JPH0813276B2 - 新規なラムダーファージｄｎａおよびその利用 - Google Patents
新規なラムダーファージｄｎａおよびその利用Info
- Publication number
- JPH0813276B2 JPH0813276B2 JP5303192A JP30319293A JPH0813276B2 JP H0813276 B2 JPH0813276 B2 JP H0813276B2 JP 5303192 A JP5303192 A JP 5303192A JP 30319293 A JP30319293 A JP 30319293A JP H0813276 B2 JPH0813276 B2 JP H0813276B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- sequences
- loxp
- lambda phage
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスジェニックマ
ウスの作製に有用な新規なラムダーファージＤＮＡに関
する。
ウスの作製に有用な新規なラムダーファージＤＮＡに関
する。
【０００２】
【背景技術】近年、産業界で使用される化学物質の種類
は増加の一途をたどり、わが国の産業界において利用さ
れている化学物質は５０，０００種を越えると言われて
いる。ところで、化学物質のヒト遺伝子ＤＮＡに対する
毒作用を予知する事を目的とした試験法として変異原性
試験があるがこの試験については、バクテリアからマウ
スに至るまでさまざまな生物種を用いる試験系が標準化
され、労働安全衛生法、薬事法、化学物質審査法におい
てその実施が義務付けられている。
は増加の一途をたどり、わが国の産業界において利用さ
れている化学物質は５０，０００種を越えると言われて
いる。ところで、化学物質のヒト遺伝子ＤＮＡに対する
毒作用を予知する事を目的とした試験法として変異原性
試験があるがこの試験については、バクテリアからマウ
スに至るまでさまざまな生物種を用いる試験系が標準化
され、労働安全衛生法、薬事法、化学物質審査法におい
てその実施が義務付けられている。
【０００３】この変異原性試験を大別すると染色体の
異常を検出する染色体異常試験と点突然変異を検出す
る遺伝子突然変異試験とに分けることができる。染色体
異常検出試験は細胞遺伝学的手法を用いるものであり、
この方法により、哺乳類培養細胞はもとより実験動物や
ヒトの染色体異常をも検出することが可能であり、マウ
スを用いる染色体異常試験や小核試験は変異原性試験の
標準的な試験法として各国のガイドラインで推奨されて
いる。これに対し遺伝子突然変異試験はエームステス
トなどの微生物試験系や哺乳類細胞を用いる培養細胞
系は盛んに用いられているが、動物個体を用いる試験と
してはマウス・スポットテストやマウス特定座位試験が
あるのみで、かねてからより簡便、迅速な個体レベルの
遺伝子突然変異検出系の開発・普及が望まれている。
異常を検出する染色体異常試験と点突然変異を検出す
る遺伝子突然変異試験とに分けることができる。染色体
異常検出試験は細胞遺伝学的手法を用いるものであり、
この方法により、哺乳類培養細胞はもとより実験動物や
ヒトの染色体異常をも検出することが可能であり、マウ
スを用いる染色体異常試験や小核試験は変異原性試験の
標準的な試験法として各国のガイドラインで推奨されて
いる。これに対し遺伝子突然変異試験はエームステス
トなどの微生物試験系や哺乳類細胞を用いる培養細胞
系は盛んに用いられているが、動物個体を用いる試験と
してはマウス・スポットテストやマウス特定座位試験が
あるのみで、かねてからより簡便、迅速な個体レベルの
遺伝子突然変異検出系の開発・普及が望まれている。
【０００４】外来遺伝子ＤＮＡをマウス授精卵に注入し
個体にまで発生させる発生工学的手法は、導入遺伝子の
個体レベルにおける機能を研究するために開発された技
術であるが、動物個体を用いて遺伝子突然変異を検出す
る系を開発する際にも有用なものである。現在、大腸菌
のｌａｃＺ，ｌａｃＩ遺伝子をマーカーとした遺伝子突
然変異検出用トランスジェニックマウスが開発され市販
されている。ｌａｃＺ遺伝子を組み込んだマウスはＭｕ
ｔａ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＨａｚｌｅｔｏｎＷａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ社より販売され、ｌａｃＩ遺伝子を組み込ん
だマウスはＢｉｇ Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社より市販されている。
個体にまで発生させる発生工学的手法は、導入遺伝子の
個体レベルにおける機能を研究するために開発された技
術であるが、動物個体を用いて遺伝子突然変異を検出す
る系を開発する際にも有用なものである。現在、大腸菌
のｌａｃＺ，ｌａｃＩ遺伝子をマーカーとした遺伝子突
然変異検出用トランスジェニックマウスが開発され市販
されている。ｌａｃＺ遺伝子を組み込んだマウスはＭｕ
ｔａ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＨａｚｌｅｔｏｎＷａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ社より販売され、ｌａｃＩ遺伝子を組み込ん
だマウスはＢｉｇ Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｓｅと呼ばれＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社より市販されている。
【０００５】これらの試験系は、同一個体から生殖細胞
を含む多くの臓器で遺伝子突然変異を検出できる優れた
特徴を持っているが、一方でプラークの色で突然変異
体を検出するため変異体を検出するのに要する労力、時
間が少なくない、試験の費用がかさむ、マーカー遺
伝子のサイズが大きい（ｌａｃＺは約３ｋｂ、ｌａｃＩ
は約１ｋｂ）ため、変異部位の同定に手間取る、などの
欠点が指摘されていた。
を含む多くの臓器で遺伝子突然変異を検出できる優れた
特徴を持っているが、一方でプラークの色で突然変異
体を検出するため変異体を検出するのに要する労力、時
間が少なくない、試験の費用がかさむ、マーカー遺
伝子のサイズが大きい（ｌａｃＺは約３ｋｂ、ｌａｃＩ
は約１ｋｂ）ため、変異部位の同定に手間取る、などの
欠点が指摘されていた。
【０００６】本発明者らは、個体レベルで遺伝子突然変
異を検出するための、より高性能なトランスジェニック
マウス試験系の開発を目的に、種々研究を行ったとこ
ろ、マウス授精卵に導入する遺伝子突然変異検出用シャ
トルベクターの開発に成功した。
異を検出するための、より高性能なトランスジェニック
マウス試験系の開発を目的に、種々研究を行ったとこ
ろ、マウス授精卵に導入する遺伝子突然変異検出用シャ
トルベクターの開発に成功した。
【０００７】
【発明の開示】本発明は、マウス授精卵に導入すること
により高性能なトランスジェニックマウスを得ることの
できる下記の特徴を有する新規なラムダーファージＤＮ
Ａを提供するものである。ラムダーファージＤＮＡの塩
基配列において、その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配
列、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺
伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列およ
び薬剤耐性遺伝子配列を組みこんだ新規なラムダーファ
ージＤＮＡであって、それらの配列の順序が、ラムダー
ファージＤＮＡのレフトアームからライトアームに向っ
てまず、
により高性能なトランスジェニックマウスを得ることの
できる下記の特徴を有する新規なラムダーファージＤＮ
Ａを提供するものである。ラムダーファージＤＮＡの塩
基配列において、その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配
列、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺
伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列およ
び薬剤耐性遺伝子配列を組みこんだ新規なラムダーファ
ージＤＮＡであって、それらの配列の順序が、ラムダー
ファージＤＮＡのレフトアームからライトアームに向っ
てまず、
【０００８】（１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次
に、（２） ｌｏｘＰ配列、次に、（３） 大腸菌ｇｐ
ｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列
および薬剤耐性遺伝子配列の３つの配列を任意の順序の
組み合わせにより位置させた配列、次に、（４） 前記
のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、次に、（５）
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組みこまれ
ていることを特徴とする新規なラムダーファージＤＮ
Ａ。
に、（２） ｌｏｘＰ配列、次に、（３） 大腸菌ｇｐ
ｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始点を有する塩基配列
および薬剤耐性遺伝子配列の３つの配列を任意の順序の
組み合わせにより位置させた配列、次に、（４） 前記
のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、次に、（５）
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組みこまれ
ていることを特徴とする新規なラムダーファージＤＮ
Ａ。
【０００９】本発明に係る新規なラムダーファージＤＮ
Ａは、これをマウス授精卵に注入し、個体に発生させ全
身に当該ＤＮＡを持つマウス（＝トランスジェニックマ
ウス）を作製し、このトランスジェニックマウスを用い
て、医薬品、食品添加物など種々の化学物質の遺伝子に
対する突然変異誘発性を調べることにより種々の化学物
質の安全性に関する試験法を確立することができる。こ
の試験法の手順の概要は以下のとおりである。
Ａは、これをマウス授精卵に注入し、個体に発生させ全
身に当該ＤＮＡを持つマウス（＝トランスジェニックマ
ウス）を作製し、このトランスジェニックマウスを用い
て、医薬品、食品添加物など種々の化学物質の遺伝子に
対する突然変異誘発性を調べることにより種々の化学物
質の安全性に関する試験法を確立することができる。こ
の試験法の手順の概要は以下のとおりである。
【００１０】 本発明に係る前記のラムダーファージ
ＤＮＡを全身に持つトランスジェニックマウスに試験化
学物質を投与する。 このトランスジェニックマウスの臓器からＤＮＡを
抽出し、染色体上のｇｐｔ遺伝子配列を欠損した大腸菌
の菌体内あるいは菌体外でｇｐｔ遺伝子を含むＤＮＡを
環状プラスミドとする。 ｇｐｔ遺伝子をプラスミド上に持つ大腸菌を６−チ
オグアニンと抗生物質（アンピシリンあるいはクロラム
フェニコール）を含む培地上に塗布し、２−３日間、３
７℃で培養し、培地上に生じたコロニー数を計測する。
また、ｇｐｔ遺伝子をプラスミド上に持つ大腸菌を抗生
物質のみを含む培地上に塗布し、同様に培養し、培地上
に生じたコロニー数を計測する。
ＤＮＡを全身に持つトランスジェニックマウスに試験化
学物質を投与する。 このトランスジェニックマウスの臓器からＤＮＡを
抽出し、染色体上のｇｐｔ遺伝子配列を欠損した大腸菌
の菌体内あるいは菌体外でｇｐｔ遺伝子を含むＤＮＡを
環状プラスミドとする。 ｇｐｔ遺伝子をプラスミド上に持つ大腸菌を６−チ
オグアニンと抗生物質（アンピシリンあるいはクロラム
フェニコール）を含む培地上に塗布し、２−３日間、３
７℃で培養し、培地上に生じたコロニー数を計測する。
また、ｇｐｔ遺伝子をプラスミド上に持つ大腸菌を抗生
物質のみを含む培地上に塗布し、同様に培養し、培地上
に生じたコロニー数を計測する。
【００１１】上記の大腸菌は染色体上のｇｐｔ遺伝子配
列が欠損しているため、大腸菌のグアニン・フォスフォ
リボシル転移酵素（これはｇｐｔ遺伝子の産物である）
活性はプラスミド上のｇｐｔ遺伝子のみに依存する。グ
アニン・フォスフォリボシル転移酵素は６−チオグアニ
ンを代謝しＤＮＡに取り込まれるようにするため、グア
ニン・フォスフォリボシル転移酵素活性の高い大腸菌は
６−チオグアニンを含む培地上で生育することができな
い。突然変異を起こしていない野生型のｇｐｔ遺伝子を
プラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォスフォリ
ボシル転移酵素活性が高いため、培地上にコロニーを形
成する事ができず、突然変異を起こしたｇｐｔ遺伝子配
列をプラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォスフ
ォリボシル転移酵素活性が低いため、６−チオグアニン
を効率よく代謝できず、培地上にコロニーを形成する。
列が欠損しているため、大腸菌のグアニン・フォスフォ
リボシル転移酵素（これはｇｐｔ遺伝子の産物である）
活性はプラスミド上のｇｐｔ遺伝子のみに依存する。グ
アニン・フォスフォリボシル転移酵素は６−チオグアニ
ンを代謝しＤＮＡに取り込まれるようにするため、グア
ニン・フォスフォリボシル転移酵素活性の高い大腸菌は
６−チオグアニンを含む培地上で生育することができな
い。突然変異を起こしていない野生型のｇｐｔ遺伝子を
プラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォスフォリ
ボシル転移酵素活性が高いため、培地上にコロニーを形
成する事ができず、突然変異を起こしたｇｐｔ遺伝子配
列をプラスミド上に持つ大腸菌は、グアニン・フォスフ
ォリボシル転移酵素活性が低いため、６−チオグアニン
を効率よく代謝できず、培地上にコロニーを形成する。
【００１２】したがって、化学物質によりマウス体内で
ｇｐｔ遺伝子配列に沢山突然変異が起これば、６−チオ
グアニンと抗生物質を含む培地上に沢山のコロニーが形
成される。換言すれば、化学物質がマウス体内にあるｇ
ｐｔ遺伝子に突然変異を起こした程度は、培地上に生じ
たコロニー数を数えることにより推測することができ
る。また、コロニーからプラスミドを単離し、プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子の塩基配列を決定することにより、
突然変異の種類および場所を正確に決定することができ
る。
ｇｐｔ遺伝子配列に沢山突然変異が起これば、６−チオ
グアニンと抗生物質を含む培地上に沢山のコロニーが形
成される。換言すれば、化学物質がマウス体内にあるｇ
ｐｔ遺伝子に突然変異を起こした程度は、培地上に生じ
たコロニー数を数えることにより推測することができ
る。また、コロニーからプラスミドを単離し、プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子の塩基配列を決定することにより、
突然変異の種類および場所を正確に決定することができ
る。
【００１３】培地中に加える抗生物質は、プラスミドを
持たない大腸菌が培地上で増殖することを防いでいる。
プラスミドを持たない大腸菌は、たとえ６−チオグアニ
ンが含まれていなくても、抗生物質が存在すると培地上
で、コロニーを形成することができない。プラスミド上
に薬剤耐性遺伝子を持つ大腸菌だけが、抗生物質を含む
培地上にコロニーを作ることができる。
持たない大腸菌が培地上で増殖することを防いでいる。
プラスミドを持たない大腸菌は、たとえ６−チオグアニ
ンが含まれていなくても、抗生物質が存在すると培地上
で、コロニーを形成することができない。プラスミド上
に薬剤耐性遺伝子を持つ大腸菌だけが、抗生物質を含む
培地上にコロニーを作ることができる。
【００１４】突然変異の頻度は抗生物質と６−チオグ
アニンを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数を抗
生物質のみを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数で
除して求めることができる。この突然変異頻度が高いほ
ど、試験に用いた化学物質の突然変異を起こす力が強い
と言うことができる。突然変異を起こす力の強い物質
は、ヒトに対し潜在的な危険性を持つ物質であり、上記
の試験方法はヒトに対する化学物質の安全性を調べる上
で重要な役割を果たすものと期待される。
アニンを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数を抗
生物質のみを含む培地上に生じた大腸菌コロニーの数で
除して求めることができる。この突然変異頻度が高いほ
ど、試験に用いた化学物質の突然変異を起こす力が強い
と言うことができる。突然変異を起こす力の強い物質
は、ヒトに対し潜在的な危険性を持つ物質であり、上記
の試験方法はヒトに対する化学物質の安全性を調べる上
で重要な役割を果たすものと期待される。
【００１５】本発明に係る新規なラムダーファージの作
製方法を以下に述べる。ラムダーファージの右腕（ライ
トアーム）、左腕（レフトアーム）およびｌｏｘＰ配列
はラムダー・イエス・ベクターより調製した。ラムダー
・イエス・ベクターはスタンフォード大学医学部Ｒｏｎ
ａｌｄ Ｗ．Ｄａｖｉｓ博士より供与を受けた。ベクタ
ーから各部品すなわち右腕、左腕およびｌｏｘＰ配列を
取り出し遺伝子突然変異検出用ベクターの作製に用いる
ことについては、Ｄａｖｉｓ博士の了承を得て行った。
製方法を以下に述べる。ラムダーファージの右腕（ライ
トアーム）、左腕（レフトアーム）およびｌｏｘＰ配列
はラムダー・イエス・ベクターより調製した。ラムダー
・イエス・ベクターはスタンフォード大学医学部Ｒｏｎ
ａｌｄ Ｗ．Ｄａｖｉｓ博士より供与を受けた。ベクタ
ーから各部品すなわち右腕、左腕およびｌｏｘＰ配列を
取り出し遺伝子突然変異検出用ベクターの作製に用いる
ことについては、Ｄａｖｉｓ博士の了承を得て行った。
【００１６】１） ラムダーＥＧ１、同ＥＧ２の作製
（図１参照） ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄ ＩＩＩで切断したｐＢＲ３２
２ベクターに、ｐＳＶ２ｇｐｔプラスミドから調製した
大腸菌のｇｐｔ遺伝子を含む０．８ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３１プラスミドを作製した。 ｐＹＧ１３１プラスミドをＳａｌＩとＢａｍＨＩで切
断後、ｐＳＥ９３６プラスミドから調製したｌｏｘＰ配
列をタンデムに２コピー含む０．４ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３３プラスミドを得た。なお、上記のｐＳ
Ｅ９３６プラスミドは、ラムダ・イエス・ベクターをＮ
ｏｔＩで切断した後、環状プラスミドとしたものであ
る。 ｐＹＧ１３３プラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断
後、ＤＮＡポリメラーゼを用い末端を平滑にし、セルフ
・ライゲーションしてＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を持たない
ｐＹＧ１３５プラスミドを作製した。
（図１参照） ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄ ＩＩＩで切断したｐＢＲ３２
２ベクターに、ｐＳＶ２ｇｐｔプラスミドから調製した
大腸菌のｇｐｔ遺伝子を含む０．８ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３１プラスミドを作製した。 ｐＹＧ１３１プラスミドをＳａｌＩとＢａｍＨＩで切
断後、ｐＳＥ９３６プラスミドから調製したｌｏｘＰ配
列をタンデムに２コピー含む０．４ｋｂＤＮＡ断片を連
結しｐＹＧ１３３プラスミドを得た。なお、上記のｐＳ
Ｅ９３６プラスミドは、ラムダ・イエス・ベクターをＮ
ｏｔＩで切断した後、環状プラスミドとしたものであ
る。 ｐＹＧ１３３プラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断
後、ＤＮＡポリメラーゼを用い末端を平滑にし、セルフ
・ライゲーションしてＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を持たない
ｐＹＧ１３５プラスミドを作製した。
【００１７】ｐＹＧ１３５プラスミドをＮｏｔＩで線
状にした後、ＮｏｔＩ部位をＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に変
換する合成オリゴヌクレオチド・リンカーおよびラムダ
ー・ファージの右腕、左腕とともにＴ４ ＤＮＡ ｌｉ
ｇａｓｅで処理した。 パッケージングにより、連結したＤＮＡをファージと
して回収した後、大腸菌ＬＥ３９２に感染させプラーク
を得た。 プラークからＤＮＡを調製し、調製したファージが目
的とする構造を有していることを制限酵素を用い確認し
た。
状にした後、ＮｏｔＩ部位をＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に変
換する合成オリゴヌクレオチド・リンカーおよびラムダ
ー・ファージの右腕、左腕とともにＴ４ ＤＮＡ ｌｉ
ｇａｓｅで処理した。 パッケージングにより、連結したＤＮＡをファージと
して回収した後、大腸菌ＬＥ３９２に感染させプラーク
を得た。 プラークからＤＮＡを調製し、調製したファージが目
的とする構造を有していることを制限酵素を用い確認し
た。
【００１８】２） ラムダーＥＧ３の作製（図２参照） ラムダーＥＧ３は上述のラムダーＥＧ１、ＥＧ２と同様
の方法で作製したが、出発材料のプラスミドとしてｐＢ
Ｒ３２２の代わりにｐＡＣＹＣ１８４を用いた。したが
ってラムダーＥＧ３ではプラスミドの複製開始点がｐＡ
ＣＹＣ１８４由来のものとなっているほか、薬剤耐性因
子がクロラムフェニコール耐性となっている。
の方法で作製したが、出発材料のプラスミドとしてｐＢ
Ｒ３２２の代わりにｐＡＣＹＣ１８４を用いた。したが
ってラムダーＥＧ３ではプラスミドの複製開始点がｐＡ
ＣＹＣ１８４由来のものとなっているほか、薬剤耐性因
子がクロラムフェニコール耐性となっている。
【００１９】３） ラムダーＥＧ５、同６、同７の作製
（図３参照） ラムダーＥＧ１およびＥＧ２の開発過程で作製したプラ
スミドｐＹＧ１３５をＳｃａＩで切断した後、クロラム
フェニコール耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂＤＮＡ断片
を挿入し、クロラムフェニコール耐性遺伝子の方向が異
なる２種類のプラスミドｐＹＧ１３７とｐＹＧ１３８を
作製した。これらのプラスミドをＮｏｔＩで線状にした
後、ラムダーＥＧ１およびＥＧ２を作製したのと同一の
方法でラムダー・ファージの右腕、左腕に連結し、ｐＹ
Ｇ１３７から作製したものをラムダーＥＧ５、ＥＧ６そ
してｐＹＧ１３８から作製したものをラムダーＥＧ７と
した各ラムダーＥＧの配列構造は下記のとおりである
（図４参照）。
（図３参照） ラムダーＥＧ１およびＥＧ２の開発過程で作製したプラ
スミドｐＹＧ１３５をＳｃａＩで切断した後、クロラム
フェニコール耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂＤＮＡ断片
を挿入し、クロラムフェニコール耐性遺伝子の方向が異
なる２種類のプラスミドｐＹＧ１３７とｐＹＧ１３８を
作製した。これらのプラスミドをＮｏｔＩで線状にした
後、ラムダーＥＧ１およびＥＧ２を作製したのと同一の
方法でラムダー・ファージの右腕、左腕に連結し、ｐＹ
Ｇ１３７から作製したものをラムダーＥＧ５、ＥＧ６そ
してｐＹＧ１３８から作製したものをラムダーＥＧ７と
した各ラムダーＥＧの配列構造は下記のとおりである
（図４参照）。
【００２０】上記で作製したラムダーＥＧ１、２、３、
５、６、７はラムダー・ファージを基本としたシャトル
型ベクターで、ファージの右腕と左腕の間に、両端にｌ
ｏｘＰ配列を同方向に持つｐＢＲ３２２系（ＥＧ３の場
合にはｐＡＣＹＣ１８４系）のプラスミドＤＮＡが線状
になって挿入されている。このプラスミドＤＮＡ領域に
はクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＥＧ１、ＥＧ２で
はアンピシリン耐性遺伝子）、プラスミドの複製開始点
（ｏｒｉ）および遺伝子突然変異検出のマーカーとなる
大腸菌のグアニン・フォスフォリボシル転移酵素遺伝子
（ｇｐｔ）が含まれている。またプラスミド領域とファ
ージの右腕および左腕の連結部位には、それぞれ制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの認識部位が作られている。各ラム
ダーＥＧの回収方法は下記のとおりである（図５参
照）。
５、６、７はラムダー・ファージを基本としたシャトル
型ベクターで、ファージの右腕と左腕の間に、両端にｌ
ｏｘＰ配列を同方向に持つｐＢＲ３２２系（ＥＧ３の場
合にはｐＡＣＹＣ１８４系）のプラスミドＤＮＡが線状
になって挿入されている。このプラスミドＤＮＡ領域に
はクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＥＧ１、ＥＧ２で
はアンピシリン耐性遺伝子）、プラスミドの複製開始点
（ｏｒｉ）および遺伝子突然変異検出のマーカーとなる
大腸菌のグアニン・フォスフォリボシル転移酵素遺伝子
（ｇｐｔ）が含まれている。またプラスミド領域とファ
ージの右腕および左腕の連結部位には、それぞれ制限酵
素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの認識部位が作られている。各ラム
ダーＥＧの回収方法は下記のとおりである（図５参
照）。
【００２１】上述の各ラムダーＥＧは遺伝子突然変異検
出用トランスジェニックマウスの作製に極めて有用であ
る。上述の新規なラムダーファージＤＮＡをマウス授精
卵に導入して得られたトランスジェニックマウスを試験
化合物で処理したマウスの臓器からＤＮＡを単離し、そ
の中に含まれる目的遺伝子の回収を行う。トランスジェ
ニックマウスからの遺伝子の回収方法は以下の３とおり
が可能である。
出用トランスジェニックマウスの作製に極めて有用であ
る。上述の新規なラムダーファージＤＮＡをマウス授精
卵に導入して得られたトランスジェニックマウスを試験
化合物で処理したマウスの臓器からＤＮＡを単離し、そ
の中に含まれる目的遺伝子の回収を行う。トランスジェ
ニックマウスからの遺伝子の回収方法は以下の３とおり
が可能である。
【００２２】１） 単離したＤＮＡをパッケージング・
エクストラクトで処理しファージとした後、Ｃｒｅ蛋白
質を発現している大腸菌に感染させ大腸菌の菌体内でフ
ァージをプラスミドに変換する。 ２） 単離したＤＮＡをＣｒｅ蛋白質と試験管内で反応
させ、プラスミドに変換し、次いで電気的に大腸菌に導
入する。 ３） 単離したＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで処理し、次
いで、Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅによりプラスミドに変
換し、電気的に大腸菌に導入する。
エクストラクトで処理しファージとした後、Ｃｒｅ蛋白
質を発現している大腸菌に感染させ大腸菌の菌体内でフ
ァージをプラスミドに変換する。 ２） 単離したＤＮＡをＣｒｅ蛋白質と試験管内で反応
させ、プラスミドに変換し、次いで電気的に大腸菌に導
入する。 ３） 単離したＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで処理し、次
いで、Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅによりプラスミドに変
換し、電気的に大腸菌に導入する。
【００２３】次に変異体の検出方法について述べる（図
５参照）。突然変異の検出は、トランスジェニックマウ
スから回収したプラスミドを上記した３方法のいずれか
で大腸菌に導入し、６−チオグアニンを含む培地上に塗
布し、６−チオグアニン耐性となった変異株（プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子に変異を持つ株）を選抜することに
より行う。生存菌数の測定は、大腸菌を希釈してから６
−チオグアニンを含まない培地上に塗布し、生存菌数当
たりの突然変異体数を計測する。更に突然変異体につい
てはそのプラスミドを単離し、ｇｐｔ遺伝子の塩基配列
決定を行い、突然変異部位の同定を行う。
５参照）。突然変異の検出は、トランスジェニックマウ
スから回収したプラスミドを上記した３方法のいずれか
で大腸菌に導入し、６−チオグアニンを含む培地上に塗
布し、６−チオグアニン耐性となった変異株（プラスミ
ド上のｇｐｔ遺伝子に変異を持つ株）を選抜することに
より行う。生存菌数の測定は、大腸菌を希釈してから６
−チオグアニンを含まない培地上に塗布し、生存菌数当
たりの突然変異体数を計測する。更に突然変異体につい
てはそのプラスミドを単離し、ｇｐｔ遺伝子の塩基配列
決定を行い、突然変異部位の同定を行う。
【００２４】本発明の遺伝子突然変異検出用シャトルベ
クターをマウス体内に組み込むことにより、以下の利点
を備えた試験系が得られる。第１の利点は、大腸菌のｇ
ｐｔ遺伝子を突然変異検出のマーカー遺伝子としている
ため、６−チオグアニンを用いるポジティブ・セレクシ
ョンが可能であるという点である。突然変異は希な現象
であり、自然突然変異頻度は１０−５−１０−６であ
る。ｌａｃＩやｌａｃＺを用いるトランスジェニックマ
ウス試験系では、１０万個以上の多数のプラークの中か
ら色調の変化した変異体を検索する（カラー・セレクシ
ョン）ため、変異体の検出には多数の細菌培養用シャー
レと高価な色素（Ｘ−Ｇａｌ）が必要である。
クターをマウス体内に組み込むことにより、以下の利点
を備えた試験系が得られる。第１の利点は、大腸菌のｇ
ｐｔ遺伝子を突然変異検出のマーカー遺伝子としている
ため、６−チオグアニンを用いるポジティブ・セレクシ
ョンが可能であるという点である。突然変異は希な現象
であり、自然突然変異頻度は１０−５−１０−６であ
る。ｌａｃＩやｌａｃＺを用いるトランスジェニックマ
ウス試験系では、１０万個以上の多数のプラークの中か
ら色調の変化した変異体を検索する（カラー・セレクシ
ョン）ため、変異体の検出には多数の細菌培養用シャー
レと高価な色素（Ｘ−Ｇａｌ）が必要である。
【００２５】これに対し、６−チオグアニンを用いるポ
ジティブ・セレクション法では、ｇｐｔ遺伝子に変異を
おこした大腸菌のみが培地上でコロニーを形成するた
め、１０万個以上の多数の大腸菌を１枚のシャーレに蒔
いて変異体を検索することが可能である。したがって、
ポジティブ・セレクション法を用いれば迅速かつ簡便
に、多数の化合物について変異原性の検索を行うことが
可能となる。また６−チオグアニンは廉価な試薬であ
り、Ｘ−Ｇａｌを使うカラー・セレクション法に比べ、
変異体検出に要する費用を軽減することができる。
ジティブ・セレクション法では、ｇｐｔ遺伝子に変異を
おこした大腸菌のみが培地上でコロニーを形成するた
め、１０万個以上の多数の大腸菌を１枚のシャーレに蒔
いて変異体を検索することが可能である。したがって、
ポジティブ・セレクション法を用いれば迅速かつ簡便
に、多数の化合物について変異原性の検索を行うことが
可能となる。また６−チオグアニンは廉価な試薬であ
り、Ｘ−Ｇａｌを使うカラー・セレクション法に比べ、
変異体検出に要する費用を軽減することができる。
【００２６】第２の利点は、ファージとして回収した遺
伝子を大腸菌の菌体内で自動的にプラスミドに変換する
ことができることである。本発明に係る上記のファージ
の中央部分に配置された２つのｌｏｘＰ配列は、それぞ
れ３４塩基対の短いＤＮＡ配列で、Ｃｒｅと呼ばれる部
位特異的組換え蛋白質により認識される。２つの同方向
ｌｏｘＰ部位に挟まれたＤＮＡ領域は、Ｃｒｅ蛋白質が
存在すると直鎖ＤＮＡから環状プラスミドとして切り出
される。したがって回収したファージをＣｒｅ蛋白質を
発現している大腸菌に感染させると、ファージはプラス
ミドに変換し、プラスミドを持った大腸菌のみがクロラ
ムフェニコールあるいはアンピシリンの入った培地上で
コロニーを形成する。このため、その後の操作、すなわ
ちプラスミドの単離および塩基配列の決定が容易であ
る。
伝子を大腸菌の菌体内で自動的にプラスミドに変換する
ことができることである。本発明に係る上記のファージ
の中央部分に配置された２つのｌｏｘＰ配列は、それぞ
れ３４塩基対の短いＤＮＡ配列で、Ｃｒｅと呼ばれる部
位特異的組換え蛋白質により認識される。２つの同方向
ｌｏｘＰ部位に挟まれたＤＮＡ領域は、Ｃｒｅ蛋白質が
存在すると直鎖ＤＮＡから環状プラスミドとして切り出
される。したがって回収したファージをＣｒｅ蛋白質を
発現している大腸菌に感染させると、ファージはプラス
ミドに変換し、プラスミドを持った大腸菌のみがクロラ
ムフェニコールあるいはアンピシリンの入った培地上で
コロニーを形成する。このため、その後の操作、すなわ
ちプラスミドの単離および塩基配列の決定が容易であ
る。
【００２７】第３の利点は、突然変異検出のマーカーと
なる遺伝子（ｇｐｔ）のサイズが小さく（４５６ ｂ
ｐ）塩基配列の決定が容易であることである。ｇｐｔの
大きさはｌａｃＺ遺伝子の１／６、ｌａｃＩ遺伝子の約
半分であり、したがって、塩基配列決定により多数の変
異体について突然変異部位を同定することが可能であ
る。
なる遺伝子（ｇｐｔ）のサイズが小さく（４５６ ｂ
ｐ）塩基配列の決定が容易であることである。ｇｐｔの
大きさはｌａｃＺ遺伝子の１／６、ｌａｃＩ遺伝子の約
半分であり、したがって、塩基配列決定により多数の変
異体について突然変異部位を同定することが可能であ
る。
【００２８】第４の利点は、遺伝子を回収するのに前述
した３つの方法をとることが可能であることである。し
たがって、ファージのパッケージングが何らかの理由で
達成し得ない場合には、第２、第３の方法によって目的
遺伝子を回収することができる。これはトランスジェニ
ックマウスから回収した貴重なＤＮＡがロスなく分析さ
れることを可能にする。
した３つの方法をとることが可能であることである。し
たがって、ファージのパッケージングが何らかの理由で
達成し得ない場合には、第２、第３の方法によって目的
遺伝子を回収することができる。これはトランスジェニ
ックマウスから回収した貴重なＤＮＡがロスなく分析さ
れることを可能にする。
【００２９】第５の利点は、培養細胞で得られた変異原
性試験の結果を個体レベルで検討する際に特に有用であ
るという点である。大腸菌のｇｐｔ遺伝子を組み込んだ
チャイニーズハムスターＡＳ５２細胞は培養細胞を用い
た遺伝子突然変異の検出系として広く用いられている。
このため、同じ遺伝子を組み込んだトランスジェニック
・マウスは培養細胞系で得られた結果を、個体レベルで
確認するのに有用となる。
性試験の結果を個体レベルで検討する際に特に有用であ
るという点である。大腸菌のｇｐｔ遺伝子を組み込んだ
チャイニーズハムスターＡＳ５２細胞は培養細胞を用い
た遺伝子突然変異の検出系として広く用いられている。
このため、同じ遺伝子を組み込んだトランスジェニック
・マウスは培養細胞系で得られた結果を、個体レベルで
確認するのに有用となる。
【図１Ａ、図１Ｂ】本発明に係る新規なラムダーファー
ジＤＮＡの作製の２つの実施例（ラムダーＥＧ１、ラム
ダーＥＧ２）を図示したものである。図１Ａと図１Ｂ
は、１つの図を便宜上２分したものであり、連続して、
図１を構成する。
ジＤＮＡの作製の２つの実施例（ラムダーＥＧ１、ラム
ダーＥＧ２）を図示したものである。図１Ａと図１Ｂ
は、１つの図を便宜上２分したものであり、連続して、
図１を構成する。
【図２Ａ、図２Ｂ】本発明に係る新規なラムダーファー
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ３）を図示
したものである。図２Ａと図２Ｂは、１つの図を便宜
上、２分したものであり、連続して、図２を構成する。
ジＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ３）を図示
したものである。図２Ａと図２Ｂは、１つの図を便宜
上、２分したものであり、連続して、図２を構成する。
【図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ】本発明に係る新規なラムダ
ーファージＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ
４）を図示したものである。図３Ａ、図３Ｂおよび図３
Ｃは、１つの図を便宜上、３分したものであり、連続し
て、図３を構成する。
ーファージＤＮＡの作製の他の実施例（ラムダーＥＧ
４）を図示したものである。図３Ａ、図３Ｂおよび図３
Ｃは、１つの図を便宜上、３分したものであり、連続し
て、図３を構成する。
【図４Ａ】ラムダーＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ３の各配列構
造を示す図である。
造を示す図である。
【図４Ｂ】ラムダーＥＧ５、ＥＧ６、ＥＧ７の各配列構
造を示す図である。
造を示す図である。
【図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ】本発明に係る新規
なラムダーファージをマウス授精卵に導入し、トランス
ジェニックマウスを作製し、このトランスジェニックマ
ウスからＤＮＡを抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体
外で環状プラスミドを形成させ、その環状プラスミドを
染色体上のｇｐｔ遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入
し、その大腸菌を６−チオグアニンと抗生物質を含む培
地上に塗布、培養して、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝
子配列に突然変異を持つ大腸菌細胞を検出する方法を図
示したものである図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄは１
つの図を便宜上４分したものであり、これらは連続して
図５を構成する。
なラムダーファージをマウス授精卵に導入し、トランス
ジェニックマウスを作製し、このトランスジェニックマ
ウスからＤＮＡを抽出し、大腸菌の菌体内あるいは菌体
外で環状プラスミドを形成させ、その環状プラスミドを
染色体上のｇｐｔ遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入
し、その大腸菌を６−チオグアニンと抗生物質を含む培
地上に塗布、培養して、環状プラスミド上のｇｐｔ遺伝
子配列に突然変異を持つ大腸菌細胞を検出する方法を図
示したものである図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄは１
つの図を便宜上４分したものであり、これらは連続して
図５を構成する。
【図６】本発明に係る新規なラムダーファージがＣｒｅ
蛋白質により、２つのｌｏｘＰ配列部位において切り出
され、その間のＤＮＡ領域が環状プラスミドを形成する
趣旨を図示したものである。
蛋白質により、２つのｌｏｘＰ配列部位において切り出
され、その間のＤＮＡ領域が環状プラスミドを形成する
趣旨を図示したものである。
Claims (3)
- 【請求項１】 ラムダーファージＤＮＡの塩基配列にお
いて、その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配列、２つのＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プ
ラスミド複製開始点を有する塩基配列および薬剤耐性遺
伝子配列を組みこんだ新規なラムダーファージＤＮＡで
あって、それらの配列の順序が、ラムダーファージＤＮ
Ａのレフトアームからライトアームに向ってまず、 （１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次に、 （２） ｌｏｘＰ配列、次に、 （３） 大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始
点を有する塩基配列および薬剤耐性遺伝子配列の３つの
配列を任意の順序の組み合わせにより位置させた配列、
次に、 （４） 前記のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、
次に、 （５） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組み
こまれていることを特徴とする新規なラムダーファージ
ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ラムダーファージＤＮＡの塩基配列にお
いて、その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配列、２つのＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プ
ラスミド複製開始点を有する塩基配列および薬剤耐性遺
伝子配列を組みこんだ新規なラムダーファージＤＮＡで
あって、それらの配列の順序が、ラムダーファージＤＮ
Ａのレフトアームからライトアームに向ってまず、 （１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次に、 （２） ｌｏｘＰ配列、次に、 （３） 大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始
点を有する塩基配列および薬剤耐性遺伝子配列の３つの
配列を任意の順序の組み合わせにより位置させた配列、
次に、 （４） 前記のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、
次に、 （５） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組み
こまれているファージを、Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｓｅを発現する大腸菌であって、染色体上のｇｐｔ遺伝
子配列が欠損している大腸菌に感染させ、その大腸菌内
においてＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅによって上記
のラムダーファージＤＮＡ配列中のｌｏｘＰ配列部位を
切断、結合せしめることにより環状ＤＮＡ（＝プラスミ
ド）を生成させ、その大腸菌を６−チオグアニンおよび
抗生物質を含む培地上に塗布し、培養することにより環
状ＤＮＡ（＝プラスミド）上のｇｐｔ遺伝子配列に突然
変異を持つ大腸菌細胞を検出する方法。 - 【請求項３】 ラムダーファージＤＮＡの塩基配列にお
いて、その塩基配列中に２つのｌｏｘＰ配列、２つのＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プ
ラスミド複製開始点を有する塩基配列および薬剤耐性遺
伝子配列を組みこんだ新規なラムダーファージＤＮＡで
あって、それらの配列の順序が、ラムダーファージＤＮ
Ａのレフトアームからライトアームに向ってまず、 （１） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列、次に、 （２） ｌｏｘＰ配列、次に、 （３） 大腸菌ｇｐｔ遺伝子配列、プラスミド複製開始
点を有する塩基配列および薬剤耐性遣伝子配列の３つの
配列を任意の順序の組み合わせにより位置させた配列、
次に、 （４） 前記のｌｏｘＰ配列と同方向のｌｏｘＰ配列、
次に、 （５） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識配列の順序において組み
こまれているラムダーファージＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩにより切断した後、２つのＨｉｎｄ ＩＩＩ切
断部位をＤＮＡ ｌｉｇａｓｅにより結合せしめて環状
ＤＮＡ（＝プラスミド）を生成させ、その環状ＤＮＡを
染色体上のｇｐｔ遺伝子配列を欠損した大腸菌に導入し
た後、その大腸菌を６−チオグアニンおよび抗生物質を
含む培地上に塗布、培養することにより、環状ＤＮＡ
（＝プラスミド）上のｇｐｔ遺伝子配列に突然変異を持
つ大腸菌細胞を検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5303192A JPH0813276B2 (ja) | 1993-10-28 | 1993-10-28 | 新規なラムダーファージｄｎａおよびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5303192A JPH0813276B2 (ja) | 1993-10-28 | 1993-10-28 | 新規なラムダーファージｄｎａおよびその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07115979A JPH07115979A (ja) | 1995-05-09 |
| JPH0813276B2 true JPH0813276B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=17917993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5303192A Expired - Lifetime JPH0813276B2 (ja) | 1993-10-28 | 1993-10-28 | 新規なラムダーファージｄｎａおよびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0813276B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7402245B2 (en) | 2005-01-21 | 2008-07-22 | Ebara Corporation | Digested sludge treatment apparatus |
-
1993
- 1993-10-28 JP JP5303192A patent/JPH0813276B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07115979A (ja) | 1995-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kuo et al. | Cloning of Saccharomyces cerevisiae DNA replication genes: isolation of the CDC8 gene and two genes that compensate for the cdc8-1 mutation | |
| Paschke et al. | Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum | |
| Higgins et al. | Surveying a supercoil domain by using the gamma delta resolution system in Salmonella typhimurium | |
| EP1276857B1 (en) | Signal sequence trapping | |
| Napierala et al. | Long CTG· CAG repeat sequences markedly stimulate intramolecular recombination | |
| US5783385A (en) | Method for homologous-recombination screening of recombinant-DNA clones in yeast host libraries | |
| US5733726A (en) | Cytotoxicity-based genetic selection system (TOXSEL) | |
| US10883120B2 (en) | DNA plasmids for the fast generation of homologous recombination vectors for cell line development | |
| Berman et al. | Selection of lac gene fusions in vivo: ompR-lacZ fusions that define a functional domain of the ompR gene product | |
| US20080058214A1 (en) | Signal sequence trapping | |
| US20030044866A1 (en) | Yeast arrays, methods of making such arrays, and methods of analyzing such arrays | |
| US5614398A (en) | Gene transfer system for insects | |
| US20240174996A1 (en) | Method for site-specific conjugation of nucleic acid to crispr family protein, and conjugate thereof and use thereof | |
| WO1998046796A1 (en) | A method of screening nucleotide sequences to identify disruptors or effectors of biological processes or pathways | |
| US5602300A (en) | Process for detecting mutations, transgenic mammal transgenic mammalian cell, and process for testing agents or conditioning for mutagenic properties | |
| US5962249A (en) | Sized-based marker identification technology | |
| JPH0813276B2 (ja) | 新規なラムダーファージｄｎａおよびその利用 | |
| EP0048081A2 (en) | DNA capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote, method of preparation thereof and eukaryotic cell containing same | |
| JP2023520948A (ja) | 核酸配列の選択方法 | |
| Nashimoto | Non-ribosomal proteins affecting the assembly of ribosomes in Escherichia coli | |
| JP2580533B2 (ja) | 遺伝子突然変異検出用トランスジェニックマウス | |
| EP0467883A1 (en) | Method of physically mapping genetic material | |
| WO2018200653A1 (en) | A yeast two-hybrid rna protein interaction system based on catalytically inactivated crispr-dcas9 | |
| Kim et al. | One-Plus Two-Hybrid System for the Efficient Selection of Missense Mutant Alleles Defective in Protein–Protein Interactions | |
| KR20150124383A (ko) | 라이브러리-라이브러리 간 단백질-단백질 결합 동시 분석 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |