ｐＨ７，０および３０ｍＭβ−メルカプトエタノ ール。その後混合物を１５μＩ画分にて予備冷却４℃１．５ｍｌミクロ遠心チュ ーブに分配する。その後ミクロ遠心チューブのキャップを閉じ、チューブを短時 間液体窒素に浸漬して凍結する。パッケージング緩衝液中の凍結したプレヘッド はその後長期間の保存のため一７０℃で保存する。

Ｂ、誘導イー・コリＢＨＢ２６８８Ｒ−細胞の凍結融解溶解物の調製パッケージ ング蛋白質供与体の抽出物を得るため前記実施例１ｂで調製したイー・コリＢＨ Ｂ２６８８Ｒ−の二次培養物を遺伝子型について確認し、イー・コリＢＨＢ２６ ９ＯＲ−調製について前記したように調製する。−夜培養物を維持し、同様に前 記したように溶原株を誘導する。

誘導されたイー・コリＢＨＢ２６８８Ｒ−細胞を、４℃で１０分間４０００ｇの 遠心分離によりペレット化する。この結果得られる上澄を除去し、全ゆる過剰の 液体を除去する。ペレット化した細胞を、合計３ｍｌの氷冷したショ糖溶液（５ ０ｍＭｈリスーＨＣｌ、ｐＨ８，０中ｌθ％シヨ糖）に再懸濁して細胞懸濁物を 形成する。この結果得られた細胞懸濁物を、４℃に予備冷却されたミクロ遠心チ ューブの６つのそれぞれに０．５ｍ１画分に分配する。２５μＩの新鮮な氷冷し たりゾチーム溶液（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ中の２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ ８，０）を、細胞懸濁物を含有するそれぞれのチューブに混合する。細胞−リゾ チーム混合物を穏やかに混合してイー・コリ抽出物を形成し、その後液体窒素に 浸漬して凍結する。

凍結チューブを液体窒素から除去し、抽出物を氷上で融解させる。前記調製した ２５μｍのパッケージング緩衝液を、融解した抽出物を含有するそれぞれのチュ ーブと混合してパッケージング緩衝液−抽出物混合物を形成する。別に調製した 混合物をその後遠心分離チューブ内で合わせ、４℃で１時間４５，０００ｇで遠 心分離してパッケージング蛋白質供与体を含有する上澄を形成する。

この結果得られる上澄を除去して、４℃で予備冷却したミクロ遠心チューブにｌ ＯμＩ画分に分配する。チューブのキャップを閉じ、その後チューブを液体窒素 に浸漬する。その後チューブを液体窒素から除去し、長期間保存のため一７０℃ で保存する。

３．２つの抽出物を使用する試験管内パッケージングの調製それぞれ実施例２ａ および２ｂで調製したプレヘットおよびパブケージング供与体を含有する凍結チ ューブを一７０℃の保存から除去し、氷上で融解させる。

蛋白質供与体を含有する凍結融解溶解物を最初に融解し、なお凍結している超音 波処理プレヘッド抽出物と混合してプレヘッド−蛋白質供与体混合物を形成する 。

この結果得られる混合物を殆ど全てが融解するまで穏やかに混合する。パッケー ジするＤＮＡ（５μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣＬ　ｐＨ８，０、ｌＯｍＭＭｇｃ Ｉ、に溶解した１℃１ｇまで）を融解して合せた抽出物と混合し、更に微細なガ ラス攪拌ロッドと混合してＤＮＡ−抽出物混合物を形成する。その後この混合物 を室温で１時間維持する。この混合物に、０．５〜１ｍｌのＳＭ　（３Ｍ緩衝液 は、１リツトルの脱イオン水に対し、５．８ｇＮａＣ１，２ｇＭｇ５Ｏ４−７Ｈ ｔ　０１５０ｍｌトリス−ＨＣＬ　ｐＨ７，５および５ｍｌの２％ゼラチン（ｗ ／ｖ）を混合し、ｐＨを７．５に調整することにより調製する）および−滴のク ロロホルムを添加して穏やかに混合する。ミクロ遠心で室温にて３０秒間１２， ０００ｇで遠心分離することにより残渣を除去する。この結果得られる上澄を除 去し、パッケージされたバクテリオファージＤＮＡ粒子を含有するものとする。

生存するバクテリオファージの滴定値は、適切な指標株上にプレートすることに より測定する。長さで９０％または８０％の野生型バクテリオファージλである 組換えＤＮＡは、それぞれ単位長さバクテリオファージλにより得られるものよ り２０倍〜５０倍低い効率によりパッケージされる。同じパッケージング抽出物 を、バクテリオファージλおよびコスミドの両者のパッケージングに使用するこ とができる。

４、トランスジェニックマウスの調製とその使用以下の研究は、トランスジェニ ック動物からの試験ＤＮＡ配列の迅速な回収および検査を達成するために、本発 明を実施し使用し得る様式の詳細を与えるものである。

Ａ、ＤＮＡ試験配列 試験配列ＤＮＡは、理論的には全ゆる数の種々の遺伝子または他の同定し得る試 験ＤＮＡ配列を含有することができる。ここに記載する原型では、イー・コリバ クテリオファージスゲノムを操作して、１ａｃＺ、β−ガラクトシダーゼ試験Ｄ ＮＡ配列を担持するものとした。λシャトルベクタＬ２Ｂ　（４６，５ｋｂ）、 またはＣ２Ｂ　（４８，０ｋｂ）を使用することができる。修飾λゲノムＬ２Ｂ の遺伝子型は、Ｌａｃ５デルタ（ｓｈｉｎｄＩＩＩλ２−３°）ｓｒｌλ３−５ ゜ｃＩ８５７ｓＸｈＬλｌ’　５ｓｃｌＩλ４°である。後記するようにこれを マウス胚にインジェクトする前に、このλＤＮＡをミリリットル当り１０マイク ログラムの濃度に希釈し、ＣＯＳ末端を主として環状λフアージモノマーを形成 する条件下でアニールして連結した。マニアナイスら、分子クローン化、実験室 マニュアル、Ｉ）Ｉ）、１０９−１１０．３８３−３８９　（コールド・スプリ ング・ハーバ−、ニューヨーク１９８２）。

また、λファージから容易に切除することができるブラスミ日記列を含有し、１ ａｃｌリプレツサ遺伝子を含有するＬ２Ｂの変種を構成することができる。この 変種は幾つかの利点を有する。第１に、後記論するように、変異を担持するファ ージの物理的同定が促進され得る。これらは、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ− チオガラクトーピラノシド）のないＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）の存在下で白色の背景上に青色のプ ラークとして生育し得るためである。またこの利点により単純化され、検定のコ ストが低減される。プレート当りのファージの密度の増加を可能とし得るためで ある。加えて、イー・コリのＩａｃＩ遺伝系は、ＤＮＡレベルで原核生物内の多 数の変異の研究を便利に可能とした最初の系であり（ミラーら、Ｊ、　Ｍｏ　Ｉ 。

Ｂｉｏｌ、１０９：２７５−３０２　（１９７７）、コウロンドレとミラー、Ｊ 。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋１７：２７５−３０２　（１９７７）、シャパー、Ｊ、Ｍ 。

１、Ｂｉｏｌ、１８９　：２７３−２８４　（１９８６））、ＩａｃＩの使用は 、変ものである。

Ｂ、トランスジェニック動物の創出 試験動物としてマウスを使用した。（ホーガンら、マウス胚子の操作：実験室マ ニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、１９８６）。前の 夜に妊娠させたメスのマウスから単細胞マウス胚子を回収した。胚子をヒアルロ ニダーゼで処理し、Ｍ１６培地中で短時間培養した。顕微鏡ガラス凹スライド上 で胚子をＭ２培地に移した。ホフマン光学系を備えたニコン・ディアホト顕微鏡 を使用し、４０×対物およびｔＯＸ接眼を用いて胚子を観察した。ミクロ鍛造に より丸めた保持ピペットを用いて胚子を所定位置に保持した。保持ピペットおよ びインジェクションピペットの両者の位置はマイクロマニュピレータを用いて調 節した。前記したＤＮＡを、ミリリットル当りｌ〜ｌＯマイクログラムの濃度で インジェクションピペットに装填した。前核の屈折性変化（ホーガンら、前記） により判断して約１ピコリツトルのＤＮＡ溶液をオス前核にインジェクトした。

ＤＮＡインジェクションの後、４００の胚子をＭ１６培地に移し、１〜２時間５ ％ＣＯｔ雰囲気で３７℃でインキュベートした。１５０の胚子がマイクロインジ ェクションの後に生き残っていた。溶解した胚子を廃棄し、正常と認められた３ ０の胚子を、５つの偽妊娠養育母親のそれぞれの輸卵管の１つに移した。この移 行は、全身麻酔（アベルチン）を使用して解剖顕微鏡の下で行った。

７つの子ネズミが生まれた。誕生の後、新たに生まれたマウスをその養育母親と 共に２週間保持し、その時点でこれらをその後離乳し、ＤＮＡ組込みを検索した 。尾部の２ｃｍの部分を除去し、０．１ＭＮａｃ１．５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、 ｐＨ７，５、ＩｍＭＥＤＴＡの２ｍｌの溶液中で短期間均一化したが、細胞およ び核膜の破壊には十分長いものとした。均一化した組織を、５０Ｕ／ｍ１ＲＮア ーゼＡおよび０．　１％ＳＤＳを用いて１５分間３７℃で処理した。この混合物 を３時間５５℃でプロテイナーゼに消化に露呈した後、フェノール／クロロホル ムにより３回抽出を行った。その後エタノールを添加することによりＤＮＡを沈 殿させた。沈殿したＤＮＡを１０ｍＭｔ−リスｐＨ８，０，０，５ｍＭＥＤＴＡ 中に再懸濁した後に、その幾分かをＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼにより消化し て、０．８％アガロースゲルを介して電気泳動した。ゲルを１時間１．５ＭＮａ Ｃ１，０，５ＭＮａＯＨ中に浸漬することによりＤＮＡを変性させた後、これを １．５ＭＮａＣＬ　０．５Ｍ）リス、ｐＨ７，４に３０分間浸漬することにより 中和した。その後ゲルをｌ０Ｘｓｓｃに１時間浸漬した。その後マニアナイス、 前記に記載されているようにサザンの方法によってＤＮＡをゲルからニトロセル ロースフィルタに移した。

移したＤＮＡのあるフィルタを、ニックトランスレーションの方法による標準的 手順により調製した！２ｐラベルしたλＤＮＡと一夜ハイブリダイズさせた。マ ニアナイス、前記。この−夜ハイブリダイゼーションの後、フィルタを０．１× ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄し、マウスゲノム内に存在するλＤＮＡ を同定するためこれに対してコダックＸＡＲフィルムを露呈させた。マウスゲノ ムＤＮＡの隣で電気泳動した標準として使用するλＤＮＡと、３２Ｐラベルした λＤＮＡにハイブリダイズしたトランスジェニックマウスＤＮＡとを強度につい て比較し、マウス細胞当りの試験ＤＮＡのコピー数を見積もった。この技術によ り３つのトランスジェニック動物を産生じ同定した。

テイルブロンティング法（ホーガンら、マウス胚子の操作：実験室マニュアル、 ｐｐ、１７４−１８３、コールド・スプリング・ハーバ−・ラポラトリイ、１９ ８６）による試験ＤＮＡ配列の存在について試験した新たに生まれたマウスは、 それらの尾部から単離されたＤＮＡ中に試験ＤＮＡ配列を担持することが認めら れた。誕生８週間後これらのトランスジェニックマウスを対合させ、試験ＤＮＡ 配列についてそれらの子孫を検査した。約５０％の得られた子孫が試験ＤＮＡ配 列を担持しており、元のトランスジェニックマウスは試験ＤＮＡ配列をその胚細 胞ラインに担持し、この配列は正常に受け継がれたことが示された。細胞当り試 験ＤＮＡ配列の約ｌコピーを有するトランスジェニックラインが得られたが、当 業者により、細胞当り複数のコピー数を得ることができ、多くの異なる応用に有 用たり得ることが理解されよう。

Ｃ９変異原処理 ６〜８週齢のトランスジェニックオスマウスを１日目と４日目に、ｋｇ体重当り １２５または２５０ｍｇＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥｔＮｕ）の腹膜内 注射により処理した。対照動物は、１０ｍ１／ｋｇ体重の１００ｍＭリン酸緩衝 液により注射した。最後の注射２時間後に組織を集めた。

ここに記載する態様では、マーカＤＮＡ配列の回収は、これをλバクテリオファ ージゲノム内に含有させることによって行った。試験管内パッケージング抽出物 により、全λバクテリオファージゲノムをマウス染色体から切除する。パッケー ジング抽出物は組込まれたλＤＮＡのＣＯＳ部位を認識し、図１に示すようにＣ ＯＳ部位の間の配列をλフアージ粒子にパッケージする。

試験ＤＮＡ配列は、トランスジェニックマウスの全ゆる組織から精製されたゲノ ムＤＮＡ内に認めることができる。試験ＤＮＡ配列はλフアージゲノム内に含有 されているため、λフアージパッケージング抽出物を使用することによりこれを 残余のゲノムＤＮＡから切除することができる。Ｌ２ＢまたはＣ２Ｂのようなパ ッケージされたλファージは、その後イー・コリ細胞上にプレートして更に評価 することができる。

バクテリオファージλＤＮＡは、感染性ファージ粒子の組立に必要な蛋白質を生 産する１以上の遺伝子を欠失するλファージを用いて感染された細菌から調製し た蛋白質抽出物を使用して試験管内でパッケージすることができる。典型的な試 験管内パッケージング反応は、μｇの無傷のバクテリオファージスＤＮＡ当りＩ Ｏ−プラーク形成単位（ｐ　ｆ　ｕ）の効率を日常的に達成することができる。

反応に存在するＤＮＡ分子の約０．０５〜０．５パーセントを感染性ウィルス粒 子にパッケージすることができる。

種々の遺伝的変異が、バタテリオファージλＤＮＡパッケージングの異なる段階 に影響を与える。例えば、Ｅ蛋白質はバクテリオファージヘッドの主要な成分で あり、最も初期の同定し得る前駆体の組立に必要である。Ｅ遺伝子におけるバク テリオファージ変異株（Ｅ−）は、ウィルスキャブジッドの全ての成分を蓄積す る。Ｄ蛋白質はバクテリオファージヘッドの外側に局在し、バクテリオファージ λＤＮＡの「プレヘッドＪ前駆体への挿入および後続するヘッドの成熟の共役プ ロセスに関与する。Ｄ遺伝子におけるバクテリオファージ変異株（Ｄ−）は、未 成熟プレヘッドを蓄積するが、バクテリオファージλＤＮＡのヘッドへの挿入は できない。Ａ蛋白質は、バクテリオファージλＤＮＡのバクテリオファージプレ ヘッドへの挿入およびＣＯＳ部位における連結した前駆体ＤＮＡの開裂に関与す る。Ａ遺伝子におけるバクテリオファージ変異株（Ａ−）も空のプレヘッドを蓄 積する。相補する抽出物か、Ａ−およびＥ−またはＤ−およびＥ−株により感染 された細胞から調製されており、また、八−変異株により感染された細胞から調 製された抽出物は、精製した野生型Ａ蛋白質の添加により相補され得る。

バクテリオファージスＤＮＡパッケージング抽出物は、バクテリオファージλＤ ＮＡの感染性ウィルス粒子へのパッケージングを可能とする蛋白質性組成物であ る。好ましくは、この発明で有用なλＤＮＡパッケージング抽出物は、少なくと も１０８、さらに好ましくは少なくとも１０”のｐｆｕ／μｇ無傷λＤＮＡのパ ッケージング効率を有するものである。

この発明のパッケージング抽出物は、適切な遺伝子型、例えば遺伝子Ａ％Ｄ１Ｅ 等におけるアンバー変異のバクテリオファージλ温厚株を含有する細胞から通常 は調製する。機能性１ａｃＺ遺伝子の欠失に加えて、有用な温厚株は好ましくは １以上の次の変異を有する： ｃｌｔｓ８５７一温度感受性バタテリオファージλリプレγす分子を特定するも のである。宿主細菌が３２℃で生育される場合、この変異によりλＤＮＡは温厚 状態で維持され、バクテリオファージの生育は、温度を一時的に４２〜４５℃に 上昇させてｃｌ遺伝子により特定されるリプレッサを不活性化することにより誘 導される。

Ｓａｍ７−細胞溶菌に必要なバクテリオファージＳ遺伝子のアンバー変異。この 変異により、ｃｌｔｓ８５７溶原株の誘導後２〜３時間の間キャブジッド成分は ５ｕｌＩＩ−細菌細胞内に蓄積される。

ｂ−領域欠損（ｂ２またはｂ１００７）−λＤＮＡ付着部位（ａｔｔ）を効率的 に除去するバクテリオファージゲノムの欠損。この変異により、完全にはなくな らないが、誘導された細胞から作成される抽出物中の内性λＤＮＡ分子のパッケ ージングが低減する。

ｒｅｄ３　（λ中）およびｒｅｃＡ（イー・コリ中）−バクテリオファージλお よび宿主の一般的な組換え系を不活性化する変異であり、これにより抽出物中の 内性λＤＮＡと外性添加組換えゲノムとの組換えが最小となる。

よって、好適な態様では、パッケージング抽出物を製造するのに有用なλ温厚株 は、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢ、ｈｓｄおよびｍｒｒ制限系の１以上を欠如するもので ある。これらの系からなる遺伝子は、形質導入、トランスポゾン（Ｔｎ）、変異 誘発等のような周知の方法により除去または不活性化することができる。

パッケージング抽出物は、通常は１以上の次の変異：ｍｃｒＡ−、ｍｃｒＢ−１ ｍｒｒ−１ｈｓｄＲ−を有する温厚性細菌から、好ましくはに−１２ムｍｃｒＢ 、ＢＨＢ２６９ＯＲ−またはＢＨＢ２６６８Ｒ−から調製し、適切な温厚性細菌 を３２℃で対数期の途上まで生育させ、温度を４５℃に１５分間上昇させること によりｃＩリプレッサ蛋白質を不活性化させることにより溶菌機能を誘導し、そ の後頁に２〜３時間３８〜３９℃で培養物を生育させてパッケージング成分を蓄 積させることによる。その後、更にここに記載するようにして細胞抽出物を調製 する。

２、変異誘発の試験 細菌をプレートするため、０．２％マルトースおよび１０ｍＭＭｇＳＯ４を補填 したＩＸＴＢ　（５ｇ／ＬＮａＣ１，１０ｇ／Ｌトリプトン）中、β−ガラクト シダーゼを欠如するイー・コリを３０℃で一夜生育させる。遠心分離により細胞 を回収し、プレート操作のため調製のｌ　０ｍＭＭｇＳＯ４に再懸濁する（マニ アナイス、前記）。

典型的な実験では、１〜５μｇのゲノムＤＮＡを試験管内λフアージパッケージ ング抽出物に露呈し、室温で２時間インキュベートする。パブケージング反応物 をその後５００μｍの３Ｍ緩衝液（１００ｍＭＮａＣ１，８ｍＭＭｇ５Ｏａ、５ ０ｍＭｈリス、ｐＨ７，５および０．０１％ゼラチン）中で希釈し、前記した細 菌を用いてインキュベートしく２．０ｍＬのＯＤ　ｓ。。＝０．５）、その後、 １．２５ｍｇ／ｍＬＸ−ｇａ　ｌおよび２．５ｍＭＩＰＴＧを含有する溶融頂部 寒天を用い、プレート当り２０，０００ｐｆｕ未満の密度でＮＺＹ／寒天ヌンク ・バイオアッセイ・ディツシュ（２４５ｍｍＸ２４５ｍｍｘ２０ｍｍ）上にプレ ートする。平板は３７℃で一夜インキユベートする。

β−ｇａｌ（ｌａｃｌではない）を含有するλゲノムについては、Ｘ−ｇａｌお よびＩＰＴＧの存在下で、λゲノム内のβ−ガラクトシダーゼ配列が変異してい なければ、ファージプラークは青色となる。しかしながら、ペトリ皿上の白色プ ラークまたは淡い青色プラークは、β−ガラクトシダーゼにおける変異が、例え ばリーディングフレームを変えたか、必須のコドンを変えたか、または配列中に 停止コドンを創出したことの証拠である。これらの白色または淡い青色のプラー クは変異について陽性であると計数し得て、これらは精製して更なる解析に供す るプラークとすることができる。白色または淡い青色対青色プラークの比率から バックグラウンドを差し引く（潜在的に変異誘発性の要因により処理されていな いマウスから抽出されたＤＮＡと比較した場合の、試験される要因の非変異誘発 性潜在性に由来する変異率。

試験ＤＮＡ配列回収効率は、マウス染色体内のＣｐＧメチル化の状態により影響 され得ることが予想される。高度にメチル化されたＤＮＡは、λパッケージング 抽出物によって効率的に切除され得ない。恐ら＜　ＣＯＳ部位における切断の阻 害、λフアージ上にコードされたλ遺伝子の発現の阻害、またはイー・コリ制限 系による制限のためである。これは、ＣＯＳ部位のような臨界的な部位の近（に 転写性エンハンサ、プロモータおよび／または他のメチル化を阻害するＤＮＡの 領域を配置してＣｐＣメチル化を低減することにより緩和され得る。薬物５′〜 アザシチジンも、ＤＮＡ精製および回収の前に標的細胞におけるＤＮＡメチル化 のレベルを低減するのに使用することができる。ジャエニシュ・アールら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：１４５１−１４５５　（１ ９８５）。この種の手順では、意図する試験ＤＮＡ配列を含有する生物から繊維 芽細胞ラインを得る。アダムス・アール・エル・ピー、生物学者のための細胞培 養、第６８−８３頁（１９８０）、エルセルビニル／ノース・ホラン・バイオケ ミカル・プレス）。５０ＲＭ５’アザシチジン補填培養培地内で、細胞を３７℃ で試験管内で露呈する。ＤＮＡ複製に際して、娘ＤＮＡはそのＣｐＧメチル化を 喪失し、これにより標的ベクタがλファージの場合、標的ベクタ中の部位のメチ ル化が除去される。これらの繊維芽細胞に由来するＤＮＡを、前記したようにそ の後試験管内パッケージング抽出物に露呈する。

その他、試験ＤＮＡ配列を含有する生物に、０．１５ＭＮａＣ１中の５′−アザ シチジンの１ｍｇ／ｍｌ溶液を直接注入することができる。これは合計４００μ ｇ投与を用い、少なくとも約４日の期間に渡って行う。ジャエニシュ、前記。

この処理の後、ＤＮＡを種々の組織から抽出して前記したようにパッケージする ことができる。

２、パッケージング抽出物およびプレート株制限系の除去試験ＤＮＡ配列回収の 効率は、パッケージング抽出物を生成するのに使用する細菌株および変異誘発試 験に使用するプレート株の両者の遺伝子型に依存することを決定した。これは、 細菌細胞が外来ＤＮＡを同定しエンドヌクレアーゼ開裂により不活性化すること を可能にする宿主調節制限系による。特定のヌクレオチドのメチル化のような修 飾により保護されていない限り、ＤＮＡは宿主のエンドヌクレアーゼ活性により 制限を受ける。特定のヌクレオチドのメチル化は通常は宿主のエンドヌクレアー ゼ分解活性による制限からＤＮＡを保護するよう働くが、幾つかのＤＮＡ配列に おけるメチル化は、実際に制限に対する感受性を与える。

１つの例として、イー・コリに−１２のｍｃｒＢ制限系は、５−メチルシトシン 残基を含有する外来ＤＮＡの生物学的不活性化に関与する。ロスら、Ｊｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７１：１９７４−１９８１（１９８ ９）。

イー・コリに内性の多数の制限／メチル化系があり、これらはエンドヌクレアー ゼ開裂により外来ＤＮＡを不活性化することができる。最も広範に知られている 系はｈｓｄ　（バイクル・ティ、ヌクレアーゼ、第８５頁、コールド・スプリン グ・ハーバ−・ラボ、コールド・スプリング・ハーバ−１Ｎ、Ｙ、１９８２）、 ｍｒ　ｒ　（ハイドマン・ジエイら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：３２４ ３−３２５０　（１９８７））、ｍｃｒＡ（ラレイら、ＰＮＡＳ、８３：９０７ ０−９０７４　（１９８６））およびｍｃｒＢ（ラレイ、前記）である。ｈｓｄ 系は、配列、Ａ””　ＡＣＮＮＮＮＮＮＧＴＧＣまたはＧＣ””　−ＡＣＮＮＮ ＮＮＮＧＴＴのＮ−６位置でアデニンメチル化により保護されていないＤＮＡを 選択的に制限することにより作用する。ｍｒｒ系はアデニンメチル化にも関与す るが、この場合はメチル化はＤＮＡを保護するようには働かず、制限系に対して 感受性のＤＮＡを作成するように働く。系ｍｃｒＡおよびｍｃｒＢは、これらが メチル化されたＤＮＡを認識して制限する点でｍｒｒに類似する。しかしながら 、これらの２つの系は、これらがメチル化されたシトシンを認識する点でｍｒｒ と異なる。更に、ｍｅｒＢの機能は少なくとも２つの遺伝子産物、ｍｃｒＢおよ びｍｃｒＣにより与えられる（ロスら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１　：ｌ ９７４−１９８１（１９８９））。ｍｃｒおよびｍｒｒの認識配列は文献中に企 図されているが、正確な配列は未だ知られていない。

トランスジェニック動物ゲノムからのＩａｃＺ構成物の回収の効率は、５−アザ シチジンを使用することなく、λパッケージング抽出物および真核ＤＮＡを切断 する制限系を欠失するイー・コリプレート株を使用することにより増加すること を突き止めた。これらの制限系を除去することにより、回収効率は、少なくとも １２．０００ｐｆｕ／μｇゲノムＤＮＡまで増加した。勿論、当業者であれば、 これらの制限系の「除去」はこれらの制限系の活性を欠損または阻害することに より行うことができ、また「制限系欠如」という用語は、限定するものではない が、いずれかの方法による制限系の除去を包含することを認識し得る。さらに、 これらの制限系を欠如する天然に存在するイー・コリの株を単離して使用するこ とができる。

イー・コリ制限系に関与する遺伝子の同定は、λファージを回収する能力に対す るある種のイー・コリ株の阻害効果の検査により達成された。関与する遺伝子の 単離は、中断対合およびＰＩ形質導入を使用することにより達成した。イー・コ リに一１２中のＤＮＡの約２００ｋｂ領域が、回収されたベクタのプレート効率 に対して阻害効果を与えることが認められた。更に、回収効率の減少に関与する 領域は、ｍｃｒＢおよびｍｃｒＣを含有する約２．６ｋｂのｍｃｒＢ領域内のイ ー・コリに一１２遺伝的地図の９８分付近にあることが認められた（バフマン・ ビー、イー・コリとニス・チフィムリウム：細胞および分子生物学、ナイドハー トら編、ＡＳＭ、ＷＡ、ＤＣ，１９８７）。

異なる制限遺伝子型によるイー・コリ株を使用する回収効率の比較を表１に示す 。表１に挙げた細菌株は、次の供給元または参照物から入手可能である：ＥＤｇ ７６７　（、インウラーエムら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７６：１１７− １２７　（１９８ｇ）、ＥＲ１４５１にニー・イングランド・バイオラプス、ベ ベリイ、ＭＡ）　、ＬＣＫ８　（ビー・バフマン、エール・イー・コリ・センタ ー）、８Ｍ６２１　（エヌ・ムライ、エノンバラ大学）、Ｋ２Ｏ２、ＬＥ３９２ 、ＮＭ５５４、ＰＬＫ−Ａ、ＰＬＫ−１７、Ｙ２Ｏ２Ｓ、イー−７ＩＪｃ、シュ ア（ストラタジーン、う・ホヤ、ＣＡ））。

表１ 翌　制限遺伝子型　プレート効率 匠赴　皿３　匹ｊ　−１ 株ＲＲ１−Ａおよびに−１２ムｍｃｒＢは以下に記載するように構成する。

株ＲＲ１−Ａは、受容体として株ＲＲＩ（マニアティス、前記）（関連する遺伝 子型＝ｍｃｒＡ＋　（ｔｅｔｓ））　、供与体としてｍｃｒＡ遺伝子遺伝表中は 近（に）ＴｎｌＯ（テトラサイクリン耐性）を担持するいずれかのイー・コリに 一１２株（関連する遺伝子型＝ｍｃｒＡ：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ”））を用いて構成 する。工程ｌ：前記したイー・コリに一１２株からＰ１溶解物を作成する。工程 ２：ＲＲＩを形質導入する（ミラー・ジエイ、分子遺伝学の実験、コールド・ス プリング・ハーバ−・ラボ、コールド・スプリング・ハーバ−１二ニーＥ−’７ 　（１９７２））。工程３：テトラサイクリン耐性コロニーを選択し精製する。

工程４ボフナー平板（ボフナー・ビー・アールら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１ ４３：９２６−９３３　（１９８０））上でテトラサイクリン耐性の喪失を選択 し、コロニーを精製する。工程５：ｍｃｒＡ制限活性の欠失を、ＨｐａｌＩメチ ラーゼ（ラレイ、前記）により試験管内メチル化したｐＢＲ３２２に対して非メ チル化ｐＢＲ３２２の形質転換効率を比較することにより試験する。ｍｃｒＡ十 株は、メチル化されたプラスミドにより大きく低減された効率を示し得る。ｍｃ ｒＡ活性が存在しない場合、その後この株をＲＲｌ−Ａと呼ぶ。

関連する遺伝子型ｍｃｒＢ：　：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ”）、ｍｒｒ：　：Ｔｎ５　 （Ｋａｎ”）およびｍｃｒＡ：　：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ”）を有する２つの供与体 イー・コＩＪＫ−１２株、および関連する遺伝子型ｒｅｃＡ＋、ｔｅｔ’を有す る受容体イー・コリに−１２を使用して株に−１２ムｍｃｒＢを構成する。工程 １〜５：ＲＲＩ−Ａの構成について前記したように工程１〜５を行う。工程２に おいて、いずれかのイー・コリに一１２ｒｅｃＡ＋株を形質導入する。工程６： ｍｃｒＢ遺伝子内にＴｎｌＯ（ｔｅｔ”）を担持するイー・コリに一１２株から ＰＩ溶解物を作成する。Ｋ−１２ｒｅｃＡ＋　（ｔｅｔｓ）株を形質導入する。

工程８：ｔｅｔ”コロニーを選択する。ｋａｎ”でもある１つのコロニーを精製 する。工程９：ボフナー平板（ボフナー、前記）上でｔｅｔ”の喪失について選 択する。工程１０：幾つかのコロニーを精製し、テトラサイクリンおよびカナマ イシンに対する感受性について試験する。ｔｅｔ’およびｋａｎ”の両者である コロニーを選択する。工程１１：ｍｃｒＡｔｅｔについて行ったようにｍｃｒＢ 制限活性の欠失について試験するが、ただしこの場合は、ｐＢＲ３２２はＡｌｕ ｌメチラーゼにより試験管内メチル化しなければならない（ラレイ、前記、ロス 、前記）。

ｍｃｒＢ十株は、メチル化されたプラスミドにより大きく低減された効率を示す こととなる。Ｐｓｔｌメチラーセ（ハイドマン、前記）により生体内メチル化し たλに対してλのプレート効率を比較することによりｍｒｒ制限活性について試 験する。ｍｒｒ十株は、メチル化されたλにより低減された効率を示すこととな る。ｈｓｄメチラーゼ（ウッド・ダブリュ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１６　 ：　１１８−１３３　（１９６６）、アダニス、バクテリオファージ、ニューヨ ーク：インターサイエンス１９５９、バイクル、前記、第９５−１００頁）によ り試験管内メチル化されたλに対してλのプレート効率を比較することによりｈ ｓｄＲ制限活性を試験する。１１ｓｄＲ＋株は、非メチル化λにより低減された 効率を示すこととなる。株（精製コロニー）が全ての制限活性、すなわちｍｃｒ Ａ、ｍｅｒＢ、ｍｒｒ、ｈｓｄＲを欠如しこの方法により構成された場合は、こ れはｍｃｒＢ領域に渡る欠損を含有するものである（ムｍｃｒＢ）。これもマウ スから回収されたλを極めて効率よ（プレートし得る。この株をに−１２ムｍｃ ｒＢと呼ぶ。

表１の記号「ム」は、株がｍｃｒＢ領域に大きい欠損を含むことを示す。表１に 挙げた他の全てのｍｃｒＢ−株はに一１２誘導体であり、ｍｃｒＢ領域に小さな 変異を含有すると考えられるが、イー・コリＣは例外であり、これはに−１２ｍ ｃｒＢ領域を含有せず、またＲＲｌ−Ａはイー・コリＢの野生型ｍｃｒＢ座を担 持するものである。これらの株の全ては等しい効率（１〜４倍以内）でＬ２Ｂフ ァージ（マウスから回収されるより寧ろｈｓｄＭ＋イー・コリに一１２内で増幅 される）をプレート調節することが知られている。回収Ｌ２Ｂファージは、マウ スゲノムからｍａｒ−イー・コリに一１２λパッケージング抽出物（ギガパック ＩＩ−ストラタジーン、う・ホヤ、ＣＡ）を使用して回収し、示した細菌株上に プレートした。ファージの「＋」プレート効率は約５００ｐｆｕ１０．０５μｇ のトランスジェニックマウスゲノムＤＮＡが認められたことを示すが、「−」プ レート効率は５ｐｆｕ１０．０５μｇ未満のトランスジェニックマウスゲノムＤ ＮＡが認められたことを示す。また（＋）はｍｒｒ活性がＹ２Ｏ２Ｓ内で確認さ れなかったことを示すことを銘記する。

ｄＣメチル化されたλ相ゲノムの阻害に関与するＤＮＡの領域をより正確に決定 するため、イー・コリに一１２ＬｃＫ８の９８分領域をクローン化した。部分的 ＬＣＫ８ゲノムライブラリーをｐＯＵ６１ｃｏｓ中で作成しくクノット・ブイら 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６：２６０１−２６１２（１９８８） ）、ギガパック”ＩＩＸＬ（ストラタジーン、う・ホヤ、カリフォルニア）を用 いてパッケージし、イー・コリＣ上にプレートした。９８分領域を含有するクロ ーンは、ｈｓｄ領域（ボウ、ジェイ・ニーら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６： １−１９（１９８３））に特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＴＧＡＧＴＧＣＧＧ ＧＧＡＡＡＴＴＧ）プローブを使用するコロニーハイブリダイゼーションによっ て同定した。ファージのプレート効率について試験する場合は、全てのクローン を宿主ＲＲ１−Ａ内で増殖させた。図３、パネル３Ａおよび３Ｂにおいて示すよ うに、ｍｃｒＢ遺伝子を含有する２、６ｋｂ断片に活性を単離した。オーブンリ ーディングフレーム（ロスら、前記）を含むｍｃｒＢ領域を図３Ａに示す。これ らの群に対応するサブクローンをその直ぐ下に示す。左に離れた表は、右に示し たＤＮＡ断片に関連する情報を与えるものである。（図３Ａおよび３Ｂに示した 制限マツプは、イー・コリＫ１２染色体のＭｃｒＢ領域に隣接するｈｓｄＳ遺伝 子の位置を示すものであり、ロス・ティら、Ｊ、Ｂａｃｔ、１７１：１９７４− １９８１（１９８９）からのものである）。

表１の結果は、９８分領域の制限活性は回収効率に対して消極的な効果を有する という観察を支持する。高いプレート効率を得るためには、最も普通に使用され るｍｃｒＢ実験室実験室性するｍｃｒＢの小さな変異に反して、９８分ｍｃｒＢ 領域の完全な欠損（ｍｃｒＢ乃至ｍｒｒ）が好適である。これは、これらのｍｃ ｒＢ−株により示されるｍｃｒＢ−表現型（検定としてＡＬｕｌメチラーゼ修飾 ｐＢＲ３２２形質転換を使用する（ロス、前記））にも拘らず、ｍｃｒＢ領域の 幾分かの阻害活性が残るためである。完全な欠損は至適の効率に帰着し、真核修 飾ＤＮＡを使用して回収効率において１０００倍より大きい改良を説明するもの である。

トランスジェニック動物ゲノムから１ａｃＺ構成物を回収する好適なイー・コリ 株は５ｃｓ−８Ｃｆｙ９ｏ’ｊ番号２００，２８８）およびｖＣ８２５７（カタ ログ番号２００．２５６）であり、これらはストラタジーン・クローニング・シ ステムズから市販されており、またキットにも含まれている（ビッグ・ブルーＴ ′・マウス変異誘発システム、カタログ番号７２０，０００）。５Ｃ８−８は次 の遺伝子型を有する：　ｒｅｃＡＬ　ｅｎｄＡｌ　ｍｃｒＡ、ム（ｍｅ　ｒ　Ｂ Ｃ−ｈ　ｓ　ｄＲＭＳ−ｍｒｒ）、ム（ａｒｇＦ−１ａｃ）Ｕ１６９、ｐｈｉ８ ０ムＩａｃＺムＭ１５、ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’）、５Ｃ８−８はｌａｃＺＡＭ１５ 遺伝子を与えるものであり、これにより５ＣＳ−８がパッケージされたバクテリ オファージにより感染された場合にα−相補を可能とするものである。この発明 で使用するための１ａｃＺＡＭ１５遺伝子型を含有する更なる市販のイー・コリ 株には次のちのが包含される：ＸＬｌ−ブルー（ストラタジーン、カタログ番号 ２００．２３６）、シュアＴＭ（ストラタジーン、カタログ番号２００，２３８ ）　、ＰＬＫ−Ｆ’（ストラタジーン、カタログ番号２００，２３７）、ＪＭｌ ｏｌ　（ストラタジーン、カタログ番号２００，２３４ＬＪＭ１０９　（ストラ タジーン、カタログ番号２００，２３５ＬおよびＮＭ５２２（ストラタジーン、 カタログ番号２００゜２３３）。

ｍｃｒＢ欠損株の使用が、変異誘発試験および哺乳動物細胞からのλフアージＤ ＮＡの回収で使用するためここで記載されているが、制限系欠如株を他の真核Ｄ ＮＡクローン化の試みに使用し得ることは明らかである。

勿論、任意の数または種類の試験ＤＮＡ配列または遺伝子をλＣＯＳ部位の間に 挿入することができる。試験管内パッケージング抽出物は、なおＣＯＳ部位の間 のＤＮＡを切除し、これをλフアージ粒子にパッケージする。よって、種々の組 換えλゲノムまたはニスミドをこの切除の場合に使用することができる。

β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子の破壊に起因する白色プラークの生 成により明らかとなる変異は、変異原の変異率を決定するのに有用であるが、Ｄ ＮＡ内の特定の変異に関する情報は殆ど与えない。更に、特定の変異の解析は、 試験β−ｇａｌ遺伝子の大きさくすなわち約３２００ｂ、ｐ、）により幾分阻害 されている。

手順の効率性の増加を促進するため、標的λファージが低減された大きさくすな わち約ｔｏ００ｂ、ｐ、を有する１ａｃＩ遺伝子）を有する標的遺伝子、および 配列解析のためにλファージからプラスミドベクタへ標的遺伝子が移行される迅 速な手段を与えるよう作成することかできる。

Ｉａｃｌおよびβ−ｇａｌ遺伝子の両者をλベクタ内に挿入するが、その際、１ ａｃＩ遺伝子内で変異が生起する場合、リプレッサ活性が喪失され、これにより β−ｇａｌ遺伝子が発現されてＩＰＴＧの非存在下で青色プラークを生成させる ものである。記載した態様では、ベクタ内で１ａｃＺ遺伝子のα部分の上流にＩ ａｃＩ遺伝子を位置させる（ミラー・ジエイ・エッチとレズニコフ・ダブリュ・ ニス、ザ・オペロン、第２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ 、１９８０、ｐｐ、１０４−１０５）。宿主イー・コリ（これはバクテリオファ ージベクタにより感染される）がＩａｃＺ遺伝子（ｌａｃＺＡＭ１５として言及 される）（ミラー・ジエイ・エッチとレズニコフ・ダブリュ・ニス、前記）の相 補的部分を与えると、これら２つの部分的遺伝子により合成された産物が組合せ られて機能性β−ガラクトシダーゼ蛋白質（α−相補として言及される）を形成 し、Ｘｇａｌの存在下で青色のプラークを生起する（ｌａｃＩ遺伝子に変異が起 った場合、またはＸｇａ　１およびＩＰＴＧの存在下、１ａｃＩ遺伝子が変異さ れていない場合）。宿主により与えられた１ａｃＺ遺伝子のムＭ１５部分は、エ ピゾーム的に（低コピー数プラスミドまたはＦ−因子を介して）与えられるか、 または細菌染色体に安定に組込まれる。］ａｃＺのα部分を使用するのは、■） α−相補により形成されるβ−ｇａｌ蛋白質は隣接する蛋白質より活性が弱いこ とが知られており、Ｉａｃｌによる不十分な抑制によるバックグラウンド青色プ ラークの可能性を最小とするためであり、また２）この遺伝子を変異誘発研究に 使用すべき際により小さく従ってより容易に特徴付けられる１ａｃＺ標的を提供 するためである。この系における宿主イー・コリの要件は次の通りである：１ａ ｃｌ（−）、ｌ　ａ　ｃ’ＺＡＭ１５、制限（−）。全てのクローン化工程は図 ４〜８に概説し、標準的な手順を使用して行う（サンブロック・ジエイら、分子 クローン化、実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・／Ｘ−バー・ ラボラトリイ、１９８９）。

記載する態様は、Ｉａｃｌを備えるＩａｃＺのα部分を利用するものである。

誘導を所望するまで１ａｃｌによる完全な抑制を維持する手段を与えることによ り、完全な１ａｃＺも使用することができる。これは種々の方法によって行うこ とができ、バクテリオファージによる感染の後数分まで宿主イー・コリ中で１ａ ｃＺ発現を妨害し、１ａｃＩレベルが適切なレベルまで高まって完全な抑制を特 徴とする特異的プロモータ（ＰＲ’　）によるムＭｌ　５１ａｃＺ発現の調節が 包含される。加えて、低レベルのＩａｃリプレッサを宿主内に維持して誘導が起 るまで１ａｃｌによる抑制の際に補助することができるが、１ａｃＩにおける変 異または系に対するＩＰＴＧの添加によるものである。第３の代替は、より高い 比活性を有するリプレッサ蛋白質を生成する改変１ａｃＩ遺伝子を使用するもの であり、これによりβ−ガラクトシダーゼ生産のより強力な抑制が可能となる。

クローン化手順のための出発材料の供給源は次の通りである：ｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔｌｌｓＫ＋および５Ｋ−１ｐＢＳ（＋）、λｇＮ１およびλＬ２Ｂはスト ラタジーン・クローニング・システムズ、う・ホヤ、ＣＡから入手し得る。

λＬ４７．１およびｐＰｒｅＢ　ニジヨード・ジエイ・エムら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ、１６：７５８３−７６００゜ｐＭＪＲｔ　５６０はアマジャ ム・コーホ、アーリントン・ハイ゛人イリノイから入手し得る。

λベクタ内の変異誘発された１ａｃＩ遺伝子の迅速な配列決定は、λベクタ内に 「λＺＡＰＪ切除配列を組込むことにより促進される。（ショート・ジエイ・エ ムら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６：７５８３−７６００　（１９ ８８）。λＺＡＰは、プラスミドに対してλベクタからの挿入物の生体内切除を 可能とするλフアージベクタである。これは、λファージがｆｌノくクテリオフ ァージ複製開始点の２つの二分割物を含有するため可能なものである。ｆｌヘル ツく一ファージにより供給された蛋白質の存在下で、２つの部分的なｆｌ開始点 の間に存在するＤＮＡはλファージから自動的に切除される。２つの二分割物は 一緒になって無傷のｆ１開始点を形成する。この結果得られるファージミドはＣ ｏ１Ｅｌ複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有し、よって挿入物はプ ラスミドベクタに効率的にサブクローン化される。２つの部分的なｆｌ開始点の 間の全ての配列は数時間以内にプラスミドとして切除される。

変異解析ベクタにおいては、これらのｆｌ開始点は、１ａｃＩ遺伝子がマウスゲ ノムＤＮＡ由来のλファージから自動的に切除され得るよう配置される。このフ ァージからプラスミドへの変換の後、他の公知の方法によって挿入物を迅速に配 列決定し、または特徴付けすることができる。１ａｃＩ遺伝子内の多数の変異の 特徴付けは、標準的な技術を使用する数か月に対して、マウスゲノムＤＮＡの単 離の後３日以内に完成することができる。

ここに記載する例では、λＺＡＰは、試験ＤＮＡ挿入物をλベクタ内における一 体化からプラスミドへ変換するのに使用する。他の系も使用することができるが 、これらは切除およびＤＮＡの線状配列の再環化を可能とすることにより迅速な 手段を与え、これを用いて試験ＤＮＡ配列をファージから解析に安定な形態へ移 すことができるものである。この種の他の系には、限定されるものではないが、 ＦＬＰ−媒介（セネコフ・ジエイら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 。

ＵＳＡ、８２ニア２７０−７２７４　（１９８５）、ジャヤラム・エム、Ｐ　ｒ 　ｏ　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：５８７５−５８７９　（１９８５ ）、マクレオド・エム、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、６：３３５７−３３６７ 　（１９８６Ｌ　レブレトン・ビーら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１８：３９３−４ ００（１９８８）　）またはＣｒｅ−１ｏｘ部位特異的組換え技術（ホエス・ア ールら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８１　：３５１−３６２　（１９８５）、ホ エス・アールら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１　：１ ０２６−１０２９（１９８４））の使用が包含される。

前記した態様はイー・コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を試験ＤＮＡ配列として 利用するものであり、これは観察される変異について陽性および陰性である表現 型を可能とするものである。他の可能な試験ＤＮＡ配列には（限定されるもので はないカリ、１ａｃｌリプレツサ、ｃｌリプレッサ、全ゆる抗生物質耐性遺伝子 配列（アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシン、クロラ ムフェニコール等）、λｒｅｄおよびｇａｍ遺伝子配列、チミジンキナーゼ遺伝 子配列、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子配列、 制限酵素またはメチル化酵素をコードする配列、ルシフェラーゼをコードする遺 伝子配列、および／またはｔＲＮＡ停止コドンまたはフレームシフトサプレッサ 遺伝子配列が包含される。

ＣＯＳ部位を除去する更により一般的なモデルを作成し得るが、ただし切除機構 はここで異なるものとなる。図２に示すように、便利な制限部位を用いて試験Ｄ ＮＡ配列ブラケットを付けることにより、試験配列を制限酵素によってマウスＤ ＮＡから分離し、その後ＣＯＳ部位を含有するλまたはニスミドベクタと連結す ることができ、または試験配列が複製開始点に結合されている場合、これを直接 形質転換することができる。試験ＤＮＡ配列と共にλフアージ複製に必要な配列 を包含させ、その後これを試験ＤＮＡ配列と共にその配列が欠如するがまたは不 全であるλゲノムにクローン化することにより、この種の系においてバックグラ ウンドを低減することができる。

５、標的遺伝子系を含有する修飾λゲノムの調製λＬＩＺαと命名する修飾λゲ ノムを、図４〜８に示す一連の分子遺伝子操作により調製する。

図４はｐＢＩｕｅＭＩ−の構成を示す。部位指向変異誘発を使用してｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＳＫ−（ストラタジーン、う・ホヤ、カリホルニア）を修飾し、Ｌ ａｃＩ遺伝子のオーブンリーディングフレームに位置５′で、ただしｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ上に存在するアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏ１Ｅｌ複製開始点 の下流で、ＡｖａＩＩＩ制限部位を導入してｐＢｌｕｅＭＩ−を形成する。

図５はｐＬａｃｌｑの構成を示す。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｌｌ５Ｋ＋　（ス トラタジーン）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化するが、この 両者はポリリンカ領域内で切断し、ポリリンカから誘導される小断片を欠如する 線状化されたｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｓＫ＋を形成するものである。制限酵素Ｐ ｓｔｌおよびＥｃｏＲＩを用いてｌ）ＭＪＲ１５６０（アマジャム・コーポレー ション、アーリントン・ハイツ、イリノイ）を消化し、ＬａｃＩｑ含有断片を放 出させ、これをアガロースゲル電気泳動により分離してゲルから溶出させる。そ の後１ａｃｌｑ含有断片を、線状化したｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔｓＫ＋に連結し てｐＬａｃｌｑを形成する。

図６はｐｉｎｔ、１の構成を示す。多重クローン化部位（ポリリンカ）を特定す る二本鎖ＤＮＡ断片を、合成オリゴヌクレオチド合成およびアニーリングにより 製造する。ポリリンカはＸｂａｌ、ＫｐｎｌおよびＰｖｕＩ部位に隣接する２つ のＡｖａ　Ｉ　１１部位を含む多重制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有する ものである。ポリリンカをＡｖａＩＩＩにより消化してポリリンカ上にＡｖａＩ ＩＩ付着末端を形成する。ｐＢｌｕｅＭＩ−をＡｖａ　Ｉ　Ｉ　Ｉにより消化し 、ポリリンカをｐＢｌｕｅＭＩ−に連結し、ＡｖａｌｌＩ部位にＰｖｕＩ部位を 導入してｐＩｎｔ、ｌを形成する。

図７はｐＰｒｅＬａｃＩｑＺ　（ｐＰＲＩＡＺ）の構成を示す。その終端に対し 、ショートら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：７５８３−７６００　（ １９８８）により記載されたようにｐＰｒｅＢを最初に調製する。

ｐＰｒｅＢを調製するため、ヤニシューペロンら、Ｇｅｎｅ、３３　：１０３− １１９（１９８５）にＪ、り記載サレタフラスミドｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ＃３７ ２５４）をＥｃｏＲＩを用いて消化し、脱リン酸化し、相補的オリゴヌクレオチ ド（マクアリスターら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４８２１−４８３ ７（１９８０）に記載されたように、それぞれ和合性ＥｃｏＲＩ末端を有し、Ｔ ７ＲＮＡポリメラーゼブロモー夕を特定する）に連結し、ＲＮＡ合成がｐＵｃ１ ９の多重クローン化部位に向かうよう配向したＴ７ブロモータを有するｐＪＦ３ を形成した。ｐＪＦ３をＨｊｎｄＩＩＩにより消化し、脱リン酸化し、モリスら 、Ｇｅｎｅ、４１：１９３−２０００　（１９８６）によって記載されたように 、ＨｉｎｄＩＩＩ和合性末端を有し、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータを特定 する相補的オリゴヌクレオチドに連結した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　（ｐＢＳ ）と命名したこの結果得られたプラスミドを単離したが、これはｐＵＣｌ　９の 多重クローン化部位にＲＮＡ合成を向けるよう配向したＴ３プロモータを含有し ていた。

その後ｐＢＳをＡａ　ｔ　Ｉ　ＩおよびＮａｒｌにより消化し、マングビーンヌ クレアーゼおよびアルカリホスファターゼを用いて処理し、プントら、Ｎｕｃｌ 、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１：１６４５−１６５５（１９８３）により記載され たｐＥＭＢＬ８プラスミドから単離した４５６塩基対（ｂｐ）Ｒｓａｌ／Ｄｒａ Ｉ　Ｉ平滑末端断片に連結した。４５６ｂ［）断片はｆｌファージの遺伝子内領 域を含有するが、ｆ１遺伝子ＩＩプロモータ配列は含有しない。この結果得られ た連結混合物から７フーンミドクローンを単離し、遺伝子内領域の両者の方向性 （＋または−）を含むクローンを単離し、ｐＢＳ（＋）またはｐＢＳ（−）と命 名したが、ここで「＋」は遺伝子内領域がＩａｃＺ遺伝子と同じ方向性にあるこ とを示すものである。それぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩを用いて消化し た後、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレニュー断片を用いて平滑末端とすることによ りｐＢＳ（−）およびｐＢＳ　（＋）からｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｓＫ　（−） およびＳＫ（＋）をそれぞれ製造した。ショートら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、１６：７５８３−７６００　（１９８８）により記載されたように２１の 独特の制限部位を含む平滑末端とした合成ポリリンカに平滑末端とした分子を連 結し、それぞれｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｓＫ　（−）またはＳＫ　（＋）を形成 した。ｆｌ遺伝子内領域のターミネータ部分の大部分は、ｐＥＭＢＬ８から単離 されるＲｓａｌ（位置５５８７）乃至ＨｉｎｆＩ（位置５７６７）制限断片に含 有される。残るターミネータ配列は、ショートら、前記に記載されたように合成 オリゴヌクレオチドを調製し、完全なターミネータ、遺伝子ＩＩ切断シグナルお よびＥｃｏＲＶおよびＮｄｅｌについての独特の制限部位を与えることにより提 供された。合成オリゴヌクレオチドおよびＲｓａＩ／Ｈ４ｎｆＩ断片を、ｐＢＳ から得られた３００９ｂｐＤｒａＩ／ＮｄｅＩ断片と連結してプラスミドｐＢＳ Ｔ−Ｂを形成した。

ｆｌ遺伝子内領域のイニシェークドメインは、５ａｕ９６１およびＤｒａ　Ｉを 用いてｐ　ＥＭＢ　Ｌ　８を消化して２１７ｂｐ断片を形成し、その後これをフ レニューにより平滑末端とした後に、Ｉ）ＢＳＴ−ＢのＮａｒＩ部位にサブクロ ーン化してｐＢｓＩＴＯ＃１２を形成することにより別々にクローン化した。ｐ ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓＫ（−）をＮａｅＩを用いて消化し、部分消化してｆｌ 複製開始点に隣接して位置するＰｖｕＩ部位でのみ切断し、ｆｌ複製開始点を欠 失するこの結果得られる断片を単離した。ｆｌ遺伝子内領域のターミネータおよ びイニシェーク領域を含むｐＢＳＩＴ○＃１２のＮａｅＩ／Ｐｖｕｌ断片に単離 した断片を連結してプラスミドｐＰｒｅＢを形成した。

ＫｐｎＩおよびＸｂａＩを用いてλｇｔ　ｌ　１　（ＡＴＣＣ＃３７１９４）を 消化し、ＬａｃＺ遺伝子を含有する６、３キロベース（ｋｂ）断片を製造し、こ れをアガロースゲルにより精製した。前記調製しストラタジーンから入手可能の ｐＢＳ（＋）をＫｐｎｌおよびＸｂａｌを用いて消化し、この結果得られたＬａ ｃＺ断片をｐＢＳ（＋）に連結してｐＢＳ　（ＬａｃＺ）を形成した。前記由来 のｐＬａｃＩｑをＮａｒＩおよび５ａｉｌを用いて消化し、この結果得られるＬ ａｃＩｑ遺伝子を含有する小断片を単離した。Ｎ　ａ　ｒ　’Ｉ’および５ａｌ Ｉを用いてｐＢＳ（ＬａｃＺ）を消化し、この結果得られるＬａｃＺ遺伝子を含 有する大断片を単離し、小Ｌａｃｌｑ含有断片に連結してｐＬａｃ　ＩｑＺを形 成した。前記で調製したｐｉｎｔ、ｌをＫｐｎｌを用いて消化し、この結果得ら れる線状分子をＬａｃｌ−ＬａｃＺ断片（Ｋｐｎｌを用いて前記調製したｐＬａ ｃ　ＩｑＺを消化することにより製造される）と連結してｐＩｎｔＬａｃＩｑＺ を形成した。その後ｐＩｎｔＬａｃＩｑＺをＸｂａＩを用いて消化し、フレノウ により平滑末端とし、５ｃａｌを用いて消化し、ＬａｃＺ−ＬａｃＩｑおよび大 部分のアンピシリン耐性遺伝子を含有する、この結果得られる大断片を単離した 。前記調製したｐＰｒｅＢをＰｖｕ　Ｉを用いて消化し、マングビーンヌクレア ーゼを用いて平滑末端とし、Ｓｃａ　Ｉを用いて消化し、ターミネータおよびイ ニシェークｆｌ遺伝子内領域成分を含有する、この結果得られる断片を単離し、 ｐＩｆｎｔＬａｃＩｑＺ誘導大断片に連結して誘導入断片ｐＰｒｅＬａｃＩＱＺ 　（ｐＰＲＩＡＺ）を形成した。

２つのパネル８Ａおよび８Ｂにより示す図８は、λＬＩＺαの構成を示すもので ある。その終端に対し、レオネンら、Ｇｅｎｅ、１０：２４９−２５９　（１９ ８０）により、マニアナイスら、「分子クローン化、実験室マニュアル」中、第 ４１頁、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９ｇ　２）により 、およびショートら、前記により記載され、遺伝マーカ（ｓ　ｒ　Ｉλ１−２） デルタ、１ｍｍ４３４ｃｌ−１ＮＩＮ５およびｃｈｉＡ１３１を有するλＬ４７ ．１を、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄｌＩＩおよびＳｍａＩを用いて消化してλＬ４７ ．１消化混合物を形成した。ストラタジーンから入手可能のλＬ２Ｂを最初にＸ ｂａｌにより消化し、その後フレノウにより処理して５’ＸｂａＩオーバーハン グを埋め、その後ＭＩｕＩにより消化してＬ２ｂ消化消化物を形成した。Ｌ４７ ．ｌおよびＬ２ｂ消化消化物をエタノール沈殿して連結のためのＤＮＡを調製し 、その後、Ｎｄｅｌにより線状化した前記調製したｐＰＲＩＡＺに連結してλＬ ＩＺαを形成した。

最終構成物、λＬＩＺαは、本発明で使用する好適な修飾λバクテリオファージ である。これは、１）ＬａｃＺのα成分の形態のレポータ遺伝子、２）末端にお けるｃｏｓ部位の存在により与えられるλバクテリオファージ切除能力、３）Ｌ ａｃ　Ｉｑ標的遺伝子の形態の指標遺伝子系（ｌａｃＩプロモータおよびリプレ ッサ構造遺伝子配列を含む）、および４）配列決定のために変異した試験遺伝子 を含有する陽性コロニーから変異した試験遺伝子を迅速に単離することを可能と する、ショートら、前記の生体内切除系により配置されたｆｌ複製開始点の要素 を組合せるためである。

６、キメラ５ＣＩＤ／ｈｕマウスの製造自発的供与者の静脈血から末梢血液リン パ球（ＰＢＬｓ）を単離する。最初に、１００ミリリツトル（ｍｌ）の血液を、 ０．１４Ｍクエン酸、０．２Ｍクエン酸三ナトリウムおよび０．２２Ｍデキスト ロースの混合物により血液凝固阻止する。

処理した血液をヒストパック−１０７７（シグマ、セントルイス、ミズーリ）上 に層形成し、２５℃で３０分間の４００ｘｇでの遠心分離により回収される単離 ＰＢＬＳを形成する。単離したＰＢＬｓをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（１５ ０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５℃でｐＨ７，２ ）によりその後２回洗浄する。この結果得られるＰＢＬ細胞ペレットをＰＢＳに 再懸濁してｌＸｌ０”細胞／ｍｌの濃度とする。

同意を得た患者の治療性扁桃摘出から得られた扁桃からリンパ球も単離する。

扁桃を最初に均一化し、その後前記したようにヒストパックによりリンパ球を単 離する。

当業者に公知の技術を使用して、単離したリンパ球にその後対象ｒＤＮＡを挿入 する。好適な技術は、リンパ球のエレクトロポーレーションおよびリンパ球の塩 化カルシウム透過である。

Ｂ、５ＣＩＤマウスの調製 常染色体劣性マウス変異５ｃｉｄを有する５ＣＩＤマウスをインダイム（サンジ エゴ、カリホルニア）から得る。その他、５ＣＩＤマウスは、ポスマら、Ｎａｔ ｕｒｅ、３０１　：５２７−５３０　（１９８３）に記載されたようにマウスの 同系交配種、Ｃ，Ｂ−１７（Ｂａ　ｌｂ／ｃ−Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ−Ｉ　ｇｈ−１ ｂ／ＩＣＲ（Ｎｌ　７Ｆ３４）から誘導される。ＩｇＭ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ ２ａを欠失するマウスの系統の解析により、欠損は遺伝性であり、劣性５ｃｉｄ 遺伝子の調節下にあることが決定された。ボスマら、前記。欠損遺伝子について ホモ接合的であるマウスの集団を確立することができる。５ＣＩＤマウスは、殺 菌した食物および水を含むミクロアイソレータ・ケージ（ラボ・プロダクツ、メ イラ・ラド、ニューシャーシー）内で維持する。

この発明の真の精神および範囲から逸脱することな（多数の変形や改変を行うこ とができる。

Ｘ づ ρＢＬＵＥＳＣＲ／ＰＴＳＫ− Ｆ／Ｇ、４ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ 多重クローン化部位 国際調査報告 ＰＬ’：Ｔ、’ＵＳ’ｌＩ１０２３６Ｊ

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．原核発現シグナルに機能的に連帯されたＬａｃＩおよびＬａｃＺを含む標的 遺伝子系を含有する切除可能に組込まれたλファージの存在を特徴とするゲノム を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
2. ２．前記ＬａｃＩがＬａｃＩ■であり、前記ＬａｃＺがＬａｃＺαである請求項 １記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
3. ３．原核発現シグナルに機能的に連結されたＬａｃＩおよびＬａｃＺを含む標的 遺伝子系を含有する切除可能に組込まれたλファージの存在を特徴とするゲノム を有するヒト細胞を含有するＳＣＩＤマウス。
4. ４．前記ＬａｃＩがＬａｃＩ■であり、前記ＬａｃＺがＬａｃＺαである請求項 ３記載のＳＩＣＤマウス。
5. ５．要因の生体内変異誘発能を決定するキットであって、（ａ）原核発現シグナ ルに機能的に連結されたＬａｃＩおよびＬａｃＺを含む標的遺伝子系を含有する 切除可能に組込まれたλファージの存在を特徴とするゲノムを有するトランスジ ェニックマウス、（ｂ）ｍｃｒＡ−、ｍｃｒＢ−、ｍｒｒ−およびｈｓｄＲ−で あるバクテリオファージ溶原株から単離されたバクテリオファージλＤＮＡパッ ケージング抽出物の画分（前記画分中に存在する前記抽出物の量は、形質転換量 の前記切除可能に組込まれたλファージを切除しパッケージするのに十分なもの とする）からなる前記キット。
6. ６．前記切除可能に組込まれたλファージにより形質転換するためのイー・コリ の制限系欠損株をさらに含む請求項５記載のキット。
7. ７．要因の変異誘発能を決定するに際し、（ａ）修飾されたバクテリオファージ により担持され変異に際して検出可能な表現型または遺伝子型をコードする試験 ＤＮＡ配列を含有する細胞を有する１以上の非ヒト哺乳動物を選択し、 （ｂ）前記哺乳動物を可能性のある変異誘発性要因に露呈し、（ｃ）露呈された 哺乳動物のゲノムから試験ＤＮＡ配列を回収し、（ｄ）試験ＤＮＡ配列を制限系 欠損微生物に導入して試験ＤＮＡ配列を発現させる ことからなる方法。
8. ８．非ヒト哺乳動物を、その実質的に全ての体細胞および胚細胞が試験ＤＮＡ配 列を含有するよう選択する請求項７記載の方法。
9. ９．ＤＮＡ配列をＩａｃＺとする請求項７記載の方法。
10. １０．試験ＤＮＡ配列をＩａｃＩとする請求項７記載の方法。
11. １１．制限系をｈｓｄとする請求項７記載の方法。
12. １２．制限系をｍｃｒＡとする請求項７記載の方法。
13. １３．制限系をｍｃｒＢ遺伝子の一般的な遺伝子座内の制限系とする請求項７記 載の方法。
14. １４．制限系をイー・コリＫ−１２の９８分の領域内に認められる制限系とする 請求項７記載の方法。
15. １５．パッケージング抽出物を使用して哺乳動物ゲノムから試験ＤＮＡ配列を回 収する請求項７記載の方法。
16. １６．パッケージング抽出物をλファージパッケージング抽出物とする請求項１ ５記載の方法。
17. １７．制限系をｈｓｄとする請求項１５記載の方法。
18. １８．制限系をｍｃｒＡとする請求項１５記載の方法。
19. １９．制限系をｍｃｒＢ遺伝子の一般的な遺伝子座内の制限系とする請求項１５ 記載の方法。
20. ２０．制限系をイー・コリＫ−１２の９８分の領域内に位置する制限系とする請 求項１５記載の方法。
21. ２１．要因の変異誘発能を決定するに際し、（ａ）修飾されたバクテリオファー ジにより担持され変異に際して検出可能な表現型または遺伝子型をコードする試 験ＤＮＡ配列を含有する細胞を有する１以上の非ヒト哺乳動物を選択し、 （ｂ）前記哺乳動物を可能性のある変異誘発性要因に露呈し、（ｃ）制限系欠損 パッケージング抽出物を使用して哺乳動物ゲノムから試験ＤＮＡ配列を回収し、 （ｄ）試験ＤＮＡ配列を制限系欠損微生物に導入して試験ＤＮＡ配列を発現させ る ことを含む方法。
22. ２２．試験ＤＮＡ配列を含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞から 試験ＤＮＡ配列を回収するに際し、制限系欠損パッケージング抽出物を使用して 前記トランスジェニック哺乳動物から前記試験ＤＮＡ配列を切除することを含む 方法。
23. ２３．変異誘発性要因を監視するに際し、（ａ）変異に際して検出可能な表現型 または遺伝子型をコードする試験ＤＮＡ配列を含有する細胞を有する１以上の非 ヒト哺乳動物を選択し（このＤＮＡ配列は試験ＤＮＡ配列の切除および再環化を 可能とする系内に含有され、この系はバクテリオファージ誘導体ゲノムにより含 有される）、（ｂ）前記哺乳動物を可能性のある変異誘発性要因に露呈し、（ｃ ）バクテリオファージゲノム内に含有される試験ＤＮＡ配列を哺乳動物ゲノムか ら回収する ことを含む方法。
24. ２４．非ヒト哺乳動物を、その実費的に全ての体細胞および胚細胞が試験ＤＮＡ 配列を含有するよう選択する請求項２３記載の方法。
25. ２５．切除および再環化系をλＺＡＰとする請求項２３記載の方法。
26. ２６．切除および再環化系をＦＬＰ媒介組換えとする請求項２３記載の方法。
27. ２７．切除および再現化系をＣｒｅ−Ｉｏｘ部位特異的組換えとする請求項２３ 記載の方法。
28. ２８．試験ＤＮＡ配列をＩａｃＩとする請求項２３記載の方法。
29. ２９．パッケージング抽出物を使用して哺乳動物ゲノムから試験ＤＮＡ配列を回 収する請求項２３記載の方法。
30. ３０．変異誘発性要因を監視するに際し、（ａ）変異に際して検出可能な表現型 または遺伝子型をコードする試験ＤＮＡ配列を含有する細胞を有する１以上の非 ヒト哺乳動物を選択し（このＤＮＡ配列は試験ＤＮＡ配列の切除および再環化を 可能とする系内に含有され、この系はバクテリオファージ誘導体ゲノムにより含 有される）、（ｂ）前記哺乳動物を可能性のある変異誘発性要因に露呈し、（ｃ ）バクテリオファージゲノム内に含有される試験ＤＮＡ配列を哺乳動物ゲノムか ら回収し、 （ｄ）試験ＤＮＡ配列を切除して再環化し、（ｅ）試験ＤＮＡ配列を分析して変 異を検出することを含む方法。
31. ３１．変異誘発性要因を監視するに際し、（ａ）変異に際して検出可能な表現型 または遺伝子型をコードする試験ＤＮＡ配列を含有する細胞を有する１以上の非 ヒト哺乳動物を選択し（このＤＮＡ配列は、バクテリオファージ誘導体ゲノムに より含有されるｆ１バクテリオファージ複製開始点の二分割物の１つにより両方 の側部で当接される）、（ｂ）前記哺乳動物を可能性のある変異誘発性要因に露 呈し、（ｃ）バクテリオファージ誘導体ゲノム内に含有される試験ＤＮＡ配列を 哺乳動物ゲノムから回収する ことからなる方法。
32. ３２．変異誘発性要因を監視するに際し、（ａ）変異に際して検出可能な表現型 または遺伝子型をコードする試験ＤＮＡ配列を含有する細胞を有する１以上の非 ヒト哺乳動物を選択し（このＤＮＡ配列は、バクテリオファージ誘導体ゲノムに より含有されるｆ１バクテリオファージ複製開始点の二分割物の１つにより両方 の側部で当接される）、（ｂ）前記哺乳動物を可能性のある変異誘発性要因に露 呈し、（ｃ）バクテリオファージ誘導体ゲノムにより含有される試験ＤＮＡ配列 を哺乳動物ゲノムから回収し、 （ｄ）ｆ１ヘルパーファージにより供給される蛋白質によりバクテリオファージ から試験ＤＮＡ配列を切除し、 （ｅ）結果的に得られるプラスミドを分析して変異を検出することからなる方法 。
33. ３３．結果的に得られるプラスミドの変異を検出するための分析が配列決定によ る請求項３２記載の方法。
34. ３４．トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、その一部または実質的に全 部の体細胞および圧細胞が変異に際して検出可能な表現型または遺伝子型をコー ドする試験ＤＮＡ配列を含有し、このＤＮＡ配列は試験ＤＮＡ配列の切除および 再環化を可能とする系内に含有され、この系がバクテリオファージ誘導体ゲノム により含有されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
35. ３５．トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、その一部または実質的に全 部の体細胞および胚細胞が変異に際して検出可能な表現型または遺伝子型をコー ドする試験ＤＮＡ配列を含有し、このＤＮＡ配列は、バクテリオファージλ誘導 体ゲノムにより含有されるｆ１バクテリオファージ複製開始点の二分割物の１つ により両方の側部で当接されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。