JP2573018B2 - 抗生物質ｗｋ−１８７５およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は抗生物質に関し、特に新規抗生物質WK−1875
およびその製法に関する。

従来の技術 抗真菌性抗生物質として、例えば、アムホテリン、グ
リセオフルビン、ピロールニトリン等の医薬や、ブラス
チシジンＳ、ポリオキシン、バリダマイシン、テトラナ
クチン等の農薬が知られている。しかし公知の抗真菌性
抗生物質は、例えば、薬効、毒性、抗菌性等の点におい
てなお改良の余地がある。本発明は、発明者が土壌から
分離した放線菌が、特に植物病原菌に対して強い活性を
もつ抗真菌性抗生物質を生産する能力を有するという知
見に基ずいている。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、新規抗生物質WK−1875およびその製
法を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明により、抗生物質WK−1875が提供される。本抗
生物質の理化学的性質は次の通りである。

融点:116−119℃ 元素分析：実測値（％） Ｃ 64.7±1.0 Ｈ 9.1±0.3 分子量:740.97 分子式:C₄₀H₆₈O₁₂ 比旋光度：▲［α］¹⁸ _D▼−12.1゜ （ｃ＝0.5,メタノール） 紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：末端吸収 赤外線吸収スペクトル（KBr法）：第１図の通り プロトン核磁気共鳴スペクトル（CDCl₃中）：第２
図の通り Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（CDCl₃中）：第３図
の通り 溶剤に対する溶解性 可溶：メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホ
ルム 不溶：水、ｎ−ヘキサン 呈色反応 陽性:H₂SO₄ 陰性：エールリッヒ反応、ドラーゲンドルフ反応 酸性、中性、塩基性の別：弱酸性物質 物質の色：白色 本抗生物質の生物学的性質は次の通りである。

１）抗菌活性 第１表は、寒天希釈法による本抗生物質の最小発育阻
止濃度（MIC、単位μg/ml）を示す。

第 １ 表 被験菌 MIC エシェリチア・コリ（Escherichia coli） ＞100 KB176（NIHJ,JC−2,IFO 12734）＊ シュードモナス・エルギナーザ ＞100 （Pseudomonas aeruginosa）Ｐ−3 KB105＊ キサントモナス・オリザエ ＞100 （Xanthomonas oryzae）KB88＊＊ ミクロコッカス・ルテウス ＞100 （Micrococcus luteus）KB40（PCI 1001）＊ スタフィロコッカス・アウレウス ＞100 （Staphylococcus aureus）KB34 （FDA 209P）＊ ミコバクテリウム・スメグマチス ＞100 （Mycobacterium smegmatis）KB42 （ATCC 607）＊ バチルス・スブチリス ＞100 （Bacillus subtilis）KB27（PCI 219）＊ カンジダ・アルビカンス ＞100 （Candida albicans）KF1＊＊ サッカロミセス・サケ ＞100 （Saccharomyces sake）KF26＊＊ アスペルギルス・ニガー ＞100 （Aspergillus niger）KF103 （ATCC 6275）＊＊ ピリキュラリア・オリザエ 6.25 （Piricularia oryzae）KF180＊＊ ムコール・ラセモスス 3.12 （Mucor rasemosus）KF223 （IFO 4581）＊＊ フィトフィトーラ・パラシチカ 1.56 （Phytophthora parasitica） KF265（IF04783）＊＊ 注：＊ 感受性寒天培地（日水製）37℃、pH7.0、24時
間目に判定。

＊＊ ポテトグルコース寒天培地 27℃、pH6.0、３日
目に判定。

本抗生物質は、前記の通り、例えばピラキュラリア
（Piricularia）属の真菌に対して強い活性を示す。

２）毒性 マウスに投与した場合の本抗生物質の急性毒性（L
D₅₀）は、30mg/kg（腹腔内）以上または100mg/kg（経
口）以上であった。

次に本発明により、ストレプトミセス属に属しかつ抗
生物質WK−1875産生能力を有する微生物を培地に好気的
に培養し、培養物中に抗生物質WK−1875を蓄積し、培養
物からこれを採取する工程からなる、抗生物質WK−1875
の製法が提供される。

本発明の抗生物質WK−1875を生産するために使用され
る菌株としては、１例として、本発明者らによって東京
湾岸の土壌から新たに分離された、ストレプトミセス・
エスピー・WK−1875株が挙げられる。

本菌株の菌学的性状は次のとおりである。

（Ｉ） 形態的性質 栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察
されない。気菌糸は酵母エキス・麦芽エキス寒天やグリ
セロール・アスパラギン寒天等で中程度に着生し、ホワ
イト系からグレイ系の色調を呈する。顕微鏡下の観察で
は、気菌糸はら旋状を呈し、20個以上の胞子の連鎖が認
められる。胞子の大きさは1.0×0.7μｍで円柱状であ
る。胞子の表面はトゲ状である。菌核、胞子のうおよび
遊走子は見出されない。

（II） 各種培地上での性状 イー・ビー・シャーリング（E.B.Shirling）とデー・
ゴットリーブ（D.Gottlieb）の方法（インターナショナ
ル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリ
オロジー,16巻,313頁,1966年）によって調べた本生産菌
の培養性状を次表に示す。色調は標準色として、カラー
・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポ
レーション・オブ・アメリカ・シカゴ,1958年）を用い
て決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて
記した。以下は特記しない限り、27℃、２週間目の各培
地における観察の結果である。

（III） 生理学的諸性質 （１）メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天 陰性 （ロ）ペプトン・イースト鉄寒天 陰性 （ハ）グルコース・ペプトン・ ゼラチン培地（21〜23℃） 陰性 （ニ）トリプトン・イースト液 陰性 （２）チロシナーゼ反応 陽性 （３）硫化水素の生産 陰性 （４）硝酸塩の還元 陰性 （５）ゼラチンの液化（21〜23℃） （グルコース・ペプトン・ゼラチン培地） 陽性 （６）スターチの加水分解 陽性 （７）脱脂乳の凝固（37℃） 陰性 （８）脱脂乳のペプトン化（37℃） 陽性 （９）生育温度範囲 17℃〜40℃ （10）炭素源の利用法 （プリーダム・ゴトリーブ寒天培地） 利用する:D−グルコース、Ｌ−アラビノース、ラフィノ
ース、メリビオース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−ラムノース、ｉ−イノシトール、スクロース やや利用する:D−フルクトース （11）セルロースの分解 陰性 （IV） 細胞壁組成 細胞壁のシアミノピメリン酸はLL型である。

以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりであ
る。細胞壁中のジアミノピメリン酸はLL型である。気菌
糸の形態はらせん状で、長い胞子鎖を形成する。胞子の
表面はトゲ状である。培養状の諸性質としては、栄養菌
糸はイエロー系あるいはブラウン系の色調を呈し、気菌
糸はホワイト系あるいはグレイ系の色調を呈する。可溶
性色素はチロシン寒天培地でのみブラウン系の色素を産
生する。

これらの結果から、本菌株はストレプトミセス属に属
する菌種であり、プリドハムとトレスナーの分類（バー
ジス・マニュアル・オブ・デターミネーティブ・バクテ
リオロジー，第８版,748〜829頁,1974年）によるグレイ
あるいはレッドシリーズに属する菌種であると考えられ
る。なお、本菌株はストレプトミセス・エスピー・（St
reptomyces sp.）WK−1875として、昭和63年２月８日、
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微
工研菌寄第9859号）。

本発明による抗生物質WK−1875生産菌を培養するため
の培地としては、ストレプトミセス属の微生物の培養に
適する炭素源、窒素源、無機物、必要に応じてその他の
栄養物を程よく含有する合成培地または天然培地を使用
することができる。

培地に使用される炭素源、窒素源は、使用菌株の利用
可能なものならばいずれの種類でもよい。例えば、炭素
源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、
マルトース、マンニット、キシロース、ガラクトース、
リボース、澱粉またはその加水分解物等の種々の炭水化
物が使用できる。その濃度は通常、培地に対して0.2％
〜５％（グルコース換算）が好ましい。また、グルコン
酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸、グリシ
ン、グルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸、さらに
はメタノール、エタノール等のアルコール類やノルマル
パラフィン等の各種の非芳香族炭化水素、あるいは植物
性もしくは動物性の各種の油脂等も使用可能である。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、燐
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム
等の各種の無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩類、
尿素、ペプトン、NZ−アミン、肉エキス、酵母エキス、
乾燥酵母、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解
物、フィッシュミールあるいはその消化物、大豆粉ある
いはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物、蛹加水
分解物等の含窒素有機物、さらにはグリシン、グルタミ
ン酸、アラニン等の各種アミノ酸が使用可能である。

無機物としては各種燐酸塩、硫酸マグネシウム、食塩
等、さらに微量の重金属塩が使用される。

栄養要求性を示す変異株を用いる場合には、当然その
栄養要求を満足させる物質を培地に加えなければならな
いが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用する
場合には特に添加を必要としない場合がある。

発酵は振盪培養または通気攪拌深部培養等の好気条件
下で行なう。培養温度は通常20℃〜40℃で、pHは４〜９
（特に７付近）である。培養期間は通常１〜７日で菌体
内外にWK−1875が生成蓄積する。

培養終了後に培養物よりWK−1875を例えば次の方法で
採取する。

培養物を遠心分離により濾液と沈殿物とに分離する。
濾液から多孔性高分子樹脂に吸着させ、溶出さることに
より抽出する。抽出物を適宜濃縮乾固することによりWK
−1875の粗物質を得る。粗物質はさらに、脂溶性物質の
精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカゲル等
の吸着剤、ゲル濾過剤などを用いる各種クロマトグラフ
ィー法、濃縮法、塩析法等を単独または適宜組み合わせ
ることにより精製する。WK−1875の精製に好適な例とし
て、シリカゲルを用い、溶出溶液としてクロロホルムと
メタノールの混液を用いる直線濃度勾配溶出法によるカ
ラムクロマトグラフィー法があげられる。これらの方法
で得られる活性画分を濃縮乾固することによりWK−1875
の精製粉末を得ることができる。

本明細書において、WK〜1875の検出および定量は、シ
リカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製、シリカ
ゲル、薄層板No.5554、厚さ0.2mm、展開溶媒：クロロホ
ルム／メタノール＝5:1、WK−1875のRf値0.60付近）お
よびフィトフトーラ・パラシチカ・バール・ニコチアナ
エ（Phytophthora parasitica var.nicotianae）KF−26
5およびムコール・ラセモサス（Mucor racemosus）KF−
223を用いる生物学的検定法によった。

以下に実施例を示す。

実施例１ ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）WK
−1875株（微工研菌寄第9859号）の斜面培養から１白金
耳を100mlの種培地（グリセロール２％、キナ粉２％、N
aCl0.3％、pH ７）を入れた500ml容の坂口フラスコに
接種し、27℃で２日間振盪培養して種培養液を得た。

こうして得られた種培養液400mlを、種培地と同一組
成（PH ７）の培地20を入れた30のジャーファーメ
ンターに移植し、27℃で３日間通気攪拌培養（通気量:1
0／分、攪拌:250rpm）を行なった。発泡を押えるため
にアデカノールLG−109（旭電化社製）を適宜添加し
た。

培養液15に等量の酢酸エチルを加えて活性物質を抽
出し、酢酸エチル層を濃縮乾固して油状物質45gを得
た。油状物質を200mlのクロロホルムに溶解し、不溶物
を除去した。クロロホルムに懸濁したシリカゲル（約1k
g）を充填したカラム（約２、6cm×75cm）の上端に、
上記の油状物質を少量のシリカゲルとともに負荷し、ク
ロロホルム／メタノール（5:1,v/v）（３）、クロロ
ホルム／メタノール（3:1,v/v）（２）で溶出した。
分画容量は約20mlとした。活性画分（No.106〜185）を
集め、減圧下で濃縮することにより、淡褐色の粉粉末3.
5gを得た。この粗粉末（3.0g）を常法により少量のシリ
カゲルに吸着させた。これを、ベンゼンに懸濁したシリ
カゲルを充填したカラム（230ml、1.1cm×60cm）の上端
に負荷し、 ベンゼン／アセトン 50:1（v/v） 〃 20:1（v/v） 〃 10:1（v/v） 〃 5:1（v/v） 〃 2:1（v/v） の順に溶出溶培を順次変えながら、各々約150〜200mlず
つ溶出した。分画容量は約10mlであった。活性画分（N
o.29〜78）のうち、最も活性の高い画分（No.46〜51）
を集め、減圧下で濃縮することにより、WK−1875の白色
精製粉末440mgをえた。本試料はシリカゲル薄層クロマ
トグラフィーにおいてクロロホルム／メタノール（5:1,
v/v）、ベンゼン／アセトン（10:1,v/v）で展開した場
合、単一スポットを与えた。また逆相型カラムを用いる
高速液体クロマトグラフィーで単一ピークを与えた。

本精製粉末の理化学的性質は、前記のとおりであっ
た。

発明の効果 抗生物質WK−1875は、主として植物病原性真菌に活性
を示すので、例えば農薬として有用であることが期待さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図はWK〜1875の赤外線吸収スペクトル（KBr法）、
第２図はプロトン核磁気共鳴スペクトル（CDCl₃中）、
第３図はＣ−13核磁気共鳴スペクトル（CDCl₃中）を示
す。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の理化学的性質を有する抗生物質WK−18
   75。 融点:116−119℃ 元素分析：実測値（％） Ｃ 64.7±1.0 Ｈ 9.1±0.3 分子量:740.97 分子式:C₄₀H₆₈O₁₂ 比旋光度：▲［α］¹⁸ _D▼−12.1゜ （ｃ＝0.5,メタノール） 紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：末端吸収 赤外線吸収スペクトル（KBr法）：第１図の通り プロトン核磁気共鳴スペクトル（CDCl₃中）：第２
   図の通り Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル（CDCl₃中）：第３図
   の通り 溶剤に対する溶解性 可溶：メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホ
   ルム 不溶：水、ｎ−ヘキサン 呈色反応 陽性:H₂SO₄ 陰性：エールリッヒ反応、ドラーゲンドルフ反応 酸性、中性、塩基性の別：弱酸性物質 物質の色：白色
2. 【請求項２】ストレプトミセス属に属し、抗生物質WK−
   1875を生産する能力を有する菌株を培地に培養し、培養
   物中に抗生物質WK−1875を生成蓄積させ、該培養物から
   WK−1875を採取することを特徴とする抗生物質WK−1875
   の製造法。